Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Национальный медицинский исследовательский центр акушерства,

гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Барков Илья Юрьевич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПРЕНАТАЛЬНОГО

СКРИНИНГА АНЕУПЛОИДИЙ ПЛОДА НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА

ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК КРОВИ МАТЕРИ

Специальность 03.02.07 – Генетика

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Научные руководители:

д.м.н. Н.А. Каретникова

д.б.н., профессор РАН Д.Ю. Трофимов

Москва - 2018

2

Оглавление

Введение .................................................................................................................. 5

Актуальность темы исследования ...................................................................... 5

Цель и задачи исследования ............................................................................... 7

Задачи исследования ............................................................................................ 7

Научная новизна ................................................................................................... 8

Практическая значимость.................................................................................... 9

Положения, выносимые на защиту .................................................................. 10

Апробация результатов ..................................................................................... 11

Внедрение результатов исследования в практику .......................................... 12

Публикации ......................................................................................................... 12

Личный вклад автора ......................................................................................... 12

Объем и структура работы ................................................................................ 13

Глава 1. Обзор литературы ............................................................................... 14

1.1 Хромосомные анеуплоидии ........................................................................ 14

1.2 Цитогенетические методы исследования .................................................. 15

1.2.1 Кариотипирование ...................................................................................................... 15

1.2.2 Исследование полового хроматина ........................................................................... 16

1.2.3 Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) .......................................................... 17

1.3 Молекулярно-генетические методы исследования .................................. 18

1.3.1 Полимеразная цепная реакция и QF-PCR ................................................................. 18

1.3.2 Хромосомный микроматричный анализ ................................................................... 19

1.4 Инвазивные методы получения материала плода .................................... 20

1.4.1 Амниоцентез ................................................................................................................ 20

1.4.2 Кордоцентез ................................................................................................................ 21

1.4.3 Биопсия хориона .......................................................................................................... 21

1.5 Скрининговые обследования беременных ................................................ 22

1.5.1 Скрининг второго триместра ................................................................................... 22

1.5.2 Скрининг первого триместра .................................................................................... 25

1.6 Неинвазивное выявление анеуплоидий по клеткам плода ...................... 29

1.7 Выявление анеуплоидий по внеклеточной ДНК в крови матери ........... 31

1.7.1 История открытия внеклеточной ДНК .................................................................. 31

3

1.7.2 Происхождение и характеристики материнской внеклеточной ДНК ................. 32

1.7.3 Происхождение и характеристики плодовой внеклеточной ДНК ........................ 35

1.7.4 Определение доли плодовой ДНК ............................................................................... 38

1.7.5 Исследование внеклеточной ДНК с применением цифровой ПЦР ......................... 39

1.7.6 Полногеномное высокопроизводительное секвенирование ..................................... 40

1.7.7 Алгоритмы анализа данных ....................................................................................... 44

1.7.8 Таргетное секвенирование ......................................................................................... 47

1.7.9 Биологические ограничения ДНК-скрининга ............................................................ 49

1.7.10 Выявление риска анеуплоидий по половым хромосомам ....................................... 52

1.7.11 Выявление риска редких анеуплоидий ..................................................................... 53

1.7.12 Применение ДНК-скрининга при многоплодной беременности ........................... 54

Глава 2. Материалы и методы исследования ............................................... 56

2.1 Материалы .................................................................................................... 56

2.2 Характеристики пациентов и получение материала ................................ 59

2.2.1 Ретроспективные группы .......................................................................................... 59

2.2.2 Проспективная группа ................................................................................................ 59

2.2.3 Забор крови и отделение плазмы ............................................................................... 60

2.2.4 Проведение амниоцентеза, биопсии ворсин хориона, кордоцентеза .................... 62

2.2.5 Получение образцов плаценты ................................................................................... 62

2.3 Специальные методы исследования .......................................................... 63

2.3.1 Проведение стандартного цитогенетического исследования .............................. 63

2.3.2 Проведение молекулярно-цитогенетического исследования (FISH) ..................... 64

2.3.3 Проведение молекулярного кариотипирования ........................................................ 64

2.3.4 Проведение QF-PCR .................................................................................................... 65

2.3.5 Выделение внеклеточной ДНК и проведение ПЦР................................................... 65

2.3.6 Приготовление библиотек для секвенирования ....................................................... 67

2.3.7 Обработка данных ...................................................................................................... 72

2.3.8 Статистическая обработка материала ................................................................. 74

Глава 3. Результаты и обсуждение .................................................................. 75

3.1 Скрининг наличия анеуплоидий ................................................................ 75

3.1.1 Результаты валидации ............................................................................................... 75

3.1.2 Определение происхождения анеуплоидий при ДНК-скрининге............................. 80

3.1.3 Определение доли плодовой ДНК ............................................................................... 83

3.1.4 Зависимость доли плодовой ДНК от массы тела и от ИМТ ................................ 85

3.1.5 Зависимость доли плодовой ДНК от срока беременности .................................... 86

4

3.1.6 Транспортировка материала для исследования ...................................................... 87

3.1.7 Пренатальная диагностика с применением микроматричного анализа .............. 89

3.1.8 Пренатальная диагностика с применением метода QF-PCR ............................... 90

3.1.9 Анализ причин ложноположительных и ложноотрицательных результатов ... 91

3.1.10 Выявление анеуплоидий при многоплодной беременности ................................... 92

3.1.11 Выявление редких и частичных анеуплоидий ......................................................... 94

3.1.12 Сравнение с опытом применения ДНК-скрининга в мировой практике ............. 94

3.2 Описание отдельных клинических случаев .............................................. 97

3.2.1 Трисомия по 21-й хромосоме при низком риске по результатам комбинированного скрининга I триместра ...................................................................... 97

3.2.2 Мозаицизм у ребенка / плода – причина ложноотрицательного результата трисомии по 21-й хромосоме .............................................................................................. 98

3.2.3 Мозаицизм плаценты - причина выявленного риска трисомии хромосомы 7 .... 102

3.2.4 Выявление частичной анеуплоидии по 4 и 12 хромосомам ................................... 107

3.2.5 Выявление трисомии 10 у пациента с лимфангиомой щеки................................. 109

3.2.6 Выявление трисомии 21 у одного плода из тройни ............................................... 110

Заключение ......................................................................................................... 113

Выводы ................................................................................................................ 115

Практические рекомендации .......................................................................... 117

Перспективы дальнейшей разработки темы .............................................. 118

Список сокращений .......................................................................................... 119

Список литературы .......................................................................................... 120

Приложения ........................................................................................................ 137

Приложение 1. Основные положения проведения ДНК-скрининга .............................. 137

Приложение 2. Образец информированного согласия ................................................... 142

Приложение 3. Направление на исследование ................................................................ 144

Приложение 4. Образец клинического лабораторного заключения (пример 1)........... 145

Приложение 5. Образец клинического лабораторного заключения (пример 2)........... 146

Приложение 6. Заключение по многопллодной беременнности .................................... 147

Приложение 7. Лабораторное заключение по результатам ДНК-скрининга ............. 148

Приложение 8. Лабораторное заключение по результатам ДНК-скрининга ............. 149

Приложение 9. Лабораторное заключение по результатам ДНК-скрининга ............. 150

5

Введение

Актуальность темы исследования

Конечной целью пренатальной диагностики является раннее выявление

патологии у плода и предупреждение рождения детей с тяжелыми

некорригируемыми врожденными и наследственными заболеваниями [1].

Одно из ведущих мест в структуре причин репродуктивных потерь,

неонатальной смертности и детской инвалидности занимают хромосомные

анеуплоидии (ХА). Они являются основной причиной спорадических

неразвивающихся беременностей и выкидышей, а у новорожденных

встречаются с частотой до 1:300. Наиболее частыми ХА у родившихся детей

являются трисомии по 21, 18 и 13 хромосомам, приводящие к проявлениям

синдромов Дауна, Эдвардса и Патау. Анеуплоидии по другим аутосомам

обычно не встречаются у родившихся детей, т.к. приводят к прерыванию

беременности на ранних сроках. В целях совершенствования пренатальной

диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у

детей, предупреждения детской инвалидности, в России внедрено

обязательное пренатальное обследование беременных, которое включает два

этапа [1,2,3]. На первом этапе проводится выявление беременных женщин

группы риска с помощью массового комбинированного скрининга

беременных с применением анализа биохимических маркеров хромосомной

патологии и ультразвукового обследования (УЗИ), для выявления

ультразвуковых маркеров хромосомной патологии. В случае установления

высокого риска хромосомной патологии у плода, на втором этапе

осуществляется проведение инвазивных диагностических процедур. Как

правило, это биопсия хориона или амниоцентез с последующим

определением кариотипа плода.

При массовом скрининге с целью выявления хромосомных нарушений

во II триместре беременности, который осуществляется в соответствии с

6

Приказом Минздрава России от 28.12.2000 №457 "О совершенствовании

пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных

заболеваний у детей", в группу риска попадает много женщин,

вынашивающих здоровый плод. Так, по результатам скрининга II триместра,

после проведения скрининга маркеров сывороточных белков в срок 16-20

недель, трисомия по 21-й хромосоме методами инвазивной пренатальной

диагностики подтверждается примерно у 1 из 80 беременных. Это приводит к

снижению доверия к результатам скрининга и, как следствие, к

значительному количеству отказов от верификации методами инвазивной

диагностики, в том числе среди пациентов, беременность которых

заканчивается рождением больного ребенка. В частности, от инвазивной

пренатальной диагностики отказываются около половины женщин,

вынашивающих плод с трисомией по 21-й хромосоме, которые по

результатам скрининга II триместра были отнесены к группе высокого риска

по рождению ребенка с хромосомной патологией.

В настоящее время в России также внедрен новый порядок

пренатального обследования, который осуществляется в соответствии с

Приказом Минздрава России от 01.11.2012г № 572н "Об утверждении

Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и

гинекология (за исключением использования вспомогательных

репродуктивных технологий). Он базируется на результатах УЗИ и

биохимических показателях в I триместре и на данных УЗИ для исключения

поздно манифестирующих пороков развития во II триместре. Этот скрининг

также основан на косвенных маркерах и имеет ограничение по

чувствительности и специфичности, колебания биохимических показателей

зависят как от хромосомного статуса плода, так и от гормонального статуса

беременной женщины. В результате комбинированный скрининг I триместра

(сочетание биохимических маркеров с данными УЗИ), даже при четком

соблюдении сроков обследования, позволяет отнести в группу риска для

7

последующего проведения инвазивной диагностики лишь около 80%

беременностей плодами с трисомией по 21-й хромосоме.

В ряде клинических ситуаций снижение числа инвазивных процедур

имеет особое значение. Необходимо максимально использовать

неинвазивные методы оценки состояния плода, минимизировать инвазивные

вмешательства женщинам с отягощенным акушерским анамнезом, при

беременности, протекающей на фоне угрозы выкидыша. Крайне важно

избегать процедур, повышающих риск инфицирования плода, беременным с

ВИЧ-инфекцией.

Таким образом, имеется необходимость в разработке и внедрении в

практическое здравоохранение более современных неинвазивных

исследований, позволяющих с более высокой точностью выявлять

беременных с риском хромосомных нарушений. Наиболее перспективным в

данном направлении является неинвазивный метод пренатального скрининга

анеуплоидий, основанный на анализе внеклеточной ДНК плода в крови

матери (ДНК-скрининг, НИПС, пренатальный тест - НИПТ) [4].

Цель и задачи исследования

Целью работы являлась оценка возможности использования

неинвазивного анализа внеклеточной ДНК крови матери для

совершенствования системы пренатального скрининга анеуплоидий плода.

Задачи исследования

1. Провести валидацию неинвазивного ДНК-скрининга анеуплоидий по

крови матери на выборке образцов с известными результатами инвазивной

пренатальной диагностики или исходами беременности для оценки его

чувствительности и специфичности по сравнению с применяемыми в

настоящее время стандартными комбинированными скринингами.

8

2. Оценить возможность использования ДНК-скрининга в качестве

уточняющего риск скринингового исследования.

3. Уточнить ограничения для проведения ДНК-скрининга.

4. Уточнить оптимальные способы проведения подтверждающей

диагностики при выявлении высокого риска хромосомной патологии плода

по результатам ДНК-скрининга.

5. Оценить возможности полногеномного ДНК-скрининга анеуплоидий

плода по сравнению с другими видами скрининга, в т.ч. при многоплодной

беременности.

6. Разработать и валидировать способ оценки доли плодовой ДНК, не

зависящий от пола плода.

7. Оценить влияние различных факторов, таких как срок беременности,

индекс массы тела, вес беременной, условия транспортировки

биологического материала в лабораторию, на долю плодовой ДНК и

результаты ДНК-скрининга.

Научная новизна

Впервые в России проведена лабораторная валидация ДНК-скрининга на

контрольной выборке с известными результатами пренатальной инвазивной

диагностики. Доказано, что при соответствующих условиях образцы крови,

подлежащие анализу, могут транспортироваться, сохраняться значительное

время, что имеет значение для отсроченного исследования.

Разработаны и апробированы подходы, позволяющие оценивать долю

плодовой ДНК независимо от присутствия Y-хромосомы, посредством

использования однонуклеотидных полиморфизмов. Проведены подбор и

применение конкретных однонуклеотидных полиморфизмов для

установления доли плодовой ДНК.

Определены факторы, которые влияют на результаты ДНК-скрининга

анеуплоидий: ложноположительные результаты могут быть обусловлены

особенностями кариотипа женщины, мозаицизмом плаценты и плода;

9

ложноотрицательные результаты - мозаицизмом плода, снижением доли

плодовой ДНК; высокий ИМТ не является ограничением к проведению

исследования при определении в процессе исследования доли плодовой

ДНК. Риск наличия плацентарного мозаицизма и мозаицизма плода следует

учитывать при выработке тактики ведения беременности: профилактика

плацентарной недостаточности, инвазивная пренатальная диагностика при

отсутствии противопоказаний (соответственно).

Разработаны методические подходы, позволяющие различать

мозаицизм плодового и материнского происхождения, а, следовательно,

минимизировать количество ложноположительных результатов ДНК-

скрининга.

Доказано отсутствие значимой корреляции доли плодовой ДНК со

сроком беременности в рекомендованный для проведения НИПС период с 11

по 18 неделю беременности.

Установлено, что ДНК-скрининг можно применять при многоплодной

беременности.

Показана возможность применения ДНК-скрининга с использованием

полногеномного подхода для выявления клинически значимых редких и

частичных анеуплоидий.

Практическая значимость

Установлено, что неинвазивный пренатальный скрининг анеуплоидий

плода на основе анализа внеклеточной ДНК крови матери на сегодняшний

день обладает большей чувствительностью и специфичностью по сравнению

с комбинированным скринингом, основанном на данных УЗИ и

биохимических маркеров. Клиническая значимость полногеномного

высокопроизводительного секвенирования заключается как в возможности

выявления высокого риска анеуплоидий, в т.ч. частичных, так и в выявлении

факторов риска осложнения беременности, что позволяет определять

индивидуальную тактику ведения беременности. Определены факторы,

10

влияющие на результаты ДНК-скрининга. Разработаны методические

подходы, позволяющие определять долю плодовой ДНК вне зависимости от

пола плода, что важно для предотвращения ложноотрицательных

результатов. Предложены способы, позволяющие различать мозаицизм

плодового и материнского происхождения и тем самым минимизировать

количество ложноположительных результатов ДНК-скрининга.

Положения, выносимые на защиту

1. ДНК-скрининг может быть рекомендован беременным с низким

риском по результатам комбинированного скрининга I и II триместров.

ДНК-скрининг может рассматриваться в качестве уточняющего риск

скринингового исследования перед инвазивной диагностикой для

беременных с высоким риском по результатам комбинированного скрининга,

что особенно актуально для пациентов с отягощенным акушерским

анамнезом.

2. ДНК-скрининг является значительно более чувствительным и

специфичным способом выявления анеуплодий у плода по сравнению со

стандартными скринингами I и II триместров, однако его эффективность не

может достигать 100% из-за биологических ограничений. В случае

выявления высокого риска анеуплоидий по результатам ДНК-скрининга и

при отсутствии врожденных аномалиий (пороков развития) по результатам

УЗИ, показана инвазивная пренатальная диагностика, которую желательно

проводить с применением методов цитогенетического или молекулярного

кариотипирования амниотической жидкости, также допустимо

использование QF-PCR или FISH.

3. Полногеномное высокопроизводительное секвенирование позволяет

получать информацию не только об анеуплоидиях по 13, 18, 21 и половым

хромосомам плода, но также о клинически значимых полных и частичных

анеуплоидиях по другим хромосомам плода, плаценты и самой матери, в том

числе связанных с осложнениями течения беременности.

11

4. При разработке нормативных документов, регламентирующих

проведение ДНК-скрининга, следует учитывать отсутствие значимой

корреляции доли плодовой ДНК со сроком беременности в рекомендованный

для проведения НИПС период с 11 по 18 неделю беременности, при этом

высокий ИМТ не является ограничением для исследования. Доля плодовой

ДНК является крайне важным критерием валидности ДНК-скрининга и её

определение должно быть регламентировано в обязательном порядке.

Апробация результатов

Результаты работы были представлены и обсуждены на 8 российских и 3

международных конференциях: IX Всероссийском научном форуме "Мать и

дитя" (Москва, 2-5 октября 2007); XXV Юбилейной конференции РАРЧ

"Репродуктивные технологии сегодня и завтра" (Сочи, 9-12 сентября 2015г.);

международном форуме “Controversies in preconception, preimplantation and

prenatal genetic diagnosis” (Барселона, Испания, 22-24 сентября 2016); XVII

Всероссийском научно-образовательном форуме "Мать и дитя - 2016"

(Москва, 27-30 сентября 2016); международной конференции “Prenatal

Molecular Diagnostics Europe” (Лиссабон, Португалия, 10-14 апреля 2017);

конференции “NGS в медицинской генетике” (Суздаль, 26-28 апреля 2017);

2-ой Всероссийской научно-практической конференции "Новые технологии

диагностики наследственных болезней" (Москва, 27-28 октября 2017);

II съезде Ассоциации специалистов медицины плода (Санкт-Петербург, 15-17

ноября 2017); конференции “NGS в медицинской генетике” (Суздаль, 25-27

апреля 2018); международной конференции “22nd International Conference on

Prenatal Diagnosis and Therapy” (Антверпен, Бельгия, 8-11 июля 2018);

“Всероссийской цитогенетической конференции” (Москва, 29-31 августа

2018).

Апробация диссертации состоялась на заседании апробационной

комиссии ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова” Минздрава России

24 сентября 2018 года, протокол №10.

12

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования одобрены Ученым Советом ФГБУ “НМИЦ

АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России и применяются в практической

работе Института репродуктивной генетики, в работе 2-го акушерского

отделения патологии беременности, а также используются в учебном

процессе на кафедре акушерства и гинекологии департамента

профессионального образования ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова”

Минздрава России и в научно-производственной деятельности ООО “НПО

ДНК-Технология”. Опубликованы методические рекомендации по

применению ДНК-скрининга, утвержденные Российским обществом

акушеров-гинекологов:

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.6.recomendations

Получен патент "Способ определения источника анеуплоидных клеток

по крови беременной женщины" (RU2016152686A).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 8 статей в

рецензурируемых научных журналах, входящих в список ВАК, 10 тезисов

докладов в сборниках трудов конференций, получен 1 патент.

Личный вклад автора

Автором проведена систематизация литературных данных по теме

диссертации, самостоятельно разработаны дизайн и программа исследования,

диссертант принимал участие в обследовании, консультировании,

диагностике, ретроспективном и проспективном анализе результатов

исследования пациентов, включенных в работу. Автором осуществлялись:

получение, подготовка, хранение биологического материала на

преаналитическом этапе, участие в молекулярно-генетических

исследованиях. Анализ, статистическая обработка полученных данных

13

проведены автором самостоятельно в соответствии с правилами и

обеспечивают достоверность результатов и сформулированных выводов.

Описание и публикация результатов клинических и лабораторных

исследований выполнены автором лично.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 150 страницах печатного текста и состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,

главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения,

выводов, списка использованной литературы, 9 приложений. Работа

иллюстрирована 8 таблицами и 32 рисунками. Указатель литературы

содержит 155 библиографических источников, в том числе 7 отечественных

и 148 иностранных публикаций.

14

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Хромосомные анеуплоидии

Хромосомные анеуплоидии (ХА) - генетические нарушения, при

которых число хромосом в клетках не кратно основному набору. История

открытия ХА начинается с 19 века, когда J. Arnold наблюдал митотические

хромосомы в клетках опухолей, а W. Flemming, исследуя митозы в клетках

роговицы, обнаружил в метафазах 22-28 хроматиновых тел [5, 6]. В 1912 г.

H. Winiwarter обнаружил 47 хромосом в метафазах сперматогоний и 23

аутосомные пары плюс непарную X-хромосому в сперматоцитах [7]. Он

предположил, что женский пол у человека определяется системой половых

хромосом ХХ, а мужской - Х0. В 1923 г. T. Painter по хромосомам в

сперматогониях и сперматоцитам установил, что диплоидное число

хромосом для обоих полов 48, а система половых хромосом представлена

хромосомами ХХ для женщин и XY для мужчин [8]. Долгое время вопрос о

числе хромосом считался решенным (2n = 48). Большой неожиданностью

стало опубликованное в начале 1956 г. сообщение шведских цитологов

J.H. Tjio и A. Levan, согласно которому число хромосом в культуре

фибробластов лёгкого от трех эмбрионов человека равно 46 [9]. Учитывая

возможность утери 2-х хромосом у эмбрионов, они воздержались от

окончательного ответа и рекомендовали дальнейшее тщательное

исследование. Их сообщения были подтверждены в том же году C.E. Ford и

J.L. Hamerton, которые окончательно установили наличие гаплоидного

набора из 23 хромосом в сперматозоидах человека и кратного ему

диплоидного набора из 46 хромосом в сперматогониях (2n = 46) [10]. В

1959 г. была выявлена первая хромосомная болезнь, вызванная анеуплоидией

- было обнаружено, что причиной синдрома Дауна является нарушение

кратности гаплоидного набора, а именно избыточная 21-ая хромосома

(2n + 1 = 47) [11]. Такое состояние обычно обозначается как трисомия по

15

21-й хромосоме. К настоящему времени установлено, что на ранних этапах

эмбрионального развития ХА могут наблюдаться фактически по всем

хромосомам. При этом рождение живых детей с полной формой большинства

анеуплоидий практически не происходит из-за элиминации

нежизнеспособных эмбрионов на ранних сроках беременности [12]. Особую

клиническую значимость имеют анеуплоидии по 13, 18 и 21 хромосомам, а

также по половым хромосомам. Они могут наблюдаться у новорожденных

детей с синдромами Дауна, Эдвардса и Патаy, отсутствие второй Х-

хромосомы у женщин, т.е. моносомия по хромосоме Х, приводит к

проявлениям синдрома Тернера, лишняя хромосома Х у мужчин является

причиной синдрома Клайнфельтера (указанные синдромы с вовлечением

половых хромосом сопровождаются мужским и женским

бесплодием) [13,14]. Анеуплоидиями по различным хромосомам

обусловлены около половины потерь беременности до 12 недель. Как

правило, они возникают de novo. Вероятность возникновения ХА у плода

возрастает с возрастом женщины [17].

1.2 Цитогенетические методы исследования

1.2.1 Кариотипирование

Дальнейший прогресс в исследовании ХА происходил благодаря

удачному объединению целого ряда методов - применению световой (в т.ч.

люминесцентной) микроскопии, клеточных культур, гипотонического

раствора, который способствует разбросу хромосом на препаратах,

использованию колхицина, который вызывает аккумуляцию митозов и

варьирующую степень сжатия хромосом, применение фитогемагглютинина,

который стимулирует переход лейкоцитов в митотическое состояние,

применение трипсина для дифференциальной окраски хромосом [15].

Разработанный к началу 1970-х годов метод кариотипирования с

16

незначительными модификациями широко применяется и до настоящего

времени, являясь стандартом при исследовании хромосом. В частности, он

позволяет выявлять трисомии по 21, 18, 13 и половым хромосомам. Помимо

этого, метод позволяет выявлять частичные анеуплоидии, обычно

возникающие у плода при наличии у клинически здоровых родителей

сбалансированных перестроек (транслокаций), в которые вовлечены 21, 18,

13 и другие хромосомы, а также обнаруживать крупные делеции и

дупликации.

1.2.2 Исследование полового хроматина

Помимо анализа метафазных хромосом, определение половых хромосом

возможно путем исследования X- или Y-хроматина в интерфазных клетках.

Достоверность установления числа X-хромосом при исследовании X-

хроматина (телец Барра) составляет около 90% (у плодов женского пола

тельца Барра обычно обнаруживаются в 12-25% амниотических клеток) [16].

Несколько выше (около 96%) выявляемость F-телец (Y-хроматина), наличие

которых связано с флюоресценцией длинного плеча Y хромосомы,

проявляющейся при окрашивании флюоресцентными красителями (в

частности, акрихин-ипритом) в виде яркого пятна диаметром 0,3-1,0 мкм

[23].

Следует отметить, что исследование в интерфазных ядрах телец Барра

или выявление окрашенных флюоресцентными красителями Y хромосом в

интерфазных клетках, в связи со значительной условностью в трактовании

результатов анализа, не имеет той достоверности, которая достигается при

анализе метафазных препаратов, особенно с применением методов

дифференциального окрашивания хромосом. Однако, исследование телец

Барра и F-телец продолжает оставаться актуальным, т.к. результаты могут

быть получены за короткое время, а само исследование полового хроматина

значительно менее трудоемкое по сравнению с плохо автоматизируемой

17

процедурой приготовления препаратов с метафазными пластинками для

дифференциального окрашивания хромосом, которая мало изменилась с

момента первоначальной разработки в 60-70 годах прошлого века.

1.2.3 Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH)

В конце 80-х - начале 90-х годов стали интенсивно разрабатываться

новые методы, позволяющие проводить исследования по значительно

меньшему количеству используемого для анализа материала и обеспечить

высокую точность без метафазного анализа хромосом. К ним, в первую

очередь, относятся методы анализа ISH (in situ hybridization), в частности,

FISH (fluorescence in situ hybridization) и применение полимеразной цепной

реакции (ПЦР).

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) является методом быстрого

проведения цитогенетической диагностики, основанным на специфичной

гибридизации флюоресцентно-меченных зондов с определенными участками

хромосом (обычно это расположенные в районе центромеры хромосомо-

специфические альфоидные повторы) [27]. При применении этого метода

обычный препарат с интерфазными или метафазными клетками подвергается

тепловой денатурации в присутствии зонда, например, к Y хромосоме,

меченного, как правило, биотином. Дальнейшая обработка препарата

флюоресцентно-меченным гликопротеином из яичного желтка авидином,

обладающим способностью практически необратимо связываться с

биотином, позволяет визуализировать исследуемый участок хромосомы.

По флюоресценции зондов можно быстро выявить число копий

хромосомы и большие структурные перестройки хромосом в интерфазных

ядрах. Метод интерфазной гибридизации in situ, несмотря на то, что известен

уже давно, продолжает оставаться актуальным для клиники, когда требуется

получить результаты быстро, когда клетки плохо культивируются in vitro или

когда отвечающая фракция клеток проявляет плохую способность к

18

стимулируемой пролиферации, необходимой для метафазного анализа; метод

позволяет также избежать ошибок в определении пола при наличии

маркерной Y хромосомы. При использовании нескольких разных красителей,

таких, как флюоресцин (желто-зеленый), родамин (красный) и других можно

одновременно визуализировать несколько разных хромосом в одной клетке,

что позволяет производить одновременно детекцию разных

анеуплоидий [28].

1.3 Молекулярно-генетические методы исследования

1.3.1 Полимеразная цепная реакция и QF-PCR

Другой хорошо разработанный за последние десятилетия метод -

полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод позволяет быстро и

специфично проводить анализ крайне малых количеств ДНК. При

использовании ПЦР можно с помощью фермента Taq-полимеразы увеличить

(амплифицировать) количество ДНК, содержащееся в одной или нескольких

клетках, до количества, достаточного для пренатальной диагностики.

Применив соответствующие праймеры (синтезированные искусственно

участки ДНК, ограничивающие амплифицируемый регион) на полиморфные

участки ДНК (STR - short tandem repeats, короткие тандемные повторы), этим

методом можно быстро установить как наличие исследуемых хромосом, так

и их количество. В практике такой метод выявления анеуплоидий с

использованием STR-маркеров получил название QF-PCR (Quantitative

Fluorescence Polymerase Chain Reaction) или КФ-ПЦР [26]. Теоретически,

применение ПЦР позволяет выявить количество ДНК, содержащееся всего в

одной клетке, находящейся в бесклеточной среде. В образце с другими

клетками при использовании одной пары праймеров генетический материал

мужской Y-хромосомы можно выявить среди десятков, если не сотен тысяч

женских клеток. Обычно такие результаты достигаются с применением

19

специальных модификаций метода ПЦР, предназначенных повышения

чувствительности проводимой диагностики. Например, разработаны

модификации метода ПЦР с применением “горячего старта” и “нестед”-

праймеров (в этом случае уже амплифицированная ДНК подвергается

дополнительной амплификации с использованием другой пары праймеров,

комплементарной последовательности, ограниченной снаружи парой

первоначально примененных праймеров) [25]. Несмотря на это, исследование

с помощью QF-PCR смешенных образцов (более 10-20% примеси

посторонней ДНК, например ДНК матери) нежелательно, что связано со

спецификой диагностики с применением STR-маркеров. В случае выявления

анеуплоидий в смешенных образцах, в т.ч. при подозрении на мозаицизм,

более целесообразно применять цитогенетический метод FISH.

1.3.2 Хромосомный микроматричный анализ

В последнее время для пренатального выявления анеплоидий все шире

применяется метод молекулярного кариотипирования на микроматрицах.

Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) - современная альтернатива

традиционному кариотипированию [24]. Данный метод позволяет избежать

этапа культивирования при диагностике по амниотической жидкости, при

этом с помощью данного метода можно не только выявлять анеуплоидии

(трисомии, моносомии), но диагностировать субмикроскопические

микроделеции и микродупликации, которые не выявляются при обычном

кариотипировании. Для проведения хромосомного микроматричного анализа

используется твердый носитель небольшого размера (микроматрица) из

стекла или кремния. В определенном порядке к нему прикреплены короткие

олигонуклеотиды (8-80 п.н.) или фрагменты ДНК (более 100 п.н.).

Например, матрицы, используемые для хромосомного микроматричного

анализа американской компанией Affymetrix содержат до 2,7 млн.

специфических олигонуклеотидов (SNP-зонды). При обычном ХМА

20

применяется микроматрица средней плотности (750 тыс. зондов),

микроматричный анализ высокого разрешения проводится с помощью

микроматрицы высокой плотности (2,67 млн. зондов). Благодаря этому,

удается получать информацию о наличии/отсутствии генетического

материала со значительной части генома. К недостаткам метода можно

отнести невозможность выявлять сбалансированные транслокации, поэтому

стандартный цитогенетический анализ дифференциально окрашенных

хромосом не теряет своей актуальности.

1.4 Инвазивные методы получения материала плода

1.4.1 Амниоцентез

В настоящее время пренатальная диагностика ХА осуществляется с

помощью различных инвазивных методов исследования тканей плодового

происхождения: хориона, амниотической жидкости, крови плода и др. Ее

появлению в конце 1960-х годов способствовало описанное выше развитие

генетики соматических клеток, позволившее создать метод изучения

кариотипа плода, основанный на исследовании амниотической жидкости,

получаемой посредством пункции околоплодного пузыря (амниоцентеза).

Впервые амниоцентез был применен с целью лечения многоводия во второй

половине XIX века. В 1956г. американский акушер F. Fuchs и датский

гастроэнтеролог P. Riis сообщили об успешном пренатальном определении

полового хроматина в клетках, полученных путем амниоцентеза [18]. В 1966

М.W. Steel и W.R. Breg смогли установить по культуре клеток

амниотической жидкости кариотип плода [19]. В настоящее время обычно

амниоцентез осуществляют с 16 недель беременности под контролем УЗИ.

Количество извлекаемой амниотической жидкости (1-40 мл) зависит от срока

беременности и задач лабораторной диагностики.

Частота процедуросвязанных осложнений после амниоцентеза

составляет 0,5-2% [20].

21

1.4.2 Кордоцентез

Для пренатального определения кариотипа может быть использована и

кровь плода, которую получают с помощью пункции сосудов пуповины

(кордоцентеза) [21]. Наиболее ранним гестационным возрастом плода, при

котором извлечение его крови в количестве 1 мл не ведет к осложнениям,

является 16 недель беременности. Поскольку в большинстве случаев

требуется большее количество крови, манипуляцию проводят в более

поздние сроки, вплоть до 27 недель беременности. Как правило, количество

аспирированной крови колеблется от 1 до 5 мл. Частота процедуросвязанных

осложнений после кордоцентеза не превышает 2% [20].

1.4.3 Биопсия хориона

С конца 1970-х годов начал широко применяться еще один способ

получения ткани в I триместре беременности - биопсия ворсин хориона,

впервые примененный отечественными исследователями В.А. Бахаревым,

И.С. Розовским и З. Кази для пренатального установления пола [22].

Получение ткани хориона осуществляется различными способами,

основными из них являются трансцервикальный метод с помощью

биопсийных щипцов малого диаметра (обычно 1,7 мм) или специального

пластикового катетера - трофокана и трансабдоминальная аспирация хориона

с использованием иглы и шприца. Процедуру с целью получения

хориональной ткани обычно проводят на сроке 10-12 недель беременности.

Перед манипуляцией требуется ультразвуковое исследование для

характеристики хориона, уточнения срока беременности, исключения

возможных отклонений в ее развитии. Основным осложнением

вмешательства является прерывание беременности, частота которого в

настоящее время не превышает 2% благодаря выполнению процедуры под

непосредственным ультразвуковым контролем [20]. Количество материала

зависит от метода его получения и колеблется от 1 до 35 мг. Имеются и

22

другие, получившие меньшее распространение способы взятия плодного

материала, применяемые для определения пола плода (биопсия кожи плода,

аспирация крови плода посредством пункции плаценты и др.) [29].

Исследование полученного плодного материала с целью выявления

анеуплоидий обычно проводится с помощью исследования метафазных

хромосом посредством применения световой микроскопии. Наибольшее

распространение для выявления анеуплоидий получил метод анализа

метафазных хромосом (кариотипирование), обычно в сочетании с

разработанным в начале 70-х годов методом дифференциальной окраски

препаратов хромосом. Для получения достаточного для анализа количества

метафаз клетки амниотической жидкости культивируют перед проведением

исследования в течение нескольких недель. Применение биопсии ворсин

хориона позволило не только заметно снизить сроки, в которые

осуществляется получение материала, но и сократить время, необходимое

для анализа. Так как в биоптате имеется достаточное количество делящихся

клеток и отпадает необходимость в длительном культивировании,

проведение кариотипирования возможно в течение суток после получения

материала.

1.5 Скрининговые обследования беременных

1.5.1 Скрининг второго триместра

В связи с тем, что ни один из способов инвазивной пренатальной

диагностики не является полностью безопасным и в 0,5-2 процентах случаев

может приводить к связанному с процедурой получения материала риску

осложнений, инвазивная пренатальная диагностика проводится, как правило,

не всем беременным, а только по медицинским показаниям. Традиционным

показанием для проведения инвазивной процедуры является выявленный

23

высокий риск ХА, на основании которого беременная включается в группу

риска по хромосомной патологии.

В 2000 г Минздравом РФ был издан приказ № 457 “О

совершенствовании пренатальной диагностики в профилактике

наследственных и врожденных заболеваний у детей”, который

регламентирует порядок проведения массового пренатального скрининга II

триместра. Данный Приказ установил порядок исследования маркеров

сывороточных белков для выявления риска хромосомной патологии во

втором триместре (на сроке беременности 15 17 недель) и сроки проведения

УЗИ-исследований, а также установил порядок проведения инвазивной

пренатальной диагностики хромосомной патологии.

Согласно "Инструкции по организации проведения пренатального

обследования беременных женщин с целью выявления врожденной и

наследственной патологии у плода" (Приложение №1 к Приказу Минздрава

России от 28.12.2000 №457 "О совершенствовании пренатальной

диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у

детей"), обследование беременных женщин включает обязательное

трехкратное скрининговое ультразвуковое исследование: в срок 10 - 14

недель беременности, когда главным образом оценивается толщина

воротникового пространства плода; в 20-24 недели ультразвуковое

исследование осуществляется для выявления пороков развития и

эхографических маркеров хромосомных болезней; ультразвуковое

исследование в 32-34 недели проводится в целях выявления пороков

развития с поздним их проявлением, а также в целях функциональной оценки

состояния плода. В срок 16 - 20 недель осуществляется забор крови

беременных для определения у всех беременных женщин для проведения

исследования у них уровней не менее двух сывороточных маркеров:

альфафетопротеина (АФП) и хорионического гонадотропина человеческого

(ХГЧ). При этом инвазивная пренатальная диагностика, в частности,

показана:

24

- женщинам, у которых в процессе ультразвукового скрининга выявлены

нарушения в развитии плода: в сроке 10 - 14 недель толщина воротникового

пространства (ТВП) 3 мм и более; наличие врожденных пороков развития

(ВПР); эхографических маркеров хромосомных и других наследственных

болезней, аномальное количество околоплодных вод и другие случаи

поражения плода, а также беременные женщины с отклонениями в уровне

сывороточных маркеров крови;

- беременным в возрасте от 35 лет и старше; имеющим в анамнезе рождение

ребенка с ВПР, хромосомной или моногенной болезнью; с установленным

семейным носительством хромосомной аномалии.

На рисунке 1 приведены результаты выявления беременных с трисомией по

21-й хромосоме (синдром Дауна, СД), проводимого согласно данной

Инструкции в Санкт-Петербурге. Так, после проведения скрининга маркеров

сывороточных белков на сроке беременности 15-17 недель трисомия по 21-й

хромосоме с помощью инвазивных методов подтверждается лишь примерно

у 1 из 80 беременных. Это приводит к снижению доверия к результатам

скрининга и, как следствие, к значительному количеству отказов от

подтверждающей инвазивной диагностики, в том числе среди пациентов,

беременность которых заканчивается рождением больного ребенка. В

частности, от инвазивной пренатальной диагностики отказываются более

половины женщин, которые по результатам исследования сывороточных

белков во II триместре были отнесены к группе высокого риска

анеуплоидий [2].

25

Рисунок 1. Результаты проведения скрининга II триместра в Санкт-

Петербурге в 2009-2011гг [2].

1.5.2 Скрининг первого триместра

С 2009 года в России также внедряется порядок пренатального

обследования, впервые регламентированный Постановлением Правительства

Российской Федерации от 31.12.2009 №1159. В 2012 году Минздравом РФ

был издан приказ № 572н “Об утверждении Порядка оказания медицинской

помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением

использования вспомогательных репродуктивных технологий)”. Данным

приказом был установлен порядок проведения массового пренатального

скрининга I триместра. Приказ № 572н установил порядок проведения

массового скринига беременных для выявления хромосомной патологии –

сроки беременности для проведения исследования, перечень исследуемых

биохимических маркеров, установил критерии проведения УЗИ-

исследований, сроки проведения УЗИ. Согласно этому Порядку, при сроке

беременности 11-14 недель беременная женщина направляется в

26

медицинскую организацию, осуществляющую экспертный уровень

пренатальной диагностики, для проведения комплексной пренатальной

(дородовой) диагностики нарушений развития ребенка, включающей УЗИ

врачами-специалистами, прошедшими специальную подготовку и

имеющими допуск на проведение ультразвукового скринингового

обследования в I триместре, и определение материнских сывороточных

маркеров (связанного с беременностью плазменного протеина А (РАРР-А) и

свободной бета-субъединицы хорионического гонадотропина) с

последующим программным комплексным расчетом индивидуального риска

рождения ребенка с хромосомной патологией. При этом, при установлении у

беременной женщины высокого риска по хромосомным нарушениям у плода

(индивидуальный риск 1/100 и выше) в I триместре беременности и (или)

выявлении врожденных аномалий (пороков развития) у плода в I, II и III

триместрах беременности врач-акушер-гинеколог направляет ее в медико-

генетическую консультацию (центр) для медико-генетического

консультирования и установления или подтверждения пренатального

диагноза с использованием инвазивных методов обследования.

Установленный данным Порядком скрининг беременных с целью

выявления анеуплоидий у плода также основан на косвенных маркерах и

имеет ограничение по чувствительности и специфичности, колебания

биохимических показателей зависят как от хромосомного статуса плода, так

и от гормонального статуса беременной женщины. Введение скрининга I

триместра позволило значительно улучшить специфичность скрининга.

Однако, комбинированный скрининг I триместра (сочетание биохимических

маркеров с данными УЗИ), даже при четком соблюдении сроков

обследования, позволяет отнести в группу риска для последующего

проведения инвазивной диагностики около 80% беременностей плодами с

трисомией по 21-й хромосоме (см. рисунок 2) [3]. Данное ограничение

фактически непреодолимо и связано с тем, что метод является косвенным.

27

Рисунок 2. Результаты проведения скрининга I триместра в Московской области в 2011-2012гг [3].

Следует отменить, что в некоторых вопросах действующие приказы

№ 457 от 2000г и № 572н от 2012г прямо противоречат друг другу. Наиболее

важные из этих противоречий следующие:

1. Оба приказа предусматривают обязательное трехкратное

скрининговое ультразвуковое исследованием, однако в приказе № 457 от

2000 г сроки проведения ультразвукового исследования указываются как

10-14, 20-24 и 32-34 недели беременности, а в приказе № 572н от 2012 г

указываются другие сроки: 11-14, 18-21 и 30-34 недели.

2. Отличаются сроки проведения исследования уровней сывороточных

маркеров и сами маркеры. Согласно приказу № 457 от 2000 г в срок 16-20

недель беременности должен осуществляться забор проб крови у всех

беременных женщин для проведения исследования у них уровней не менее

двух сывороточных маркеров: альфафетопротеина (АФП) и хорионического

гонадотропина человеческого (ХГЧ), в то же время, согласно приказу № 572н

28

от 2012 г данное исследование не проводится, а при сроке беременности

11-14 недель проводится комплексная пренатальная (дородовая) диагностика

нарушений развития ребенка, включающая УЗИ врачами-специалистами и

определение материнских сывороточных маркеров (связанного с

беременностью плазменного протеина А и свободной бета-субъединицы

хорионического гонадотропина) с последующим программным комплексным

расчетом индивидуального риска рождения ребенка с хромосомной

патологией.

3. Отличаются показания для направления беременной женщины на

консультацию с целью решения вопроса о проведения инвазивной

пренатальной диагностики. Согласно приказу № 457 от 2000 г показаниями

для ее проведения являются: возраст матери 35 лет и старше; рождение в

семье ребенка с хромосомной патологией; носительство семейной

хромосомной аномалии; наличие у плода ВПР; наличие эхографических

признаков хромосомной патологии; отклонение уровней сывороточных

материнских маркеров АФП, ХГЧ и других. Согласно приказу № 572н от

2012 г. показаниями для проведения инвазивной пренатальной диагностике

являются установлении у беременной женщины высокого риска по

хромосомным нарушениям у плода (индивидуальный риск 1/100 и выше) в I

триместре беременности и (или) выявлении врожденных аномалий (пороков

развития) у плода в I, II и III триместрах беременности.

4. Оба приказа при пренатально диагностированных врожденных

аномалиях (пороках развития) у плода предусматривают проведение

консилиума врачей, однако состав консилиума в разных приказах

отличается: согласно приказу № 457 от 2000 г. при выявлении ВПР,

хромосомной или другой наследственной болезни у плода тактика ведения

беременности определяется консультативно, о чем делается запись в

медицинской документации беременной женщины. Консилиум должен

включать врача-генетика, врача ультразвуковой диагностики, врача акушера-

гинеколога, по показаниям-врача-неонатолога и других специалистов, а

29

согласно приказу № 572н от 2012 г в случае установления в медико-

генетической консультации (центре) пренатального диагноза врожденных

аномалий (пороков развития) у плода определение дальнейшей тактики

ведения беременности осуществляется перинатальным консилиумом врачей.

в который должны входить врач-акушер-гинеколог, врач-неонатолог и врач-

детский хирург.

Помимо указанных противоречий, ситуация усугубляется тем, что

приказ № 572н от 2012 г. определяет порог высокого риска по хромосомным

нарушениям у плода (и, соответственно, критерий обязательного

направления пациенток на инвазивную диагностику) как 1/100 и выше, а

зарегистрированная МЗ РФ и разрешенная к применению программа PRISCA

по умолчанию использует порог 1/250.

1.6 Неинвазивное выявление анеуплоидий по клеткам плода

В 70-90-е годы появились противоречивые сообщения о возможности

неинвазивной генетической диагностики по клеткам плода,

предположительно поступающим в материнский кровоток, а также в

различные отделы цервикального канала. Одни исследователи сообщали о

возможности подобной диагностики [30,31,32,33,36,42]. В то же время

другие не могли воспроизвести их результаты [34,37,43,44,45]. Однако,

несмотря на невоспроизводимость получаемых результатов, абсолютная

безопасность неинвазивного подхода для матери и плода позволяла

рассматривать его в качестве перспективного [29]. В связи с крайне низким

количеством циркулирующих в материнском кровотоке клеток плодового

происхождения, исследователями предлагались различные способы их

предварительного обогащения. Наиболее перспективными представлялись

сортировка с помощью магнитного поля - магнитно-активированная

клеточная сортировка (MACS) и флуоресцентно-активированная клеточная

сортировка (FACS) с применением моноклональных антител к

30

экспрессируемым на клеточной поверхности рецепторам [38,39,40]. Для

положительной флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (т.е.

обогащения исследуемого образца клетками плода) применялись, например,

положительная селекция с помощью моноклональных антител к

гликофорину A (GPA), трансферрину (CD71) с применением ДНК-

специфичного красителя Hoechst 33342, который может проникать в живые

клетки. Для обогащения клетками плода применялась и отрицательная

магнито-активированная клеточная сортировка, которая производилась,

например, с помощью панлейкоцитарных моноклональных антител анти-

CD45. Обогащение плодными клетками также производили и другими

методами, в т.ч., с помощью двухэтапного градиентного осаждения клеток

при центрифугировании в растворе фиколл-верографина. Для обогащения

культуры лимфоцитов периферической крови беременных женщин

лимфоцитами плода применялись специальные методы культивирования,

например, “воздушное” культивирование ("air-culture" cytogenetic

technique) [41]. При этом для детекции плодных клеток обычно

использовался метод FISH с хромосомо-специфичными ДНК-зондами, чаще

всего на 13, 18, 21, Х и Y хромосомы. Применение этих методов позволило

доказать наличие клеток плода в материнском кровотоке и определить их

количество (1 ядерная клетка плода на 105-108 ядерных материнских клеток),

а также продемонстрировать потенциальную возможность применения

методов в клинической практике для проведения неинвазивного

пренатального скрининга анеуплоидий. При этом наиболее значимые

результаты были получены при использовании флуоресцентно-

активированной клеточной сортировки на проточном цитофлюориметре.

Несмотря на потенциальные возможности, широкое применение

методов выявления анеуплоидий по ядросодержащим клеткам плода в крови

матери в клинической практике не произошло. В основном это было связано

с крайне низким содержанием плодных клеток в исследуемых образцах, а

также с нахождением выявляемых клеток на разных стадиях апоптоза, что

31

делает их непригодными для исследования. Исследователи указывали также,

что часть клеток плода может циркулировать в материнском кровотоке и

после беременности и это может влиять на результаты, получаемые при

повторной беременности [35].

В настоящее время отдельные попытки использовать для неинвазивной

пренатальной диагностики ядросодержащие клетки плода не прекращаются.

Современные авторы предлагают использование ядросодержащих

эритроцитов плода [46], клеток трофобласта [47], а также одновременное

использование и ядросодержащих эритроцитов, и клеток трофобласта [48].

Описываемая эффективность современных методов обогащения с

применением моноклональных антител позволяет выделить из 4 мл крови

матери 14-22 ядросодержащих эритроцита и 1-44 клетки трофобласта, общая

эффективность составляет 2,38 - 7,25 клеток из 1 мл крови матери. Для

исследования полученного материала авторами предлагается применение

полногеномной амплификации, которая позволяет из единичных клеток

плода получить 50 мкл ДНК в концетрации 290-844 нг/мкл. Полученную

ДНК авторы предлагают анализировать с помощью STR, с применением

молекулярного кариотипирования методом сравнительной геномной

гибридизации (aCGH), либо с помощью высокопроизводительного

секвенирования [48].

1.7 Выявление анеуплоидий по внеклеточной ДНК в крови матери

1.7.1 История открытия внеклеточной ДНК

В 1995 году группа российских авторов (Казаков В.И. с соавт.) обратила

внимание на внеклеточную ДНК, циркулирующую в крови беременных

женщин, однако их публикация осталась незамеченной [49]. В 1997 году

группой авторов под руководством Dennis Lo было предложено исследовать

не клетки плода, а циркулирующую в кровотоке матери свободную,

32

внеклеточную ДНК плода для проведения неинвазивной пренатальной

диагностики [50]. При этом относительная концентрация внеклеточной ДНК

плода по отношению к внеклеточной ДНК матери в плазме материнской

крови оказалась существенно выше, чем относительная концентрация

геномной ДНК плода в клеточной фракции [51]. В среднем концентрация

внеклеточной ДНК плода составляет 10-12% от общей ДНК в плазме крови

матери. Было установлено, что свободная ДНК представляет собой короткие

двухцепочечные сильно фрагментировые участки ДНК, их длина составляет

менее 200 п.н. [52]. Немаловажным оказалось и то, что фрагменты

фетальной ДНК равномерно представляют геном плода, а выводятся из

организма матери непосредственно после родов [53]. Это позволило

предположить, что ДНК плода в периферической крови матери может стать

удачной альтернативой применению методов выявления анеуплоидий по

ядросодержащим клеткам плода.

Следует отметить, что впервые об обнаружении внеклеточной ДНК в

человеческой плазме крови стало известно уже в середине 20 века, еще до

открытия структуры ДНК Уотсоном и Криком [54]. Это не было оценено по

достоинству вплоть до того, когда повышенный уровень внеклеточной ДНК

был выявлен в 1960-х годах у больных с системной красной волчанкой, а

позднее - у онкологических больных [55].

1.7.2 Происхождение и характеристики материнской внеклеточной ДНК

Внеклеточные нуклеиновые кислоты содержатся не только в

периферической крови, но и в других жидкостях организма (в

спинномозговой жидкости, лимфе, желчи, моче, мокроте и т.д.), они

представлены помимо геномной также митохондриальной ДНК, вирусной

ДНК и РНК, информационной РНК, микроРНК. Концентрация свободной

ДНК у здоровых доноров находится в пределах 10-100 нг/мл

плазмы/сыворотки. Изменение концентрации внеклеточной ДНК может быть

33

ассоциировано с развитием онкозаболеваний, а также связано с физическими

нагрузками, травмами, инфекционными заболеваниями, инсультом,

инфарктом, беременностью [56].

Внеклеточная ДНК содержится в жидкостях организма во внеклеточных

визикулах (в виде апоптозных телец, микрочастиц, микровезикул и экзосом),

в виде комплексов ДНК с гистонами или нуклеосом, ДНК/РНК-

липопротеинового комплекса (виртосом) [57].

По мнению одних исследователей, основной причиной появления

внеклеточной ДНК является некроз тканей [58,59]. По версии других -

апоптоз, в пользу этой версии говорит размер фрагментов ДНК,

детектируемых в плазме [60,61]. Некроз и апоптоз - два различных вида

гибели клеток. Некроз вызывает насильственная гибель от повреждения,

апоптоз - запрограммированная клеточная смерть. Некроз распространен

значительно меньше, чем апоптоз и может индуцироваться тяжелыми

необратимыми повреждениями, такими как инфаркт, высокие дозы

ионизирующего излучения, воздействие повреждающих клеточную

мембрану веществ, блокировка энергетических процессов в клетке. Некроз

характеризуется конденсацией хроматина, увеличением размера клетки с ее

последующим лизисом. По всей вероятности, в здоровом организме

появление свободной ДНК во внеклеточных жидкостях связано с процессом

апоптотической гибели клеток, который начинает регистрироваться с

раннего эмбриогенеза. Некроз клеток, как источник свободной ДНК, по-

видимому, имеет в этом случае минимальное значение. [62].

Предполагается, что в норме основным источником внеклеточной ДНК

являются гемопоэтические клетки, клетки иммунной системы. Ежедневно в

организме взрослого человека вступают в деление примерно 1011-1012 клеток,

такое же количество клеток должно подвергаться апоптозу. Помимо этого, в

организме человека каждый день продуцируется 1011 эритротцитов, и

энуклеированные ядра становятся потенциальным источником свободной

ДНК в случае нарушения механизмов ее деградации в макрофагах,

34

непосредственно участвующих в фагоцитозе этих ядер. Описано влияние на

уровень внеклеточной ДНК ферментов нуклеаз, изменение активности

которых и связанное с этим изменение уровней внеклеточной ДНК

установлено при разных патологиях [63].

Молекулярные пути, ведущие к индукции апоптоза, разделяют на два: на

внешний и внутренний. Внешний путь апоптоза ведет к гибели клетки,

индуцированной внеклеточными сигналами, обусловленными связыванием

лигандов со специфическими трансмембранными рецепторами,

называемыми рецепторами смерти, которые относятся к семейству TNF/NGF.

Внутренний апоптоз представляет собой ответ клеток на ряд стрессирующих

условий, включающих повреждение ДНК, оксидативный стресс и многие

другие факторы. Так или иначе, но оба эти пути апоптоза связаны с запуском

ферментного каспазного каскада, активация которого и обуславливает

процессы конечных стадий апоптоза (каспазы представляют собой

цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные

последовательности) [64].

Деградация клеточной (хромосомной) ДНК в процессе апоптоза клеток

проходит две стадии: сначала ДНК расщепляется в нуклеосомных единицах

апоптотических клеток ферментом ДНКазой, активированной каспазой;

после поглощения макрофагами апоптотических клеток ДНК деградирует до

нуклеотидов в лизосомах с помощью фермента ДНКазы II. Последний

отвечает также за деградацию ДНК из эритроидных предшественников в

костном мозге и фетальной печени, что в случае фетальной печени

свидетельствует о наличии апоптоза в эмбриогенезе, когда печень является

ярко выраженным гемопоэтическим органом [65].

Сложно переоценить значение патогенетической роли апоптоза. По-

видимому, все основные заболевания человека (атеросклероз,

онкологические, нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания и др.) в

большей или меньшей степени связаны с нарушениями в механизмах

апоптоза клеток, либо с увеличением, либо с уменьшением его

35

интенсивности. Несомненно, что нарушения эти напрямую будут связаны с

нарушениями в механизмах удаления продуктов клеточной гибели, т.е. с

фагоцитарной активностью разных клеточных элементов.

Имеющиеся данные свидетельствуют об активном участии макрофагов

в процессах фагоцитирования клеток, погибающих в результате апоптоза или

некроза. При этом оказалось, что погибающие клетки не пассивно

высвобождают ДНК в циркуляцию, а для этого необходимо активное

взаимодействие клеток с макрофагами. Показано, что в условиях in vitro без

макрофагов некротические клетки вообще не высвобождают ДНК в

свободном виде. Можно предположить, что в отсутствие макрофагов или при

их нарушенной функции клеточные материалы перевариваются не

полностью, и та же ДНК может находиться в составе нуклеосом. С другой

стороны, при определенных количественных взаимоотношениях между

макрофагами и некротическими (или апоптотическими) клетками макрофаги

сами подвергаются апоптозу, что и может стать причиной отсутствия

механизмов расщепления ДНК и появления ее в свободном виде [66].

Причиной гибели макрофагов может стать фагоцитоз макрофагами

бактерий с последующим подъемом уровня внеклеточной ДНК [67]. По

крайней мере, следует признать за устоявшийся факт, что появление

внеклеточной ДНК является результатом не просто апоптоза или некроза

клеток, а результатом активного взаимодействия клеток с макрофагами с

последующим появлением в циркуляции их внеклеточной ДНК. Возможно, с

активностью макрофагов связаны различные размеры внеклеточной ДНК,

которые значительно меньше у внеклеточной ДНК из апоптотических

клеток, чем из некротических [60].

1.7.3 Происхождение и характеристики плодовой внеклеточной ДНК

Источником плодовой внеклеточной ДНК в периферической крови

беременных является апоптоз клеток трофобласта, плаценты и

36

гемопоэтических клеток плода [68,69,70]. При этом циркулирующая в

материнском кровотоке плодовая ДНК представлена фрагментами длиной

100-160 п.н., что в среднем на 20 п.н. короче, чем фрагменты внеклеточной

ДНК материнского происхождения [71]. Как оказалось, размер внеклеточной

ДНК как плодового, так и материнского происхождения кратен размеру

витка вокруг нуклеосомы, что убедительно подтверждает теорию

апоптотического происхождения внеклеточной ДНК, а также позволяет

объяснить разницу в их длине [72]. Зависимость длин фрагментов

внеклеточной ДНК от структуры нуклеосом представлена на рисунке 3.

Рисунок 3. Распределение фрагментов ДНК по размерам.

ДНК плода обозначена синей линией, общая ДНК - красной,

митохондриальная ДНК - зеленая пунктирная линия. Числа над пиками

обозначают размер ДНК в парах нуклеотидов. Над графиком приведено

схематическое изображение структурной организации нуклеосомы. Слева

37

направо показана двойная спираль ДНК вокруг нуклеосомного ядра с

сайтами расщепления нуклеазами; ядра нуклеосом с накрученной вокруг них

молекулой ДНК. Эти данные свидетельствуют о том, что фрагменты

внеклеточной ДНК образуются в результате ферментативной обработки ДНК

апоптотических клеток, а не в следствие некроза [72].

Фетальная ДНК начинает определяться в крови матери, начиная с 5-й

недели беременности, при этом её доля в общей массе внеклеточной ДНК

может зависеть от множества факторов [73,74]. Содержание фетальной ДНК

возрастает на протяжении всей беременности. В исследовании более 22 тыс.

образцов плазмы крови беременных с одноплодной беременностью,

полученных на разных сроках гестации, было показано, что с 10-й по 20-ю

неделю беременности внеклеточная ДНК в среднем содержит 10% ДНК

плода и доля фетальной ДНК увеличивается на 0,1% в неделю; начиная с

21-й недели, она растет в среднем уже на 1% в неделю [75]. Также доля

фетальной ДНК отрицательно коррелирует с весом матери. Было показано,

что в среднем для матери с весом в 60 кг доля фетальной ДНК составляет

12%, в то время как при весе 120 кг - только 6% [73]. Это может быть связано

с ростом концентрации внеклеточной ДНК в кровотоке по мере увеличения

веса матери, при том, что количество ДНК плода остается на прежнем

уровне. Полагают, что увеличение количества материнской ДНК происходит

по причине повышения уровня смертности клеток жировой ткани и

макрофагов в результате метаболической и иммунологической дисфункции

[76]. Другим объяснением может быть разведение плодовой ДНК, связанное

с увеличением объема крови матери [75]. Содержание ДНК плода в крови

матери снижается также после физических нагрузок, предположительно за

счет увеличения количества материнской ДНК, связанного с процессами

механического повреждения мышц, а также с повреждением ДНК в

результате окислительного стресса [71, 77].

Было показано, что на сроке 11-13 недель беременности, в среднем по

популяции медианное значение концентрации фетальной ДНК составляет

38

11,4%, при этом значительной разницы для случаев с нормальной

беременностью и для плода с трисомией не наблюдается [73, 75]. Доля

фетальной ДНК не зависит от возраста, национальности, курения, пола

плода, а также продолжительности хранения плазмы после её получения [73].

1.7.4 Определение доли плодовой ДНК

Наличие фоновой материнской ДНК значительно затрудняет анализ

плодовой ДНК в крови матери. Поэтому крайне важно установить её долю

относительно доли ДНК матери в каждом конкретном случае. Это позволяет

оценить достоверность получаемых в ходе исследования клинических

результатов и позволяет избежать ложноотрицательных результатов. Как

отмечалось выше, доля плодовой ДНК положительно коррелирует со сроком

гестации и отрицательно с весом матери [70]. Cнижение достоверности

получаемых результатов при выявлении трисомий у плода обычно

наблюдается при содержании доли плодовой ДНК менее 4%, при этом с 10

по 20 неделю беременности менее 4% плодовой ДНК содержат примерно 2%

образцов [78]. Такие образцы требуют повторного забора крови на более

поздних сроках гестации. Было показано, что при повторном заборе крови (в

среднем интервал между двумя заборами составлял 27 дней) доля плодовой

ДНК увеличивается в среднем на 1% и для более половины образцов

составляет выше 4% [75].

Для установления доли плодовой ДНК могут применяться локусы

ДНК, которые имеются у плода и отсутствуют у матери. Например, такими

локусами могут быть локусы хромосомы Y при беременности плодом

мужского пола или ген RHD (Rhesus D) у беременной с резус-отрицательной

принадлежностью крови. Определение наличия Y хромосомы и гена RHD

часто применяется в клинической практике, однако таким способом можно

определить концентрацию плодовой ДНК лишь у половины беременных

[79,80,81]. Поэтому разрабатываются и другие способы установления доли

39

плодовой ДНК в материнском кровотоке, не зависящие от пола и резус-

фактора плода, которые также основаны на обнаружении различий между

ДНК матери и плода. Одним из методов является определение доли ДНК

плода на основании профиля метилирования. Метод основан на

эпигенетических различиях между плодовой и материнской ДНК, а именно

на различиях в метилировании ДНК матери и плода. В качестве маркеров

используются гиперметилированные гены у плода и гипометилированные у

матери, что позволяет использовать чувствительные к метилированию

рестриктазы, которые специфично разрушают неметилированную ДНК

матери и не действуют на гиперметилированную ДНК плода. После

обработки данным ферментом становится возможной специфичная детекция

свободной ДНК плода методом ПЦР реального времени [82,83,84]. К другим

способам относятся выявление унаследованных от отца мутаций, анализ

полиморфизма тандемных повторов [85,86]. Также рассматривается

принципиальная возможность установления доли плодовой ДНК с

использованием информации о длине фрагментов внеклеточной ДНК [72,87].

Следует отметить, что разделение материнской и плодовой ДНК в основном

имеет значение только для установления доли плодовой ДНК, для

определения изменения количества копий хромосом разделение материнской

и плодовой ДНК обычно не требуется. Однако, т.к. без установления доли

плодовой ДНК невозможно оценить достоверность получаемых результатов,

разработка надежных способов определения доли плодовой ДНК вне

зависимости от пола плода и их валидация продолжают оставаться крайне

актуальными задачами.

1.7.5 Исследование внеклеточной ДНК с применением цифровой ПЦР

Первые попытки использовать внеклеточную ДНК для определения

анеуплоидий у плода были предприняты в 2007 году с использованием

цифровой ПЦР (Digital PCR) [88]. В отличие от стандартной количественной

40

ПЦР, которая проходит в едином реакционном объеме, для проведения

цифровой ПЦР образец с помощью специального прибора случайным

образом разделяют на большое количество изолированных

микрокомпартментов, так называемых микрореакторов. Для выявления

анеуплоидии с помощью цифровой ПЦР могут применяться различные

подходы:

- измерение соотношения представленности однонуклеотидных

полиморфизмов с высокой гетерозиготностью, находящихся на конкретной

хромосоме. Применимость этого метода зависит от генотипа матери;

- cравнение представленности неполиморфных локусов, находящихся

на разных хромосомах. В этом случае удается избежать ограничений,

связанных с генотипом матери;

- использование эпигенетических маркеров, позволяющих отличить

плодовую свободноциркулирующую ДНК от ДНК матери.

Помимо этого, возможна комбинация различных подходов. Однако, в

настоящее время метод выявления анеуплоидий плода по крови матери с

помощью цифровой ПЦР имеет только теоретическое значение, т.к. не

применяется на практике.

1.7.6 Полногеномное высокопроизводительное секвенирование

Появление методов высокопроизводительного секвенирования (next

generation sequencing, NGS), ставшее возможным благодаря появлению

методов, позволяющих одновременно определять последовательности

(секвенировать) миллионы фрагментов ДНК, что позволило открыть в

научных и клинических исследованиях в области выявления анеуплоидий у

плода по крови матери новую эру, как в исследовательском, так и в

практическом направлении [89]. Применяемые при высокопроизводительном

секвенировании технологии способны одновременно анализировать

отдельные молекулы ДНК, независимо друг от друга.

41

Высокопроизводительное секвенирование, в отличие от цифровой ПЦР, не

требует априорных знаний об исследуемых последовательностях и позволяет

использовать информацию от всех последовательностей внеклеточной ДНК в

крови беременной. Первым из использованных методов скрининга

анеуплоидий, стал прямой подход, основанный на секвенировании всей

внеклеточной ДНК плазмы крови беременной женщины с последующим

биоинформационным анализом данных [90].

Данный полногеномный подход основан на подсчете секвенированных в

ходе проведения исследования фрагментов (ридов), приходящихся на

каждую из хромосом и сравнения с аналогичными данными, имеющимися

для референсного набора хромосом. Например, при доле плодовой ДНК 5%

среди всей ДНК, в случае трисомии у плода по какой-либо хромосоме мы

увидим увеличение числа фрагментов, относящихся к соответствующей

хромосоме на 2,5%. Разбросы доли фрагментов, приходящихся на каждую

хромосому для референсных образцов, зависят от конкретной хромосомы и

ее GC состава. В ряде случаев возникает значительное искажение величины

покрытия в зависимости от GC состава участка хромосомы. Для того чтобы

уменьшить вариабельность данных связанных с этим эффектом применяются

статистические модели, позволяющие скорректировать полученное покрытие

с учетом GC состава фрагмента. У 13, 18 и 21 хромосом, исследование

которых представляет особый интерес, разброс в значениях покрытия

относительно небольшой. Помимо простого подсчета количества

фрагментов, приходящихся на каждую из хромосом, можно дополнительно

учитывать информацию о размере секвенированного фрагмента ДНК. Это

возможно благодаря тому, что распределение длин внеклеточной ДНК

материнского и плодового происхождения, как указывалось выше,

отличается между собой [71,72,91,92]. Схема проведения исследования при

подобном комбинированном подходе представлена на рисунке 4.

42

Рисунок 4. Определение анеуплоидий плода с помощью полногеномного подхода. Секвенируются фрагменты внеклеточной ДНК крови матери, учитывается разница в длине у фрагментов плодовой и материнской ДНК. В качестве примера представлена частичная анеуплоидия хромосомы 2 [92].

43

Вне зависимости от используемой платформы, для дальнейшего

секвенирования необходимо приготовление библиотек, т.е. совокупности

фрагментов ДНК, относящихся к одному биологическому образцу,

модифицированных соответствующим для применяемого метода образом.

Одним из этапов обычно является фрагментация ДНК. Однако,

приготовление библиотек при исследовании внеклеточной ДНК не требует

предварительного разрушения ДНК, т.к. внеклеточная ДНК уже находится в

сильно фрагментированном состоянии. После этапа лигирования адаптеров

проводится этап амплификации ДНК для достижения необходимого для

секвенирования количества материала (обычно изначального количества

ДНК недостаточно), затем этап клональной амплификации ДНК на

микросферах/твердой подложке, для получения достаточного сигнала от

каждой молекулы [94]. Применимость основных платформ

высокопроизводительного секвенирования для ДНК-скрининга показана

рядом авторов [90,95,96,97,98]. Два основных подхода, которые широко

используются при ДНК-скрининге (полногеномное и таргетное

секвенирование) представлены на рисунке 5. При полногеномном подходе

секвенируются все попавшие в образец молекулы ДНК, при таргетном

подходе секвенирование производится выборочно. Изображены

полногеномное и таргетное секвенирование. A. Полногеномное

секвенирование использует статистический подсчет ридов, производимый с

помощью эталонного (референсного) генома человека. B. При таргентном

секвенировании анализируются конкретные локусы с однонуклетидными

полиморфизмами (SNP; красные и синие звездочки). Материнские генотипы

используются для моделирования распределений аллелей для каждого

варианта плоидности и основаны на фактическом распределении SNP, расчет

производится на основе учёта вероятности каждой гипотезы. C. В

альтернативном подходе таргетного секвенирования выбранные фрагменты

обогащаются и сопостовляются с геномом человека. Соотношения хромосом

рассчитываются с помощью статистических методов [98].

44

Рисунок 5. Основные подходы, которые используются при ДНК-скрининге.

1.7.7 Алгоритмы анализа данных

Из алгоритмов анализа данных, используемых при полногеномном

секвенировании внеклеточной ДНК с целью выявления хромосомных анеуплоидий

у плода, наиболее известным алгоритмом является расчет параметра Z для

каждой исследуемой хромосомы [95,97]. Этот подход основан на

предположении, что доля фрагментов, приходящихся на каждую из

хромосом, пропорциональна их исходному количеству и распределение

45

значения доли фрагментов, приходящихся на каждую из хромосом, является

нормальным для образцов без анеуплоидии. Исходя из свойств нормального

распределения для большинства эуплоидных образцов (более 99%) значения

Z будут лежать в интервале (-3,3). При значении |Z| > 3 более вероятным

является предположение о том, что полученное значение не принадлежит к

выборке нормальных образцов и верна гипотеза о наличии у плода

анеуплоидии. Допускается существование интервала значений, при котором

риск наличия анеуплоидий не определен, например при 2,5 < |Z| < 3. Данный

подход не учитывает возможность наличия нестандартного количества

копий отдельных фрагментов ДНК у самой матери, что может приводить к

ложноположительным результатам, поэтому дополнительно анализируется

не только Z для каждой хромосомы, но и Z для фрагментов длиной 5

млн.п.н. с шагом 50 тыс.п.н. Сравнение Z для всей хромосомы и медианы

значений для отдельных фрагментов хромосомы позволяет выявлять случаи

ложноположительных результатов. Помимо этого, поскольку эффективность

секвенирования отдельных фрагментов ДНК в значительной степени зависит

от их GC состава, на этапе анализа данных проводят GC-коррекцию. Другой

подход, используемый для определения риска наличия анеуплоидий -

сравнение покрытия проверяемой хромосомы с покрытием остальных

хромосом внутри образца и проверка статистической значимости

обнаруженных отличий с использованием критерия Стьюдента (T-test) [96].

Алгоритм анализа данных представлен на рисунке 6.

46

Рисунок 6. Алгоритм анализа данных при ДНК-скрининге с применением полногеномного высокопроизводительного секвенирования.

Преимуществом полногеномного подхода является возможность

исследования всего генома, а не отдельных хромосом, что позволяет выявить

анеуплоидии по любой хромосоме. Также немаловажным является

способность данного подхода без дополнительных модификаций процесса

пробоподготовки выявлять частичные анеуплоидии размером в несколько

миллионов пар нуклеотидов. Выявляемые при этом нестандартные

анеуплоидии в ряде случаев могут являться проявлением плацентарного

мозаицизма и применяться как маркеры возможного осложнения

беременности, задержки развития плода, а также угрозы раннего прерывания

беременности. Также они могут свидетельствовать о наличии начальных

47

стадий некоторых онкологических заболеваний. Одними из самых

актуальных задач, стоящих перед исследователями в настоящее время

являются выяснение причин ложноположительных результатов, особенно

часто встречающихся при выявлении нарушений по половым хромосомам, а

также разработка способов минимизации подобных случаев.

К недостаткам полногеномного подхода относится невозможность

выявления кратного нарушения хромосомного набора - триплоидии. Однако,

триплоидии практически не встречаются среди живорождённых детей.

Обычно они являются причиной гибели эмбриона на ранней стадии развития,

а если плод и доживает до срока более 10-11 недель беременности, то имеет

многочисленные врожденные дефекты, которые легко выявляются с

помощью ультразвукового исследования.

1.7.8 Таргетное секвенирование

Альтернативой полногеномному подходу является таргетное

секвенирование (от “target” – мишень, цель). Подобные методы

разрабатываются в первую очередь для удешевления исследования и

основаны на выборочном, “прицельном” секвенировании отдельных

хромосом. В настоящее время опубликовано и используется в клинической

практике два варианта таргетного подхода.

Первый подход разработан компанией Ariosa Diagnostics Inc., США (в

2014 году о приобретении Ariosa Diagnostics Inc. сообщила швейцарская

фармацевтическая компания Roche) и основан на выборочной амплификации

и последующем секвенировании ограниченного числа локусов на каждой

хромосоме, назван авторами цифровым анализом отдельных регионов (digital

analysis of selected regions DANSR™) [99]. Для определения наличия

анеуплоидий, разработаны олигонуклеотиды специфичные 384 локусам на

каждой из исследуемых хромосом, с помощью которых в одной пробирке

амплифицируются целевые регионы, после чего проводится сравнение

48

покрытия локусов на исследуемых (21, 18, 13 и т.д.) хромосомах с покрытием

на всех остальных хромосомах. Достоверность определяется путем подсчета

Z-score. Для увеличения точности, помимо неполиморфных локусов,

секвенируется небольшое количество полиморфных локусов, позволяющих

оценивать долю плодовой ДНК, и проводить оценку наличия анеуплоидий с

учетом этой информации [100]. После валидации определения наличия

анеуплоидий методом NGS авторы перешли к использованию микрочипов

[101,102], что позволяет снизить стоимость проведения исследования.

Второй вариант таргетного подхода предложен компанией Natera Inc.,

США (ранее - Gene Security Network) и основан на секвенировании

однонуклотидных полиморфных локусов (SNP) [103,104]. После

амплификации с помощью мультилексной ПЦР примерно 20 000 локусов

SNP, проводится секвенирование и подсчет представленности различных

аллелей в плазме крови беременной. Дополнительно к этому, проводится

секвенирование генома самой матери с помощью клеточной ДНК, а также,

при возможности, и генома отца. При расчетах используется технология

собственной разработки Parental SupportTM, которая использует полученную

информацию о генотипе родителей в сочетании с данными международного

проекта HapMap (сокращение от Haplotype Map, проект направлен на

разработку гаплотипа генома человека). С помощью данных о генотипе

родителей и данных о частоте встречаемости различных гаплотипов

проводится компьютерное моделирование миллиардов различных вариантов

генотипа плода, после чего выбирается наиболее достоверная модель.

Применение полиморфных локусов SNP позволяет выявлять как

триплоидию, так и случаи спонтанной редукции одного из эмбрионов, а при

наличии материала отца - повышать точность анализа и снижать минимально

необходимое содержание плодовой ДНК. Заявляется, что это позволяет

проводить анализ уже с 9 недель беременности [105]. При таргетном подходе

снижается объем секвенирования по сравнению с полногеномным подходом,

что уменьшает себестоимость исследования и позволяет увеличить

49

количество исследуемых одновременно образцов. Однако, при

необходимости исследования дополнительных локусов ДНК требуется

разработка новых диагностических наборов. Также особенностью метода

является необходимость знать генотипы родителей (как минимум генотип

матери), чтобы выбрать полиморфизмы, подходящие для анализа по

аллельной частоте и отделить реальные полиморфизмы от ошибок

секвенирования.

1.7.9 Биологические ограничения ДНК-скрининга

Как уже указывалось, наиболее вероятным источником плодовой ДНК в

кровотоке матери являются клетки оболочек плода – трофобласта и

плаценты. При этом еще в 1983 г. стало известно о возможном

несоответствии между кариотипом оболочек плода и самого плода, т.е.

плацентарном мозаицизме [106]. Несоответствие кариотипа плода с

результатами, полученными после проведения процедуры биопсии ворсин

хориона (ограниченный плацентарный мозаицизм), как выяснилось в

дальнейшем, явление не редкое, оно наблюдается в 1-2% случаев

[1,107,108,109]. Подобный мозаицизм может являться причиной

ложноположительных результатов при проведении ДНК-скрининга

[110,111]. Наличие анеуплоидных клеток и в тканях плода (в мозаичной или

полной форме), и в плаценте подтверждается в 10-11% ограниченного

плацентарного мозаицизма [107]. Причиной мозаицизма могут являться

нарушения как в митозе, так и в мейозе. В первом случае зигота имеет

нормальный кариотип, а нарушения числа хромосом возникают в процессе

последующих делений. В этом случае обычно в плаценте наблюдаются

отдельные участки с трисомиями, при этом плод имеет нормальный кариотип

(моносомные по аутосомам клетки обычно элиминируются). Во втором

случае изначально зигота имеет трисомный кариотип, а в процессе

эмбриогенеза происходит элиминация лишней хромосомы. При этом

50

наблюдается высокая степень мозаицизма или же полная трисомия плаценты.

Плод может иметь как нормальный, так и мозаичный кариотип. В случае

нормального кариотипа плода есть риск возникновения однородительской

дисомии, что может приводить в дальнейшем к проявлению болезней

импринтинга. В любом случае, мозаицизм плаценты может приводить как к

ложноположительным, так и ложноотрицательным результатам ДНК-

скрининга, в зависимости от распределения нормальных и анеуплоидных

клеток между плодом и плацентой. Возможные варианты мозаицизма

представлены на рисунке 7 [112].

Рисунок 7. Возможные варианты плацентарного мозаицизма. Здоровые клетки представлены на рисунке белым цветом [112].

Другой возможной причиной ложноположительных результатов при

ДНК-скрининге может являться спонтанная редукция одного из эмбрионов

при изначально многоплодной беременности (“проблема исчезающего

близнеца”). Подобное встречается примерно в 0,18% случаев [113]. Наличие

информации о редукции эмбриона необходимо как для принятия решения о

51

целесообразности проведения ДНК-скрининга, так и при интерпретации

полученных результатов, поэтому детальное проведение УЗИ, а также

тщательный сбор анамнеза, включающий сбор информации о проводимых

ранее УЗИ, может иметь в этих случаях важное значение.

На результаты ДНК-скрининга может повлиять и нестандартный

кариотип в клетках крови самой матери, например, он сам может оказаться

мозаичным по количеству хромосом Х [114]. Отмечается, что частота

изменения числа копий хромосомы Х у женщин имеет тенденцию

увеличиваться с возрастом [115]. Целесообразность цитогенетического

исследования самой матери при положительных результатах ДНК-скрининга

дискутируется. Высказывается мнение, что иногда это может помочь

избежать инвазивной процедуры [114].

Источником как ложноположительных, так и ложноотрицательных

результатов могут оказаться так же и крупные вариации числа копий в

геноме матери [114,116]. Эту проблему в большинстве случаев решает

усовершенствование алгоритмов анализа.

Крупными хромосомными перестройками и анеуплоидиями часто

сопровождаются опухолевые процессы. При этом иногда внеклеточная ДНК

опухолевых тканей может составлять самую значительную часть

циркулирующей в крови матери внеклеточной ДНК, что может приводить к

ложноположительным результатам ДНК-скрининга [117]. Если заранее

известно о наличии в организме матери опухолевых процессов, то от

проведения ДНК-скрининга целесообразно отказаться.

Ложноотрицательные результаты могут быть получены при слишком

низкой доле плодовой ДНК в крови матери. Получаемые в этом случае

результаты оказываются невалидными и не должны выдаваться пациенту. С

целью избегания подобных случаев и увеличения точности ДНК-скрининга,

проводимое исследование обязательно должно включать в себя определение

доли плодовой ДНК [100,104,118].

52

Наличие биологических причин ложноположительных и

ложноотрицательных результатов исследования не позволяет полностью

исключить наличие анеуплоидий при отрицательных результатах НИПС, а

также требует обязательного проведения подтверждающих инвазивных

процедур в случае положительных результатов ДНК-скрининга. Одной из

актуальных задач на сегодняшний день является разработка способов

минимизации влияния нестандартнго кариотипа самой матери на получаемые

в ходе исследования результаты.

1.7.10 Выявление риска анеуплоидий по половым хромосомам

При применении НИПС в широкой клинической практике неожиданно

обнаружилось, что результаты с выявленным высоким риском анеуплоидий

по хромосоме Х зачастую оказываются ложноположительными, т.е.

впоследствии не подтверждаются. Доля ложноположительных результатов

оказалась значительно выше, чем изначально было показано в клинических

испытаниях [128,129,130]. Сообщается, что у женщин с низким риском

анеуплоидий по данным комбинированного скрининга, доля

ложноположительных результатов моносомии по хромосоме Х при

проведении НИПС достигает 90% [131]. Данное явление может быть связано

как с мозаицизмом плода и плаценты, так и с нестандартным кариотипом

самой беременной женщины. Кроме того, процент ложноположительных

результатов в значительной степени может зависеть от применяемого

алгоритма анализа - точности оценки доли плодовой ДНК в целом и ее

сопоставление с долей плодовой ДНК по хромосоме Х. В связи с

возникающими проблемами, ряд проводящих НИПС организаций

отказываются определять риск анеуплоидии по хромосоме Х.

53

1.7.11 Выявление риска редких анеуплоидий

Применение при проведении ДНК-скрининга полногеномного подхода

позволяет выявлять не только риск анеуплоидий по хромосомам 21, 18, 13 и

нарушения по числу половых хромосом, но также и анеуплоидии по другим

хромосомам [132,133]. Как известно, на ранних этапах эмбрионального

развития встречаются анеуплоидии с вовлечением практически всех

хромосом [12]. И хотя до срока проведения НИПС большинство

анеуплоидных эмбрионов элиминируется, обследование получаемого на

сроках беременности выше 10-11 недель абортивного материала показало,

что при неразвивающихся беременностях наблюдаются анеуплоидии не

только по 21, 18, 13 и половым хромосомам, но и по целому ряду других

хромосом [134]. Подобные анеуплоидии считаются редкими для этих сроков

беременности. В связи с тем, что некоторые решения для НИПС являются

таргетными и не позволяют выявлять наличие редких анеуплоидий, а

компании, которые предлагают пациентам услуги по проведению ДНК-

скрининга не всегда могут отследить исходы беременностей, встречаются

только единичные сообщения о выявлении с помощью НИПС редких

анеуплоидий. Зачастую, даже если с помощью ДНК-скрининга редкие

анеуплоидии и выявляются, информация о них не сообщается пациентам.

Американским обществом акушеров-гинекологов проведение ДНК-

скрининга редких анеуплоидий на текущий момент не рекомендовано [127].

В случае обнаружения риска наличия редкой анеуплоидии возможен

вариант плацентарного мозаицизма, когда анеуплоидными являются только

клетки плаценты. При этом у плода может наблюдаться однородительская

дисомия [135]. В этом случае происходит наследование обеих копий всей

хромосомы или ее части от одного из родителей, что может приводить к

болезням импринтинга, например, к синдромам Прадера-Вилли и

Ангельмана [136]. Также из-за потери гетерозиготности возможно

проявление рецессивных моногенных заболеваний. Проведенными

54

исследованиями продемонстрировано, что способ возникновения редких

анеуплоидий в плаценте и вероятность однородительской дисомии у плода

зависят от конкретной хромосомы, вовлеченной в анеуплоидию [137].

Например, риск однородительской дисомии составляет не более 10% для

16-й хромосомы, для других хромосом он ниже. Однако, эти данные

получены посредством исследования материала биопсии хориона, которое

позволяет выявлять всего 5% анеуплоидных клеток. Доля анеуплоидных

клеток, необходимая для детекции с использованием НИПС, значительно

больше и вероятность наличия однородительской дисомии может быть

значительно выше.

Помимо этого, у плода возможен низкоуровневый мозаицизм, при

котором анеуплоидными являются незначительное количество клеток плода.

При этом, описано много случаев подобного низкоуровневого мозаицизма с

вовлечением разных хромосом, который приводит к различным порокам и

задержке развития [135,138,139,140,141,142,143,144]. Также описан случай,

когда выявленный с применением ДНК-скрининга высокий риск трисомии

по 9 хромосоме не подтвердился с помощью инвазивной пренатальной

диагностики, однако был подтвержден при обследовании крови родившегося

ребенка [133]. Подобные случаи требуют дальнейшего изучения, т.к. могут

быть связаны с совершенно разными причинами, например, с выявляемыми

на доклинической стадии онкологическими заболеваниями у самой матери

или с упоминавшимися выше случаями редукции одного из эмбрионов при

изначально многоплодной беременности.

1.7.12 Применение ДНК-скрининга при многоплодной беременности

Общая частота наступления многоплодной беременности, в т.ч. в связи с

широким применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ),

в последние десятилетия возросла и составляет около 3% [145].

Многоплодная беременность клинически отличается от одноплодной, т.к.

55

зачастую протекает более тяжело, характеризуется повышенной частотой

осложнений как для плода, так и для матери, сопровождается повышенным

риском анеуплоидий, при ней чаще наблюдаются угроза прерывания

беременности и преждевременные роды [146]. Проведение амниоцентеза

при многоплодной беременности чаще заканчивается потерей беременности

[20]. При применении ВРТ многоплодная беременность наступает в 10-20 раз

чаще, чем при самостоятельном зачатии. При этом биохимические маркеры

стандартного биохимического скрининга валидированы на обычную

беременность и могут существенно различаться – при применении ВРТ

возрастает уровень β-ХГЧ и снижается уровень PAPP-A, что ведет к

увеличению ложноположительных результатов скрининга [147]. В связи со

сказанным выше, применение ДНК-скрининга при многоплодной

беременности представляется крайне актуальным, с его помощью можно

избежать неоправданных инвазивных вмешательств. Предварительные

результаты использования НИПС при многоплодной беременности оказались

обнадеживающими, однако, из-за недостаточного количества исследований,

проблемы “исчезающего близнеца”, профессиональные общества призвали к

увеличению усилий в этом направлении [127,150,151, 152,153,154].

56

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы

Для анализа внеклеточной ДНК крови матери в работе исследовались

1918 образцов плазмы крови беременных женщин. Помимо этого, в работе

анализировались периферическая жидкая кровь новорожденных,

замороженная плазма крови, материал биопсии ворсин хориона,

амниотическая жидкость, биоптаты плаценты. Все исследования

выполнялось добровольно, по желанию женщины, после подписания

соответствующих форм информированного согласия. Образец

информированного согласия представлен в приложении 2. С целью

валидации метода, а также определения возможности транспортировки

образцов ретроспективно проведено исследование двух групп беременных

женщин с применением высокопроизводительного секвенирования

внеклеточной ДНК.

Первую ретроспективную группу составили 286 образцов плазмы крови

беременных женщин, которые наблюдались в ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И.

Кулакова” Минздрава России. Образцы первой ретроспективной группы

были получены у женщин, направленных на пренатальную инвазивную

диагностику с целью проведения кариотипирования плода. Получение

материала для неинвазивного ДНК-скрининга осуществлялось в пробирки с

антикоагулянтом этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) объемом 9-

10 мл на сроке беременности 10-20 недель, медиана составила 14 недель.

Обследование также включало: скрининг I–II триместра беременности (УЗИ,

определение содержания сывороточных маркеров, компьютерный анализ);

цитогенетическое исследование; инвазивные процедуры. Внутриматочные

вмешательства с целью получения хориона, плаценты, амниотической

жидкости выполняли в 11-14 недель или в 17-20 недель в связи с

противопоказаниями к проведению в ранние сроки беременности или

57

поздним обращением женщины. У всех женщин было получено

информированное согласие на инвазивную пренатальную диагностику

(биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез). Во всех 286 наблюдениях

пациентов первой ретроспективной группы в образцах тканей плодового

происхождения (хорион, плацента, амниотическая жидкость) был определен

кариотип плода с помощью стандартного цитогенетического метода, а

периферическая кровь женщин была исследована на наличие анеуплоидий и

Y-хромосомы у плода с помощью ДНК-скрининга анеуплоидий по крови

матери. Все беременные имели высокий риск хромосомной патологии плода,

обусловленный возрастом, изменениями в уровнях сывороточных маркеров,

особенностями фенотипа плода. Подсчет рисков осуществлялся с помощью

компьютерных программ Astraia и Prisca. Схема обследования пациентов

первой ретроспективной группы представлена на рисунке 8.

Вторая ретроспективная группа состояла из 477 образцов беременных

женщин в сроке от 8 до 20 недель гестации, которые обследовались условиях

медико-генетической консультации ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н.Городкова"

Минздрава России (г.Иваново). 63 из 477 образцов использовались при

валидации выявления анеуплоидий с помощью ДНК-скрининга, в этой

подгруппе 22 образца имели установленную цитогенетически хромосомную

патологию. Все 477 образцов второй ретроспективной группы исследовались

для определения сохранности внеклеточной ДНК при транспортировке в

ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. Забор крови

осуществлялся как в пробирки с ЭДТА объемом 9-10 мл, с получением

плазмы и её заморозкой по месту взятия материала, так и в пробирки Cell-

Free DNA BCT (Streck, США) объемом 10 мл, которые не подвергались

заморозке и доставлялись на исследование не позднее 14 дней после забора

крови. Пробирки хранились и транспортировались машиной-

рефрижератором в соответствии с рекомендациями производителя при

температуре не ниже +6С.

58

Рисунок 8. Схема обследования пациентов первой ретроспективной

группы.

В рамках проспективного исследования было проанализировано 1155

образцов женщин, которые проходили медико-генетическое

консультирование в ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава

России. В это число входили женщины в т.ч. и с высоким риском ХА (риск

выше 1:100 по данным комбинированного скрининга), которые отказались от

59

предложенной инвазивной диагностики. Всем женщинам были разъяснены

ограничения ДНК-скрининга. Забор крови производился в количестве 9 мл в

пробирки с ЭДТА, на сроке 11-17 (медиана 14) недель беременности. Все

пациенты подписали информированное согласие на проведение

молекулярно-генетического исследования. При высоком риске анеуплоидий

по данным ДНК-скрининга пациентам рекомендовалось проведение

инвазивной пренатальной диагностики.

2.2 Характеристики пациентов и получение материала

2.2.1 Ретроспективные группы

В первую ретроспективную группу вошли пациенты с известным

кариотипом, установленным в результате проведения инвазивной процедуры

с последующей пренатальной диагностикой. Большая часть женщин 284

(99%) была обследована в связи с высоким риском наличия у плода ХА. В 1

случае причиной обследования было пренатальное определение отцовства. В

1 случае женщина обследовалась с целью проведения пренатальной

диагностики гемофилии А, в связи с носительством данного заболевания.

Количество образцов с анеуплоидиями в первой ретроспективной группе

составляло 80 (28% процентов).

Во вторую ретроспективную группу вошли 477 пациентов,

наблюдающихся в ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н.Городкова" Минздрава

России, 22 из которых (34,9%) были с установленной хромосомной

патологией. Указанные 22 пациента с хромосомной патологией и 41 пациент

без патологии составили подгруппу из 63 пациентов, которым произведен

ДНК-скрининг с целью валидации метода.

2.2.2 Проспективная группа

Проспективную группу составили 1145 пациентов, наблюдающихся в

ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. У 104 (9%)

60

пациентов был определен высокий риск наличия ХА по данным

комбинированного скрининга (риск выше 1:100). У остальных 1041 (91%)

женщин риск наличия анеуплоидий по данным комбинированного скрининга

был низкий (менее 1/100). Для всех женщин был известен исход

беременности, в случае высокого риска анеуплоидии по данным ДНК-

скрининга проводилось кариотипирование плода или ребенка, при низком

риске ХА оценка хромосомного статуса новорожденного проводилась

фенотипически. При уровне внеклеточной ДНК ниже порога

чувствительности метода на более позднем сроке беременности проводился

повторный забор материала. Все пациенты были ознакомлены с

информацией о проведении ДНК-скрининга, с образцами документов можно

ознакомиться в приложениях 1-5.

2.2.3 Забор крови и отделение плазмы

Забор периферической жидкой крови для проведения ДНК-скрининга

осуществлялся в ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России

и в ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н.Городкова" Минздрава России в

предварительно промаркированные пробирки объемом 9-10 мл. Для

получения необходимого биоматериала объема допускалось использование

2-х пробирок меньшего объема (объемом 5 мл), в этом случае каждая

пробирка маркировалась индивидуально. Пробирки заполнялись кровью

полностью, в пределах ±10% от предусмотренного объема.

В качестве антикоагулянта для проведения молекулярно-генетических

исследований применялась этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в

концентрации 1,2-2 мг/мл крови (4-7 ммоль/л). Сразу после получения крови

её перемешивали с антикоагулянтом, несколько раз плавно переворачивая

пробирку, не допуская встряхивание.

Забор крови для ХМА и QF-PCR проводили в аналогичные пробирки с

ЭДТА объемом 2,5 мл, в которые аспирировали по 2 мл крови. Для

61

проведения стандартного кариотипирования с применением

цитогенетических методов исследования в качестве антикоагулянта

применяли гепарин в концентрации 100 eд/мл, забор крови осуществлялся в

объеме 1-2 мл.

Помимо обычных пробирок с ЭДТА, забор крови в ФГБУ "ИвНИИ

МиД им. В.Н.Городкова" Минздрава России также осуществлялся в

пробирки Cell-Free DNA BCT (Streck, США) объемом 10 мл. Пробирки

хранились и транспортировались в соответствии с рекомендациями

производителя при температуре не ниже +6С.

Получение двух аликвот плазмы из цельной крови для проведения ДНК-

скрининга проводили с помощью двух последовательных

центрифугирований. Первое центрифугирование производилось 20 минут

при низком центробежном ускорении (1600g), второе центрифугирование

производилось 15 минут при высоком центробежном ускорении (не менее

12000g). Это обеспечивает максимальное снижение риска лизиса клеток при

получении плазмы на первом этапе, а также избавление от клеточных

элементов на втором, что крайне важно, т.к. контаминация материнской

геномной ДНК может существенно влиять на долю плодовой ДНК и, как

следствие, на результаты ДНК-скрининга. Большая продолжительность

центрифугирования устанавливалась в случае мутной, хилезной плазмы. Оба

раза плазму, не задевая осажденную клеточную фракцию, переносили в

промаркированные чистые пробирки. В случае, если выделение ДНК

происходило не сразу после центрифугирования, обе аликвоты плазмы

(рабочую и контрольную) до выделения ДНК помещали на хранение при

температуре -20С. В случае, если выделение производилось непосредственно

после центрифугирования, на хранение помещалась одна аликвота плазмы,

которая использовалась в дальнейшем для отсроченного исследования.

62

2.2.4 Проведение амниоцентеза, биопсии ворсин хориона, кордоцентеза

Проведение инвазивной пренатальной диагностики осуществлялось в

отделении клинической генетики ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова”

Минздрава России. Забор материала осуществлялся с применением

ультразвукового контроля в количестве 5-10 мкг хориона, 10-15 мл

амниотической жидкости, 1-2 мл крови плода из пуповины.

2.2.5 Получение образцов плаценты

Исследование материала плаценты проводили с целью верификации

случаев плацентарного мозаицизма при несоответствии результатов

инвазивной диагностики, а также кариотипа плода/ребенка с данными,

полученными при проведении ДНК-скрининга. Материал плаценты для

дальнейшего исследования молекулярно-цитогенетическими методами

получали из 4-х разных частей, в соответствии со стандартным

протоколом [93]. Исследование производилось как непосредственно после

получения материала, так и отсрочено, для этого материал частично

помещался в парафиновые блоки и хранился при комнатной температуре,

частично – помещался на хранение при температуре -20С. Пробоподготовка

при работе с плацентой производилась в патологоанатомическом отделении

ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. Схема забора

материала плаценты представлена на рисунке 9.

Рисунок 9. Получение образца плаценты для исследования мозаицизма [93].

63

2.3 Специальные методы исследования

2.3.1 Проведение стандартного цитогенетического исследования

Кровь в объеме 0,8 мл культивировали в одноразовых флаконах, с 6 мл

питательной средой RPMI 1640, содержащей ФГА в концентрации 1 мкг/мл,

1,5 мл цельной сыворотки крупного рогатого скота. Культивирование

проводили 72 часа при температуре 37С. За 1,5 часа до окончания

культивирования встряхивали флакон и вводили колхицин в конечной

концентрации 0,5 мкг/мл. Данный этап необходим для накопления

лимфоцитов в стадии метафазы. По окончании культивирования клетки с

питательной средой переносили пробирки для центрифугирования и

осаждали в течение 10 минут при 1000g. Полученный осадок обрабатывали

20 минут гипотоническим раствором 0,075 М хлорида калия при 37C. После

проведения гипотонии центрифугировали при 1000g в течение 10 минут.

Затем клетки фиксировали с помощью охлажденной до 4С смеси этанол-

уксусная кислота в соотношении 3:1, приготовленной непосредственно перед

использованием. После окончательного центрифугирования при 1000g, 10

минут, супернатант удаляли, суспензию раскапывали на влажные

охлажденные стекла, после этого высушивали на воздухе. Цитогенетическое

исследование проводили с применением модифицированной методики

дифференциального окрашивания метафазных хромосом (G-окраска), по

Seabright [15]. Для этого препараты хромосом при комнатной температуре

10-20 секунд обрабатывали 0,25% раствором трипсина, затем трижды

промывали в растворах 700, 960 и абсолютного спирта не менее 30 секунд в

каждом. Препараты высушивали на воздухе, для окрашивания применяли 5%

раствор красителя Гимза, приготовленный на фосфатном буфере (pH 6,8).

Время окрашивания 5-10 минут, после окраски препараты промывали

дистиллированной водой, затем высушивали на воздухе. Образцы

64

нормальных кариотипов 46,ХХ (женский) и 46,XY (мужской) представлены

на рисунке 10.

Рисунок 10. Стандартное цитогенетическое исследование с применением дифференциального G-окрашивания метафазных хромосом.

Слева представлен нормальный женский кариотип 46,XX; справа

нормальный мужской кариотип 46,XY.

2.3.2 Проведение молекулярно-цитогенетического исследования (FISH)

Выявление анеуплоидий с применением метода FISH проводили с

использованием соответствующих зондов Vysis Fish Probes (Abbott

Molecular, США) на хромосомы 21, 18, 13; для исследования половых

хромосом применяли зонды Vysis CEPX/Y, согласно протоколу

производителя.

2.3.3 Проведение молекулярного кариотипирования

Исследование анеуплоидий с применением молекулярного

кариотипирования (микроматричного анализа) проводилось на микрочипах

CytoScan Optima Array (Affymetrix, США), согласно протоколу

производителя.

65

2.3.4 Проведение QF-PCR

Проведение QF-PCR осуществляли с применением набора реагентов для

детекции трисомий по 13, 18, 21 и половым хромосомам Aneufast QF-PCR Kit

(Genomed Biotech Ltd, Великобритания), в соответствии с прилагаемым к

реагентам инструкциям производителя.

2.3.5 Выделение внеклеточной ДНК и проведение ПЦР

Выделение внеклеточной ДНК проводили из 1-2 мл плазмы с помощью

набора реагентов MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit (Thermo Fisher

Scientific, США), в соответствии с прилагаемой к реагентам инструкцией

производителя. Контроль качества полученной внеклеточной ДНК

проводили на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent, США) с использованием

набора High Sensitivity DNA Kit (Agilent, США). Образцы получаемых

результатов представлены на рисунках 11-13.

Рисунок 11. Нормальный вид внеклеточной ДНК (Agilent Bioanalyzer 2100).

66

Рисунок 12. Вид внеклеточной ДНК. Кроме целевого пика в большом

количестве присутствует высокомолекулярная фракция (Agilent Bioanalyzer

2100).

Рисунок 13. Вид внеклеточной ДНК. Значительно повышен уровень

апоптотической ДНК (Agilent Bioanalyzer 2100).

Для определения доли плодовой ДНК осуществлялась амплификация

полиморфных локусов ДНК. Она проводилась с помощью ПЦР, с

применением специфичных олигонуклеотидов (праймеров). Амплификация

производилась мультиплексно, т.е. все локусы ДНК амплифицировались

одновременно в одной пробирке. В качестве субстрата для амплификации

служила внеклеточная ДНК, выделенная из плазмы.

67

2.3.6 Приготовление библиотек для секвенирования

Для каждого образца готовили две разные библиотеки. Первую

библиотеку для секвенирования внеклеточной ДНК, которую использовали

для определения риска наличия анеуплоидии у плода. Вторую - для

таргетного секвенирования однонуклеотидных полиморфизмов, которые

применяли для оценки доли внеклеточной ДНК плода в образце, вне

зависимости от пола плода.

1. Приготовление библиотек для высокопроизводительного

секвенирования проводили согласно инструкциям производителя, без этапа

разрушения (шеринга) первоначальной ДНК, поскольку внеклеточная ДНК

изначально сильно фрагментирована, длина её фрагментов составляет 100-

200 п.н. Измерение концентрации полученной из плазмы ДНК производили

на флуорометре Qubit 2.0 с использованием наборов Qubit dsDNA HS Assay

Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Для приготовления библиотеки ДНК

использовали 2-10 нг внеклеточной ДНК. Приготовление библиотек

включало этапы:

• формирование тупых концов на фрагментах ДНК c использованием

End repair enzyme и последующей очисткой образца с помощью магнитных

частиц AMPure XP beads (Beckman, США);

• лигирование адаптеров и баркодов P1-A-BC. Использовали 16-ти

кратное разведение всех адаптеров, поскольку количество входящей ДНК

ниже рекомендуемого производителем. Очистку образца проводили с

помощью магнитных частиц AMPure XP beads;

• ник-трансляция и амплификация с помощью Platinum® PCR SuperMix

High Fidelity. Проводили 6 циклов с использованием универсальных

адаптеров и последующей очисткой образца с помощью магнитных частиц

AMPure XP beads;

68

• измерение концентрации и оценку качества приготовленных библиотек

проводили с использованием прибора Bioanalyzer 2100 фирмы Agilent

(США);

• проведение эмульсионной ПЦР, обогащение библиотек и нанесение на

чип проводили при помощи автоматической станции Ion Chef. За один запуск

прибора готовили сразу 2 чипа;

• секвенирование проводили на приборах Ion Proton или Ion S5. Для

прибора Ion Proton использовали чипы P1 v2 и v3, а для Ion S5 чипы 540.

2. При приготовлении библиотек для таргетного секвенирования проводили

ПЦР-амплификацию ДНК с использованием специфичных

олигонуклеотидов (праймеров). Список однонуклеотидных полиморфизмов и

последовательности олигонуклеотидов приведены в таблице 1. В таблице

приведены предварительно отобранные для таргетного секвенирования

олигонуклеотиды на хромосомах 1-12, их позиции в геноме (версия hg38) и

последовательности олигонуклеотидов, используемые для амплификации.

Знаком “+” отмечены олигонуклеотиды, вошедшие в окончательную панель,

с учетом частоты их встречаемости и проверенной на практике

работоспособности.

Измерение концентрации полученного ПЦР-продукта производили на

флуорометре Qubit 2.0, с использованием наборов Qubit dsDNA BR Assay Kit

(Thermo Fisher Scientific, США). Для приготовления библиотек для

таргетного секвенирования использовали от 8 до 14 нг амплификата ПЦР.

69

Таблица 1. Однонуклеотидные полиморфизмы.

70

Таблица 1. Однонуклеотидные полиморфизмы (продолжение).

Приготовление библиотек для высокопроизводительного

секвенирования проводили согласно инструкциям производителя без

этапа разрушения первоначальной ДНК и формирования тупых концов на

фрагментах, поскольку полученные ПЦР продукты имеют длину 70-

110 п.н., а для амплификации используются фосфорилированные

праймеры. Список необходимого оборудования и реактивов приведен в

таблице 2. Приготовление библиотек включало этапы:

лигирование адаптеров и баркодов P1-A-BC. Использовали 16-ти

кратное разведение всех адаптеров, поскольку количество

71

входящей ДНК ниже рекомендуемого производителем. Очистку

образца проводили с помощью магнитных частиц AMPure XP beads;

Таблица 2. Наборов реагентов, использованных для проведения ДНК-скрининга.

Этап исследования Реагент Производитель

Выделение ДНК MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit ThermoFisher

Приготовление библиотек для секвенирования

Ion Xpress Plus Fragment Library Kit

ThermoFisher

Приготовление библиотек для секвенирования

Ion Xpress™ Barcode Adapters 1- 96 Kit

ThermoFisher

Приготовление библиотек для секвенирования

AMPure XP beads

Beckman

Измерение концентрации

ДНК

Qubit dsDNA HS Assay Kit

ThermoFisher

Измерение концентрации

ДНК

Qubit dsDNA BR Assay Kit

ThermoFisher

Измерение концентрации

ДНК

High Sensitivity DNA Kit

Agilent Technologies

Секвенирование NaOH, 10 M раствор, molecular biology grade SigmaAldrich

Секвенирование DynabeadsMyOneStreptavidin C1 ThermoFisher

Секвенирование Ion PI™ Template OT2 200 Kit v3 ThermoFisher

Секвенирование Ion 540™ Kit-OT2 ThermoFisher

Секвенирование Ion PI™ Sequencing 200 Kit v3 ThermoFisher

Секвенирование Ion PI™ Chip Kit v2 ThermoFisher

Секвенирование Ion 540™ Chip Kit ThermoFisher

ник-трансляция и амплификация. Проводили 6 циклов с

использованием универсальных адаптеров. Очистку образца

72

проводили с помощью магнитных частиц AMPure XP beads;

измерение концентрации и оценка качества приготовленных

библиотек, которые проводили с использованием прибора Bioanalyzer

2100 фирмы Agilent;

проведение эмульсионной ПЦР, обогащение библиотек и нанесение

на чип, его проводили при помощи автоматической станции Ion

Chef, за один запуск прибора готовили одновременно 2 чипа;

cеквенирование, которое проводили на приборах Ion Proton и Ion S5.

Для Ion Proton использовали чипы P1 v2 и v3, для Ion S5 чипы 540.

2.3.7 Обработка данных

Первичную обработку данных секвенирования - определение

последовательности ДНК, выравнивание её на референсный геном человека

сборки hg19, фильтрацию ПЦР дупликатов проводили с использованием

управляющего прибором сервера Torrent Server, TMAP, FilterDuplicates v 5.4.

После выравнивания прочитанных фрагментов на референсный геном и

фильтрации ПЦР-дупликатов проводили:

1. фильтрацию фрагментов по качеству выравнивания;

2. фильтрацию не уникальных участков генома;

3. GC-коррекцию с использованием локальной линейной регрессии с

весовыми коэффициентами;

4. подсчет параметров Z-score и T-score;

5. контроль параметров качества проведения анализа.

Анализ данных проводили с использованием собственного

программного обеспечения, разработанного лаборатории молекулярно-

генетических методов ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава

России. Схема процесса анализа риска наличия анеуплоидий приведена на

рисунке 14.

73

Рисунок 14. Схема процесса анализа риска наличия анеуплоидий у плода.

В случае выявления высокого риска моносомии по хромосоме Х,

проводили дополнительный анализ, с целью уточнения риска наличия

мозаичной формы моносомии по хромосоме Х у самой матери. Алгоритм

дополнительного анализа приведен в разделе “Определение происхождения

анеуплоидий при ДНК-скрининге”.

74

2.3.8 Статистическая обработка материала

Для работы с файлами формата bam, содержащими информацию о

выравнивании прочитанных фрагментов на референсный геном,

использовался программный пакет SAMtools и модуль Pysam для языка

программирования Python [155]. Статистический анализ данных проводили с

использованием программных пакетов R (версия 3.2.2) и Microsoft Excel.

Статистическую значимость относительного изменения доли плодовой ДНК

определяли с использованием критерия Манна-Уитни с поправкой на

непрерывность. Статистическую значимость разницы частоты встречаемости

мозаичной формы моносомии определяли при помощи критерия Хи-квадрат

с поправкой Йетса. Статистически значимыми считали различия при

p менее 0,05. Анализ данных секвенирования проводили с использованием

разработанного в лаборатории программного обеспечения.

75

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Скрининг наличия анеуплоидий

3.1.1 Результаты валидации

Во всех 286 наблюдениях пациентов первой ретроспективной группы в

образцах тканей плодового происхождения (хорион, плацента,

амниотическая жидкость) был определен кариотип плода с помощью

стандартного цитогенетического метода, а периферическая кровь женщин

была исследована на наличие анеуплоидий и Y-хромосомы у плода с

помощью ДНК-скрининга анеуплоидий по крови матери. Все беременные

имели высокий риск хромосомной патологии плода, обусловленный

возрастом, изменениями в уровнях сывороточных маркеров, особенностями

фенотипа плода. Подсчет рисков осуществлялся с помощью компьютерных

программ Astraia и Prisca. У 11% женщин предыдущие беременности

закончились рождением детей с генетическими нарушениями или

прерыванием неразвивающейся беременности с анеуплоидией у плода; 7%

женщин страдали привычным выкидышем. У 13% беременность наступила

после ЭКО, донорства яйцеклетки не было ни в одном случае. У 5% женщин

в родословной отмечены случаи наследственной и врожденной патологии у

близких родственников.

Доля плодовой ДНК в материнском кровотоке является крайне важным

критерием валидности ДНК-скрининга. В проведенном нами исследовании

среднее содержание доли плодовой ДНК в 1918 образцах составило 11,6%

(90% доверительный интервал составил от 6,6% до 17,5%). В пяти образцах в

1-й группе валидации уровень плодовой ДНК был менее 4%, в связи с чем

они были исключены из дальнейших расчетов диагностических

характеристик ДНК-скрининга. Важно отметить, что при этом в двух

образцах с низкой долей плодовой ДНК не были выявлены трисомии по 21

хромосоме (ложноотрицательный результат), что подтвердило важность

76

оценки доли плодовой ДНК для получения валидных результатов ДНК-

скрининга. Результаты биоинформатического анализа данных ДНК-

скрининга в 1-й группе валидации представлены на рисунке 15. Зеленым

Рисунок 15. Результаты биоинформатического анализа данных НИПС.

цветом обозначены образцы с нормальным количеством хромосом, красным

- с наличием анеуплоидии по 21, 18 и 13 хромосомам.

Данные исследования первой ретроспективной группы представлены в

таблице 3. Исключены 5 образцов с низкой долей ДНК плода.

Таблица 3. Результаты выявления анеуплоидий для первой ретроспективной группы. N=281 Вид хромосомного нарушения.

Результаты НИПС

Подтверждено кариотипом

Ложно- позитивные

Ложно-негативные

Трисомия 21 44 44 0 0 Трисомия 18 19 19 0 0 Трисомия 13 3 2 1 0 По всем половым хромосомам 16 15 1 0

77

При исследовании первой ретроспективной группы, сопоставление

полученных обоими методами результатов показало, что в 279 из 281 (99%)

случаях данные цитогенетического исследования совпадают с результатами

ДНК-скрининга. Всего с помощью ДНК-скрининга высокий риск

анеуплоидий по 21, 18, 13 и половым хромосомам был установлен в 82

случаях, из них трисомия 21 - 44 наблюдения, трисомия по 18 хромосоме – 19

наблюдений, трисомия по 13 хромосоме – 3 наблюдения, нарушения по

половым хромосомам 16 наблюдений. Получен один ложноположительный

результат по 13-й хромосоме и один положительный результат при

выявлении моносомии хромосомы Х.

Результаты выявления анеуплоидий для второй ретроспективной

подгруппы представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты выявления анеуплоидий для второй ретроспективной группы. N=63 Вид хромосомного нарушения

Результаты НИПС

Подтверждено кариотипом

Ложно- позитивные

Ложно-негативные

Трисомия 21 15 15 0 0 Трисомия 18 6 6 0 0 Трисомия 13 0 0 0 0 По всем половым хромосомам 1 1 0 0

При исследовании второй ретроспективной подгруппы, сопоставление

полученных обоими методами результатов показало, что во всех 63 случаях

(100%) данные цитогенетического исследования совпадают с результатами

ДНК-скрининга. Всего с помощью НИПС высокий риск по 21, 18, 13 и

половым хромосомам был установлен в 22 случаях.

Результаты выявления анеуплоидий для проспективной группы

представлены в таблице 5. Исключены 10 образцов с низкой долей плодовой

ДНК.

78

Таблица 5. Результаты выявления анеуплоидий для проспективной группы. N=1145 Вид хромосомного нарушения

Результаты НИПС

Подтверждено кариотипом

Ложно- позитивные

Ложно-негативные

Трисомия 21 13 14 0 1 Трисомия 18 0 0 0 0 Трисомия 13 4 4 0 0 По всем половым хромосомам 16 9 7 0

При проведении проспективного исследования при уровне плодовой

ДНК менее 4% производился повторный забор крови. Уровень плодовой

ДНК ниже 4% после перезабора крови наблюдался в 10 случаях (0,87%). Это

могло быть связано как с осложненным течением беременности, так и с

приемом женщиной лекарственных препаратов. Например, устойчиво низкий

уровень плодовой ДНК наблюдался нами в случае приема женщиной

преднизолона и метипреда после операции тимэктомии.

При исследовании проспективной группы, сопоставление полученных с

помощью НИПС и цитогенетическим методом результатов показало, что в

1137 из 1145 (99%) случаях данные цитогенетического исследования

совпадают с результатами ДНК-скрининга. В результате проспективного

исследования было обнаружено 13 образцов с высоким риском трисомии по

21 хромосоме, 4 образца с риском трисомии по 13 хромосоме, 8 образцов с

риском моносомии Х, 1 образец с риском трисомии по Х хромосоме. Все

трисомии по аутосомам были подтверждены инвазивной диагностикой.

Моносомия по Х хромосоме была подтверждена в трех случаях, в одном из

них ребенок имел мозаичный кариотип. У одного плода в результате

инвазивной диагностики был обнаружен мозаичный кариотип 47,ХХХ/46,ХХ

при высоком риске моносомии Х по данным ДНК-скрининга, это может быть

объяснено ошибками на этапе митоза и образованием трёх клонов клеток. В

случае с высоким риском трисомии по Х хромосоме, был подтвержден

трисомный кариотип у матери, исследование кариотипа плода не проводили.

Ложноотрицательнй результат, полученный при выявлении трисомии 21,

связан с мозаицизмом у плода, характеризующимся наличием трех клонов

79

клеток: моносомного, нормального (дисомного) и трисомного. При

исследовании новорожденного методом FISH для 21 хромосомы было

обнаружено 77 (76%) ядер с 3 сигналами, 18 ядер (18%) с 2 сигналами и 6

(6%) ядер с 1 сигналом.

Обобщенные результаты выявления анеуплоидий с помощью ДНК-

скрининга для проспективной и перспективной групп представлены в

таблице 6.

Таблица 6. Обобщенные результаты по всем группам, N=1489.

Вид нарушения

Рез-ты НИПС

Подтв. кариот.

Ложн. позит.

Ложн. негат.

Чувствитель ность, %

Специфич ность, %

Положительн. предиктивная оценка (PPV)

Отрицательн. предиктивная оценка (NPV)

Трисомия 21 72 73 0 1 98,6 (92,6-100)

100 (99,7-100)

100 (95-100)

100 (99,6-100)

Tрисомия 18 25 25 0 0 100 (86,3-100)

100 (99,8-100)

100 (86,3-100)

100 (99,8-100)

Tрисомия 13 7 6 1 0 100 (59-100)

99,9 (99,6-100)

87,5 (47,4-99,7)

100 (99,8-100)

45X 25 18 7 0 100 (78,2-100)

99,5 (99-99,8)

72 (45,1-86,1)

100 (99,8-100)

По всем половым хромосомам

33 25 8 0 100 (86,3-100)

99,5 (98,9-99,8)

75,8 (57,7-88,9)

100 (99,8-100)

Всего с помощью ДНК-скрининга высокий риск анеуплоидий по 21, 18,

13 и половым хромосомам был установлен в 137 случаях, из них трисомия 21

- 72 наблюдения (совпадает с кариотипом во всех наблюдениях), трисомия по

18 хромосоме – 25 наблюдений (также совпадает с кариотипом во всех

наблюдениях), трисомия по 13 хромосоме – 7 наблюдений (один случай

ложноположительный), риск нарушений по половым хромосомам был

установлен в 33 случаях, подтвержден кариотипом в 25 случаях. При анализе

половых хромосом все образцы, в которых определялась Y-хромосома, были

отнесены к мужскому полу. Все отрицательные по Y-хромосоме образцы

рассматривались как относящиеся к женскому полу. Моносомия хромосомы

Х была определена в 23 наблюдениях и подтверждена данными

цитогенетического анализа в 18. В семи случаях был получен результат,

80

трактуемый как моносомия хромосомы X при наличии у плода нормального

женского кариотипа 46,ХХ.

Таким образом, ложноположительные результаты наблюдались при

выявлении по данным ДНК-скрининга высокого риска моносомии

хромосомы X, а также высокого риска трисомии по 13 хромосоме. Поэтому,

несмотря на высокую чувствительность ДНК-скрининга при выявлении

анеуплоидий по 13 и половым хромосомам, специфичность диагностики

ниже, чем для 21 и 18 хромосом. Возможно, что это объясняется

плацентарным мозаицизмом, т.к. анеуплоидии по этим хромосомам могут

быть менее критичны для функционирования плаценты.

Ложноотрицательный результат, полученный при выявлении трисомии

21 подробно описан в разделе “Описание клинических случаев”. Он связан с

мозаицизмом у плода, характеризующимся наличием трех клонов клеток:

моносомного, нормального (дисомного) и трисомного. При исследовании

новорожденного методом FISH для 21 хромосомы было обнаружено 77 (76%)

ядер с 3 сигналами, 18 ядер (18%) с 2 сигналами и 6 (6%) ядер с 1 сигналом.

Отсроченное исследование 70 вторых (контрольных) аликвот плазмы,

проведенное через год после первоначального исследования,

продемонстрировало полное совпадение результатов.

3.1.2 Определение происхождения анеуплоидий при ДНК-скрининге

Материнские анеуплоидии являются частой причиной

ложноположительных результатов ДНК-скрининга. В настоящей работе ими

были обусловлены 4 из 9 (44%) ложноположительных результатов

исследования, в первую очередь с вовлечением хромосомы Х. После

введения разработанного нами алгоритма анализа, позволяющего различать

материнское и плодовое происхождение анеуплоидий по половым

хромосомам, количество ложноположительных случаев резко сократилось. В

случае, если анеуплоидными являются все клетки матери, их выявление

81

обычно не представляет сложности из-за аномально высокого изменения в

покрытии хромосомы. Однако, зачастую моносомии по Х хромосоме

наблюдаются в мозаичной форме, в таких случаях изменения в покрытии Х

хромосомы могут быть сопоставимыми с анеуплоидиями плодового

происхождения. Как уже указывалось выше, распределение длин плодовой и

материнской ДНК отличаются между собой - фрагменты ДНК плодового

происхождения обычно короче, чем материнские. Как правило, фрагменты

свободноциркулирующей ДНК имеют размер менее 200 п.н. При этом

возможная длина прочтения для полупроводникового секвенатора достигает

400 п.н. Поскольку в процессе приготовления библиотек для секвенирования

внеклеточной ДНК не требуется этап её фрагментации и отбора по длине, то

логично предположить, что распределение прочтений по длине отражает

реальные длины анализируемых фрагментов. Распределение значений доли

плодовой ДНК для Х хромосомы при анализе фрагментов разной длины в

исследуемых образцах приведено на рисунке 16. Видно, что при отборе для

анализа фрагментов ДНК меньшей длины, для анеуплоидии плодового

происхождения «эффективная» доля плодовой ДНК возрастает, если же

анеуплоидия в исследуемом образце материнского происхождения, доля

плодовой ДНК остается неизменной. Алгоритм дополнительного анализа

для случаев высокого риска моносомии по Х хромосоме по данным

НИПС представлен на рисунке 17. Проведение дополнительного этапа

анализа позволяет выявить случаи, когда результаты ДНК-скрининга

обусловлены особенностями кариотипа матери и значительно увеличить

положительное предсказательное значение исследования.

82

Рисунок 16. Распределение значений доли плодовой ДНК для Х хромосомы

при анализе фрагментов разной длины.

Рисунок 17. Алгоритм дополнительного анализа при выявлении по данным ДНК-скрининга высокого риска моносомии по хромосоме Х.

83

3.1.3 Определение доли плодовой ДНК

В ходе валидации было продемонстрировано, что при низкой доле

плодовой ДНК в образце возможны ложноотрицательные результаты.

Определение доли плодовой ДНК просто осуществить в случае с

беременностью плодом мужского пола, с этой целью применяют сравнение

покрытия Y хромосомы с покрытием остальных аутосом. Если же плод

женского пола, то оценка представленности плодовых фрагментов

становится сложной задачей. Для определения доли плодовой ДНК был

выбран подход, основанный на поиске однонуклеотидных полиморфизмов,

которые находятся в гомозиготном состоянии у матери и в гетерозиготном у

плода. Были отобраны 85 полиморфизмов с частотой встречаемости

гетерозиготного генотипа 49-51% для европейской популяции и 45-55% для

африканской, китайской и японской популяций. Данные полиморфизмы

располагаются на расстоянии не менее 20 млн. п.н. на 1-12 хромосомах.

Специфичные праймеры для амплификации каждого из выбранных

фрагментов были подобраны таким образом, чтобы длина амплификата не

превышала 110 п.н. Список полиморфизмов и последовательности праймеров

приведены в таблице 1. Часть полиморфизмов исключили из дальнейшего

исследования в ходе предварительных испытаний в связи с отсутствием

продукта амплификации на гель-электрофорезе, отличием длины фрагмента

от ожидаемой, либо если было более одного продукта амплификации.

Оценку доли плодовой ДНК проводили с помощью секвенирования 53

частотных полиморфизмов. После выравнивания на референсный геном, для

позиций на геноме, соответствующих выбранным полиморфизмам,

подсчитывали количество прочтений для каждого из аллелей. Для анализа

использовали только фрагменты с качеством выравнивания не менее 30 и с

длиной не менее 80% от ожидаемой длины фрагмента.

Определение доли плодовой ДНК проводили с использованием

полиморфизмов с покрытием не менее 1000 прочтений, для которых

84

представленность одного аллеля была 80-99,5%. Сравнение результатов

определения доли плодовой ДНК с применением однонуклеотидных

полиморфизмов и по Y хромосоме проводилось посредством исследования

158 образцов крови от беременных плодом мужского пола. Среднее

количество полиморфизмов, для которых у матери был гомозиготный

генотип, составило при секвенировании 27 (24-29), при этом около половины

из них были информативными. Сравнение определения доли плодовой ДНК

по Y хромосоме и с помощью SNP представлено на рисунке 18.

Рисунок 18. Сравнение определения доли плодовой ДНК по Y хромосоме и с помощью SNP.

При сравнении доли плодовой ДНК, установленной с помощью SNP и

по данным, полученным при исследования хромосомы Y установлена

корреляция г=0,7. Медиана абсолютной разницы значения доли плодовой

ДНК, определенной с использованием SNP и Y хромосомы, составила 1,8%

(0,8-2,8%), для образцов с долей плодовой ДНК ниже 6% - 1,1% (0,5-1.8%).

85

3.1.4 Зависимость доли плодовой ДНК от массы тела и от ИМТ

Рисунок 19. Зависимость доли плодовой ДНК от массы тела.

На рисунке 19 представлен график зависимости доли плодовой ДНК от

массы тела беременной женщины. Наблюдается снижение доли ДНК плода с

ростом массы тела, однако коэффициент корреляции равен всего лишь -0,2.

Рисунок 20. Зависимость ИМТ от массы тела.

На рисунке 20 представлен график зависимости ИМТ от массы тела. Коэффициент корреляции 0,91.

86

Рисунок 21. Зависимость доли плодовой ДНК от ИМТ.

На рисунке 21 представлен график зависимости доли плодовой ДНК от

ИМТ беременной женщины, наблюдается снижение доли ДНК плода с

ростом ИМТ, коэффициент корреляции -0.18. Несмотря на то, что при

увеличении массы тела и ИМТ доля ДНК плода снижается, образцы для

которых доля ДНК плода была ниже необходимого минимума наблюдалась

среди женщин с различной массой тела. При проведении исследования нами

не выявлено достоверных отличий между женщинами с разным ИМТ, т.е.

высокий ИМТ не является противопоказанием к проведению исследования

при определении в процессе исследования доли плодовой ДНК.

3.1.5 Зависимость доли плодовой ДНК от срока беременности

На рисунке 22 представлен график зависимости доли плодовой ДНК от

срока беременности. С ростом срока беременности не наблюдается роста

доли плодовой ДНК, коэффициент корреляции 0, что отличается от данных

представленных в литературе. Вероятно, это обусловлено тем, что большая

часть исследований была проведена в сроках 11-15 недель, для более поздних

сроков беременности проведено небольшое количество исследований. По

87

данным Wang и соавторами, на сроках беременности 10 - 21 неделя доля

ДНК плода растет очень медленно, примерно на 0,1% в неделю [75]. Кроме

того, с увеличением срока беременности растет ИМТ.

Рисунок 22. Зависимость доли плодовой ДНК от срока беременности.

3.1.6 Транспортировка материала для исследования

Проведен анализ возможности ДНК-скрининга образцов, доставленных

из ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н.Городкова" Минздрава России (г.Иваново).

Проводился сравнительный анализ образцов, забранных в пробирки с EDTA,

прошедших процедуру отделения плазмы по месту забора крови и её

замораживание (доставка замороженной плазмы осуществлялась в

лабораторию молекулярно-генетических методов ФГБУ “НМИЦ АГП им.

В.И. Кулакова” Минздрава России машиной-рефрижератором) с образцами

крови, забор которых осуществлялся в пробирки Cell-Free DNA BCT (Streck,

США) объемом 10 мл, которые не подвергались заморозке. Образцы в

пробирках Cell-free DNA BCT доставлялись в лабораторию на исследование

в течение 2-х недель с момента забора. При анализе сравнивалась

концентрация выделенной ДНК для разных пробирок и доля плодовой ДНК.

88

Медиана доли плодовой ДНК для пробирок с EDTA составила 10,4%,

для пробирок Cell-free DNA BCT 10,2%. Медианы концентрации выделенной

ДНК составили 0,113 нг/мкл и 0,108 нг/мкл соответственно. Результаты

сравнения распределения доли плодовой ДНК для образцов, забранных в

пробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT приведены на рисунке 23. Сравнение

распределения концентрации выделенной ДНК для образцов, забранных в

пробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT приведено на рисунке 24. В обоих

случаях достоверных различий не наблюдалось.

Рисунок 23. Сравнение распределения доли плодовой ДНК для образцов, забранных в пробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT.

Рисунок 24. Сравнение распределения концентрации выделенной ДНК для образцов, забранных в пробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT.

89

3.1.7 Пренатальная диагностика с применением микроматричного анализа

Как правило, у пациентов с высоким риском хромосомной патологии по

результатам ДНК-скрининга исследование с применением микроматричного

анализа осуществлялось в качестве альтернативы стандартному

цитогенетическому кариотипированию на больших сроках беременности

(выше 20 недель). Этот метод не требует этапа культивирования и

результаты могут быть получены значительно быстрее (как правило, за 5-10

дней). Образец получаемых результатов представлен на рисунке 25.

Исследование с применением молекулярного кариотипирования

(микроматричного анализа) при проведении подверждающей пренатальной

диагностики было обязательным при выявленном при ДНК-скрининге риске

делеций и дупликаций (частичных анеуплоидиях). Пример применения

микроматричного анализа в подобной ситуации приводится в разборе

клинических случаев.

Рисунок 25. Применение молекулярного кариотипирования при

проведении пренатальной диагностки у пациента X., с высоким риском на

основании результатов ДНК-скрининга у плода трисомии 18.

90

Исследуемый материал на представленном рисунке – амниотическая

жидкость. В результате проведенного исследования трисомия по 18-й

хромосоме подтверждена. В ходе выполнения данной работы исследование с

применением микроматричного анализа проведено у 64 пациентов с высоким

риском анеуплоидий плода по результатам ДНК-скрининга в дополнение к

цитогенетическому исследованию, результаты определения анеуплоидий

совпали.

3.1.8 Пренатальная диагностика с применением метода QF-PCR

При проведении подтверждающей инвазивной пренатальной диагостики

при выявленном на основании результатов ДНК-скрининга высоком риске

трисомий 21, 18, 13, а также по половым хромосомам, помимо

цитогенетического и молекулярного кариотипироваия, нами широко

применялся метод QF-PCR. Образец получаемых при применении метода

QF-PCR результатов представлен на рисунке 26. Всего исследование

применялось в 53 случаях.

Рисунок 26. Применение метода QF-PCR при проведении исследования амниотической жидкости пациента С., с высоким риском у плода трисомии 13 по результатам ДНК-скрининга.

91

На представленном рисунке трисомия по 13-й хромосоме подверждается

по 4-м независимым маркерам: наблюдается наличие 3-х пиков при

исследовании STR-маркеров 13-й хромосомы D13628, D13S631, D13S742, а

также значительное различие в высоте у двух пиков, наблюдаемых при

исследовании STR-маркера 13-й хромосомы D13S634. Анализ удалось

провести во всех 53 случаях, включая 2 пренатальных исследования образцов

амниотической жидкости, когда исследование не удалось провести ни с

помощью стандартного кариотипирования (отсутствие роста культуры), ни с

помощью молекулярного кариотипирования (недостаточное количество

материала, плохое качество образца).

3.1.9 Анализ причин ложноположительных и ложноотрицательных результатов

Обобщенный анализ причин полученных ложноположительных и

ложноотрицательных результатов представлен в таблице 7.

Таблица 7. Анализ причин ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

ID образца

Результат кариотипирования

Результат НИПС

Доля плодовой

ДНК

Анализ причин

Ложноотрицательный результат

4295ABR

Трисомия 21

норма

10%

мозаицизм у ребенка обнаружено 3 клона клеток (T21 - 77 клеток (76%) M21 - 6 клеток (6%) D21 - 18 клеток (18%))

Ложноотрицательный/ложноположительный результат

3021GOL 47,XXX/46,XX 45,Х мозаицизм плода и плаценты

Ложноположительные результаты 3249ROM 46,XX 45,Х 17,3% мозаицизм матери K101 46,XX 45,Х 23,8% мозаицизм матери GA96 46,XX 45,Х 9,2% мозаицизм матери 6254PAN 46,XX 47,ХXX >90% трисомия у матери 8984BEL

46,XX

45,Х

4,2%

не установлена, вероятно плацентарный мозаицизм

92

Таблица 7. Анализ причин ложноположительных и ложноотрицательных результатов (продолжение).

Ложноположительные результаты 4081SHA

46,XX

45,Х

4,7%

не установлена, вероятно плацентарный мозаицизм

3574VAS

46,XX

45,Х

13%

не установлена, вероятно плацентарный мозаицизм

IGR43

46,XX

45,X

3,9%

не установлена, вероятно плацентарный мозаицизм

K163

46,ХХ

T13

15%

не установлена, вероятно плацентарный мозаицизм

5434 46,XY T7 11% не установлена, вероятно плацентарный мозаицизм 7143MIN 46,XX T7 8% мозаицизм плаценты (подтверженный FISH) 5179SIV фенотипически норма,

девочка T10 12,2% вероятно лимфоангиома

у матери

3.1.10 Выявление анеуплоидий при многоплодной беременности

Многоплодная беременность может быть либо однояйцевая

(монозиготными близнецами), либо многояйцевая (дизиготная). При

беременности однояйцевыми близнецами применение ДНК-скрининга, по

сути, ничем не отличается от проведения исследования при одноплодной

беременности. Более того, выявление патологии в случае, если оба плода

имеют анеуплоидии даже упрощается. При самостоятельных беременностях

монозиготные близнецы составляют примерно треть от всех близнецов, они

происходят из одной зиготы, разделившейся на ранних этапах эмбриогенеза.

При этом плацентация зависит от стадии, на которой разделяются эмбрионы.

В случае, когда разделение происходит до дифференцировки эмбриональных

клеток (в течение первых 4-х дней после оплодотворения), беременность

будет дихориальная, диамниотическая - она наблюдается примерно в 25-30%

монозиготных беременностей. При разделении клеточной массы на стадии

имплантации бластоцисты, беременность будет монохориальная,

93

диамниотическая - встречается в 70-75% монозиготных беременностей. Если

деление происходит после имплантации бластоцисты, то наблюдается

монохориальная, моноамниотическая беременность (такими являются 1-2%

новорожденных однояйцевых близнецов) [149]. Проведенные нами тестовые

исследования 9 пациентов после программ ВРТ не выявили каких-либо

затруднений при ДНК-скрининге, проводимом при беременности

монозиготными близнецами. Подобная ситуация обычно возникает в случае

переноса одного эмбриона с дальнейшим установлением наличия

многоплодной беременности. Однако, далеко не всегда имеется возможность

заранее с высокой степенью достоверности установить какая именно

многоплодная беременность наступила у обратившейся на ДНК-скрининг

беременной – монозиготными близнецами или дизиготными. Частота

наступления самостоятельной беременности разнояйцевыми близнецами

сильно различается в зависимости от популяции – минимальная в Азии

(6/1000), промежуточная в США и Европе (10-20/1000), максимальная в

Африке (40/1000). Частота монозиготных близнецов более постоянна и

составляет 4-4,5/1000 при самостоятельном наступлении беременности.

Дизиготная беременность наступает при оплодотворении двух разных

ооцитов и генетически близнецы в этом случае различаются между собой как

обычные братья и сестры. Возникновение дизиготных близнецов связывают с

повышенным содержанием в крови матери ФСГ (фолликулостимулирующего

гормона), с наследственностью, с возрастом, количеством родов и другими

факторами [148]. С целью валидации ДНК-скрининга при исследовании

близнецов, нами произведен ДНК-скрининг у 5 пациентов с дизиготной

беременностью, для которых ранее уже было установлено наличие трисомии

по 21-й хромосоме только у одного из двух плодов (т.е. имелась заведомо

сложная для проведения ДНК-скрининга ситуация). Также нами проведено

исследование у одного пациента с наличием многоплодной беременности

тройней с разнояйцевыми близнецами, только один из плодов при этом имел

трисомию по 21-й хромосоме. Во всех случаях ДНК-скрининг позволил

94

выявить наличие высокого риска трисомии 21, при этом доля плодовой ДНК

в данных наблюдениях превышала 8%. Более подробно наблюдение с

проведением ДНК-скрининга при беременности тройней приводится в

разделе с описанием клинических случаев.

3.1.11 Выявление редких и частичных анеуплоидий

Полногеномный подход при проведении ДНК-скрининга позволяет не

только устанавливать риск нарушений по 21, 18, 13 и половым хромосомам,

но также и выявлять риск других, редких анеуплоидий, а также частичных

анеуплоидий, делеций и дупликаций. В нашей работе было 10 подобных

наблюдений, их общая частота составила 0,7%. Они были представлены:

анеуплоидиями по 7-й хромосоме в 4-х случаях; трисомиями по 8-й

хромосоме в 2-х; трисомией по 10-й хромосоме – в 1-м случае, делециями и

дупликациями – в 3-х. Три наблюдения подробно описаны в разделе

“Описание отдельных клинических случаев”. Это доказанный случай

мозаицизма плаценты при выявленном при проведении ДНК-скрининга

риске трисомии по 7-й хромосоме, выявление частичной анеуплоидии по 4 и

12 хромосомам, выявление риска трисомии по 10-й хромосоме у пациента с

лимфангиомой щеки.

3.1.12 Сравнение с опытом применения ДНК-скрининга в мировой практике

Впервые в клинической практике НИПС начал применяться в 2011 году

в США [105]. По данным проводимых исследований, было установлено, что

ДНК-скрининг обладает высокими диагностическими характеристиками,

которые могут различаться для разных хромосом

[118,119,120,121,122,123,124] (см. таблицу 8).

95

Таблица 8. Диагностические характеристики ДНК-скрининга для различных хромосом приведены с 95% доверительным интервалом, рассчитанным по обобщенным данным [118,119,120,121,122,123,124].

Хромосома

Число

исследований

Чувствитель-

ность, %

Специфич- ность, %

Положительная предиктивная

оценка (PPV)1, %

Отрицательная предиктивная

оценка (NPV)2, %

21 77 308 99,17 (98,48-99,6)

99,94 (99,92-99,95)

96,07 (94,84-97,08)

99,99 (99,98-99,99)

18 77 308 97,80 (95,7-99,04)

99,94 (99,92-99,96)

88,97 (85,48-91,87)

99,99 (99,98-100)

13 69 572 95,74 (89,46-98,83)

99,93 (99,91-99,95)

65,75 (56,2-72,66)

99,99 (99,99-100)

X/Y 22 237 92,75 (83,89-97,61)

99,88 (99,91-99,94)

76,19 (65,65-84,81)

99,98 (99,95-99,99)

Приводимые выше данные демонстрируют высокую предсказательную

ценность отрицательного результата ДНК-скрининга, который с высокой

вероятностью позволяет исключить наличие анеуплоидий по 21, 18, 13 и

половым хромосомам. Сообщается, что в ряде клиник применение НИПС

позволило сократить число инвазивных процедур на 30% [125]. В

опубликованных в 2012 г. рекомендациях Американского общества акушеров

гинекологов (ACOG) применение НИПС считается показанным для группы

женщин с высоким риском [126]. В рекомендациях ACOG от 2015 г.

применение ДНК-скрининга признано целесообразным уже для всех

беременных женщин, вне зависимости от группы риска [127].

Несмотря на высокие диагностические характеристики, заявляемые

зарубежными авторами, следует признать, что большинство работ

проводится заинтересованными фирмами. Поэтому нет ничего

удивительного, что указанные в исследованиях цифры являются явно

завышенными и опровергаются конкретными клиническими примерами, 1 Положительная предиктивная оценка (PPV) – это процент лиц с положительными результатами теста, у которых имеется искомое заболевание. PPV позволяет оценить вероятность того, что заболевание действительно имеется, если результаты теста положительные. Зависит от свойств теста и характеристик исследуемой выборки. 2 Отрицательная предиктивная оценка (NPV) - это процент лиц с отрицательными результатами теста, у которых нет искомого заболевания. NPV позволяет оценить вероятность того, что заболевание действительно отсутствует, если результаты теста отрицательные. Зависит от свойств теста и характеристик исследуемой выборки.

96

полученными в нашей работе, демонстрирующими совершенно не редкие

биологические ограничения, накладываемые на эффективность метода,

которая по этой причине вряд ли превышает 99%. Также на текущий момент

представляется совершенно необоснованным отказ от комбинированного

скрининга I триместра, т.к. в нашей работе продемонстрировано, что эти

подходы во многом взаимодополняют друг друга.

В настоящее время в ряде стран проведение НИПС осуществляется

бесплатно беременным женщинам с высоким риском ХА (т.е. покрывается

медицинской страховкой), при этом в Нидерландах с апреля 2017 года ДНК-

скрининг проводится бесплатно всем беременным женщинам. Однако, при

этом в основном проводится исследование только на трисомии по 21, 18 и

13 хромосомам, хотя наша работа показывает важность исследования всех

хромосом. Это объясняется тем, что исследование нарушений по половым

хромосомам на практике связано со значительным числом

ложноположительных результатов, а исследование на другие аутосомы

ограничено применением таргентного подхода. Также во многих странах, в

отличие от России, не достаточно хорошо организовано проведение

обычного комбинированного скрининга I триместра, поэтому вопрос полного

перехода на ДНК-скрининг конкретных хромосом 21, 18 и 13 является

безальтернативным.

97

3.2 Описание отдельных клинических случаев

3.2.1 Трисомия по 21-й хромосоме при низком риске по результатам комбинированного скрининга I триместра

Пациент Ю., 35 лет, ИМТ = 19,4 кг/м2, обратилась для проведения ДНК-

скрининга на сроке беременности 13 недель 4 дня. Скрининг I триместра

проводился по месту жительства, установлен низкий риск хромосомной

патологии. По результатам УЗИ, видимых для данного срока пороков

развития эмбриона не выявлено. ТВП = 2,3 мм (норма), размеры носовой

кости соответствуют сроку беременности, конечности без видимой

патологии. В полости матки одно плодное яйцо, содержащее эмбрион,

частота сердечных сокращений 158 уд./мин., ритмичная. Копчико-теменной

размер 6,6 см; хорион по передней стенке, толщина 1,3 см. По результатам

биохимического обследования: PAPP-A = 0,80 МоМ; β-ХГЧ = 1,48 MoM.

Индивидуальные риски по результатам комибинрованного скрининга

I триместра низкие: риск трисомии 21 - 1:380; риск трисомии 18 - 1: 3400;

риск трисомии 13 - 1:10000 .

Забор крови для проведения ДНК-скрининга осуществлялся дважды, с

интервалом 3 недели. При проведении первого исследования концентрация

плодовой ДНК, измеренная по Y-хромосоме, составила 3,16% (ниже порога

чувствительности метода), по результатам второго исследования - 4,93%.

На основании результатов ДНК-скрининга установлен высокий

риск трисомии по 21-й хромосоме. Было рекомендовано очное медико-

генетическое консультирование для решения вопроса о проведении

подтверждающей инвазивной диагностики.

По результатам УЗИ на сроке беременности 17 недель патологии не

выявлено, наблюдалась задержка развития плода на 1 неделю.

По результатам инвазивной пренатальной диагностики

(кариотипирование амниотической жидкости) подтвердилось наличие

трисомии по 21-й хромосоме у плода мужского пола.

98

3.2.2 Мозаицизм у ребенка / плода – причина ложноотрицательного результата трисомии по 21-й хромосоме

Пациент А., 35 лет, ИМТ = 23,5 кг/м2, c высоким риском по результатам

комбинированного скрининга I триместра, установленным по месту

жительства, обратилась для проведения ДНК-скрининга в связи отказом от

проведения инвазивной процедуры. Забор крови был провезен на сроке

беременности 15 недель. По данным ДНК-скрининга, был установлен низкий

риск наличия трисомий по 13, 18 и 21 хромосомам. Доля плодовой ДНК

составила 10% (значительно выше 4%, порога чувствительности метода). В

связи с отсутствием также каких-либо УЗИ-маркеров хромосомной

патологии, женщина приняла решение пролонгировать беременность. После

рождения ребенка у пациента А., стало известно о возможном наличии у

новорожденного синдрома Дауна. Это было подтверждено микроматричным

анализом (рисунок 27).

Рисунок 27. Результаты молекулярного кариотипирования новорожденного

ребенка пациента А. Установлена трисомия по 21-й хромосоме. Optima,

Affymetrix.

99

Дополнительно было проведено исследование с применением метода

FISH, которое показало, что ошибочный результат при проведении ДНК-

скрининга связан с наличием у ребенка (а ранее, соответственно, и у

плода) 3-х клонов клеток - с моносомией, дисомией (нормой) и

трисомией по 21-й хромосоме. Полученные в результате FISH-

исследования результаты показаны на рисунке 28.

Рисунок 28. Исследование новорожденного ребенка пациента A. с применением метода FISH. В крови наблюдается мозаицизм по 21-й хромосоме - присутствуют 3 клона клеток – с одной, двумя и тремя хромосомами 21. Данный мозаицизм стал причиной ложноотрицательного результата ДНК-скрининга по 21 хромосоме.

При исследовании методом FISH была проанализирована 101 клетка

периферической крови. Для 21 хромосомы было обнаружено 77 (76%) ядер с

3 сигналами, 18 ядер (18%) с 2 сигналами и 6 (6%) ядер с 1 сигналом.

Анализ контрольной аликвоты образца плазмы из архива подтвердил

первоначальный результат ДНК-скрининга. Согласно полученным

результатам, вновь подтвердился низкий риск анеуплоидии по всем

хромосомам, при доле плодовой ДНК 10%. Также была проведена

100

контрольная индентификация образцов с применением полиморфных SNP

маркеров, которая подтвердила, что образцы биологически идентичны.

В возрасте 2-х месяцев у ребенка был снова осуществлен забор крови,

для проведения стандартного кариотипирования. Помимо этого, проведен

повторный анализ методом FISH. Кариотипирование производилось по 100

клеткам, что значительно больше обычно анализируемого количества.

Установленный кариотип: mos 47,XY+21[94]/46,XY[6]

Моносомных клонов клеток при кариотипировании обнаружено не

было.

Анализ методом FISH производился по 300 клеткам периферической

крови. Он подтвердил наличие 3-х клонов клеток с 3 сигналами для 21-й

хромосомы в 256 ядрах (85%), 32 сигналами в 56 ядрах (13%) и 1 сигналом в

5 ядрах (2%).

Несмотря на то, что принято считать, что моносомная линия аутосомных

клеток быстро элиминируется, результаты проведенных исследований

показали, что в незначительном количестве они могут сохраняться вплоть до

рождения ребенка. Материал плаценты в данном случае не был доступен для

исследования, но можно предположить, что низкая доля трисомных клеток в

плаценте не позволила выявить трисомию по 21 хромосоме с использованием

ДНК-скрининга.

Данное исследование продемонстрировало, что выявление мозаицизма,

в значительной степени зависит от метода, который используется при

исследовании. Как показано выше, исследование образца крови

новороженного ребенка пациента А. с использованием молекулярного

кариотипирования не выявило мозаицизма у ребенка. При этом FISH анализ

того же образца крови выявил наличие 3-х клонов клеток. Стандартное

кариотипирование периферической крови, произведенное в возрасте 2-х

месяцев не выявило моносомных клеток, кроме того, только 6%

проанализированных клеток имели нормальных кариотип. Согласно

Европейским рекомендациям по проведению цитогенетических

101

исследований (доступны на сайте https://www.e-c-a.eu), при стандартном

кариотипировании, в случае, когда не предполагается мозаицизма

проводится исследование 10-20 клеток. При данном количестве

исследованных клеток нормальные клоны могли быть не выявлены.

Отсутствие моносомных клонов клеток в результатах стандартного

кариотипирования может объясняться тем, что они хуже культивируются

перед цитеогенетически исследованием. Помимо этого, повторный забор

крови с новым анализом методом FISH продемонстрировал, что у ребенка

прошло изменение соотношения различных клонов клеток. Это может

связано с пониженной выживаемость моносомных по аутосомам клеток.

Соотношение разных клеточных линий может отличатсья разных

тканях, а также меняться в ходе беременности. Элиминация моносомных

клеток и влияние метода подтверждения анеуплоидии на конечный результат

может объяснить ложноотрицательные результаты, причины которых

остались неясными.

Данный случай показывает, что отрицательные результат ДНК-

скрининга не позволяет полностью исключить наличие анеуплоидии. Также

он подтверждает важность проведения скрининга I триместра и ограничения

ДНК-скрининга в случае беременностей с высоким риском по данным

комбинированного скрининга.

102

3.2.3 Мозаицизм плаценты - причина выявленного риска трисомии хромосомы 7

Пациент М., 39 лет, ИМТ = 23,0 кг/м2, обратилась для проведения

неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий плода по крови

матери на сроке беременности 13 недель 6 дней. У пациента 2-ая

беременность. Основанием для проведения ДНК-скрининга являлся старший

репродуктивный возраст женщины. В результате проведенного исследования

установлен высокий риск трисомии по хромосоме 7. Риск анеуплоидий по

хромосомам 13, 18, 21, а также по половым хромосомам оценен как низкий, в

связи этим было рекомендовано пролонгирование беременности.

Установленный в ходе исследования пол плода – женский. Доля плодовой

ДНК составила 8,% (выше 4% - порога чувствительности метода).

Изначально в ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава

России женщина обратилась для наблюдения за течением беременности.

Соматически не отягощена. Первая беременность (в 25 лет) протекала без

осложнений, завершилась своевременными оперативными родами (тазовое

предлежание), родился живой доношенный мальчик 3340/51 см, Апгар 8/9

баллов.

Данная беременность наступила самопроизвольно. С ранних сроков

беременности было диагностировано низкое расположение плаценты

(доходит до области внутреннего зева), краевое прикрепление пуповины.

Был проведен пренатальный скриниг I триместра, все показатели в пределах

нормы (риск хромосомной патологии плода низкий).

С 23 недель беременности был диагностирован гестационный сахарный

диабет, назначена диетотерапия. В 25 недель беременности установлен

диагноз: железодефицитная анемия средней степени тяжести (Hb – 83 г/л),

была проведена антианемическая терапия препаратами железа.

В III триместре беременность осложнилась угрожающими

преждевременными родами, в связи с появлением кровянистых выделений из

103

половых путей пациентка была госпитализирована, проведена

гемостатическая терапия, гормональная терапия микронизированным

прогестероном, проведена профилактика респираторного дистресс -

синдрома плода. С 29 недель беременности отмечено умеренное маловодие.

В дальнейшем – течение беременности без осложнений. В связи с

наличием краевого предлежания плаценты и наличием рубца на матке после

предыдущей операции кесарева сечения в 2003 году, в сроке 39 недель

проведена операция: кесарево сечение. Родилась живая доношенная девочка.

Массой 2838 грамм, ростом 48 см., Апгар 8/9 баллов. Объем кровопотери

800 мл.

После родоразрешения произведено исследование плаценты. Забор

образцов для лабораторного исследования производился из 4-х сегментов:

верхнего левого, нижнего левого, нижнего правого, верхнего правого (см.

рисунок 29).

Рисунок 29. Исследование плаценты. Количество вырезанных блоков - 4.

104

Макроскопическое описание плаценты

Общая масса последа после отделения пуповины и амниотических

оболочек 398 г (< 10 percentiles ), малая для гестационного срока плацента.

Размеры плацентарного диска -18х17х2 см. Форма плаценты - правильная.

Плодная поверхность: фиолетового цвета. Вид - блестящая, наложения - нет.

Материнская поверхность: синюшно-красного цвета. Вид - блестящая,

наложения - нет.

МВП полнокровное. Пуповина: длина 27 см, диаметр 0,5 см,

прикрепление краевое.

Извитость пуповины, витков: 12. 1 ложный узел. Индекс извитости

пуповиы (ИИП) 0,44. Плодные оболочки: цвет серовато-розовый, вид -

блестящие. наложение желтые, точечные.

Количество вырезанных блоков (кусочков) 4.

Микроскопическое описание плаценты

Пуповина: строение правильное, артерии и вены спавшиеся,

воспалительных изменений нет.

Оболочки: воспалительных изменений - нет

Хорион: в строении ворсинчатого дерева преобладают зрелые

промежуточные ворсины, количество полноценно капилляризованных

терминальных ворсин 15-20 %; единичные незрелые промежуточные

ворсины ограничены небольшими участками. Строма большинства

стволовых ворсин фиброзирована. Балльная оценка – 21 (норма 22).

Отставание созревания ворсинчатого дерева на 2-3 недели. Умеренно

выраженные компенсаторные процессы в виде синцитиальных почек (++),

синцитиокапиллярные мембраны в небольшом количестве (+).

Дистрофические процессы умеренно выражены: десквамация

синцитиотрофобласта (+). Плодный фибриноид (++). Дистрофическое

обызвествление (+++). Очаговые некрозы базальной пластинки (++). Старые

105

и свежие инфаркты ворсинчатого дерева с очагами обызвествления и

свежими кровоизлияниями. Воспаления нет.

Патологогистологическое заключение (диагноз)

Малая для гестационного срока плацента. Замедленное созревание

ворсинчатого дерева. Компенсированное состояние плаценты. Старые и

свежие инфаркты ворсинчатого дерева. Краевое прикрепление и

гиперизвитость пуповины (индекс извитости 0,44).

Код диагноза МКБ-10: [O43.8] Другие плацентарные нарушения

Цитогенетическое исследование плаценты

Исследование производили методом FISH, с применением зондов

Poseidon DNA Probes SE 7(D7Z1), green (производства фирмы Kreatech,

Нидерланды). Исследовался биоптат плодовой части плаценты, полученный

из 4-х сегментов: верхний левый, нижний левый, нижний правый и верхний

правый сегменты. Ниже представлены полученные результаты по отдельным

сегментам.

1) Верхний левый сегмент

nuc ish 7(D7Z1*2)[120]/7(D7Z1*3)[71]/7(D7Z1*4)[9]

- 60% - 3 сигнала, 35%- 2 сигнала, 5%- 4 сигнала.

Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 60 процентах клеток.

2) Нижний левый сегмент

nuc ish 7(D7Z1*2)[165]/7(D7Z1*3)[35]

- 82% - 2 сигнала, 18% - 3 сигнала.

Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 18 процентах клеток.

3) Нижний правый сегмент

nuc ish 7(D7Z1*2)[189]/7(D7Z1*3)[11]

- 95% - 2 сигнала, 5%- 3 сигнала.

Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 5 процентах клеток.

106

4) Верхний правый сегмент

nuc ish 7(D7Z1*2)[131]/7(D7Z1*3)[69]

- 65% - 2 сигнала, 35% - 3 сигнала.

Трисомия по 7-й хромосоме наблюдается в 35 процентах клеток.

Полученные результаты также представлены на рисунке 30.

В качестве контроля исследовалась кровь нормальной здоровой

женщины, исследовались 200 клеток, сигналов с трисомией по 7-й

хромосоме не выявлено.

Цитогенетическое исследование ребенка

Произведено исследование стандартного кариотипа ребенка пациента М.

по периферической крови новорожденной девочки. Установлен нормальный

кариотип 46,ХХ в 30 клетках. Дополнительно произведено исследование

крови ребенка методом FISH по 7 хромосоме: 46,ХХ.ish 7(D7Z1*2)[200]. Т.е.

во всех 200 исследованных клетках выявлена дисомия по 7 хромосоме

(норма).

Рисунок 30. Пациент М., мозаицизм по 7-й хромосоме в различных сегментах плаценты.

107

3.2.4 Выявление частичной анеуплоидии по 4 и 12 хромосомам

Пациент П., 30 лет, ИМТ = 17,6 кг/м2. У плода по результатам ДНК-

скрининга выявлен высокий риск частичной делеции 4-й хромосомы и

частичной дупликации 12-й хромосомы, результаты были потверждены

микроматричным анализом амниотической жидкости. Беременность была

прервана на сроке беременности 18 недель. Результаты пренатальной

диагностики по амниотической жидкости представлены на рисунке 31.

Рисунок 31. Результаты молекулярного кариотипирования амниотической жидкости пациента П.

Установленный в ходе исследования молекулярный кариотип плода:

arr[hg19] 4p16.3(68,345-35,195,686)x1 - делеция короткого плеча

4-й хромосомы размером 35 млн. п.н. Данная делеция соответствует Wolf-

Hirschhorn syndrome (OMIM 194190);

arr[hg19] 12p13.33p11.22(173,786-28,183,286)x3 - дупликация короткого

плеча 12 хромосомы размером 28 млн п.н. Дупликация в данном регионе

описана как Pallister-Killian syndrome (OMIM 601803).

Обнаруженные у плода делеция и дупликация – патогенные, в связи с

чем было рекомендовано прерывание беременности. Также рекомендовано

кариотипирование самих супругов. При проведении кариотипированя у

108

матери выявлена сбалансированная транслокация с вовлечением 4-й и 12-й

хромосом, которая и была причиной появления нарушений у плода.

Результаты кариотипирования представлены на рисунке 32.

Рисунок 32. Результаты кариотипирования пациента П. (кариотип самой матери).

Как следует из результатов проведенного исследования, с помощью

полногеномного ДНК-скрининга удалось выявить крайне редкие

хромосомные нарушения с вовлечением 4-й и 12-й хромосом, что

невозможно сделать при проведении неинвазивного скрининга с

использованием таргетного подхода. Это позволило не только предотвратить

рождение больного ребенка, но выявить причину, по которой эти нарушения

у плода возникли. В связи с высоким риском хромосомных нарушений при

следующей беременности, супругам рекомендовано проведение

преимплантационной генетической диагностики.

109

3.2.5 Выявление трисомии 10 у пациента с лимфангиомой щеки

Пациент Л., возраст 28 лет, ИМТ = 21,7 кг/м2, обратилась для

проведения ДНК-скрининга на сроке беременности 14 недель 5 дней в связи

с повышенным уровнем β-ХГЧ. Скрининг I триместра проводился на сроке

беременности 12 недель 6 дней, хорион расположен низко по задней стенке

толщиной 1,4 см, ТВП - 1,5 мм, носовая кость определяется. Биохимические

маркеры β-ХГЧ = 6,098 МоМ; PAPP-A=1,377MoM. Установленный по

результатам комбинированного риска I триместра риск хромосомной

патологии плода низкий – риск трисомии 21 - 1:2638; риск трисомии 18 -

1:20000; риск трисомии 13 - 1:20000. В анамнезе - неразвивающаяся

беременность в I триместре (в 6 недель, по результатам гистологии -

частичный пузырный занос).

По результатам проведенного ДНК-скрининга пол плода - женский, доля

плодовой ДНК по SNP составила 12,2% (значительно выше 4%, порога

чувствительности метода). Риска анеуплоидий по хромосомам 13, 18, 21 и

половым хромосомам не выявлено.

Установлен высокий риск трисомии по 10-й хромосоме.

Рекомендовано пролонгирование беременности под наблюдением

акушера-гинеколога. В связи с выявленными особнностями 10 хромосомы,

вероятно обусловленными наличием врожденного образования у женщины -

лимфангиомы правой щеки значительных размеров, рекомендовано

динамическое наблюдение - УЗИ и молекулярно-генетический анализ

повторно в 20-21 неделю, от проведения которого пациент отказалась. При

проведении УЗИ на сроке 20 недель беременности маркеры хромосомных

аномалий и врождённые пороки развития не выявлены, низкая плацентация.

При проведении УЗИ в 24 недели выявлен мелкий дефект межжелудочкой

перегородки в перимембранозном отделе. По данным УЗИ в 36 недель 1 день

- один живой плод в головном предлежании, продольном положении

(головка плода низко). Начальные проявления пиелоэктазии слева.

110

3.2.6 Выявление трисомии 21 у одного плода из тройни

Пациент: К. Возраст: 36 лет. ИМТ = 22,0 кг/м2. Карта №: 61242/18.

Женщина обратилась для проведения инвазивной пренатальной

диагностики. По результатам УЗИ на момент обращения: беременность

трихориальная триамниотическая, соответствует 9-10 неделям.

В анамнезе - 1 нормальный ребенок, 1 искусственный аборт без

осложнений, 1 неразвивающаяся беременность двойня в сроке 5 - 6 недель,

без выскабливания. Настоящая беременность наступила самопроизвольно.

Течение без осложнений.

Анамнез жизни: Перенесенные заболевания: в оспа, краснуха.

Аутоиммунный тиреоидит. По ЭКГ- блокада правой ножки пучка Гиса (со

слов). Перенесенные операции: не было. Семейный анамнез:

Наследственность не отягощена. Аллергоанамнез: Но-шпа

Гемотрансфузионный анамнез: Гемо-плазмотрансфузии отрицает. Вредные

привычки: отрицает. Профессиональных вредностей нет. Семейное

положение: брак зарегистрирован. Брак по счету: 2.

Возраст мужа: 37 лет. У супруга брак первый.

Группа крови отца ребенка: A (II).

Резус-принадлежность отца ребенка: (+) положительный.

Гинекологический анамнез: менструация с 14 лет, установились сразу.

Регулярные, через 24-25 дней по 5-7 дней. Умеренные. Болезненные.

День менструального цикла: 68.

Гинекологические заболевания: Эрозия шейки матки, лазеркоагуляция;

кандидоз.

3 берем. - замершая беременность двойня в сроке 5-6 недель, без

выскабливания.

Рост: 168 см. Вес: 63 кг. ИМТ: 22,3 кг/м2.

Забор материала для инвазивной диагностики производился на сроке

беременности 9-10 недель (биопсия хориона).

111

Установлены кариотипы:

1. 1-й правый плод из тройни:

46,XY,9ph - норма (гетерохроматиновый район на 9-й хромосоме -

полиморфизм, нормальный)

2. 2-й средний плод из тройни:

46,XY,9ph - норма

3. 3-й левый плод тройни:

47,XX,+21 - трисомия по 21-й хромосоме у плода женского пола.

Заключения по кариотипам приводятся в приложении 6.

Забор крови для ДНК-скрининга производился перед проведением

инвазивной процедуры, после подписания информированного согласия,

образец зарегистрирован под лабораторным номером k734.

ДНК-скрининг установил высокий риск трисомии по 21-й

хромосоме.

Лабораторные данные ДНК-скрининга приводятся в приложении 7.

При проведении УЗИ на сроке беременности 12 недель 3 дня выявлена

прогрессирующая дихориальная диамниотическая двойня. Ультразвуковые

маркеры хромосомных аномалий и врождённые пороки развития не

выявлены. Установлена спонтанная редукция аномального плода. После

повторного подписания информированного согласия, был произведен новый

забор крови для ДНК-скрининга, образец зарегистрирован под лабораторным

номером k734B.

Повторное исследование вновь продемонстрировало высокий риск

трисомии по 21-й хромосоме. Результаты ДНК-скрининга пациента К. при

повторном заборе крови приведены в приложении 8. Зависимость

нормированного покрытия от GC состава и отклонение покрытия от

референсных данных по всем хромосомам приведено в приложении 9.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии эффекта

“замершего близнеца,” т.к. на момент повторного забора крови по УЗИ

наблюдалась беременность только двумя здоровыми плодами мужского пола

112

(пол установлен по кариотипу, с учетом расположения плодов при

проведении УЗИ). Также наблюдается изменение в соотношении половых

хромосом. Это доказывает существование биологических ограничений при

применении ДНК-скрининга.

113

Заключение

Целью работы являлась оценка возможности использования

неинвазивного анализа внеклеточной ДНК крови матери для

совершенствования системы пренатального скрининга анеуплоидий плода.

Согласно проведенному исследованию, в большинстве случаев, ДНК-

скрининг может проводиться уже с 10-11 недель беременности, в том числе и

у повторно беременных. Благоприятные результаты ДНК-скрининга

позволяют с высокой вероятностью исключить анеуплоидии плода по

исследуемым хромосомам, в том числе при решении вопроса о

пролонгировании беременности на ранних сроках у женщин с угрожающим и

привычным выкидышем. При выявлении высокого риска хромосомных

нарушений с помощью ДНК-скрининга по крови матери необходимо

проведение медико-генетического консультирования и, в случае отсутствия

врожденных аномалиий (пороков развития) по результатам УЗИ, выполнение

подтверждающих диагностических инвазивных процедур, что связано с

биологическими ограничениями метода. Подтверждающую пренатальную

диагностику желательно проводить по амниотической жидкости, а не по

хориону, чтобы минимизировать ошибки, связанные с плацентарным

мозаицизмом. При этом допустимо использование методов QF-PCR и FISH,

которые позволяют получать результаты в кратчайшее время, т.к. не требуют

этапа культивирования клеток амниотической жидкости. В случае, если

результаты ДНК скрининга не подтверждаются с применением QF-PCR и

FISH, необходимо исследование всего кариотипа.

Также, согласно нашим исследованиям, на сроках 11-18 недель

беременности отсутствует значимая корреляция доли плодовой ДНК со

сроком беременности. Это следует учитывать при рассмотрении вопроса о

назначении повторного забора крови при низкой доле плодовой ДНК, т.к.

причиной могут быть, например, принимаемые женщиной лекарственные

препараты.

114

В рамках проведенной работы был определен комплекс факторов,

предрасполагающих к успешному выявлению беременных с высоким риском

хромосомных нарушений плода, определена зависимость доли плодовой

ДНК в зависимости от срока беременности, а также от индекса массы тела и

от веса беременной, от условий транспортировки биологического материала

в лабораторию. Установлено, что транспортировка материала в лабораторию

может осуществляться как в виде замороженной плазмы, так и виде цельной

крови. Уточнены ограничения для проведения ДНК-скрининга, оценены

возможности полногеномного ДНК-скрининга анеуплоидий плода по

выявлению не только распространенных трисомий по 13, 18, 21 и половым

хромосомам, но также и при выявлении редких хромосомных нарушений,

включая частичные анеуплоидии. В ходе работы показана возможность

проведения ДНК-скрининга при многоплодной беременности, причем не

только при монозиготной (однояйцевой) беременности, но и при дизиготной

беременности. Более того, продемонстрирована возможность применения

ДНК-скрининга даже при беременности тройней.

В ходе проведенной работы уточнены оптимальные способы проведения

подтверждающей диагностики при выявлении высокого риска хромосомной

патологии плода по результатам ДНК-скрининга. Необходимым этапом

исследования является определение доли плодовой ДНК. Если она ниже

порога чувствительности метода (около 4%), то результаты ДНК-скрининга

могут быть недостоверными. Для определения доли плодовой ДНК в ходе

проведенного исследования разработаны и валидированы методы,

позволяющие измерять долю плодовой ДНК вне зависимости от пола плода.

Наши исследования показали, что высокий ИМТ не является важным

ограничением при проведении ДНК-скрининга, т.к. у большинства

беременных с повышенным весом доля плодовой ДНК превышает порог

чувствительности метода.

115

Выводы

1. В ходе проведенного исследования продемонстрировано, что ДНК-

скрининг анеуплоидий плода по крови матери обладает значительно более

высокими чувствительностью и специфичностью по сравнению с

применяемыми в настоящее время стандартными комбинированными

скринингами первого и второго триместров беременности. Это позволяет

рекомендовать применение ДНК-скрининга беременным женщинам с низким

риском по результатам комбинированного скрининга I и II триместров.

2. Благодаря более высокой специфичности ДНК-скрининг может

рассматриваться в качестве уточняющего риск скринингового исследования

перед инвазивной диагностикой для беременных с высоким риском по

результатам комбинированного скрининга. Это позволит снизить число

проводимых инвазивных процедур, что особенно актуально для женщин с

отягощенным акушерским анамнезом, а также при ведении беременных с

ВИЧ-инфекцией.

3. Несмотря на то, что ДНК-скрининг является высокочувствительным и

высокоспецифичным способом выявления анеуплодий, его эффективность не

может достигать 100% из-за биологических ограничений: мозаицизм матери,

плода и плаценты.

4. В случае выявления высокого риска анеуплоидий по результатам

ДНК-скрининга, при отсутствии врожденных аномалиий (пороков развития)

по результатам УЗИ, необходима подтверждающая инвазивная пренатальная

диагностика, которую желательно проводить по амниотической жидкости с

применением методов цитогенетического или молекулярного

кариотипирования, также допустимо использование QF-PCR или FISH.

5. Полногеномное высокопроизводительное секвенирование позволяет

получать информацию не только об анеуплоидиях по 13, 18, 21 и половым

хромосомам плода, но клинически значимых полных и частичных

анеуплоидиях по другим хромосомам плода, плаценты и самой матери, в том

числе связанных с осложнениями течения беременности.

116

Продемонстрирована возможность проведения ДНК-скрининга при

многоплодной беременности.

6. При разработке нормативных документов, регламентирующих

проведение ДНК-скрининга, следует учитывать, что отсутствует значимая

корреляция доли плодовой ДНК со сроком беременности в рекомендованный

для проведения НИПС период с 11 по 18 неделю беременности, при этом

высокий ИМТ не является важным ограничением к проведению

исследования. Доля плодовой ДНК является крайне важным критерием

валидности ДНК-скрининга и её определение должно быть

регламентировано в обязательном порядке.

117

Практические рекомендации

1. Проведение ДНК-скрининга может быть рекомендовано всем

беременным, в т.ч. женщинам с низким риском по результатам

комбинированного скрининга.

2. Высокий индекс массы тела не является ограничением для

исследования.

3. При выявлении высокого риска по результатам ДНК-скрининга

показана инвазивная пренатальная диагностика, которую желательно

проводить с применением методов кариотипирования амниотической

жидкости, допустимо также использование QF-PCR или FISH.

4. ДНК-скрининг желательно проводить с применением полногеномного

подхода, что позволяет получать информацию не только об анеуплоидиях по

13, 18, 21 и половым хромосомам плода, но клинически значимым полным и

частичным анеуплоидиям по другим хромосомам плода, плаценты и самой

матери, в том числе связанным с осложнениями течения беременности.

118

Перспективы дальнейшей разработки темы

1. Внедрение ДНК-скрининга по крови матери как рутинного скрининга

беременных может совершить прорыв в оказании помощи беременным

женщинам, позволит снизить число проводимых инвазивных процедур, при

этом существенно уменьшить частоту рождения детей с тяжелыми

инвалидизирующими заболеваниями и перинатальную смертность. Однако,

несмотря на свою неинвазивность, ДНК-скрининг направлен на выявление

хромосомных анеуплоидий у плода, лечение которых на сегодняшний день

невозможно. Поэтому единственным способом предотвращения рождения

больного ребенка является прерывание беременности больным плодом.

Однако, при применяемых в настоящий момент подходах, диагностика

завершается в сроки, когда редукция больного плода при многоплодной

беременности уже невозможна, т.к. она влечет гибель также и здоровых

плодов. В связи с этим, необходима разработка новых технологий,

позволяющих завершить диагностические мероприятия, включающие ДНК-

скрининг и инвазивную пренатальную диагностику, на более ранних сроках

беременности.

2. Представляется необходимой дальнейшая работа по оценке

клинической значимости выявляемых при полногеномном ДНК-скрининге

редких и частичных анеуплоидий, делеций и дупликаций различного

происхождения (плодового, материнского, плацентарного).

3. Требует дальнейшей разработки нормативная база. В частности, при

широком внедрении ДНК-скрининга, существует вероятность использования

его результатов в немедицинских целях, например, для селекции по полу.

Это следует учитывать при разработке нормативных документов,

регламентирующих проведение массового ДНК-скрининга, в частности,

представляется нецелесообразной выдача информации о поле плода на

ранних сроках беременности, когда по действующему законодательству

допускается прерывание беременности без медицинских показаний.

119

Список сокращений

ДНК-скрининг - неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий

НИПС - неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий

НИПТ - неинвазивный пренатальный тест

NGS – высокопроизводительное секвенирование

ХА - хромосомные анеуплоидии

УЗИ - ультразвуковое исследование

ТВП - толщина воротникового пространства

АФП - плазменный протеин А

PAPP-A - ассоциированный с беременностью протеин-А плазмы

β-ХГЧ - свободная бета-субъединица хорионического гонадотропина

ИМТ - индeкс массы тела

ВПР - врожденные пороки развития

ДНК - дeзоксирибонуклeиновая кислота

п.н. - пары нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

QF-PCR – количественная флюоресцентная ПЦР

ХМА - хромосомный микроматричный анализ

SNP – однонуклеотидный полиморфизм ДНК

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

PPV - положительная предиктивная оценка

NPV - отрицательная предиктивная оценка

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

120

Список литературы

1. Баранов В.С. Пренатальная диагностика наследственных

болезней. Состояние и перспективы / В.С. Баранов В.С., Т.В. Кузнецова, Т.К.

Кащеева, Т.Э. Иващенко. - СПб.: Н-Л, 2017. – с.471.

2. Кащеева Т.К. Анализ случаев рождения детей с болезнью Дауна в

Санкт-Петербурге в 1997-2006 годах. / Т.К. Кащеева, Л.В. Лязина,

Н.В. Вохмянина и др. // Журнал акушерства и женских болезней – 2007. - Т.

LVI - №1 – с.11-15.

3. Жученко Л.А. Реализация мероприятий Национального проекта

«Пренатальная (дородовая) диагностика нарушений развития ребенка» в

Московской области. / Л.А. Жученко, Е.Н. Андреева, Е.Ю. Воскобоева и др.

// Российский вестник акушера-гинеколога - 2013. - №3 – с.6-12.

4. Сухих Г.Т. Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг

анеуплоидий плода по крови матери методом высокопроизводительного

секвенирования. Клинические рекомендации. / Г.Т. Сухих, Д.Ю. Трофимов,

И.Ю. Барков и др. // Акушерство и гинекология. - 2016.- № 6 – с.1-22.

5. Arnold J. Beobachtungen über Kerntheilungen in den Zellen der

Geschwülste/ J. Arnold // Virchows Archiv Pathol. Anat. - 1879/ - T.78 - №2 –

с.279-301.

6. Flemming W. Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung. / W. Flemming //

Leipzig, Vogel - 1882. – 465c.

7. Winiwarter H. Etudes sur la spermatogénèse humaine. / H. Winiwarter

// Arch. de Biol. - 1912. - № 27 – с.90–189.

8. Painter T.S. Studies in mammalian spermatogenesis. II.

Spermatogenesis of man. / T.S. Painter // J. Exp. Zool. - 1923. - V.37. - 291c.

9. Tjio J.H. The Chromosome Number of Man. / J.H. Tjio, A. Levan /

Hereditas – 1956. - № 42 – с.1–6.

10. Ford C.E. The chromosomes of man. / C.E. Ford, J. L. Hamerton /

Nature - 1956. - T.4541 - №178 – с.1020-3.

121

11. Lejeune J. Study of somatic chromosomes from 9 mongoloid children.

/ J. Lejeune, M. Gautier, R. Turpin // Les Comptes Rendus Hebdomadaires des

Séances de L’Académie des Sciences - 1959. - № 248 – с.1721-1722.

12. Ekimov A.N. Results of the incorporation of the preimplantation

genetic screening using Agilent platform into the clinical practice. / A.N. Ekimov,

E.V. Ekimova, A.N. Abubakirov, D.Yu Trofimov // 13-th Ann. Meet.

Preimplantation Genet. Diagnosis Intern. Soc. (PGDIS). Canterbury, UK.

Chromosome Research. Abstract book. - 2014. - T.22- № 4 – с.573-643 – p.15.

13. Jacobs P.A. A case of human intersexuality having a possible XXY

sexdetermining mechanism. / P.A. Jacobs, J.A. Strong // Nature - 1959. - №182 –

с.302-303.

14. Ford C. E. A sexchromosome anomaly in a case of gonadal dysgenesis

(Turner's syndrome). / C.E. Ford, O.J. Miller, P.E. Polani, J.C. de Almeida, J.H.

Briggs // Lancet - 1959. - Т 7075 - №1 – с.711-713.

15. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. /

M. Seabright // Lancet - 1971. –T.7731 - №2 – с.971-972.

16. Therkelsen A.J. Difference in the frequency of sex chromatin positive

cells in the different intermitotic phases of human cells in tissue culture. / A.J.

Therkelsen, L.U. Lamm // Exp. Cell Res. - 1966. - Т.44 - №2 – с.636-40.

17. Nagaoka S.I. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into

an age - old problem. / S. I. Nagaoka, T. J. Hassold, P. A. Hunt // Nat. Rev. Genet.

- 2012. - Т. 13 - № 7- с.493-504.

18. Fuchs F. Antenatal sex determination. /F. Fuchs, P. Riis // Nature. -

1956. – Т.4503 - №177- с.330.

19. Steele M.W. Chromosome analysis of human amniotic-fluid cells. /

M.W. Steele, W.R. Breg //Lancet. - 1966. – Т. 7434 - №1 – с.383-5.

20. Ghi T. ISUOG Practice Guidelines: invasive procedures for prenatal

diagnosis. / T. Ghi, A. Sotiriadis, P. Calda, C. Da Silva, N.S. Raine-Fenning, Z.

Alfirevic, G. McGillivray // Ultrasound Obstet. Gynecol. - 2016. - T.2 - № 48 –

с.256-68.

122

21. Xiang Y. Cordocentesis: a useful method for prenatal diagnosis. / Y.

Xiang, N. Sun, X. Chang, X. Bian, F. Wang // Chin. Med. J. (Engl.) – 1996. –

T.109 - №4 – с.291-294.

22. Kazy Z. Chorion biopsy in early pregnancy: a method for early

prenatal diagnosis for inherited disorders. / Z. Kazy, I.S. Rozovsky, V.A.

Bakharev // Prenat. Diagn. – 1982. - № 2 – с.39-45.

23. Caspersson Т. The use of fluorescence techniques for the recognition

of mammalian chromosomes and chromosome regions. / T. Caspersson Т., J.

Lindsten, G. Lomakka, A. Moller, L. Zech // Int. Rev. Exp. Pathol. – 1972. -

№11 – с.1-72.

24. Levy B. Prenatal diagnosis by chromosomal microarray analysis. /

В. Levy, R. Wapner // Fertil Steril. 2018. – T.109 - №2 – с.201-212.

25. Yourno J. A method for nested PCR with single closed reaction tubes.

/ J. Yourno // PCR Methods Appl. - 1992. - №1 – с.60-65.

26. Adinolfi M. Rapid detection of aneuploidies by microsatellite and the

quantitative fluorescent polymerase chain reaction. / M. Adinolfi, B. Pertl,

J. Sherlock // Prenat. Diagn. – 1997. - №17 – с.1299-311.

27. Tkachuk D.C. Clinical applications of fluorescence in situ

hybridization. / D.C. Tkachuk, D. Pinkel, W.-L. Kuo [et al.] // Genet. Anal. Tech.

Appl. – 1991. - № 8 – с.67-74.

28. Klinger K.W. Multicolor fluorescence in situ hybridization for the

simultaneous detection of probe sets for chromosomes 13, 18, 21, X and Y in

incultured amniotic fluid cells. / K.W. Klinger, G. Landes, W. Dackowski [et al.]

// Hum. Mol. Genet. – 1992. - № 1 – с.307-313.

29. Барков И.Ю. Пренатальное определение пола. / И.Ю. Барков,

В.А. Бахарев, Н.А. Каретникова. // Проблемы репродукции. - 1999. – T. 5 -

№ 1- с.5-14.

30. Walkonowska J. Practical and theoretical indications of fetal maternal

lymphocyte transfer. / J. Walkonowska, F.A. Conte, M.M. Grumbach // Lancet -

1969. - T.7606 - № 1- с.1119-1122.

123

31. Warren R. Prenatal sex determination from exfoliated cells found in

cervical mucus. / R. Warren, L. Sanchez, D. Hammond, A. McLeod // Am. J.

Hum. Genet. – 1972. - № 24 – с.22-6.

32. Grosset L. Antenatal fetal sex determination from maternal blood

during early pregnancy. / L. Grosset L., V. Barrelet, N. Odartchenko // Am J.

Obstet. Gynecol. – 1974. - №120 - с.60-63.

33. Faust J. Antenatal diagnosis of fetal sex by detection of Y-chromatin

containing cells in maternal blood. / J. Faust, A. Bewerunge, M. Habedank,

P. Kopecky // Geburtshilfe Frauenheilkd - 1976. – T. 36 -№ 12 – с.1091-8.

34. Bobrow М. Unreliability of fetal sexing using cervical material. /

M. Bobrow, B. V. Lewis // Lancet – 1971. - № 2- с.486.

35. Schroder J. Fetal leukocytes in the maternal circulation after delivery. /

J. Schroder, A. Tilikainen., A. de la Chapelle // Transplantation - 1974. -№ 17 –

с.346-354.

36. Rhine S.A. A simple alternative to amnioсentesis for first trimester

prenatal diagnosis. / S.A. Rhine, C.G. Palmer, J.F. Thompson // Birth Defects

Orig. Artie Ser. – 1977. - №12 – с.231-247.

37. Goldberg М. First-trimester fetal chromosomal diagnosis using

endocervical lavage: a negative evaluation. / M. Goldberg, A.T.L. Chen, Y.W.

Ahn, J.A. Reidy // Am. J. Obstet. Gynecol. – 1980. - № 138 – 436 – с.440.

38. Iverson G.M. Detection and isolation of fetal cells from maternal

blood using the flourescence-activated cell sorter (FACS). / G.M. Iverson, D.W.

Bianchi, H.M. Саnn, L.A. Herzenberg // Prenat. Diagn. – 1981. - № 1- с.61-73.

39. Busch J. Enrichment of fetal cells from maternal blood by high

gradient magnetic cell sorting (double MACS) for PCR- based genetic analysis. /

J. Busch // Prenat. Diagn. – 1994. – T.14 - №12 – с.1129-1140.

40. Zheng Y.L. Prenatal diagnosis from maternal blood: simultaneous

immunophenotyping and FISH of fetal nucleated erythrocytes isolated by negative

magnetic cell sorting. / Y.L. Zheng, N.P. Carter, C.M. Price [et al.] // J. Med.

Genet. – 1993. - № 12 – с.1051-1056.

124

41. Simpson J.L. Isolating fetal cells in maternal circulation for prenatal

diagnosis. / J.L. Simpson, S. Elias // Prenat. Diagn. - 1994. - T.14 - №13 – с.1229-

42.

42. Lo Y.M. Prenatal sex determination by DNA amplification from

maternal peripheral blood. / Y.M. Lo, P. Patel, J.S. Wainscoat [et al.] // Lancet

1989. - T. 8676 - №2 – с.1363-1365.

43. Adinolfi М. Gene amplification to detect fetal nucleated cells in

pregnant women. / M. Adinolfi, C. Camporese, T. Carr // Lancet - 1989. - T.8658 -

№2 – с.328-329.

44. Schwinger E. No identification of Y-chromosomal DNA in blood from

pregnant women bearing a male fetus? / E. Schwinger., M. Hillers, H.P. Vosberg //

Am. J. Hum. Genet. – 1989. - №45 – с.A268.

45. Nakagome Y. Prenatal sex determination. / Y. Nakagome, S.

Nagafuchi., Y. Nakahori // Lancet – 1990. T. 8684 - № 335 – с.291.

46. Zhang H. Frequency-enhanced transferrin receptor antibody-labelled

microfluidic chip (FETAL-Chip) enables efficient enrichment of circulating

nucleated red blood cells for non-invasive prenatal diagnosis. / H. Zhang, Y. Yang,

X. Li [et al.] // Lab. Chip. - 2018. T.18 - №18 – с.2749-2756.

47. Vestergaard E.M. On the road to replacing invasive testing with cell-

based NIPT: Five clinical cases with aneuploidies, microduplication, unbalanced

structural rearrangement, or mosaicism. / E.M. Vestergaard, R. Singh, P. Schelde

[et al.] // Prenat. Diagn. - 2017 - T.37 - №11 – с.1120-1124.

48. Huang C.E. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidy by

circulating fetal nucleated red blood cells and extravillous trophoblasts using

silicon-based nanostructured microfluidics. C.E. Huang, G.C. Ma, H.J. Jou [et al.]

// Mol. Cytogenet. - 2017. - №10 – с.44.

49. Казаков В.И. Внеклеточная ДНК в крови беременных женщин. /

В.И. Казаков, В.М. Божков, В.А. Линде и др. // Цитология - 1995. - T.37 - №3

– с.232-6.

50. Lo Y.M. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. /

125

Y.M. Lo, N. Corbetta, P.F. Chamberlain [et al.] // Lancet – 1997. - T. 9076 -

№350 – с.485-487.

51. Lo Y.M. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and

serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. / Y.M. Lo, M.S. Tein,

T.K. Lau [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 1998. - T. 62 - №4 – с.768-775.

52. Chan K.C.A. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal

plasma. / K. C. A. Chan, J. Zhang, A. B. Y. Hui [et al.] // Clin. Chem. - 2004. - Т.

50 - № 1- с.88-92.

53. Lo Y.M. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. /

Y.M. Lo, J. Zhang, T.N. Leung [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 1999. - T.64 - №1

– с.218–224.

54. Mandel P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme. /

P. Mandel, P. Metais // C. R. Acad. Sci. Paris - 1948.- № 142 – с.241-243.

55. Tan E.M. Deoxybonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the

serum of patients with systemic lupus erythematosus. / E.M. Tan, P.H. Schur, R.I.

Carr, H.G. Kunkel // J. Clin. Invest. - 1966. – T.45 -№11 – с.1732-40.

56. Козлов В.А. Свободная внеклеточная ДНК в норме и при

патологии. / В.А. Козлов // Медицинская иммунология - 2013. - T. 15 - № 5-

с.399-412.

57. Peters D.L. Origin, translocation and destination of extracellular

occurring DNA - a new paradigm in genetic behaviour. D.L. Peters, P.J. Pretorius /

/Clin. Chim. Acta. – 2011. T.412 - №11 – с.806-11.

58. Choi J.J. The role of macrophages in the in vitro generation of

extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. / J.J. Choi, C.F. Reich, D.S.

Pisetsky // Immunology - 2005. - T. 115 - № 1 – с.55-62.

59. Li C.N. Cell-free DNA is released from tumor cells upon cell death: a

study of tissue cultures of tumor cell lines. / C.N. Li, H.L. Hsu, T.L. Wu [et al.] //

J. Clin. Lab. Anal. - 2003. – T.17 - № 4 – с.103-107.

60. Jahr S. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients:

quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. /

126

S. Jahr, H. Hentze, S. Englisch [et al.] // Cancer. Res. - 2001. - T.15 - №61 –

с.1659-1665.

61. Stroun M. About the possible origin and mechanism of circulating

DNA apoptosis and active DNA release. / M. Stroun, J. Lyautey, C. Lederrey [et

al.] // Clin. Chim. Acta. - 2001. – T. 313 - №№ 1-2 - с.139-142.

62. Suzuki N. Characterization of circulating DNA in healthy human

plasma. / N. Suzuki, A. Kamataki, J. Yamaki, Y. Homma // Clin. Chim. Acta -

2008. - T. 387. - №№ 1-2 - с.55-58.

63. Gahan P.B. Circulating nucleic acids in plasma and serum. / P.B.

Gahan, R. Swaminathan // Recent developments. Ann. N. Y. Acad. Sci.- 2008. –

№ 1137 – с.1-6.

64. Favaloro B. Role of apoptosis in disease. / B. Favaloro, N. Allocati,

V. Graziano,, C. Di Ilio, V. De Laurenzi // Aging (Albany N.Y.) – 2012. – T.4 - №

5 – с.330-349.

65. Nagata S. Autoimmune diseases caused by defects in clearing dead

cells and nuclei expelled from erythroid precursors. / S. Nagata // Immunol. Rev –

2007. - № 220 – с.237-250.

66. Choi J.J. The role of macrophages in the in vitro generation of

extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. / J.J. Choi, C.F. Reich 3rd,

D.S. Pisetsky // Immunology – 2005. – T. 115 - № 1 – с.55-62.

67. Pisetsky D.S. The origin of extracellular DNA during the clearance of

dead and dying cells. / D.S. Pisetsky, A.M. Fairhurst //Autoimmunity – 2007. T.

40 - № 4 – с.281-284.

68. Lo Y.M. Circulating nucleic acids in plasma and serum: an overview. /

Y.M. Lo // Ann N Y Acad Sci. - 2001. - № 945- P. 1-7.

69. Alberry M. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic

pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast. / M. Alberry,

D. Maddocks, M. Jones [et al.] // Prenat. Diagn. – 2007. – Т. 27 – № 5– с.415–8.

70. Пантюх К.С. Неинвазивная пренатальная диагностика

анеуплоидий плода, основанная на секвенировании внеклеточной ДНК крови

127

беременной женщины. / К.С. Пантюх К.С., Е.С. Шубина // Акушерство и

гинекология - 2015. - № 8- с.5-11.

71. Breitbach S. Circulating cell-free DNA: an up-coming molecular

marker in exercise physiology. / S. Breitbach, S. Tug, P. Simon // Sports. Med. -

2012. T. 42 - №7- с.565-86.

72. Lo Y.M. Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide

genetic and mutational profile of the fetus. / Y.M. Lo, K.C. Chan, H. Sun [et al.] //

Sci. Transl. Med. - 2010.- T.61 - №2 - 61ra91 – с.1-13.

73. Ashoor G. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13

weeks’ gestation: effect of maternal and fetal factors. / G. Ashoor, L. Poon,

A. Syngelaki [et al.] // Fetal Diagn. Ther. - 2012. - Т. 31 - № 4- с.237-43.

74. De Jong A. Non-invasive prenatal diagnosis for aneuploidy: toward an

integral ethical assessment. / A. De Jong, W.J. Dondorp, S.G. Frints [et al.] / Hum.

Reprod. - 2011. - T. 26 - № 11- с.2915-7.

75. Wang E. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free

DNA in maternal plasma. / E. Wang, A. Batey, C. Struble [et al.] // Prenat. Diagn.

- 2013. - Т. 33 - № 7- с.662-6.

76. Haghiac M. Increased death of adipose cells, a path to release cell-free

DNA into systemic circulation of obese women. / M. Haghiac, N.L. Vora, S. Basu

[et al.] // Obesity (Silver Spring) - 2012. - T.20 - №11- с.2213-9.

77. Schlütter J.M. The cell-free fetal DNA fraction in maternal blood

decreases after physical activity. / J. M. Schlütter, L. Hatt, C. Bach [et al.] //

Prenat. Diagn. - 2014. - Т. 34 - № 4- 341- с.4.

78. Nicolaides K.H. Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a

routinely screened first-trimester population. / K.H. Nicolaides, А. Syngelaki,

G. Ashoor [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2012. - T.207 - № 5- с.374-e1-6.

79. Hall, A. Non-invasive prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA

technology: applications and implications / A. Hall, A. Bostanci, C.F. Wright //

Public Health Genomics. - 2010. - Vol. 13, № 4 – с.246-255.

80. Costa, J. M. New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders

128

/ J. M. Costa, A. Benachi, E. Gautier // N. Engl. J. Med. - 2002. - № 346–с.1502.

81. Avent, N. D. RHD genotyping from maternal plasma: guidelines and

technical challenges / N. D. Avent // Methods in Molecular Biology. - 2008. -

№ 444 – с.185-201.

82. Fuxi Z. Quantification and application of the placental epigenetic

signature of the RASSF1A gene in maternal plasma / Z. Fuxi, L. Runhua, Y. Jing

[et. al.] // Prenat. Diagn. - 2010. - № 30 – с.778-782.

83. Nygren A.O. Quantification of Fetal DNA by Use of Methylation-

Based DNA Discrimination / A. O. Nygren, J. Dean, T. J. Jensen [et al.] // Clin.

Chem. - 2010. - Vol. 56. – с.1627 - 1635.

84. Zamanpoor M. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma

in gestational diabetes mellitus, iron deficiency anemia and gestational

hypertension pregnancies / M. Zamanpoor, R. Rosli, M. N. Yazid [ et al.] // J.

Matern. Fetal. Neonatal. Med. - 2013. - № 26- с.960-966.

85. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for

polymorphic DNA markers. / D. Tautz // Nucleic. Acids. Res. - 1989. - T.17 -

№ 16 –с.6463-71.

86. Alford R. L. Rapid and efficient resolution of parentage by

amplification of short tandem repeats. / R.L. Alford, H.A. Hammond, I.Coto,

C.T.Caskey // Am. J. Hum. Genet. - 1994. - T. 55 - № 1- с.190-5.

87. Yu S.C.Y. Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for

noninvasive prenatal testing. / S. C. Y. Yu, K. C. A. Chan, Y. W. L. Zheng [et al.]

// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2014. - Т. 111 - № 23- с.8583-8.

88. Fan H.C. Detection of aneuploidy with digital polymerase chain

reaction / H. C. Fan, S. R. Quake // Anal. Chem. - 2007. - Т. 79 - № 19- с.7576-

7579.

89. Ребриков Д.В. NGS: высокопроизводительное секвенирование /

Д.В. Ребриков, Д.О. Коростин, Е.С. Шубина, В.В. Ильинский. – М: БИНОМ,

2014. – 232 с.

90. Fan H.C. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun

129

sequencing DNA from maternal blood. / H. C. Fan, Y. J. Blumenfeld, U. Chitkara

[et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2008. - Т. 105 - № 42- с.16266-16271.

91. Sun K. Size-tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light

on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing. /

K. Sun, P. Jiang, A.I.C. Wong [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2018. -

T.115 - №22 – с.e5106-e5114.

92. Yu S.C. Combined Count- and Size-Based Analysis of Maternal

Plasma DNA for Noninvasive Prenatal Detection of Fetal Subchromosomal

Aberrations Facilitates Elucidation of the Fetal and/or Maternal Origin of the

Aberrations. / S.C. Yu, P. Jiang, K.C. Chan [et al.] // Clin. Chem. - 2017. - T.63-

№2 – с.495-502.

93. Burton G.J. Optimising sample collection for placental research. /

G.J.Burton, N.J. Sebire, L. Myatt [et al.] // Placenta - 2014. - T.35 - № 1 - 9-22.

94. Shendure J. Next-generation DNA sequencing. / J. Shendure, H. Ji //

Nat. Biotechnol. – 2008. – Т. 26 – № 10 – с.1135–45.

95. Chiu R.W.K. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal

aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma.

/ R. W. K. Chiu, K. C. A. Chan, Y. Gao [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. –

2008. – Т. 105 – № 51– с.20458–20463.

96. Yuan Y. Feasibility study of semiconductor sequencing for

noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy. / Y. Yuan, F. Jiang, S. Hua [et

al.] // Clin. Chem. – 2013. – Т. 59 – № 5– с.846–9.

97. Liao C. Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by

semiconductor sequencing. / C. Liao, A. Yin, C. Peng [et al.] // Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. - 2014.- Т. 111 - № 20 – с.7415- 20.

98. Vermeesch J.R. Prenatal and pre-implantation genetic diagnosis. /

J.R. Vermeesch, T. Voet, K. Devriendt // Nat. Rev. Genet. - 2016. - T.10 №17 –

с.643-56.

99. Sparks A.B. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for

evaluation of fetal trisomy. / A. B. Sparks, E. T. Wang, C. a Struble [et al.] //

130

Prenat. Diagn. – 2012. – Т. 32 – № 1– с.3–9.

100. Sparks A.B. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of

cell- free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and

trisomy 18. / A. B. Sparks, C. a Struble, E. T. Wang [et al.] // Am. J. Obstet.

Gynecol. – 2012. – Т. 206 – № 4– с.319.e1-9.

101. Juneau K. Microarray-Based Cell-Free DNA Analysis Improves

Noninvasive Prenatal Testing. / K. Juneau, P. E. Bogard, S. Huang [et al.] // Fetal

Diagn. Ther. - 2014. – с.1-5.

102. Stokowski R. Clinical performance of non-invasive prenatal testing

(NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays

or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled

clinical studies / R. Stokowski, E. Wang, K. White [et al.] // Prenat. Diagn. – 2015.

– Т. 35 – № 12– с.1243–1246.

103. Zimmermann B. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of

chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic

loci. / B. Zimmermann, M. Hill, G. Gemelos [et al.] // Prenat. Diagn. – 2012. – Т.

32 – № 13– с.1233–41.

104. Samango-Sprouse C. SNP-based non-invasive prenatal testing detects

sex chromosome aneuploidies with high accuracy. / C. Samango-Sprouse,

M. Banjevic, A. Ryan [et al.] // Prenat. Diagn. – 2013. – Т. 33 – № 7– с.643–9.

105. Agarwal A. Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in

the United States / A. Agarwal, L. C. Sayres, M. K. Cho [et al.] // Prenat. Diagn. –

2013. – Т. 33 – № 6– с.521–531.

106. Kalousek D.K. Chromosomal mosaicism confined to the placenta in

human conceptions / D.K. Kalousek, F.J. Dill // Science - 1983. - T. 221– №4611

– с.665–7.

107. Phillips O.P. Risk of fetal mosaicism when placental mosaicism is

diagnosed by chorionic villus sampling. / O.P. Phillips, A.T. Tharapel, J.L. Lerner

[et al.] / Am. J. Obstet. Gynecol. - 1996. - T.174 - №3 – с.850-5.

108. Malvestiti F. Interpreting mosaicism in chorionic villi: results of a

131

monocentric series of 1001 mosaics in chorionic villi with follow-up

amniocentesis. / F. Malvestiti, C. Agrati, B. Grimi [et al.] // Prenat. Diagn. 2015. -

T. 35 - № 11 – с.1117-27.

109. Gu S. Chromosomal microarray analysis on uncultured chorionic

villus sampling can be complicated by confined placental mosaicism for

aneuploidy and microdeletions. / S. Gu, M. Jernegan, I.B. Van den Veyver [et al.]

// Prenat. Diagn. – 2018. - T.38 - №11 – с.858-865.

110. Choi H. Fetal aneuploidy screening by maternal plasma DNA

sequencing: 'false positive' due to confined placental mosaicism./ H. Choi,

T.K. Lau, F.M. Jiang [et al.] // Prenat. Diagn. - 2013. - T.33 - № 2 – с.198-200.

111. Hall A.L. Positive cell-free fetal DNA testing for trisomy 13 reveals

confined placental mosaicism. / A.L. Hall, H.M. Drendel, J.L. Verbrugge [et al.] //

Genet. Med. - 2013. - T.15 - № 9 – с.729-32.

112. Gardner R.J.M. Chromosome abnormalities and genetic counseling,

3rd edn / Editors R.J.M. Gardner, G.R. Sutherland. Oxford: Oxford University

Press, 2003. – с.577.

113. Curnow K.J. Detection of triploid, molar, and vanishing twin

pregnancies by a single-nucleotide polymorphism–based noninvasive prenatal test

/ K. J. Curnow, L. Wilkins-Haug, A. Ryan [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. –

2015. – Т. 212 – № 1– с.79.e1-79.e9.

114. Wang S. Maternal X chromosome copy number variations are

associated with discordant fetal sex chromosome aneuploidies detected by

noninvasive prenatal testing / S. Wang, S. Huang, L. Ma [et al.] // Clin. Chim.

Acta – 2015. – Т. 444– с.113–116.

115. Russell L.M. X chromosome loss and ageing / L. M. Russell, P. Strike,

C. E. Browne, P. A. Jacobs // Cytogenet. Genome Res.–2007. - Т. 116 - № 3 –

с.181-185.

116. Bayindir B. Noninvasive prenatal testing using a novel analysis

pipeline to screen for all autosomal fetal aneuploidies improves pregnancy

management / B. Bayindir, L. Dehaspe, N. Brison [et al.] // Eur J Hum Genet –

132

2015.

117. Osborne C.M. Discordant noninvasive prenatal testing results in a

patient subsequently diagnosed with metastatic disease / C. M. Osborne,

E. Hardisty, P. Devers [et al.] // Prenat. Diagn. – 2013. – Т. 33 – № 6– с.609–611.

118. Dar P. Clinical experience and follow-up with large scale single-

nucleotide polymorphism-based non-invasive prenatal aneuploidy testing. / P. Dar,

K. J. Curnow, S. J. Gross [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2014. - T. 211 - № 5

– с.527.e1-527.e17.

119. Jiang F. Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced

noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex

chromosomal aneuploidies. / F. Jiang, J. Ren, F. Chen [et al.] // BMC Med.

Genomics - 2012. - Т. 5 – № 1- с.57.

120. Nicolaides K.H. Assessment of Fetal Sex Chromosome Aneuploidy

Using Directed Cell-Free DNA Analysis / K. H. Nicolaides, T. J. Musci,

C. A. Struble [et al.] // Fetal Diagn. Ther. – 2014. – Т. 35 – № 1– с.1–6.

121. Norton M.E. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study:

results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21

and trisomy 18. / M. E. Norton, H. Brar, J. Weiss [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol.

– 2012. – Т. 207 – № 2– с.137.e1-8.

122. Palomaki G.E. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies

trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international

collaborative study. / G. E. Palomaki, C. Deciu, E. M. Kloza [et al.] // Genet. Med.

– 2012. – Т. 14 – № 3– с.296–305.

123. Palomaki G.E. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down

syndrome: an international clinical validation study. / G. E. Palomaki,

E. M. Kloza, G. M. Lambert-Messerlian [et al.] // Genet. Med. – 2011. – Т. 13 –

№ 11– с.913–20.

124. Porreco R.P. Noninvasive prenatal screening for fetal trisomies 21, 18,

13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using

massively parallel genomic sequencing of DNA / R. P. Porreco, T. J. Garite,

133

K. Maurel [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2014. – Т. 211 – № 4– с.365.e1-

365.e12.

125. Pettit K.E. The utilization of circulating cell-free fetal DNA testing

and decrease in invasive diagnostic procedures: an institutional experience. /

K. E. Pettit, A. D. Hull, L. Korty [et al.] // J. Perinatol. – 2014. – Т. 34 – № 10–

с.750–3.

126. The American College of Obstetricians and Gynecologists.

Noninvasive Prenatal Testing for Fetal Aneuploidy: Committee Opinion No. 545 /

American College of Obstetricians and Gynecologists // Obs. Gynecol. – 2012. –

Т. 120– с.1532–1534.

127. The American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG)

Committee Opinion No. 640: Cell-Free DNA Screening For Fetal Aneuploidy /

ACOG // Obs. Gynecol. – 2015. – Т. 126 – № 3– с.e31-37.

128. Zhang B. Noninvasive prenatal screening for fetal common sex

chromosome aneuploidies from maternal blood / B. Zhang, B.-Y. Lu, B. Yu [et

al.] // J. Int. Med. Res. – 2017. – Т. 45 – № 2– с.621–630.

129. McNamara C.J. Maternal source of false-positive fetal sex

chromosome aneuploidy in noninvasive prenatal testing. / C. J. McNamara,

L. A. Limone, T. Westover, R. C. Miller // Obstet. Gynecol. – 2015. – Т. 125 –

№ 2– с.390–2.

130. Hartwig T.S. Discordant Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT) - a

systematic review / T. S. Hartwig, L. Ambye, S. Sørensen, F. S. Jørgensen //

Prenat. Diagn. - 2017. - Т.37 - №6 – с.527-539.

131. Reiss R.E. Sex Chromosome Aneuploidy Detection by Non-Invasive

Prenatal Testing: Helpful or Hazardous? / R. E. Reiss, M. Discenza, J. Foster [et

al.] // Prenat. Diagn. – 2017. – T.37 - №5 – с.515-520.

132. Liang D. Non-invasive prenatal testing of fetal whole chromosome

aneuploidy by massively parallel sequencing. / D. Liang, W. Lv, H. Wang [et al.]

// Prenat. Diagn. – 2013. – Т. 33 – № 5– с.409–15.

133. Ma J. Birth of a child with trisomy 9 mosaicism syndrome associated

134

with paternal isodisomy 9: case of a positive noninvasive prenatal test result

unconfirmed by invasive prenatal diagnosis / J. Ma, D. S. Cram, J. Zhang [et al.] //

Mol. Cytogenet. – 2015. – Т. 8 – № 1– с.44.

134. Yang J. A case of placental trisomy 18 mosaicism causing a false

negative NIPT result / J. Yang, Y. Qi, F. Guo [et al.] // Mol. Cytogenet. – 2017. –

Т. 10 – № 1– с.40.

135. Reittinger A.M. A prenatal diagnosis of mosaic trisomy 5 reveals a

postnatal complete uniparental disomy of chromosome 5 with multiple congenital

anomalies / A. M. Reittinger, B. M. Helm, D. J. Boles [et al.] // Am. J. Med.

Genet. Part A – 2017. – Т. 173 – № 9– с.2528–2533.

136. Horn R. Opening Pandora’s box?: ethical issues in prenatal whole

genome and exome sequencing / R. Horn, M. Parker // Prenat. Diagn. – 2017. –

с1–6.

137. Wolstenholme J. Confined placental mosaicism for trisomies 2, 3, 7, 8,

9, 16 and 22: Their incidence, likely origins, and mechanisms for cell lineage

compartmentalization / J. Wolstenholme // Prenat. Diagn. - 1996. -Т.16 - №6-

с.511- 524.

138. Bruns D.A. Twenty-five additional cases of trisomy 9 mosaic: Birth

information, medical conditions, and developmental status / D. A. Bruns, E.

Campbell // Am. J. Med. Genet. Part A – 2015. – Т. 167 – № 5– с.997–1007.

139. Utermann B. Pre- and Postnatal Findings in Trisomy 17 Mosaicism /

B. Utermann, M. Riegel, D. Leistritz [et al.] // Am. J. Med. Genet. – 2006. –

Т.1636– с.1628–1636.

140. Balbeur S. Trisomy rescue mechanism: the case of concomitant

mosaic trisomy 14 and maternal uniparental disomy 14 in a 15-year-old girl. /

S. Balbeur, B. Grisart, B. Parmentier [et al.] // Clin. case reports – 2016. – Т. 4 –

№ 3– с.265–271.

141. Chareonsirisuthigul T. Intrauterine growth retardation fetus with

trisomy 16 mosaicism. / T. Chareonsirisuthigul, S. Worawichawong, R. Parinayok

[et al.] // Case Rep. Genet. – 2014. – Т. 2014– с.739513.

135

142. Chen C.P. Prenatal diagnosis and molecular cytogenetic

characterization of low-level mosaic trisomy 12 at amniocentesis associated with a

favorable pregnancy outcome / C. P. Chen, C. J. Lin, S. R. Chern [et al.] //

Taiwan. J.Obstet. Gynecol. - 2017. - Т.56 - №2- с.238-242.

143. Chen C.P. Mosaic trisomy 17 at amniocentesis: Prenatal diagnosis,

molecular genetic analysis, and literature review / C. P. Chen, L. K. Wang,

S. R. Chern [et al.] // Taiwan. J. Obstet. Gynecol. – 2016. – Т. 55 – № 5– с.712–

717.

144. Sparks T.N. Mosaic trisomy 16: what are the obstetric and long-term

childhood outcomes? / T. N. Sparks, K. Thao, M. E. Norton // Genet. Med. – 2017.

– Т. 19 – № 10 – с.1164–1170.

145. Pison G. Frequency of twin births in developed countries. /G. Pison,

A.V. D'Addato // Twin Res. Hum. Genet. - 2006. - T.2 - №9 – с.250-9.

146. Rao A. Obstetric complications of twin pregnancies. / A. Rao, S.

Sairam, H. Shehata // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. - 2004. - T.18 -№4

– с.557-76.

147. Gjerris A.C. First-trimester screening markers are altered in

pregnancies conceived after IVF/ICSI. / A.C. Gjerris, A. Loft, A. Pinborg [et al.] //

Ultrasound Obstet. Gynecol. - 2009. - T.33 - №1 – с.8-17.

148. Aston K.I. Monozygotic twinning associated with assisted

reproductive technologies: a review. / K.I. Aston, C.M. Peterson, D.T. Carrell //

Reproduction - 2008. T.136 - №4 – с.377-86.

149. Hall J.G. Twinning. / J.G. Hall // Lancet - 2003. T.9385 - №362 –

с.735-43.

150. Yang J. Performance of non-invasive prenatal testing for trisomies 21

and 18 in twin pregnancies. / J. Yang, Y. Qi, Y. Hou [et al.] // Mol. Cytogenet. -

2018. - T.11 - №47 – с.1-6.

151. Hochstenbach R. Discordant NIPT result in a viable trisomy-21

pregnancy due to prolonged contribution to cfDNA by a demised trisomy-14

cotwin. / R. Hochstenbach, M.G. Elferink, P.H. van Zon [et al.] // Clin. Case Rep.

136

- 2018. - T.6 - №5 – с.788-791.

152. Takeda E. Performance and outcomes of noninvasive prenatal testing

for twin pregnancies in Japan. / E. Takeda, N. Suzumori, K. Kumagai [et al.] // J.

Obstet. Gynaecol. Res. - 2018. - T.44 - №10 – с.1909-1914.

153. Tan Y. Noninvasive prenatal testing (NIPT) in twin pregnancies with

treatment of assisted reproductive techniques (ART) in a single center. Y. Tan,

Y. Gao, G. Lin [et al.] // Prenat. Diagn. - 2016. - T.36 - №7 – с.672-9.

154. Fosler L. Aneuploidy screening by non-invasive prenatal testing in

twin pregnancy. / L. Fosler, P. Winters, K.W. Jones [et al.] // Ultrasound Obstet.

Gynecol. - 2017. - T.49 - №4 – с.470-477.

155. Li H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. / H. Li,

B. Handsaker, A. Wysoker [et al.] // Bioinformatics – 2009. – Т. 25 – № 16–

с.2078–9.

137

Приложения

Приложение 1

Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининга анеуплоидий плода по крови матери методом высокопроизводительного секвенирования

Основные положения проведения ДНК-скрининга

Общие принципы

1. ДНК-скрининг по крови матери должен быть добровольным.

2. Перед ДНК-скринингом показано ультразвуковое исследование, в частности, для

получения сведений о количестве плодов, особенностях анатомии плода, оценки

его жизнеспособности, при необходимости, уточнения срока беременности.

3. ДНК-скрининг рекомендуется проводить при сроке беременности не менее 10-11

акушерских недель.

4. При выявлении высокого риска хромосомных нарушений с помощью ДНК-

скрининга необходимо проведение подтверждающих диагностических инвазивных

процедур с получением результатов кариотипирования до 22 акушерских недель. В

связи с этим, учитывая суммарное время выполнения процедуры ДНК-скрининга и

подтверждающей инвазивной диагностики (около двух недель каждое),

направление на ДНК-скрининг целесообразно осуществлять до срока

беременности 17 акушерских недель.

Показания к проведению ДНК-скрининга

Скрининговое определение анеуплоидий плода (включая определение

частичных анеуплоидий при наличии у плода несбалансированных транслокаций,

ассоциированных с синдромами Дауна, Эдвардса и Патау) при одноплодной

беременности рекоменовано всем женщинам, не имеющим противопоказаний.

138

Противопоказания к проведению ДНК-скрининга

1. Онкологические заболевания у беременной женщины.

2. Многоплодная беременность, включая случаи спонтанной редукции плода при

многоплодной беремеменности.

Клинические ситуации, при которых проведение ДНК-скрининга невозможно

Уровень плодовой ДНК ниже порога аналитической чувствительности метода

(обычно 4-5%), что часто наблюдается при сроках беременности менее 10-11

недель.

Клинические ситуации, при которых проведение ДНК-скрининга ограничено

1. Индекс массы тела пациента более 30 кг/м2.

2. Беременность, наступившая в результате ЭКО с использованием донорской

яйцеклетки и при суррогатном материнстве.

3. Мозаицизм в соматических клетках матери, плода и его оболочек, в который

вовлечены исследуемые хромосомы.

4. Наличие у пациента донорских органов и тканей.

Особенности проведения ДНК-скрининга

1. Все этапы анализа проводятся строго в соответствии с инструкциями

производителей оборудования и наборов реагентов, стандартными операционными

процедурами (СОП) или иными документами, утвержденными в данном

учреждении, а также региональными и федеральными нормативными

документами, регламентирующими лабораторно-диагностическую деятельность и

порядок оказания медико-генетической помощи, в т.ч. "Инструкции по мерам

профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-

диагностических лабораториях лечебно- профилактических учреждений" (утв.

Минздравом СССР 17.01.1991г.), Национального стандарта РФ ГОСТ Р 52905-2007

"Лаборатории медицинские. Требования безопасности" (утв. и введен в действие

приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

139

от 27 декабря 2007г. №531-ст).

2. При наличии у лаборатории технической возможности определять долю

внеклеточной ДНК плода, в отдельных случаях исследование может быть

выполнено на более ранних сроках беременности при условии достижения доли

плодовой ДНК порога аналитической чувствительности метода (обычно 4-5%).

Доля плодовой ДНК зависит как от срока беременности, так и от массы тела

беременной женщины и ряда других факторов. В большинстве случаев к сроку

беременности 10-11 акушерских недель она достаточна для проведения анализа на

анеуплоидии. Однако примерно в 3-5% случаев получить результат не удается, в

том числе из- за низкой доли плодовой ДНК. Практика показывает, что повторный

забор крови на более поздних сроках позволяет получить результат только в 50-

60% случаев, т.к. у части женщин доля плодовой ДНК остается низкой и на более

поздних сроках. Тактика дальнейшего обследования пациента в этом случае

должна быть согласована с врачом-генетиком и врачом акушером-гинекологом для

принятия решения о проведении инвазивной пренатальной диагностики, так как

низкая доля внеклеточной плодовой ДНК может быть связана с повышенным

риском анеуплоидий.

3. Технически получение результата возможно вплоть до момента родоразрешения.

Однако положительные результаты тестирования необходимо подтверждать

стандартными инвазивными диагностическими процедурами - биопсия хориона,

плацентоцентез, амниоцентез, кордоцентез с дальнейшим проведением

кариотипирования плода. При этом прерывание беременности по медицинским

показаниям (хромосомная патология плода) разрешено до 22 недель беременности

(Приказ Минздрава России от 03 декабря 2007г. №736). В связи с этим, учитывая

время, необходимое для проведения самого исследования (до двух недель), а также

процедур по подтверждению хромосомной патологии и прерыванию

беременности, забор биоматериала для ДНК-скрининга целесообразно

осуществлять до 17 акушерских недель. При наличии возможности провести

подтверждающую диагностику за меньшее время (например, с помощью

молекулярного кариотипирования) сроки исследования могут быть изменены.

4. Перед исследованием пациент должен быть ознакомлен с возможностями и

ограничениями метода, а также подписать информированное согласие (см. образец

140

в приложении 1). Пациенты должны быть проинформированы о том, что:

- ДНК-скрининг по крови матери предназначен для выявления женщин с высоким

риском наличия анеуплоидий у плода и не заменяет диагностические инвазивные

тесты;

- в случае выявления хромосомных нарушений с помощью ДНК-скрининга по крови

матери необходимо проведение подтверждающих диагностических инвазивных

процедур;

- пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий по крови матери не предназначен для

выявления микроаномалий хромосом, мозаицизма, полиплоидии, структурных

аномалий хромосом, моногенных и других генетических заболеваний, не

связанных с анеуплоидиями;

- при наличии в семье ранее выявленных наследственных патологий может

потребоваться назначение иных видов скрининговых тестов или проведение

пренатальной диагностики с целью исключения конкретных заболеваний; в этом

случае семье необходимо проконсультироваться с врачом-генетиком;

- отсутствие у плода нарушений по данным неинвазивного пренатального ДНК-

скрининга по крови матери не гарантирует отсутствие анеуплоидий как по

исследованным, так и по другим хромосомам. Наибольшая точность исследования

достигается при выявлении анеуплоидий 21-й и 18-й хромосом, тогда как точность

выявления трисомии по 13-й и численных нарушений по половым хромосомам –

ниже;

- при низкой доле внеклеточной плодовой ДНК в крови матери получение

результатов теста может оказаться невозможным; в этом случае необходима

консультация врача-генетика и врача акушера-гинеколога, в том числе для

решения вопроса о целесообразности проведения повторного исследования и

инвазивной пренатальной диагностики.

5. Несмотря на то, что потенциально данный скрининговый метод обладает

возможностью выявлять хромосомные микроделеции и микродупликации,

назначение подобных исследований в настоящий момент не представляется

целесообразным в связи с недостаточной валидированностью подобных

исследований.

6. ДНК-скрининг по крови матери подразумевает только исследование на наличие

141

анеуплоидий. Если требуется определение пола плода, это должно быть отдельно

отражено в письменном заявлении пациента до начала исследования.

7. Результаты ДНК-скрининга не должны рассматриваться в отрыве от результатов

других клинических тестов. В частности, при выявлении пороков развития плода с

помощью УЗИ, необходимо проведение медико-генетического консультирования

для решения вопроса о возможном назначении инвазивных диагностических

процедур вне зависимости от результатов ДНК-скрининга.

8. Результаты ДНК-скрининга должны интерпретироваться врачом акушером-

гинекологом или врачом-генетиком. В случае неблагоприятных результатов ДНК-

скрининга консультация врача- генетика обязательна.

142

Приложение 2

Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининга анеуплоидий плода по крови матери методом высокопроизводительного секвенирования

Клинические рекомендации

Образец информированного согласия

ПОЛНОЕ НАИМЕНОВАНИЕ УЧРЕЖДЕНИЯ

НАЗВАНИЕ СТРУКТУРНОГО ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ

Информированное согласие на исследование

«Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий по крови матери»

Я, __________________________________________________________________________,

дата рождения (день, месяц, год) ________________________, паспорт (серия, номер) ________________________, кем выдан _______________________ ____________________________________________ когда выдан «____» ______________г., проживающая по адресу ________________________________________________________, контактный телефон __________________________________, срок беременности ______________, мой вес______кг, мой рост ________см.

Я проинформирована о назначении, возможностях и ограничениях неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий у плода по крови матери, в том числе:

- ДНК-скрининг по крови матери предназначен для выявления женщин с высоким риском наличия анеуплоидий у плода и не заменяет диагностические инвазивные тесты.

- В случае выявления хромосомных нарушений с помощью ДНК-скрининга по крови матери необходимо проведение подтверждающих диагностических инвазивных процедур. При этом важно учитывать, что прерывание беременности по медицинским показаниям (хромосомная патология плода) разрешено до 22 недель беременности (Приказ Минздрава России от 12 ноября 2012г. № 572н).

- Пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий по крови матери не предназначен для выявления микроаномалий хромосом, мозаицизма, полиплоидии, структурных аномалий хромосом, моногенных и других генетических заболеваний, не связанных с анеуплоидиями.

- При наличии в семье ранее выявленных наследственных патологий может потребоваться назначение иных видов скрининговых тестов или проведение пренатальной диагностики с целью исключения конкретных заболеваний. В этом случае необходимо проконсультироваться с врачом-генетиком.

- Отсутствие у плода нарушений по данным неинвазивного пренатального ДНК-скрининга по крови матери не гарантирует отсутствие анеуплоидий как по исследованным, так и по другим хромосомам.

143

- Точность выявления разных анеуплоидий отличается (для 21-й и 18-й хромосом выше, чем для 13-й и половых хромосом).

- При низкой доле внеклеточной плодовой ДНК в крови матери получение результатов может оказаться невозможным. В этом случае необходима консультация врача, в том числе для решения вопроса о проведении повторного исследования или инвазивной диагностики.

- Сдача крови осуществляется натощак в сроки беременности с 10-11 до 17 акушерских недель; проведение исследования на более поздних сроках допускается только на основании коллегиального решения врача акушера-гинеколога, врача-генетика, врача лабораторного генетика.

- Перед сдачей крови необходимо избегать повышенной физической активности, т.к. она может приводить к снижению доли внеклеточной плодовой ДНК.

- Полученная в ходе исследования информация может быть в обезличенном виде использована медицинским учреждением для научных исследований в порядке, регламентированном ФЗ от 27.07.2006г. №152-ФЗ «О персональных данных».

Я понимаю всю информацию, содержащуюся в данном документе. Я имела возможность задать все интересующие меня вопросы и получила удовлетворившие меня ответы. Ознакомившись с вышеуказанной информацией, на проведение неинвазивного ДНК-скрининга по крови матери согласна. Пациент (Ф.И.О.) _____________________________ Подпись ______________________ Подтверждаю, что пациент ознакомился с представленной информацией и расписался в моем присутствии. Медицинский работник (Ф.И.О.) _______________________________ Подпись______________________ Дата «____» ___________ 20____г.

144

Приложение 3

Образец сопроводительного документа-направления на исследование

ПОЛНОЕ НАИМЕНОВАНИЕ УЧРЕЖДЕНИЯ

НАЗВАНИЕ СТРУКТУРНОГО ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ

Направление на исследование «Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий по крови матери»

Ф.И.О. пациента_______________________________________________________________

Номер карты_________________ Направивший врач_______________________________

Наличие информированного согласия на исследование (да, нет)_________

Дата рождения (день, месяц, год) ________________________

Рост __________см Вес _________ кг

Срок беременности (акушерский) _____ недель _____ дней

Количество плодов ______

Беременность (нужное подчеркнуть): наступила самопроизвольно / в результате применения ВРТ / суррогатное материнство

Предполагаемые нарушения на основании других исследований (УЗИ, биохимического скрининга и т.п.), если имеются __________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Дата забора крови (день, месяц, год) ______________

Время забора крови _____ час _____мин

Ф.И.О. и подпись лица, проводившего забор крови_________________________________

Указанные выше сведения и мои данные на пробирках верны.

_________________________ (подпись пациента)

145

Приложение 4

Образец клинического лабораторного заключения (пример 1)

ПОЛНОЕ НАИМЕНОВАНИЕ УЧРЕЖДЕНИЯ НАЗВАНИЕ СТРУКТУРНОГО ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ

«Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий по крови матери»

Ф.И.О. пациента_______________________________________________________________

Название направившего учреждения______________________________________________

Номер карты_________________ Направивший врач_______________________________

Наличие информированного согласия на исследование ________________

Возраст ______ полных лет Индекс массы тела (ИМТ) _______ кг/м2

Срок беременности _____ недель _____ дней (на момент забора крови).

Количество плодов ______

Самостоятельная беременность или в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) ____________________________

Предполагаемые нарушения на основании других исследований (УЗИ, биохимического скрининга и т.п.), если имеются _____________________________________________________________________________

Материал получен «____» ___________ 20____г.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фракция плодовой ДНК составляет 7% (выше 4%, порога чувствительности метода).

Вероятность анеуплоидий по хромосомам 21, 18, 13, а также численных нарушений по половым хромосомам: <0,02%.

Дата «____» ___________ 20____г. Врач: ________________________________ Примечание: Если данным методом нарушений у плода не выявлено, нельзя полностью исключить анеуплоидии как по исследованным, так и по другим хромосомам. Метод имеет ограничения, в частности, невозможность выявления микроаномалий хромосом, мозаицизма, полиплоидий, структурных аномалий хромосом, моногенных и других генетических заболеваний, не связанных с анеуплоидиями.

146

Приложение 5

Образец клинического лабораторного заключения (пример 2)

ПОЛНОЕ НАИМЕНОВАНИЕ УЧРЕЖДЕНИЯ НАЗВАНИЕ СТРУКТУРНОГО ПОДРАЗДЕЛЕНИЯ

«Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий по крови матери»

Ф.И.О. пациента_______________________________________________________________

Название направившего учреждения______________________________________________

Номер карты_________________ Направивший врач_______________________________

Наличие информированного согласия на исследование ________________

Возраст ______ полных лет Индекс массы тела (ИМТ) _______ кг/м2

Срок беременности _____ недель _____ дней (на момент забора крови).

Количество плодов ______

Беременность наступила самопроизвольно или в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) ____________________________

Предполагаемые нарушения на основании других исследований (УЗИ, биохимического скрининга и т.п.), если имеются __________________________________________________

Материал получен «____» ___________ 20____г.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фракция плодовой ДНК составляет 9% (выше 4%, порога чувствительности метода).

Установлен высокий риск трисомии по хромосоме 21 (выше 95%).

Рекомендована консультация врача-генетика с целью назначения пренатальной диагностики методом кариотипирования. Дата «____» ___________ 20____г. Врач: ________________________________

147

Приложение 6 Заключение по многопллодной беременнности

ФГБУ "НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова" Минздрава России

Москва, ул.Акад. Опарина, д.4, тел.8(495) 531-44-44 Отделение клинической генетики

8-495-438-24-10

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ

ДИАГНОСТИКИ № ____

Ф.И.О.: XXXXXXXXXXXXXXXX Дата рождения: XXXXXX1982 Возраст: 36 лет Амбулаторная карта №: 61242/18 И.Б. Диагноз: Беременность 9-10 недель в 36 лет трихориальная триамниотическая. В анамнезе-неразвивающаяся беременность двойня в сроке 5- 6 нед., без выскабливания (2016). O30.1

С целью определения кариотипа плода, в первом триместре произведено три транабдоминальных хориоцентеза под контролем ультразвукового исследования.

По клеткам хориона прямым методом установлены кариотипы плодов. 1. Кариотип плода 46, ХУ,9ph нормальный мужской кариотип, расположение гетерохроматинового района хромосомы 9 в коротком плече (вариант нормального полиморфизма) (1 правый плод из тройни). 2. Кариотип плода 46, ХУ,9ph нормальный мужской кариотип, расположение гетерохроматинового района хромосомы 9 в коротком плече (вариант нормального полиморфизма) (2 средний плод из тройни). 3. Кариотип плода 47, ХХ,+21 несбалансированный женский кариотип, трисомия по 21 хромосоме (3 левый плод из тройни).

Врач-лабораторный генетик ________________________ Бугай Т.В. Заведующий отделением клинической генетики

д.м.н., профессор ________________________ Бахарев В.А. 12.09.2018

148

Приложение 7 Лабораторное заключение по результатам ДНК-скрининга

Номер образца ЛИС: k734

Характеристика плазмы: плазма чистая без примесей

Количество ДНК, полученное при выделении, в нг:

18,20

Баркод (IonXpress): IonXpress_1

Количество входящей ДНК, в нг ( > 2): 7,28

Концентрация библиотеки ДНК на участке 150-350 п.н., в pM ( > 200 pM):

7 625,00

Количество ридов после удаления ПЦР дупликатов ( > 5 000 000):

5824683

Генетический пол плода: мужской

Доля плодовой ДНК по Y-хромосоме

( > 4%):

14,1

Доля плодовой ДНК по 21-хромосоме 4,60%

Доля плодовой ДНК по SNP ( > 4%): 10.6(6.4-22.0)

Соотношение X/Y -1,02

T-score 13 хромосома ( < 4): -0,9

T-score 18 хромосома ( < 4): -2,4

T-score 21 хромосома ( < 4): 4,5

Результаты исследования:

Анализируемый образец содержит ДНК с МУЖСКИМ генотипом.

Высокий риск трисомии по 21-й хромосоме.

149

Приложение 8 Лабораторное заключение по результатам ДНК-скрининга

Номер образца ЛИС: k734B

Характеристика плазмы: плазма без примесей

Количество ДНК, полученное при выделении, в нг:

35.40

Баркод (IonXpress): 003

Количество входящей ДНК, в нг ( > 2): 7.79

Концентрация библиотеки ДНК на участке 150-350 п.н., в pM ( > 200 pM):

6738

Количество ридов после удаления ПЦР дупликатов ( > 5 000 000):

4005475

Генетический пол плода: мужской

Доля плодовой ДНК по Y-хромосоме

( > 4%):

14,35%

Доля плодовой ДНК по 21 хромосоме: 4,85%

Доля плодовой ДНК по SNP ( > 4%): 17.9(6.4-19.2)

Соотношение X/Y -0,87

T-score 13 хромосома ( < 4): -0,5

T-score 18 хромосома ( < 4): -0,9

T-score 21 хромосома ( < 4): 7,0

Результаты исследования:

Анализируемый образец содержит ДНК с МУЖСКИМ генотипом.

Высокий риск трисомии по 21-й хромосоме.

150

Приложение 9 Лабораторное заключение по результатам ДНК-скрининга

Зависимость нормированного покрытия от GC состава:

Отклонение покрытия хромосом от референсных данных:

151

Благодарности

В заключение хочу выразить глубокую благодарность и

признательность моим научным руководителям Трофимову Дмитрию

Юрьевичу и Каретниковой Наталии Александровне за

высоквалифицированную помощь на всех этапах выполнения

диссертационной работы.

Также хочу выразить искреннюю благодарность и признательность

своим коллегам Шубиной Екатерине, Мукосей И.С., Гольцову А.Ю.,

Крашенинниковой Р.В., Сибгатуллиной Д.Б., Ступко О.К., Бугай Т.В.,

Кочетковой Т.О., Екимову А.Н., Тюниной Т.Ю., Саделову И.О.,

Бахареву В.А., Зарецкой Н.В., Андроновой Н.В., Быстрицкому А.А.,

Донникову А.Е., руководителю 2-го акушерского отделения патологии

беременности Тетруашвили Н.К. и сотруднику отделения Ким Л.В.,

руководителю патолого-анатомического отделения Щёголеву А.И. и

сотруднику отделения Ляпину В.М., всему коллективу ФГБУ "НМИЦ АГП

им. В.И. Кулакова".

Отдельно выражаю благодарность за неоценимую помощь и поддержку

директору Центра Сухих Геннадию Тихоновичу и председателю общества

акушеров-гинекологов Серову Владимиру Николаевичу.

"Работа поддержана Министерством образования и науки Российской

Федерации (соглашение № 14.607.21.0136, идентификатор проекта

RFMEFI60715X0136)."