外来医薬品を駆逐tkl.pc.uec.ac.jp/images/class2018/日大集中講義...外来医薬品を駆逐するための...

外来医薬品を駆逐するためのハイブリッド分子の作製：

化学・生物学的技術を中心とした悪アガキ

電通大院・基盤理工・創薬ラボ准教授瀧真清

2018/09/18 ＠日大・桜上水キャンパス

BIG PICTURE

• 人間の尊厳がなくなる治らない病気（例：癌、アルツ）

• 緊急時の即時・簡便診断（例：救急車内、手術前）

• 日本の若い人の金銭的ツケ（医療赤字）

を何とかしたい。

3

新参の薬学者としてのありきたりな

創薬＝必要悪

T7 phage

… and their hybrids ! Fluorescent

amino acids(CBC, 2008)

Keep-on-

fluorescent

pharmacophores(ABC, 2018)

Bio-compatible

secret project

Taki Lab. at a glance: MEDICINAL engineering

Turn-on

fluorescent

sensors(Anal Chem, 2016)

Dumbbell-shaped

stable DNAs(ANIE, 2004)Aptamer-related

secret project

NEXT-A reactionPET-probe fused

target binders(CTMC, 2016)

Functional Fc

Covalent

binders(Bioconj Chem, 2018)

Macrocycles(Chem Comm, 2014)

Biologics

NonBiologicsCCarbon

Combinatorial Libraries

Rational Designings

Chemistry

Fullerene

bisadducts(JACS, 1998)

AI-related

secret project

… and their hybrids !




Functional Fc

Biologics

CCarbon

Chemistry

tRNA

protein Modified protein

L/F-transferase

tRNA

Soffer et al., J. Biol. Chem., 246, 5207 (1972).

LysLeuLeu

Signal for protein degradation

Background:Role of L/F-transferase in nature

Unnecessary Unnecessary

Lys (or Arg)

9

tRNA


L/F-transferase

tRNA

Soffer et al., J. Biol. Chem., 246, 5207 (1972).

Lys (or Arg) LysPhePhe

Signal for protein degradation

Background:Role of L/F-transferase in nature

Unnecessary Unnecessary

10

tRNA


L/F-transferase

tRNA

Lys

Fundamental principle for ANY-probe labelingmediated by L/F-transferase

ANY-probe

11

Lys (or Arg)

e.g., Taki et al., Chem. Commun., 47, 9116 (2011).

tRNA

PET probe introduction via the NEXT-A reaction

F-protein

Engineered ARS

L/F-transferase

F

F

F

protein

tRNA

One-pot reaction

FMT FET

or

12Amino Acids, 47, 1279 (2015); FEBS Open Bio, 3, 252 (2013).

N-terminal EXtension by Transferase & Aminoacyl-tRNA synthetase

反応速度が命！

放射性の目印

Phe

FMT

FET

Kinetics of the enzymatic transfer

Amino acid

Km

(μM)1.1 2.6 18

kcat

(min-1)60 62 1.0×102

kcat/Km

(μM-1min-1) 55 24 5.7

Phe FMT FET

L/F-transferase

ｌ

-

13Amino Acids, 47, 1279 (2015); FEBS Open Bio, 3, 252 (2013).

37 oC, 20 min

FMT : protein = 2 : 1

Mass (m/z)

NEXT-A

Protein labeling with a PET probe (FMT)

Edman:

> 99% !!

F

F

14Amino Acids, 47, 1279 (2015).

• [18F]FET-Lys-Kallidin

0 2 4 6 8 10

Time(min)

mV

• [18F]FET + Lys-Kallidin

NEXT-A

Radioactive 18F introduction into a peptide by the NEXT-A reaction

0 2 4 6 8 10

Time(min)

mV

[18F]FET

[18F]FET-Lys-Kallidin

15Curr. Top. Med. Chem., 16, 2703 (2016).

放射性の目印

In vivo Cancer Imaging

LOW

HIGH

PET/SPECT/CT: FX3300

Tumor

Dorsal

Ventral

Rostral

Caudal

Coronal Image Transverse Image[18F]FET-Lys-Kallidin-cycloRGD

T. Furukawa, H. Kimura, unpublished (2018).

分子標的型薬剤

放射性の目印

ここまでのまとめ：

NEXT-A reaction :蛋白質／ペプチド／抗体（バイオ分子）のアタマ（N末端NH2基）だけに異種分子を共有結合させる新規酵素反応

17

放射性目印または安定性向上蛋白質

分子標的型薬剤

癌イメージング薬剤または１回投与型薬剤

+

18

Hybridize

Take-home message:

+

化学単なる足し算ではなくなる瞬間がより面白い

分子１

分子２

分子X （薬）

T7 phage



Keep-on-

fluorescent


Bio-compatible

secret project


Turn-on

fluorescent


Dumbbell-shaped


secret project



Functional Fc

Covalent



Biologics

NonBiologicsCCarbon


Rational Designings

Chemistry

Fullerene


AI-related

secret project

T7 phage


Turn-on

fluorescent


Covalent



Biologics

CCarbon


Chemistry

22

T7 phage

1種類の人工分子

10億種類のライブラリーペプチド（天然っぽい分子）

10億種類のネオバイオ分子候補

10BASEd-T (Gp10 based-thioetherification) reaction :ウィルスの表面で10億種類のネオバイオ分子候補を作る方法：

精密有機合成化学：ウィルスには反応しない。↓

ウィルスは活きたまま、増殖させられる。

単なる足し算以上のもの（ネオバイオ分子）が

たった1分子でもできればそれだけを増やすことができる

TMR-IA: ー＋

10BASEd-T：単なる教科書反応（Williamson型エーテル合成； SN2）

1) reduction (TCEP)

2) alkylation (TMR-IA)

one-pot reaction

3 h. @ 4 ℃

-SH

HS- HS-

-SH

Gp10

SH SH S S

▲

S S

Fukunaga et al., Mol. BioSyst., 9, 2988 (2013).

O

O

NON

NH

O

10BASEd-T

40

50

100

10

kDa

Identified by LC-MS/MS

fluorescence imaging

SH SH

←まるで酵素反応！

23

LC-MS/MS analysis of TMR-adducton T7 phage

O

O

NON

NH

O

24

複雑な生体分子を特異的に認識した時、

強度が上がりなおかつ

蛍光色がかわる

生体分子

応用例：光る薬剤（蛍光診断薬）の作製 Part I

ニーズの具体例：① 救急車の中での血液内特定物質の簡易迅速測定② 手術時の微小癌の摘出③ 癌診断

M. Taki, K. Mochizuki et al., Anal. Chem., 88, 1096 (2016).

S. Uematsu et al., AIP Conf. Ser., 1807, 020028 (2017).

T7 phage

A fluorogenic coreLibrary = 1 billion different peptides

One-billion different fluorogenic molecules

Protein-specific indicator molecule(s)

10BASEd-Tによる環境応答性ネオバイオ分子候補ライブラリーの作製

26

T7 phage

Selection

環境応答性蛍光分子

T7 phage-displayed model peptide is

site-specifically modified via the 10BASEd-T

Gp10

SH SH S S

Like an enzymatic reaction

27

28

GST-binding 12 monoclones with strong ELISA signals:

Group 1: ---

----

-----

Group 2:

Group 3:

NXVSCXGZ

XXNPCXXZ

XPGPCG

Z: Hydrophobic amino acids

X: Any amino acids

29Z: Hydrophobic amino acids

X: Any amino acids

XZCXZDGZ

ZXZCZXDGZLNYCDGW

NXVSCXGZ

XXNPCXXZ

XPGPCG

CDZZ

(TMR)

(DMN)

(DBD)

(Prodan)

取得した蛍光性GST結合体:

Large

Small

Core

size

30

Group 1:best color-changing and turning-on sensor

GST

NTVSC*HGF

Weak yellow Intense blue

31

Group 2 & 3:moderate color-changing and turning-on sensor

NNPC*TGF

PGPC*G

N = 1.2

KD = 2.4 ± 0.1 μM

ΔH = -4.2 ± 0.1 kcal/mol

-TΔS = -3.6 kcal/mol

ΔG = -7.8 kcal/mol

標的蛋白質(GST)

標的でない蛋白質(streptavidin)

標的蛋白質(GST)

蛍光コアのみ（進化前）

周辺構造のみ

O

x x x

進化後疎水性相互作用と分子間力とがバランス良く作用

熱測定

32

33

V

V

H

H

a

bcd

F

F a

T

T

bcd

e

fg

gfe

VHOD

どの疎水性基がどの程度標的蛋白質と接近しているか？飽和移動差スペクトル法（１H NMR）

蛍光コアも進化させた周辺構造もどちらも重要！

飽和時間＝1s

飽和時間＝2s

飽和時間＝4s

GST蛋白質→ネオバイオ分子へのNOE

34

V

a

c

d

F

ef

0 1 2 3 4 5

0

2

4

6

D a ta 1

T im e (s )

ST

D I

nte

ns

ity

V (M e )

N M e2

F

c

d

e

1.90.78

0.50

weak (below 0.1)

0.24

0.62

0.55

0.24

0.29

必ずV↓ ↓ゆらぎ

V

a

cd

eF(meta)

STD = STDmax x (1-ekt)

k値：

GST蛋白質と接近している度合い

飽和時間

～0

36K. Yahiro, Peptide Science 2015, 89 (2016).

37

ちょっとまとめ： Fluorophore evolution

10BASEd-T

Core

GST

GST

GSH

38Z: Hydrophobic amino acids

X: Any amino acids

ZXZCZXDGZLNYCDGW

NXVSCXGZ

XXNPCXXZ

XPGPCG

CDZZ

(DMN)

(DBD)

(Prodan)

取得したGST結合体: 次世代シーケンサーを用いて再度解析

Large

Small

Core

size蛍光基の種類によらない共通配列

T7 phage-S

GST

Selection against

GST

T7 phage-S

T7 phage-S

T7 phage-S

T7 phage-S

GST

T7 phage-S

GST

Prodan

4-DMN

DBD

NGSでの共通配列：YCDGW

共通してソルバト蛍光を示す

40

T7 phage-S

GST

Selected peptide (seq: YCDGW)

GST特異的なソルバト蛍光性の確認：

500 600 700Wavelength (nm)

Flu

ore

scen

ce in

ten

sity

(a.

u.)

(A)

(B)

(C)

LNYCDGWGST

streptavidin

w/o

LNYCDGW

LNYCDGW

41

T7 phage-S

GST Fragmentalteration

-S

GST

Covalent binder

蛍光分子 → 反応点への変換

Solvatochromic bait fragments

Uematsu et al., Bioconjugate Chem., in press (2018).

１回投与型薬剤

42

YCDGW

血清中でも標的蛋白質だけにドンズバリ共有結合

YCDGW

標的の不可逆的阻害(共有結合型薬剤）

Uematsu et al., Bioconjugate Chem., in press (2018). Whole protein

FAM fluorescence

43

y4

1150.3y5

1313.3b5

1279.4

y2

262.1

b3

391.3

[M-H2O]2+

762.0y52+

657.5

b52+

640.4

y62+

714.5 b4

1164.3

m/z

Inte

nsity

b2

228.1

b6

1336.3

y3

377.1

L N Y C * D G W

y2y4y6 y5

b3 b4 b5b2 b6

y3

SO O

IAY*SK

12 13 14 15 Time (min)

Trypsinized fragments of

GST + covalent binder

GSH結合ポケットのチロシン

Newly appeared

44

Tyrosineat the GSH-binding pocket

↑Fluorine atom of the covalent binder

Best docking model of the binder with GST

Uematsu, Tabuchi et al., Bioconjugate Chem., in press (2018).

T7 phage-S

Consensus sequence

GST

T7 phage-S

T7 phage-S

T7 phage-S

T7 phage-S

GST

T7 phage-S

GST

alteration-S

Structure determination by LC-MS/MS

Covalent binder

Bait Warhead

Uematsu, Tabuchi et al., Bioconjugate Chem., in press (2018).

ちょっとまとめ：Covalent binderの取得（ライブラリーからの取得は世界初）

library

１回投与型薬剤

46

10BASEd-T

One-billionpeptide library

T7 phage

+One-billion

crown library

core

抗体医薬代替物の取得を目的とした

超分子型ライブラリーの作製

LC-MS/MS analysis of macrocycle on T7 phage (1)

47

本当にファージウィルス上でクラウンライブラリーができるの？

Fukunaga et al., Chem. Commun., 50, 3921 (2014).

LC-MS/MS analysis of macrocycle on T7 phage (2)

48Fukunaga et al., Chem. Commun., 50, 3921 (2014).

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

R0 R1 R2 R3 R4 R5 R6

Rounds

10/11 clones

Biopanning against Hsp90

RSWC*RKSRKNSGGGLVWC*F

ab

so

rba

nc

e a

t 4

50

nm

OEGunmodified

OEG

unmodified

Hsp90

BSA

Hsp90

NTD

MD

CTD

Inp

ut

GST-pull down

GST

GST

GSTBlot: α T7

ELISA

HSP90

49

OEG

10億種類中たった1種類！

The macrocycle binds to NTD of Hsp90

Hsp90 NTD-binding supramolecule

linear peptide

Isothermal titration calorimetry (ITC) measurement

HSP90

O

x

50

KD = 1.7 ± 0.5 μM

ΔH = -13.7 ± 1.6 kcal/mol

VS

51Fukunaga et al., Chem. Commun., 50, 3921 (2014).

クラウンの柔軟な水素結合の生体分子への応用：初めて（皆、金属を捕まえることにしか着目していなかった）

CDスペクトル：

←クラウン型

←直鎖ペプチド型

問題点：結合に伴うエントロピー損失→結合力が弱い（KD = μMオーダー）

Hsp90-NTD

52

Selected cryptand analog as the specific binder

VS

Hsp90-NTD

Improved crown analog with more hydrogen donor

54

Ox

GSTHsp90-NTD

Cryptand binds to NTD of Hsp90 with high affinity

N = 1.1

KD = 62 ± 10 nM

ΔH = -16.9 ± 0.3 kcal/mol

-TΔS = 7.0 kcal/mol

ΔG = -9.9 kcal/mol

Isothermal titration calorimetry (ITC) measurement

Enthalpy driven !

抗体並み！

クリプタンド化しないとHsp90に結合しない。(data not shown)

WA

IL

V

A

IL

V

RRS

AVR

Conventional 1H NMR

WQP

W LI

I

RL

W

azacrownHOD

ppm

DMSOW

W

A

V

V

I

L

55

STD-1H-NMR:Which hydrophobic moieties closely interact with Hsp90?

NOE from Hsp90 to the ligand

56

[θ], d

eg

ree

cm

2d

mo

l-1

Wavelength, nm

CDスペクトル測定：最初からβターン構造(クラウンの時とは異なる）

分子内環化（酸化）されづらい：S-S間は空間的に遠い

Hsp90結合性

Hsp90に結合せず

力場作成支援プログラムの開発

Hsp90

近大の宮下先生との共同研究による分子動力学（MD)シミュレーション

58

↑特徴的な動きと好ましいエンタルピー寄与（絶妙な角度での水素結合）

全体として：適度な剛直性による結合に伴うエントロピー損失の低減

→

→

→：疎水性相互作用

→

→βターン↓

クリプタンド型のまとめ：抗体並みの性能は何故達成されたか？

重要なW：欠損すると結合力落ち

59

Active Hsp90 refolds luciferase.Hsp90 was inhibited.

Tar

get

unre

late

d p

ept

ide

DM

SO

No

addit

ive

Geld

anam

ycin

Cryptand inhibits Hsp90 activity:

ATP結合サイト以外の場所にて阻害

60

ちょっとまとめ： Macrocycle evolution

10BASEd-T

Core

GST

Hsp90

Hsp90

Macrocycle precursor

Cryptand

or

Crown analog

Mochizuki et al., Manuscript in preparation (2018).

KD = 62 nM

ここまでのまとめ：

10BASEd-T reaction :T7ファージウィルス上に提示させたペプチドが持つシステイン(SH基)だけに人工物を共有結合させる化学反応

61

T7 phage

人工分子

ライブラリーペプチドセレクション

ネオバイオ分子

T7 phage



Keep-on-

fluorescent


Bio-compatible

secret project


Turn-on

fluorescent


Dumbbell-shaped


secret project



Functional Fc

Covalent



Biologics

NonBiologicsCCarbon


Rational Designings

Chemistry

Fullerene


AI-related

secret project

Keep-on-

fluorescent



CCarbon


Chemistry

Previous work:

target

A)

Always-on

target

B)

Turn-on

3

target

C)This work:

Keep-onH2O

Tabuchi & Taki, ABC, in press (2018).

光る薬剤（蛍光診断薬）の作製 Part II

さっきのやつ

Discovered keep-on pharmacophore

HSAno HSA

HSA

Keep-onfluorescence

Hydrolysis(no fluorescence)

Tabuchi & Taki, ABC, in press (2018).

High-throughput screening assay

Size-Exclision Chromatography (SEC)

6Protein (i.e., HSA)

LC-MS

Dynamic Combinatorial Chemistry

取得された蛍光分子の評価

HSA に最も強く結合する化合物

HSAに対して特異的かつ強く結合

7

8

365nmで励起

“Keep-on” property of pharmacophore

@600nm

Ex. 365nm

HSA

Keep-onH2O

Hydrolysis

T7 phage



Keep-on-

fluorescent


Bio-compatible

secret project


Turn-on

fluorescent


Dumbbell-shaped


secret project



Functional Fc

Covalent



Biologics

NonBiologicsCCarbon


Rational Designings

Chemistry

Fullerene


AI-related

secret project

まとめにかえて：実用化は？

◎

○

○

◎：市販

○：基幹特許取得+動物試験で好成績

私が本気で予想していること

• 20年後：（今で言う）文系出身のリベラルアーツを習熟したリーダーも、

情報科学を武器にして実験科学者を従えて、安価・迅速に創薬を行う時代。

• 創薬は医学者や薬学者だけが行うものではないことが常識となる。

72

誰でも創薬

Acknowledgment: Lab. members

Kawaguchi et al., FEBS Open Bio, 3, 252 (2013).

73

H. Inoue K. Mochizuki

望月（学振DC1,オープンイノベーション（OI）コース）

AIP Conf. Ser. (2017);Bioconjugate Chem. (2018).

Anal. Chem. (2016).

植松

お金のかからない創薬人出のかからない創薬学生教育に適した創薬

田淵

（トビタテ！JAPANで米国留学）

外来医薬品を駆逐tkl.pc.uec.ac.jp/images/class2018/日大集中講義...外来医薬品を駆逐するための...

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