北見工業大学工学部バイオ環境化学科准教授小西正朗 - jst...column:...

新規酢酸耐性菌を用いたリグノセルロース系バイオマスからのエタノール生産

北見工業大学工学部

バイオ環境化学科

准教授小西正朗

1

研究背景

2

コーンコブ(穂軸)スイートコーン

バイオプロセス

有用物質生産

バイオリファイナリー（Biorefinery）：バイオマス等を原料としバイオプロセス物質生産の次世代基盤技術

様々な物質へ変換

酵素糖化

コーンコブ酵素糖化液

エタノール乳酸

糖アルコールポリマー原料高機能性物質(アスタキサンチン)発酵基質としての問題点

糖化効率が悪い発酵阻害の問題

発酵に用いられる宿主はこれらの物質への耐性が低い

除去操作が必要(活性炭処理等)

製造コスト増加・前処理の複雑化

発酵阻害を受けない菌の探索

発酵阻害物質の生成

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発酵阻害耐性菌を宿主とした微生物工場の開発

4

課題：発酵阻害に対する特性

合成生物学による代謝導入

糖化液。＋発酵阻害物質

任意の代謝遺伝子

発酵阻害耐性菌発酵阻害耐性菌有用菌

遺伝子導入技術の開発

乳酸(ポリマー原料)バイオアルコール

バイオマスプラスチック有機酸酵素製剤

課題：ゲノム情報遺伝導入法

グルコース

ピルビン酸

TCA回路

解糖系

乳酸(ポリマー原料) 検討項目：発酵阻害耐性菌の探索培養特性評価ドラフトゲノム解析遺伝子導入法

乳酸菌由来乳酸脱水素酵素（LDH)

先行研究例(糖脂質[ソホロリピッド,SL]生産)

5

121℃ , 60min1.0~5.0%硫酸メイセラーゼフィルター滅菌

硫酸処理酵素処理 pH 5

3％以上の硫酸前処理で増殖、糖脂質生産を阻害

■ソホロリピッド生産菌による糖化液からのソホロリピッド生産

Konishi M.*, Yoshida Y., Horiuchi J.: Efficient production of sophorolipids by Starmerella bombicola using a corncob hydrolysate medium. J. Biosci. Bioeng. 119, 317-322 (2015)

スクリーニング方法（耐性菌の探索）

6

北見工業大学屈斜路研修所概観

発酵阻害耐性菌の分類ー系統分類ー

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子嚢胞子

形態観察・生化学試験でも、P. membranifaciens と一致NBRCへ寄託

寄託番号：NITE P-02257

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増殖特性評価使用菌株： Pichia menbranifaciens KS47-1株 , Pichia menbranifaciens NBRC 10125,

Pichia manshurica NBRC 10726, Pichia deserticola NBRC 70716, Pichia kluyveri NBRC 1165, Kregervanrija fluxuum NBRC 0773, Saccaromycescerevisiae BY4742

培地： YM培地, コーンコブ糖化液培地 20 mL培養方法：振とうフラスコ培養（28 C, 200 rpm）

糖化液中での増殖挙動

糖化液の分析例

9

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 2 4 6 8 10

Retention time (min)

Inte

nsity

(-)

HM

F(2.

23) Fr

ufur

al(3

.58)

Vani

line

(7.1

0)

コーンコブ糖化液(10倍希釈)

Column: μBOUNDASPHERE 5μ 100Å (3.9×150 mm)Mobile phase: 0.1% H3PO4/CH3CN = 85/15Flow rate: 1 ml / minSample Volume: 10 μlDetector: UV (275 nm)

HMF: 5-hydroxymethyl furfural

阻害物質：酢酸・フルフラール・ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)などを含む

個別成分に対する耐性

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高濃度酢酸存在下でのエタノール発酵

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Glucose

Acetate Biomass

好気条件 (～24h)

Glucose Ethanol

Acetate嫌気[微好気]条件 (24 h～)

Biomass

200 ml容量バッフル付フラスコ酢酸添加YPD培地 20 ml(100 g/L glucose, 20 g/L peptone, 10 g/L yeast extract, 250 mM acetate (pH 5.0)温度: 28 C,攪拌: 200 rpm (0～24h), 70 rpm (24h～)

KS47-1

NBRC10125

BY4742

KS47-1

NBRC10125

BY4742

BY4742

NBRC10125

KS47-1

KS47-1

スイッチング

ドラフトゲノム解析北海道ライフサイエンステクノロジー社に委託しKS47-1株のGenome解析を行った

k-value 61Contig 379Total contig size 11399492Max. contig size 552197Minimum contig size 121N50 contig size 287258

Table. Velvet(Ver 1.2.03)によるアセンブルの結果

CDS tRNA rRNAKS47-1Genome 4666 181 5

Table. MiGAPによるアノテーションの結果

Table.3 NCBI BLAST(2.2.18)解析の結果

SoftwareRefSeq 39TrEMBL 935NR 932Total 1906

特許出願：発酵阻害物質への耐性を有する新規ピキア属酵母

特願2016-239366（基礎出願特願2016-116160）

論文投稿：Konishi M*, Arakawa T., Kato Y., Ishida M., Horiuchi J: Genome Announc. [in press] DOI:10.1128/genomeA.01672-16

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ゲノム解析（方法）ゲノムDNA抽出:アルカリSDS法シーケンス： HiSeq 2000 (Illumina), 2 Gb, ペアエンドアセンブル： DDBJ Read Annotation Pipeline (Velvet V

1.2.03)アノテーション： MiGap (Microbial Genome Annotation

Pipeline Ver 2.18)ORF, RNA予測: AUGSUTUS 2.5.5, tRNAscan-SE 1.23, NCBI BLAST 2.2.18, RNAmmer 1.2Annotation: NCBI BLAST 2.2.18Reference Databese set: RefSeqrelease 67, TrEMBL release 2014_04,NR [20141001]

既知の酵母との遺伝的類似性

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Saccharomyces cerevisiae S288C

Pichia membranifaciens KS47-1

Pichia membranifaciens NRRL Y-2026*

1606

2439

2893

175

16

56

2893

Venn diagram based on the similarity of CDSs among P. membranifaciens KS47-1, P. membranifaciens NRRL Y2026, and Saccharomyces cerevisiae S288C. The overlap was described by thresholds of 60% identities and 70% coverages using in silico MolecularCloning Genomic Edition version 6.0.35D. Diagram was draw by R version 3.3.2.

*) Riley, R., Haridas, S., Wolfe, K.H., Lopes, M.R., et al. 2016. Comparative genomics of biotechnologically important yeasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 113: 9882-9887.

本菌株特異的遺伝子

酢酸耐性関連遺伝子

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Table. Estimated inhibitory compounds-tolerance associated genes of KS47-1.

Query (S. cerevisiae S288c) Results

Pichia membranifaciens KS47-1 Pichia membranifaciens NRRL Y-2026

Name Accession No. Length Accession Length Q_cov Identity Accession Length Q_cov Identity

(a.a) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) (Locus_tag) (a.a) (%) (%)

Acetate tolerant-associated genes

FPS1 CAA38096 669 GAV27344 581 8 38 No Hit

(PMKS-000808)

HOG1 NP_013214 435 GAV30090 418 54 48 XP_019016084 439 88 79

(PMKS-003596) (PICMEDRAFT_17479)

PMA1 NP_011507 918 GAV27308 913 98 82 XP_019017200 911 98 83


PDR12 NP_015267 1501 GAV27646 1495 98 64 XP_019019180 1489 98 64


HAA1 NP_015333 694 No Hit No Hit

TPO2 NP_011654 641 GAV27934 708 98 59 XP_019018723 602 95 63

(PMKS_001402) (PICMEDRAFT_31287)

TPO3 NP_015482 608 GAV27934 708 96 62 XP_019016311 524 95 62


Abbreviation: Q_cov, Query coverage.

出芽酵母(S. cerevisiae)で知られている酢酸耐性遺伝子と類似性の高い遺伝子を探索

酢酸耐性機構

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既知の酢酸の取り込みやストレス応答に関与する遺伝子はヒットしない

高毒性 pH低下

酢酸代謝遺伝子・その他耐性関連遺伝子

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Table. Estimated acetate assimilation associated gene and inhibitory compounds-tolerance associated genes of KS47-1.

Query (S. cerevisiae S288c) Results

Pichia membranifaciens KS47-1 Pichia membranifaciens NRRL Y-2026

Name Accession No. Length Accession Length Q_cov Identity Accession Length Q_cov Identity

(a.a) (Locus_tag) (a.a) (%) (%) (Locus_tag) (a.a) (%) (%)

Acetate assimilation

ACH1 NP_009538 526 GAV26611 524 99 73 XP_019016311 524 99 74


ACS1 NP_009347 713 GAV28358 673 95 59 XP_019020447 671 90 67


GAV28674 319 44 63

(PMKS_002148)

ACS2 NP_013254 683 GAV28358 673 98 70 XP_019020595 673 98 69


GAV28674 319 46 63

(PMKS_002148)

ALD4 NP_015019 519 GAV27085 525 95 69 XP_019019753 525 95 47


Furfural and 5-HMF tolerant associated genes

ADH6 NP_014051 360 GAV28462 375 99 42 XP_019015385 375 99 47


NP_010030 361 GAV30683 362 99 37

(PMKS-004202)

ADH7 NP_014051 360 GAV28462 375 98 41 XP_019015385 375 99 47


NP_010030 361 GAV30683 362 98 40

(PMKS-004202)

ZWF1 NP_014158 505 GAV30453 236 44 56 XP_019016188 508 97 58


ARI1 CUA76880 342 GAV26909 349 95 37 XP_019019389 359 93 36

(PMSK_000370) (PICMEDRAFT_16083)

Abbreviation: Q_cov, Query coverage.

酢酸代謝

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ACS1Acetate CoA ligase

酢酸同化経路

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Acetate Acetｙｌ CoA

CoA

ATP AMP + PPi

TCA cycle

Acetate CoA ligase （ACS1）

好気的でATPリッチな条件で活性化している可能性

酢酸同化による解毒作用が強力か？

まとめ

• コーンコブ糖化液中で増殖阻害を受けない酵母Pichia membranifaciensKS47-1株を分離した。

• 好気培養で酢酸を優先的に利用できる。

• 好気培養と嫌気培養を組み合わせた2段階培養で250mM酢酸存在下でエタノールを生産できる（6 g/L）。

• ドラフトゲノム解析により、酢酸耐性ならびに代謝遺伝子について解析を進めている。酢酸取り込みについては未知の遺伝子を持っている可能性が高い。

• 酢酸以外の増殖阻害物質に対しても高い耐性を持つ。

• フルフラール類の耐性に関与する遺伝子を保持している。

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展望

• コーンコブ以外のバイオマスでの有効性• 遺伝子組換え系の構築（Pichia pastorisの宿主ベクター系をベースに検討中)

• 遺伝子組換え系を利用した異種タンパク生産• 合成代謝遺伝子を組み込んだ種々の物質生産

• 特異な耐性関連遺伝子の利用

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バイオマス由来発酵阻害物質に対し

ロバストなバイオプロセス構築副生成酢酸の有効利用

既存の微生物に酢酸耐性付与

問い合わせ先

北見工業大学社会連携推進センター

内島典子

ＴＥＬ 0157-26-4161E-mail [email protected]

北見工業大学工学部バイオ環境化学科

小西正朗

ＴＥＬ 0157-26-9402E-mail [email protected]

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