BIOCHIM1E, 1981, 63, 67-69.

Obtention de protoplastes de levure l'aide de diffdrentes prdparations de sue hdpato-pancreatique d' Helix pomatia.

M. D I A T E W A , I. V I A R D et A. J. C. S T A H L <>.

(Refu le 11-7-1980, acceptd aprOs rdvision le 9-10-1980).

Laboratoire de Biochimie, Facultd de Pharmacie, Universitd Louis Pasteur, B.P. 10, 67048 Strasbourg Cedex.

S u m m a r y .

Conversion of large amounts oJ Saccharomyces cerevisiae cells to protoplasts is studied using various preparations extracted from Helix pomat ia hepato-pancreatic juice. The most favorable yield in two hours incubations (88 per cent) is obtained with 20 ml cytohelicase, a chitinase and glucanase enriched extract, per 400 g of yeast cells, harve- sted at the end of the logarithmic growth phase and preincubated in presence of 2-mercaptoetha- nol.

Mots-el~s : protoplastes / levure f h6liease. Key-words : protoplats / yeast / helicase.

I n t r o d u c t i o n .

Pour isoler des mitochondries de Saccharomyces cerevisiae, en vue d ' en extraire des acides nucl6iques [1], des prot6ines [2] et des enzymes [3, 4], nous t ransformons couramment des cellules en protoplastes par digestion de la paroi cellulaire h l 'a ide de pr6parat ions de suc h6pato-pancr6a- tique d'escargot (Helix pomatia). Dans la pr6sente 6tude, nous avons compar~ 1.e rendement en proto- plastes obtenu h l 'a ide de diverses pr6parat ions d'h61icase.

M a t 6 r i e l e t M ~ t h o d e s .

1. Culture cellulaire: Les cellules d'une souche sau- vage haploide de Saccharomyces cerevisiae (IL 8, collec- tion P. Slonimski) sont cultiv6es dans 20 1 d'un milieu contenant 1 p. cent (p/v) de yeast extract Difco, 1 p. cent bactopeptone Difco et 1 p. cent de o-galactose pur Merck,

To whom all correspondence should be addressed.

5 × 106 unit6s Sp6cilline G Sp6cia, ~t raide de deux fer- menteurs Microferm 114 New-Brunswick. Les cellules (environ 400 g) sont r6colt6es par centrifugation pendant 10 mn ~t 700 >( g b. a t- 4°C, en fin de la phase exponen- tielle de croissance, et lav6es trois fois avec de l'eau distill6e h -t-4°C [3].

2. Pr@aration des protoplastes : 400 g de cellules sont agit6es pendant 30 mn 5. -4- 28°C dans 800 ml de solution de 2-mercapto6thanol 0,64 M, EDTA 25 mM ~ pH 7,0 [4, 5, 6]. Recueillies par centrifugation, elles sont lav6es 3 fois dans 1 1 de tampon K2HPOt 150 mM, acide citrique 50 raM, sorbitol 1,08 M, pH 5,8 [4] h n u 4°C. Les cellules humides sont mises en suspension dans 800 ml du marne tampon. La preparation enzymatique : Suc d'Helix poma- tia brut ou h61icase lyophilis6e ou cytoh61icase (R6actifs IBF, 35 avenue Jean-Jaur~s, 92390 Villeneuve-la-Garenne) est alors ajout~e, en quantit~s sp6cifi6es plus loin. Le m61ange est incub6 en agitant ~ A- 30°C. La formation des protoplastes est suivie en diluant le milieu d'incu- bation 1 : 2 0 0 avec de l'eau distill6e, ce qui conduit h une lyse hypotonique des protoplastes. L'absorbance est lue au spectrophotom~tre ~ 600 nm contre de l'eau distill6e.

R ~ s u l t a t s e t D i s c u s s i o n .

Pour t ransformer 400 g de cellules de ]evure humides en protoplastes, nous avons ajout6, soit 6 ml de suc d'Helix pomatia brut, soit 6 g d'h61i- case lyophilis6e, soit 10, 15 ou 20 ml de cyto- h61icase, une p r@ara t ion enrichie en chitinase et en glucanase. Le temps d ' incubat ion a &6 pro- long6 jusqu 'h l 'obtent ion d 'une conversion de 80 h 90 p. cent des cellules en protoplastes (figure 1). Les condit ions id~ales, nous permet tan t par la suite d ' isoler des mitochondries en bon 6tat, ne devraient pas n6cessiter une dur6e d ' incuba t ion supErieure fi 2 h 30. Les meilleurs r6sultats sont obtenus ( tableau I) avec 20 ml de cytoh61icase pour 400 g de cellules dans 800 mt de tampon.

6

68 M. Diatewa and coll.

Les quantit6s de ~-glucuron~dase et de sulfatase ajout6es ~ 400 g de celtules de levure humide et figurant dans le tableau I ne sont qu'une indication, car les enzymes intervenant r6ellement dans la lyse de la paroi ceHulaire telles les glucanases (1 ~ 3) et ~ (1 ~ 6), les prot6ases, les chitinases [5] n'ont pas 6t6 dos6es. L'allure des courbes

(figure 1) montre que la vitesse initiale, est fonc- tion de la quantit6 de cytoh61icase ajout6e. Cette vitesse initiale n'est pas augrnent6e significafive- ment par l'addition de quantit6s plus importantes de cytohflicase. Apr6s l'exp6rience d'incubation en pr6sence de 20 ml de cytoh61icase, le surna- geant de la centrifugation des protoplastes

A 600nm

1.0

0,5

o ~ ~ i ~ heures d ' i n c u b a t i o n

FIG. 1. - - Formation des protoplastes de levure d partir de 400 g de cellules humides :

X Suc d'Helix pomatia pour hydrolyse des parois cellulaires : 6 ml, soit 6 ampoules ; • H61icase lyophilis6e, 6 g soit 4 f lacons; O Cytoh61icase, 10 m l ; [] Cytoh61icase, 15 m l ; • Cytoh61icase, 20 ml.

TABLEAU I.

Pourcentage de cellules de levure transform6es en protoplastes h l'aide des trois pr6parations de suc digestif d'Helix pomatia.

Pr6paration enzymatique utilis~e Pourcentage de cellules

transform6es en protoplastes en :

Quantit6 Quantit6 de ~-glucuroni- de sulfatase 2 h 3 h D6nomination Quantit6 dase en unit&

Fisman en unit& Roy

Suc d'Helix pomatia brut 6 ml 600 000 6 000 000 40 55 H61icase lyophilis6e 6 g 4 000 000 40 000 000 75 88 Cytoh61icase 10 ml 1 000 000 50 000 000 67 80 Cytoh61icase 15 ml 1 500 000 75 000 000 80 92 Cytoh61icase 20 ml 2 000 000 100 000 000 88 94

BIOCH1MIE, 1981, 63, n ° I.

Protoplastes de levure. 69

(7.000 × g pendant 15 mn) a 6t6 r6cup6r6 et conserv6 gt l'6tat congeM fi - - 2 0 ° C pendant 15 jours. Additionn6 de 10 ml de cytoh61icase fra~che, ce milieu nous a servi fi traiter une nouvelle quan- tit6 de 400 g de cellules fra~ches. La conversion en protoplastes a 6t6 alors de 85 p. cent en 2 h.

A partir de protoplastes ainsi pr6par6s, avec 400 g de cellules incub6es en pr6sence de 20 ml de cytoh61icase, nous obtenons 1,6 ± 0,4 g de rnitochondries (exprim6es en prot6ines mitochon- driales totales) /t l'aide de m6thodes d6crites ant& rieurement [3, 4, 7].

Remereiements.

Nous remercions les Laboratoires Spdcia pour l'envoi de Spdciltine Get le Ddpartement rdacti/1BF de Pharmin-

dustrie pout" la ]ourniture de cytohdlicase utilis~e lors de ces essais.

BIBLIOGRAPHIE.

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2. Felter, S. & Stahl, A. (1978) Biochimie, 60, 1175-1179. 3. Schneller J. M., Schneller, C., Martin, R. & Stahl,

A. J. C. (1976) Nucl. Acids Res., 3, 1151-1165. 4. Diatewa, M. & Stahl, A. J. C. (1980) Biochem. Bio-

phys. Res. Commun., 941, 189-198. 5. Anderson, F. B. & Millbank, J. W. (1966) Biochem. L,

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BIOCH,tMIE, 1981, ¢~, n ° i.