저작자표시 비영리 공연 및 방송할 수...
TRANSCRIPT
저 시-비 리-동 조건 경허락 2.0 한민
는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게
l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.
l 차적 저 물 성할 수 습니다.
다 과 같 조건 라야 합니다:
l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 허락조건 확하게 나타내어야 합니다.
l 저 터 허가를 러한 조건들 적 지 않습니다.
저 에 른 리는 내 에 하여 향 지 않습니다.
것 허락규약(Legal Code) 해하 쉽게 약한 것 니다.
Disclaimer
저 시. 하는 원저 를 시하여야 합니다.
비 리. 하는 저 물 리 적 할 수 없습니다.
동 조건 경허락. 하가 저 물 개 , 형 또는 가공했 경에는, 저 물과 동 한 허락조건하에서만 포할 수 습니다.
이학 사학 논
쁜꼬마 충 사조 인자 DAF-19
새로운 작용 에 한 연구
A novel action mechanism of DAF-19/RFX
transcription factor in C. elegans
2015년 2월
울대학 대학원
생명과학부
박 동
쁜꼬마 충 사조 인자 DAF-19
새로운 작용 에 한 연구
A novel action mechanism of DAF-19/RFX
transcription factor in C. elegans
지도 수 이
이 논 이학 사학 논 로 출함
2014년 12월
울대학 대학원 생명과학부
박 동
박동 이학 사 학 논 인 함
2014년 12월
원 장 (인)
부 원장 (인)
원 (인)
i
국 요약
쁜꼬마 충 사조 인자 DAF-19
새 운 작용 에 연구
쁜꼬마 충 생존에 부 합 상황에 다우어라는 면 충
상태 뀐 후 nictation이라는 특 행동 다. 이 행동 다
우어가 3차원 공간 리를 들고 드는 행동 , 주변 상
황이 생존이나 번식에 합 지 못 시 종 생존에 인 산
일 것이라 추 했다. Nictation에는 IL2 감각 뉴런에 분
는 아 틸 린과 자극 인지 는 모가 요 다.
쁜꼬마 충 진 잘 보존 포 소 인 모를 통해
개체 에 질, 신 달 질 등 지각 있다.
모는 미 소 구 axoneme이 심부를 구 고 있다.
Axoneme 체를 틀 워 있고 kinesin, dynein이라는
운동 단 질에 해 이 지는 구조 운 통해 과 분해가 이
진다. 종 운동 단 질에 해 일어나는 axoneme ,
분해를 복 는 과 Intraflagellar transport(IFT)라고 일컫는
다.
쁜꼬마 충 모 생 단계에 핵심 인 역 는 심
조 인자는 daf-19이라는 자다. daf-19 60개
모 구조를 지닌 감각 뉴런에 고 RFX라는 winged helix
transcription factor를 해독 다. 모를 지닌 감각 뉴런 그 끝에
ii
모 구조가 존재 는데 이것이 사람 눈과 입, 같 감각
역 신해 외부 경 변 나 자극들 느낌 써 개체
구 는 것이다.
RFX 사 인자는 날개 모양 나 구조가 특징 보존 어
있는 사 인자다. RFX 조 는 자 모
속에는 X-box라는 열이 존재 는데 이는 진 잘 보존
어 있다. IL2 신경 포에 특이 는 klp-6는
kinesin-3라는 운동 단 질 해독 는데 이 단 질 IFT 구조체
를 구 는 단 질들 운 는 역 다. 특이 게도 klp-6
자는 감각 모 구조를 는데 요 자임에도 불구
고 모 속에 X-box 찾 가 힘들었다. klp-6
모 속에 X-box 자체가 보존 어 있지 않거나
존과는 차별 새 운 태 존재 다면 RFX 새 운 조
커니즘 힐 있 거라 가 했다. 본 연구에 klp-6 모
분 법 통해 DAF-19이 사 조 해 요
가 어느 곳인지 알아내었고 이 부분에 DAF-19 사 조 인자
조 인자들이 붙어 복합체를 구 해 사를 조 것이
라는 아이 어에 착안했다. 간추 진 열 이용해 컴퓨 그
램 분 했다. 그 결과 자 에 요 klp-6 모
속 특 열에 어떤 사 조 인자가 결합 지 생 보 법
근해보았고 불어 DAF-19과 리 직 결합 는
사 조 인자를 분 해내고자 yeast two hybrid 라는 분자생
법 사용했다. 본 연구를 통해 체 , 고도 달 스
크리닝 , 존 보편 고 효 인 생 법 등 루
사용해 새 운 모 생 히고자 했고 모 생 심 조
iii
인자인 RFX 사 조 인자 새 운 분자 작용 에
체 규명 고자 다.
주요어 : 쁜꼬마 충, DAF-19/RFX, klp-6, X-box, 사 조 ,
새 운 모티
번 : 2012-20305
iv
차
국 요약 ............................................................................................... i
차 ....................................................................................................iv
그림 도 차 ................................................................................v
I. ................................................................................................. 1
1. C. elegans 모델동 장 ............................................. 1
2. C. elegans 모 능 ........................................................... 1
3. DAF-19/RFX 사 인자 모 생 조 커니즘 ................. 2
4. 독특 DAF-19 자 klp-6 ...................................... 4
II. 실험 재료 법.............................................................................6
III. 실험 결과.......................................................................................16
1. 단일 뉴런 모 에 추 인 역 는 KLP-6…………16
2. 핵심 모 생 조 인자 DAF-19/RFX……………………………………17
3. 새 운 태 klp-6 모 속 X-box……………………………….19
4. 진 잘 보존 어 있는 새 운 모티 …………………………….22
5. 새 운 모티 를 이용 DAF-19 작용 탐색……………….22
IV. 고찰…………………………………………………………………………………………………..25
참고 헌 .......................................................................................... 53
요약 .......................................................................................... 57
Acknowledgement ............................................................................ 60
v
그림 차
Figure 1. EMS mutagenesis scheme…………………………………..…30
Figure 2. SNP mapping results of daf-19(of3), daf-19(of4)……..31
Figure 3. Fluorescent images of daf-19, rescue lines and mutants
with another IL2-specific marker……………….................................32
Figure 4. X-box candidate regions in klp-6 promoter…………..….33
Figure 5. Possible X-box deletion results…………………………..…34
Figure 6. klp-6 promoter analysis (regions from -1048 to -590
and from -1048 to -624 )……………….……………..........................35
Figure 7. klp-6 promoter analysis (regions from -614 to ATG and
-604 to ATG)………………………………...……………………………...36
Figure 8. Final Result of klp-6 promoter analysis…………………...37
Figure 9. klp-6 promoter analysis among Caenorhabditis
species……………….……………...........................................................38
Figure 10. New X-box motif in klp-6 promoter …………………….39
vi
Figure 11. Control figures of RNAi experiment…………………..…...40
Figure 12. Reduction of klp-6 expression by inhibiting pes-1……41
Figure 13. Physical interaction test of DAF-19 with PES-1……...42
vii
도 차
Table 1. Next generation sequencing results of daf-19(of3)……..43
Table 2. Result of FIMO analysis………………………………………...44
Table 3. RNAi screening of candidate genes………………………..…49
Table 4. Mutant screening of candidate genes……………………..….51
Table 5. Result of yeast two hybrid analysis……...……………..…...52
1
I.
1. C. elegans 모델동 장
C. elegans는 1974 부 연구 모델 등장 이래 신경,
생, 노 , 사조 등 다양 역들에 해 개체 이해
있는 통합 인 모델 시스 이다. 생 연구에는 인 모델동
들이 몇 가지 있지만 C. elegans는 재 지 포 가계도 신경계
연결 구조가 게 진 일 동 이다. 단 신경계, 강
도구, 지놈 트 , 해부 신경지도
등 여러 요인에 힘입어 신경작용 과 구조 생 등에 많
연구가 진행 어 있다. 라 포 운명이 어떻게 결 는지( 생
), 어떻게 신경회 보 달이 행동 만들어내는지(신경생 )
등 근원 인 질 에 요 단 를 시 있는 모델이다.
명 몸 지니고 있어 체내에 단 질 손쉽게 미경
통해 찰 있다.
2. C. elegans 모 능
C. elegans는 생존에 부 합 상황(주변에 다른 개체가 많고 아
고 상황인 경우)에 다우어라는 면 충 상태 달해 nictation
이라는 특 행동 다. 이 행동 다우어가 3차원 공간 리
2
를 들고 드는 행동 , 주변 상황이 생존이나 번식에 합 지
못 시 종 생존에 인 산 일 것이라 추 했다.
Nictation에는 IL2 감각 뉴런에 분 는 아 틸 린이 요 다고
보고 있다(Lee et al., 2011). IL2 모 구조는 C. elegans 다우
어가 nictation 행동 도 도 는데 핵심 인 역 다. 이
모 구조는 외부 리 자극 인지 여 주변이 nictation 에
합 경이라는 신 를 개체 속 보내 다.
모는 1676 Antonie van Leeuwenhoek에 해 견 포 구조
체 미 소 구 axoneme이 심부를 구 고 있다. 이는
진 매우 잘 보존 포 이다. 모를 구 는 Axoneme
체를 틀 워 있고 kinesin, dynein이라는 운동 단 질에
해 이 지는 구조 운 통해 과 분해가 이 진다. 이러
종 운동 단 질에 해 axoneme 과 복 과 IFT
(Intraflagellar transport)라고 일컫는다.
3. DAF-19/RFX 사 인자 모 생 조 커니즘
C. elegans에 모 생 핵심 인 역 는 심 조 자는
daf-19이라는 자다. daf-19 자는 60개 모 구조를 지
닌 감각 뉴런에 고 RFX라는 winged helix transcription
factor를 해독 다(Swoboda et al., 2000). 이 사 인자는 사람,
리, , 충 인 모든 종 모에 존재 는 요 구조
3
합 다. 포 에는 RFX 사 인자 동 단 질 모 8종
가 존재 다고 알 있다. 그러나 C. elegans에 는 RFX 사 인자
동 단 질 DAF-19 종 에 없다. 진 상 모든 RFX
사 인자가 공통 지닌 DNA 결합 구조를 외 나 지 구조를
RFX 사 인자를 분 나 있다. C. elegans
DAF-19 척추동 RFX 1-4, 6 그리고 리 RFX 함께 같
범주에 포함 다. 척추동 RFX1-RFX4 역시 모 과 지
에 인 역 담당 고 있다. RFX 사 인자는 날개 모양 나
구조가 특징 보존 어 있는데 이 구조를 통해 자
모 속 X-box라는 특 모티 에 특이 결합해 사를 조
다는 사실이 행 연구를 통해 있다(Burghoorn et al.,
2012). 구체 말 자면, 모 합 시 IFT 소단 체를 해독 는
자들 사 를 RFX가 담당함 써 모 생에
심 조 자 역 는 것이다. X-box는 구조 칭 이루고 있
는 열인데 개 칭 복 열이 1-3개 뉴클 티드를 사이
에 고 모티 를 이루고 있다. 척추동 에 는 RFX1-4가 같 단
질 다른 단 질이 다양 조합 이합체를 이 X-box
속 개 칭 복 열에 결합 다. 자에 라 그 조합
상당히 달라질 있다(Iwama et al.,1999; Morotomi-Yano et
al.,2002).
4
4. 독특 DAF-19 자 klp-6
IL2 신경 포에 특이 는 자인 klp-6는 Kinesin
like protein 6라는 이름이 축약 뜻이다. KLP-6 운동 단 질
IFT 구조체를 구 는 단 질 운 는 역 고 있다. 주
체에 합 IFT 구 단 질 모 끝 운 다
(Anterograde transport). 단일 뉴런인 IL2 감각 뉴런에 특이
해 그 뉴런 모 생 조 다. 본 연구에 는 EMS random
mutagenesis란 고 인 forward genetics 법 이용해 klp-6
자 조 는 DAF-19를 찾아낼 있었다. 지만 놀랍게
도 이 klp-6 자는 모 속에 X-box 찾 가 힘들
었다. 몇몇 논 에 는 klp-6 자 모 속 X-box가 아마
도 없 거라고 추 도 했다(Peden et al., 2005).
DAF-19이라는 모 생에 핵심 인 역 는 사 조 인자
에 해 조 고 있지만 klp-6는 그 모 속에 X-box
자체가 보존 어 있지 않았다. 만약 X-box가 다른 태 존
재 거나 재 지 알 지지 않 미지 열이 에 여 다면 새
운 모 생 조 커니즘 힐 있 거라는 생각에 이르게
었다. 모 분 법 통해 DAF-19이 특이 결합해
사 조 있 법 요 부 가 어느 곳인지 알아내 해
klp-6 모 일부분에 GFP 클 닝 처리해 시 IL2 신
경 포에 만 는 모 부분 찾아내고자 했다. 분 통
5
해 25개 도 염 열이 klp-6 에 요 다는 걸 알아냈고
이 열 속에 개 X-box 후보 열이 포함 어 있 지만 존
에 알 진 것과는 다른 양상인 것 인 있었다. 상당히 떨어진
에 개 X-box가 했고 구조 칭 이루고 있는
열 역시 아니었다. 행 C. elegans 연구에 는 보고 없는 새 운
견이었다. 이 열 Caenorhabditis 속에 함께 속해 있는 C.
brenneri, C. japonica에 놀랍게도 고스란히 보존 어 있었다. 생 보
데이 베이스를 간추 진 열 분 통해 자
에 요 klp-6 모 속 모티 에 어떤 사 조 인자가 결합
지 분 해보고 독립 yeast two hybrid 법 DAF-19 사
조 인자에 리 결합 는 인자를 찾아 DAF-19/RFX 사
조 인자 새 운 분자 작용 규명 고자 했다.
6
II. 실험 재료 법
1. 실험 재료
1) 지
C. elegans를 키우는 지 는 nematode growth medium (NGM)
사용 며 조 다 과 같다. NGM 지는 1L를 만들 bacto-
trypton(Difgo) 4g, potassium dihydrogen phosphate(Shinyo) 3g,
sodium chloride(Fisher) 2g, dipotassium hydrogen
phosphate(Showa chemical) 0.5g, cholesterol(Sigma) 0.008g
고 천 2% 첨가 여 사용 다.
일 E. coli를 키우는 지 는 Luria Bertani(LB) 지를
사용 다. 이트에 고체 지를 만들 는 천 가루 (agar
powder)를 2% 첨가 고, 원 는 균주를 택 해 각
라스미드가 가진 마커에 라 ampicillin, kanamycin, streptomycin
등 항생 를 사용 다.
2) C. elegans strains
야생 Bristol N2를 사용 며 mutant strain C. elegans
Genetics Center에 요청 여 사용 다. 본 연구에 사용 mutant
strain daf-19(of3), daf-19(of4), daf-19(rh1024), fkh-
2(ok683), eri-1(mg366);lin-15B (n744), egl-5(n486), daf-
7
3(e1376), fkh-7(ok793), fkh-10(ok733)이다. 실험에 사용
벌 들 모 고체 지에 OP50-1 E. coli 균주를 양 여 lawn
만들고 그 에 C. elegans를 3-4일 간격 겨주며 양 다.
3) E. coli 균주
C. elegans 이 는 장균 OP50-1(streptomysin 내 균주)
사용 고, 일 인 라스미드 증폭 해 는 DH5a 를
사용 다.
4) 시약
DNA 동에는 USB 사 agarose 를 사용 다.
5) 효소
효소 타 다른 효소들 주 MBI fermentus 사 Promega,
Boehringer Mannheim, Takara, New England Biolab 사 품
사용 다.
6) 타
미 주입(microinjection) 라스미드 추출에는 Qiagen
plasmid kit를 사용 고, PCR 산 에는 Bohringer
Mannheim PCR purification kit, DNA agarose gel에 DNA 추출
8
에는 Qiagen Qiaex II MBI fermuetus 사 DNA gel extraction
kit를 사용 다.
2. 실험 법
1) Making transgenic animals by microinjection
미 주입 통해 C. elegans에 자를 transformation 는 법
사용했다. 미 주입 해 DNA를 Qiagen plasmid kit를 사용
여 고, 체농도가 `180ng/ul가 도 맞추었다. N2 bristol
strain에 pklp-6::gfp(60ng/ul), paqp-6::dsred(60ng/ul)를
pRF4(rol-6) (60ng/ul)를 마커 사용 다.
미 주입 과 에 는 Differential interference contrast(DIC) 미
경 이용 고, 벌 어린 체 마리를 2% agar에 상체
찰 여 생식 쪽이 주사 늘 쪽 도 후 DNA 채
워진 주사 늘 생식 속 찔러 고 압 공 압 DNA
용액이 생식 속 들어가도 다. 미 주입이 료 개체는
신속히 M9 용액 덮어 마르지 않게 후 새 지에 겼다.
2) Gamma ray irradiation
질 벌 생 단계를 다 맞춰 주 해 50ㅠ 이트에
10마리씩 Gravid adult를 계 후 6시간동안 알 고 거해주거
나 15ml conical tube에 벌 들 Harvest 고 같 부 M9
9
3번 도 씻어주는 bleaching 법 이용 다(Clinical centrifuge에
1200rpm, 30s). 이후 1-5ml 도 Hyperchlorite solution 쳐주
고 Inversion 계를 이용해 3-7분 도 잘 어주고 1200rpm, 20-
30s 도 원심분리해 다. 원심분리 벌 를 같 부 M9 4
번 도 씻어주고 지에 뿌 다. 생 단계를 맞춘 알 48시간
도 L4 stage가 지 키운다. Gamma ray를 4000rad 10분
도 처리해주고 Gamma ray 처리 L4 생단계 벌 들 이
트 당 5마리 씩 100 π NGM lite 20장에 계 해 다. 이 후 씨 20
도에 12일에 14일 도 굶 지 키운다. 굶 지 일부를
각각 조 만 잘라 50 π 이트 20장에 붙이고 24-36시간 20도
에 키운다. 잘라 붙인 20개 이트에 각각 1마리씩 50 π
이트 20장에 Marker를 지닌 벌 를 다( 400 이트).
100% Integration line 인해 다
3) EMS random mutagenesis.
L4 생 단계 벌 를 모아 다. 이후 M9 이용해 2회 도 씻어
주고 15ml tube에 모아 다. 모 벌 에 M9 2ml, EMS 20ul 처리
해 뒤 parafilm 감아 잘 동 해 다. 이 후 4시간 도 rotor를 이
용해 잘 inversion해 다. 2차 M9 씻어주고 100 π NGM lite에
가라앉힌 용액 뿌 주고 8시간 도 키운 후 늦 L4, 어린
체 시 에 5마리씩 30개 이트에 겨 다.
10
4) klp-6 Promoter analysis
Bristol N2 벌 에 klp-6 promoter를 분 여 GFP를 PCR fusion
해 미 주입했다. 사용 primer는 다 과 같다.
-1048 forward : AAGTTATGAAATGCCGCAAAG
-854 forward : GGAGTTTGCTACGATATTCGG
-641 forward : CAAACACCGTTTGGTCCG
-613 forward : GTCGCTTGGAGACCTACATG
-604 forward : GACCTACATGGCAACATTGACT
B primer that link ATG regions with GFP :
AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCCCATTATTCTGAAAAGT
TCAAC
B primer that link -624 regions with GFP
AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTCGGACCAAACGGTGTTTG
B primer that link -590 regions with GFP
AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTGTTGCCATGTAGGTCTCCA
AG
B primer that link -586 regions with GFP
AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTCAATGTTGCCATGTAGGTC
TC
B primer that link -584 regions with GFP
AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTGTCAATGTTGCCATGTGAG
TC
11
5) RNAi experiment
Feeding RNAi 법 사용했다. RNAi library는 국 MRC 에
것 이용했다. eri-1(mg366);lin-15B(n744);Ex[pklp-6::gfp]
이용해 RNAi 처리 고자 는 자 RNAi를 라이 러리
부 어 ampicillin이 들어있는 Luria Broth에 키웠다. 1 mM
IPTG를 해 사 도해주었다. cDNA는 pPD129.36
(L4440) vector 속에 클 닝 어 있다. Bleached embryos나 L4 생
단계 벌 를 각각 L4 어린 체 지 키워 후 찰
다.
6) Yeast two hybrid yeast two hybrid 일 일 실험
DAF-19에 리 결합 는 단 질 찾 해 포항공과
(Postech)에 고 있는 Panbionet에 실험 뢰해 진행했다.
DAF-19 cDNA를 C. elegans에 추출 RNA 부 Reverse
transription 통해 합 후
forward primer : TTAGATCCTACAAAGATATCGTT
reverse primer : TTACAGAAGACCTGCTTTCTC
를 이용해 PCR 후 T-vector cloning 시도했다. PCR purification
이후 T4 DNA ligase, T4 DNA vector를 사용해 클 닝 후 회
사에 뢰했다. daf-19C full cDNA는 self-transcription activity가
있어 결합 단 질 찾 가 용이 지 않아 dimerization domain(2-
12
255)를 외 288부 끝 지( 374 아미노산, Truncated DAF-
19) 도를 GAL4-DNA 결합 부 가 있는 pGBKT7(bait)에 었고
종 yeast strain PBN204, AH109 strain 사용했다. PBN204
는 URA3, ADE2, lacZ를 AH109는 ADE2, HIS3, lacZ reporter
사용 는 yeast strain들이다. pGADT7 vector를 prey vector 사용
해 yeast strain에 transformation시 genome-wide 식
DAF-19과 결합 는 단 질 찾고자 했다.
일 일 실험 RNAi 실험에 미 결과를 보인 PES-1,
DAF-19(Full DAF-19, Truncate DAF-19) bait, prey vector 양
쪽 모 에 클 닝해 어주고 상 결합 는지 여부를 reciprocal
test를 통해 인했다. 사용 primer는 다 과 같다.
pes-1 primers EcoRI/ BamHI (pcr product; 263 aa, 792 nt)
pes-1-fF: GCGAATTCACGTCATCAATCAAATCTGATG
pes-1-fR: GCGGATCCTCAAGAACTTTTAGGAAAATGAAA
Tdaf-19 primers NdeI/ BamHI (pcr product; 374 aa, 1125 nt)
Tdaf-19F: CATATGTTACATAACAACAATGTAGTATC
Tdaf-19R: GCGGATCCTTACAGAAGACCTGCTTTCTC
Full daf-19 (A : prey vector_pGADT7, B: bait vector_pGBKT7)
daf19_A_F_NdeI:CATATGTTAGATCCTACAAAGATATCGTT
daf-19A_R_XmaI:GTTCCCGGGGTTACAGAAGACCTGCTTTCTC
daf19_B_F_NcoI:TTCCATGGCTTAGATCCTACAAAGATATCGTT
13
daf19_B_R_SalI:TTTGTCGACTTACAGAAGACCTGCTTTCTC
PES-1, Truncated DAF-19 경우 Bait(B), Prey(A) vector에 사
용 는 restriction enzyme과 primer가 동일 지만 Full DAF-19
경우는 구분해 사용했다. 클 닝 후 역시 Panbionet에 뢰해
실험 진행했다.
7) Single-nucleotide polymorphism (SNP) mapping
daf-19(of3), daf-19(of4)를 Hawaiian CB4856 과 를 시 다.
Daf-c phenotype 지니고 GFP가 없는 F2를 골라 냈고 F2를 모아
gDNA를 뽑았다. 뽑 gDNA를 PCR primer를 통해 PCR했고 각
SNP에 맞는 restriction enzyme 처리했다. 그 결과 Recombinants
는 2번 염색체 속 polymorphism인 F10C1(-1.07), F37H8(3.32)
를 통해 이 지역 안 daf-19 mutation 인 있었다.
9) Mutant rescue
daf-19(of3), daf-19(of4)를 daf-19 gDNA 부분이 포함
fosmid(WRM0622dH09)를 pPD114.108 vector안에 클 닝 어 있
는 pact-5::gfp를 marker 사용해 함께 미 주입해주었다.
10) Fluorescence Microscopy
Transgene 양상 찰 해 질 동 2.5mM
14
levamisole 마 시킨 후 mouth pipette 이용해 5% agar pad 에
놓는다. 사용 미경 Axioplan 2 microscope나 Confocal
LSM700 microscope (Zeiss)를 사용했다.
11) Site directed mutagenesis
QuickChange site-directed mutagenesis kit를 사용했다. 자가
들어있는 라스미드를 해 PCR 진행 다. Primer는 다 과 같다.
gg F ccttcgcttggagacctacatCAACattgactccacgtg
gg R cacgtggagtcaatgttgatgtaggtctccaagcgaagg
ggca F cgtcgcttggagacctacatACattgactccacgtg
ggca R cacgtggagtcaatGTatgtaggtctccaagcgacg
ggcaac F cgtcgcttggagacctacatattgactccacgtgtatg
ggcaac R catacacgtggagtcaatatgtaggtctccaagcgacg
본 실험 거 고자 는 부 가 커 2개 염 열씩 3단계
나 6개 염 열 거했다. PCR 진행 후 tra-
nsformation 단계를 통해 XL1-blue supercompetent cell에 도입 다.
12) Computational analysis
C. elegans klp-6 모 열과 C. briggsae, C. brenneri, C.
japonica, C. remanei, P. pacificus에 보존 klp-6 자 모
열 1kb(ATG 부 )를 MEME(Multiple Em for motif Elicitation)란
15
그램 이용해 분 했다. http://meme.nbcr.net/meme/intro.html
에 속해 MEME 그램에 각 종 열들 꺼번에 actual
sequence에 입 고 소값 2, 값 300 고 그램 실
행 다. 얻 결과 FIMO 분 시도, C. elegans 자 체
모 를 스크리닝해 새 운 모티 를 지닌 자를 찾아냈다.
16
III. 실험 결과
1. 단일 뉴런 모 에 추 인 역 는 KLP-6
IL2 신경 포에 특이 는 자인 klp-6는 앞 언
했듯이 핵심 모 구조 운 는 운동 단 질 만드는 자이
다. IL2 감각 신경 뉴런 생 시 에 KLP-6 운동 단 질 다른
kinesin 단 질인 OSM-3 함께 모를 는 구조체를 운 고
polycysin과 같 감각 모 막에 존재 는 단 질 를
잡아주는 역 담당 다(Peden et al., 2005). 행 연구를 통해
모 생에 자들 다 DAF-19 조 며 그
모 에 X-box라는 모티 가 존재 다고 있었다(Swoboda et
al.,2000). 지만 모 생 에 요 단 질임에도 불구 고 klp-
6 모 에는 X-box가 모 속에 알 진 태 보존 어 있지
않았다. 라 X-box가 실지 않 모 생 자 조
커니즘에 가지게 었다. klp-6 자는 그 좋 가
있었고 이 자를 이용해 존에 알 지지 않았 DAF-19
X-box 독립 인 사 조 연구 고자 했다.
실험 계 고자 본인 klp-6 모 에 GFP(녹색 단 질)
를 지해 IL2 신경 포에만 특이 GFP가 도 고
이에 조군 IL2 신경 포 자매 뉴런인 IL1 신경 포 특이
17
는 aqp-6라는 포막 단 질 합 는 자에
DsRED( 색 단 질) 지해 질 동 작했다. AQP-6
단 질 개체 내에 통 역 함 써 에 포막
과 높여 주는 능 해주는 포막 단 질 모 생과는
이 없는 자이다(Huang et al., 2007). 이 게 만들어진 질
동 이용해 EMS random mutagenesis를 행했다. EMS 처리 후
스웨덴 카 린스카 과 Peter Swoboda 실험실에 있는
COPAS biosort를 이용했다. 찾고자 는 돌연변이 타입 DsRED
신 는 그 지 고 GFP 녹색 신 (klp-6 특이
지 신 )가 사라진 돌연변이체 다.
이 후 SNP(Short Nucleotide Polymorphism) mapping 이용
해 염색체 상 돌연변이가 일어난 부분 좁 본 후 (Figure
2A,B) Next-generation whole genome sequencing 이용해
좁힌 범 속 돌연변이 후보군들 골라내어 klp-6 자 를
해 는 모 생 조 에 자를 분 해낼 있었다(Table
1).
2. 핵심 모 생 조 인자 DAF-19/RFX
계 실험 행 결과 2개 GFP가 사라진 돌연변이체 라인
보 있었고 이 2개 돌연변이체는 DAF-19/RFX 사 조
인자에 돌연변이가 생했다는 걸 알아낼 있었다(Figure 3A).
18
존에 존재 지 않았 새 운 daf-19 돌연변이 각각 돌연변이
체를 daf-19(of3), daf-19(of4) 명명했다.
daf-19(of3) 돌연변이는 11번째 exon에 Glutamine(CAA) 염
열이 stop codon(TAA) 뀌어 nonsense mutation이 일어
났고 daf-19(of4) 돌연변이는 8번째 exon에 Glutamate(GAA)가
Lysine(AAA) 뀐 missense mutation이 일어났다. 돌연변이
모 존에 알 진 daf-19 돌연변이체 인 daf-c(dauer
formation constitutive), dye-filling defect 찰 있었다. 각각
돌연변이 daf-19 자가 포함 fosmid를 통해
rescue 었다(Figure 3B). 여 klp-6 이 아닌 IL2 감각 뉴런이
사라진 것 아닐지 살펴보 해 daf-19(rh1024) 돌연변이체에
다른 IL2 특이 인 자인 F28A12.3 모 에 녹색 단 질
cloning해 시 보니 IL2가 손상 지 않 채 그 있다는
걸 인 있었다(Figure 3C). 라 daf-19 IL2 생 조
는게 아닌 단일 뉴런 모 생 사 에 특이 조
는 것 인 있었다.
IL2 같 모 생 이 인 감각 신경 뉴런에 는 DAF-19
사 조 인자가 모를 구 는 IFT 구조 이거니
이러 IFT 구조 모 생 과 운 거나 게끔 도
주는 많 종 운동 단 질 지 여 만큼 핵심 모 생
조 인자 알 있다(Swoboda et al., 2000).
19
RFX 사 인자는 단 질 특 날개 모양 나 구조가 진
잘 보존 어 있는 사 조 인자다. 구조뿐만 아니라 그 조 커
니즘 역시 잘 보존 어 있는데 RFX에 해 사 조 는
자 모 속에는 X-box라는 열이 특이 존재 다.
사 인자 날개 모양 DNA 결합 부 가 X-box에 결합해 사를 조
다는 사실 익히 행 연구를 통해 있다(Swoboda et al.,
2000).
결 COPAS biosort라는 고도 달 screening 시스
이용해 klp-6 자 조 는 DAF-19 존재를 다시 번
인 있었다.
3. 새 운 태 klp-6 모 속 X-box
C. elegans에 진 보존 어 있는 X-box는
GTHNYYATRRNAAC 같 태를 이루고 있다고 알 있다
(Efimenko et al., 2005). 나 motif 속 2개 X-box ATG 개
시 돈에 리 떨어 있는 X-box를 X1, 가 게 해 있
는 X-box를 X2라고 각각 이름 붙일 있도 약속이 어 있는
데 이 개 열이 지는 않지만 역 상 동일 태를
띠는, 즉 palindromic 태를 띤다고 알 있다(Swoboda et al.,
2000). 앞 이야 했듯 DAF-19 조 는 자
모 속에는 X-box가 있어야만 다. 지만 IL2 감각 신경 포에
20
특이 는 자인 klp-6 모 속에는 DAF-19
조 는 자 속 모 상에 히 있어야 X-box
가 보존 어 있지 않았다. 모 에 핵심 인 역 함에도
불구 고 klp-6 모 속에는 X-box가 존에 알 진 태 는
달리 몇몇 사 X-box 후보들이 이 아닌 나씩 존재 는 모습만
열 조를 통해 인 있었다(Figure 4). 후보들 4번째 지역
이 컴퓨 분 통해((Farré et al., 2002; Messeguer et al.,2003)
RFX 결합 부 추 어 부분 돌연변이 도 실험 통해 거해
보았 나 pklp-6::gfp 이 사라지지 않았다(Figure 5). 라 조
본 인 법 에 부분에 근 고자 klp-6
모 분 행했다. 편향 결과를 고자 X-box 에
계 없이 klp-6 모 를 임 나 뒤 GFP를 달아 개체에 주
입해 찰했다. 특이 게도 이 는 명 히 알 없지만 ATG
근처에 TATA box 같이 사 조 에 요 열 없이 가운
데 부 만 도 pklp-6::gfp가 다는 걸 알 있었다. 이 상
이용해 왼쪽 끝 -1048 고 시 에 요 열 른
쪽 끝 알아낼 있었다(Figure 6). 그리고 른쪽 끝 ATG
고 차 왼쪽 여나가는 법 통해 왼쪽 끝 알아냈다
(Figure 7). 그 결과 ATG 부 -614에 -590 사이 지역이
에 요 라는 걸 알아낼 있었다(Figure 8).
이에 해 독립 klp-6 모 속에 진 보존 어
21
있는 모티 를 인해보고자 생 보 그램 이
용해 데이 베이스에 장 어 있는 Caenorhabditis 속에 속해 있는
종들 모 열들 해 보았다(Bailey et al.,2009). C.
elegans klp-6 모 열과 불어 C. briggsae, C. brenneri, C.
japonica, C. remanei, P. pacificus에 보존 klp-6 자 모
열 MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)이란 그램
이용해 분 했다. 실험 결과 C. brenneri, C. japonica에 공통 보
존 어 있는 나 모티 를 견 있었다. 이 모티 는 25개
열 구 어 있었는데 이는 놀랍게도 모 분 법 얻
모티 에 그 포함 열이라는 걸 인 있었다(Figure 9).
얻 결과를 이용해 FIMO(Find Individual Motif Occurence) 분
법 상 분 시도했다. FIMO 분 MEME를 통해 도출
klp-6 모 새 운 모티 를 이용해 C. elegans upstream
sequence database를 스크리닝해 promoter 속에 보존 어 있는
motif를 지닌 자를 찾아 내는 법이다(Grant et al.,2011). 본 연
구에 는 이 법 통해 klp-6 모 에 보존 어 있 새 운 모
티 를 함께 지닌 120여개 자를 얻 있었다(Table 2). 이름
이 붙여지지 않 자들이 많았지만 C37H5.11(cwp-2),
C37H5.4(cwp-3) 경우 klp-6 같이 컷 특이 인 모 뉴런
에 해 LOV-1, PKD-2 함께 해 polycystin 구 는
자도 있었다. 이처럼 모 뉴런에 거나 지 않 라
22
도 작용 부 가 모 뉴런인 자들이라면 klp-6에 낸 모티
를 지니고 있는 새 운 들이 있 것이다.
4. 진 잘 보존 어 있는 새 운 모티
모 분 법 이용해 새롭게 알아낸 열 속에 개 X-
box 후보 열이 포함 어 있 는 나 모티 사이 간격이 존
에 알 진 2-3 염 열과는 달리 6개 도 떨어 있었고 X1, X2가
나씩 구 어 있는게 아니라 X2 추 는 X-box 태만이 2개
가 존재했다. 25개 구 이 열 C. elegans DAF-19
결합 태 행 연구에 는 보고 없는 새 운 견이었
다(Figure 10). 불어 생 보 그램 분 통
해 진 이 부 가 요 다는 사실 번 검증해낼 있었
다. 노란 색 시 X-box 사 열 외에도 앞 쪽 6개 열
(GTCGCT)가 3개 종에 그 보존 어 있는 것 보아
낸 모티 에 이 6개 열이 에 상당히 요 도 있다는 가능
시 다(Figure 9).
5. 새 운 모티 를 이용 DAF-19 작용 탐색
C. elegans가 아닌 인간이나 포 에 RFX 사 조 인자
행 연구 사 를 살펴보면 인간에 포 특이 복합체를 이루는
RFX 사 조 인자 조 인자 조합이 다양 다는 것이 알
23
있다. 사 조 에 해 도 X-box 이 외에 S, Y box 같
이 보존 모티 들이 존재해 각각 결합 는 단 질들이 나 잘 알
있다. 이들 생 에 조 양상 후
모 생 과 에 과 지에 아주 커다란 향 미 다(Reith et
al., 2001). 본 연구에 도 X-box에만 DAF-19 사 조 인자가 결
합 고 그 외 나 지 부분에는 조 인자들이 붙어 복합체를 구
해 사를 조 것이라는 아이 어를 도출 있었다. 라 생
보 데이 베이스를 간추 진 열 분 시도했다.
모 분 통해 낸 자 에 요 특 열 속에 어
떤 사 조 인자가 결합 지 컴퓨 그램 통해 조사해 보았다
(Farré et al., 2002; Messeguer et al.,2003). 인용 컴퓨 그램
C. elegans 특이 인 사 조 인자만 다루는 그램이 아니고
인간에 부 yeast에 이르 지 범 사 인자를 포함
그램이다. 라 단 후보군 도출해낸 후 C. elegans 상동
자를 일일이 찾아냈다. 이 게 얻 많 후보 사 조 인자를
RNAi screening 거나 돌연변이체에 직 pklp-6::gfp를 해
보았다. RNAi screening 해 eri-1(mg366);lin-15B(n744) 돌연
변이체에 pklp-6::gfp를 시 다. 실 해 daf-19
체 cDNA를 해시키는 RNAi를 여본 결과 그 효 이 30% 이상
는 걸 인 있었다(Figure 11). C. elegans RNAi 실험 경우 보
통 feeding RNAi 법 많이 사용 다. 지만 뉴런에는 취
24
dsRNA가 장 통해 달 지 않 에 직 RNAi가 처리 도
해 는 eri-1(mg366);lin-15B(n744) 돌연변이체를 이용해야
다. 그 결과 pes-1이라는 forkhead transcription factor를 해독 는
자 처리 결과 다 는 아니었지만 몇몇 개체에 cell body 개
가 어든 걸 인 있었다(Figure 12A; Table 3). 불어
DAF-19에 직 결합 다고 알 진 egl-5(n486), daf-3(e1376),
RNAi library에 없었 fkh-7(ok793), fkh-10(ok733)는 돌연변이체
에 직 pklp-6::gfp를 미 주입했 나 미 결과는 없었다(Table
4). pes-1에 결과를 짓고자 pes-1(leDF1: forkhead 역
1900bp 도가 거 돌연변이체)에 역시 pklp-6::gfp를 미 주입해
본 결과 일부 cell body가 어든 개체가 몇몇 보이 했 나 모든 개
체가 그런 양상 보인 것이 아니라 추후 인이 요 다(Figure
12B; Table 4). 독립 DAF-19에 리 결합 는 단 질
조사해 보 해 yeast two hybrid 실험 진행해보았다. 실험 결과
RPL-3, RPL-20과 같 리보좀 단 질과 COL-143, COL-180
라겐, DPY-5, ALP-1(T11B7.4e) 포골격 단 질과 같 사조
과는 단 질이 나 다(Table 5). RNAi 실험 결과를 통해 얻
PES-1과 DAF-19 사이 일 일 yeast two hybrid assay를 해
본 결과 놀랍게도 미 결과가 도출 었다(Figure 13). 사 인
자 사이 리 인 결합이 입증 었 므 PES-1과 DAF-19이 함께
복합체를 구 해 사 조 가능 시 있었다.
25
IV. 고찰
모 생 조 는 DAF-19/RFX 사 조 인자는 모를 지니
고 있는 미생 에 인간에 이르 지 구조 능이 진 잘
보존 핵심 모 생 조 인자이다. 리에 도 운동 모
도 는 사 조 에 연구가 상당 부분 진행 어 있는
상황이고 사람이나 척추동 에 도 MHC class II 같 면역
자들이 RFX 사 조 인자를 통해 사가 조 다는 사실이
있다. 각 면역 자들 조 후 생
과 에 모 과 지에 아주 커다란 향 미 다. Ciliopathy
라고 일컫는 모 질병 모 과 능에 가 생 는
것이다. 질병 는 Nephronophthisis(NPSP), Senior-Loken
syndrome(SLS), Joubert syndrome(JBTS), Bardet-Biedl
syndrome(BBS), Meckel-Gruber syndrome(MKS) 그리고
Orofacialdigital syndrome(OFD)등이 있다(Hildebrandt et al.,2011).
같이 모에 결함이 생 질병 지닌 자 경우 신장과 간에
가 생 고 만이 동 며 심 경우 신 인 지 생
있다. 이뿐만 아니라 다지증과 손가락 이가 상 인 질병이
생 고 안구 속에 아들이는 감각 용체에 가 생
시 실명에 이르 지 다.
재 지 DAF-19/RFX 사 조 인자는 자 모
26
속에 존재 는 X-box 열에 이합체 태 결합 다고 알 있었
는데 C. elegans 모 생에 자 모 속에
X-box가 없는데도 DAF-19 조 는다고 알 진 몇 가지
자가 알 있다. 이들 IFT 복합체 A를 구 는 구조 합
는 자인 daf-10 그리고 klp-6 같이 구조 운 는 운
동 단 질들 해독 는 osm-3, klp-11, klp-20, kap-1이다(Peden
et al., 2005). 지만 자 사 조 에 해 는 알 있지
않다. 이 같 상 각 다른 단일 뉴런에 모 생 조
이 사 에 다양 단 질 조합 통해 조 다는 가 가
능 고 모 생, 지 그리고 능이라는 면에 각 구분
이 존재 가능 시 다. 일 DAF-19에 직 결
합 는 건 아니지만 FKH-2 사 조 인자 역시 DAF-19 사 조
아 AWB 단일 감각 뉴런 모 생 조 다. 이 과 에
FKH-2는 kinesin II 단 체인 KAP-1 도해 AWB 특
모습인 branching pattern 게끔 다고 알 있다
(Mukhopadhyay et al., 2007).
이에 인해 본 연구에 도 DAF-19 함께 klp-6 조
다른 핵심 사 인자가 리 인 통해 작
용 지 않 는 아이 어를 해결해보고자 yeast two hybrid
screening 생 보 컴퓨 분 시도해보았 나 미
결과를 얻진 못했다(Table 2,3,4).
27
편 C. elegans DAF-19 다른 종 RFX 사 조 인자들과
는 달리 나 단 질만 보존 어 있다고 알 있다. 지만 DAF-
19 여러 가지 isoform들 지니고 있고 각 isoform들 특이 게도
각 다른 역 다고 알 있다. 각 isoform들 사 과 에
각 다른 태 RNA processing 과 거쳐 는데 DAF-
19 a/b isoform(DAF-19A/B) 모 뉴런에 작용 다. DAF-
19 c isoform DAF-19M(Male-specific)이라 일컬어지는데 이는
컷 특이 인 행동인 짝짓 polycystin과 같 모 속 막단
질 합 는 역 담당 다. 이 isoform EGL-46라고 는
사조 인자에 해 어 LOV-1, PKD-2 같 컷 특이 인
리자극 감각 용체를 는 것 알 있다(Wang et
al.,2010;Yu et al.,2003). DAF-19 d isoform DAF-19C (Cilia-
specific)이라고 불 진다. 모 뉴런에 주 해 모 생
핵심 자들 조 다. DAF-19이 결합 는 것이라고
알 진 X-box는 사실 다 모 생에 자 모
속에 존재 다. 이미 다른 종에 는 다른 RFX들끼리
heterodimer를 이룸 써 자 조 다는 사실이
잘 있는 상황에 C. elegans에 있는 DAF-19 각 다른
isoform들끼리 heterodimer를 이 자 사를 조 다는
가능 역시 존재 있다. 그리고 heterodimer를 이루는 isoform
조합에 라 결합 는 모 모티 모습이 달라진다면 본 연구
28
에 낸 새 운 모티 가 그 증거가 있 것이다.
Caenorhabditis 속에 진 잘 보존 어 있는 klp-6 모
속 새 운 모티 에 DAF-19이 결합해 사를 조 게 다면
실 는 X-box가 모 속에 존재 지 않는다고 알 있
자들 모 속에는 새 운 결합 모티 가 존재 있 것이
다. 미롭게도 klp-6 자는 자웅동체에 는 IL2 감각 뉴런에 만
특이 지만 컷에 는 CEM( 리), RnB, HOB( 리) 같
컷 특이 인 뉴런에 는 양상 찰 있었고 이는
DAF-19M isoform 특이 인 돌연변이가 생 면 이 해 다는
사실이 행 연구를 통해 알 있다(Wang et al.,2010). 새롭게 견
모티 에 인 klp-6 에 실 조 DAF-19
isoform 태에 존 일 있다는 특이 견이 것이다. 모
생에 여 지 않 DAF-19A/B DAF-19M 각각 모
뉴런 속 컷 특이 인 뉴런 속 자 알 지지 않 ,
다른 태 모티 에 결합해 그 달리 있 것이라 추 해
본다. 그 게 다면 본 연구 결과 얻 klp-6 자 속 모
25개 열에 단 히 DAF-19C 개가 결합 는 것이 아니라
DAF-19C DAF-19M이 heterodimer를 이 사를 조 도
있다. 불어 컴퓨 그램 이용 열분 통해 얻 사조
인자 후보군들 pes-1 forkhead 사조 인자 RNAi 실험 통해
pklp-6::gfp 이 감소 는 걸 인 있었고 yeast two hybrid
29
일 일 실험 결과 DAF-19과 리 결합 는 것 나
다. 돌연변이체에 pklp-6::gfp를 미 주입 결과가 드라마틱 지
않아 추후 인이 요 지만 DAF-19 사 조 인자 이합체
에 있어 추 낸 25개 열 속에 PES-1이 DAF-19과 직 결합
해 사 조 에 참여 가능 견 있었다. 인간에 포 특
이 복합체를 이루는 RFX 사 조 인자 조 인자
조합이 다양 다는 것이 알 있 나 모 생 연구는 인간에
도 여 히 재진행 이고 아직 지 벽히 풀리지 않 들이 산
해 있다. 본 연구를 통해 찾아낸 모티 에 익히 알 진 DAF-19과
새롭게 찾아낸 PES-1 사 조 인자가 결합해 사 조 복합체를
구 다는 가 이 입증 면 새 운 RFX 사 조 인자 작용
시 있 것이다. C. elegans에 도 DAF-19 사 조 인자
를 통해 감염 균에 면역 이 조 다는 결과가 이미
있다(Xie et al., 2013). RFX 사 조 인자가 모 생뿐만
아니라 면역에 능 인 면 도 상당히 진 연 계 속
에 잘 보존 어 있다는 사실이 지고 있는 시 에 사 조
에 부 인 립 는 연구는 욱 요해질 것이다.
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
Table 1. Next generation whole genome sequencing
result. Mutated genes were in verified SNP region.
Chromosome Genomic
position
Mutation
type
Mutation
classes Descriptions Sequence
II 7586647 point missense CCC->TCC[Pro->Ser] F35D2.5
(syd-1)
II 8120659 point missense GGA->GAA[Gly->Glu] C41C4.5a.1
II 9234923 point missense TCC->TTC[Ser->Phe] T26C5.2
II 9476116 point missense GGA->GAA[Gly->Glu] T19H5.2
II 9672139 point Missense GGC->GAC[Gly->Asp] ZK1320.7
II 9766774 point premature_
Stop TGG->TGA[Trp->stop]
ZK1321.2
(skh-1)
II 9835204 point Missense GTC->ATC[Val->Ile] ZK938.4
II 10158735 point premature_
Stop CAA->TAA[Gln->stop]
F33H1.1
(daf-19)
II 10866312 point missense CCC->CTC[Pro->Leu] M106.4
II 11270981 point missense GCT->ACT[Ala->Thr] C47G2.1
II 11698016 point missense AGA->AAA[Arg->Lys] C47D12.8
44
Table 2. Result of FIMO analysis.
Seq Name Direction Start End p value Matched sequence
R144.1 + 387 411 2.99E-15 GTCGCTTGGAGACCTACATGGCAAC
Y41D4A.7 + 10 34 5.93E-10 GGTGCCTGGGTACCTACGTGCCTAC
Y48C3A.5b − 517 541 1.26E-09 CAGGCCTGGCTACCTACGTGCCTAC
Y48C3A.5a − 517 541 1.26E-09 CAGGCCTGGCTACCTACGTGCCTAC
B0041.1 − 335 359 1.27E-09 GTCAACTGGCTGCCTACATGCCTAC
ZK1005.1 + 423 447 2.84E-09 TACGCCTACCTACCTACGTGCCTAC
F25H2.3 + 733 757 3.11E-09 GTCTCATGGTTTCCTACATGCTTAC
C28A5.5 − 604 628 1.08E-08 GTCACCTAGCGACCCCAATGGCTCC
Y53C10A.5 − 1119 1143 1.58E-08 TATGCCTGACGACCTACATGCCTAG
C33C12.1 − 593 617 1.61E-08 CTTGCCTGGTTACCTACTTACCAAC
ZC482.1 − 1129 1153 1.77E-08 GCCGCCTACCTACCTACAAGACTAC
F33A8.10 − 598 622 1.80E-08 TACGCCTATCCACCTACGTGCCTAC
C18G1.6 − 144 168 2.01E-08 GTCGCAAAGCGACCTAGGTCGCTAG
F48F5.1 − 296 320 2.10E-08 TCTGCCTGATTACCTACATGGCTAC
F27C1.13 + 8 32 2.20E-08 TGTGCCTGCCTACCTACATGCCTAC
C01A2.2 − 1160 1184 2.77E-08 GGCGCCTACCTACCTACCTACCTAC
T22H9.3 − 640 664 4.56E-08 CATGCCTACATACCTACATGCCAAC
R08C7.7 − 274 298 4.85E-08 CACGCCTACATGCCTACATGCCTAC
R08C7.5 + 265 289 4.85E-08 CACGCCTACATGCCTACATGCCTAC
C18H7.6 − 553 577 5.11E-08 GGAGCCTACATGCCTACATGCCTAC
C18H7.4 + 394 418 5.11E-08 GGAGCCTACATGCCTACATGCCTAC
ZC513.9 + 423 447 5.33E-08 ACCGATTGCCTACCTCCGTGCCTAC
D2062.5 + 933 957 6.30E-08 CTTGCCTACATGCCTACATGCCTAC
F54F11.2 + 551 575 6.30E-08 CATGCCTACATACCTACATGCCTAC
R09E12.9 + 40 64 6.33E-08 TTTGCCTACATGCCTACATGCCTAC
F43H9.2b + 536 560 6.70E-08 TCCGCTTACCTGCCTACGTGCCTAC
45
Y39A1A.10 + 656 680 7.43E-08 GACATCTGGCGTCCTTCATGGTAAC
W06A11.1 + 579 603 8.75E-08 TTTGCTTACCTGCCTACGTGCCTAC
ZK616.5 − 768 792 8.85E-08 GTTGCCTGGCGACCTCACTGACTGG
C18G1.6 + 590 614 1.15E-07 GTCGCAATGCGACCTAGGTCGCTAG
F34D6.2 − 111 135 1.19E-07 CGTGCCTAAATACCTACGTGCTTAC
F31D5.3d − 642 666 1.39E-07 GTGGCCTGCCTGCCTACTTGCCTGC
F31D5.3a − 642 666 1.39E-07 GTGGCCTGCCTGCCTACTTGCCTGC
F31D5.3b − 642 666 1.39E-07 GTGGCCTGCCTGCCTACTTGCCTGC
F31D5.3c − 642 666 1.39E-07 GTGGCCTGCCTGCCTACTTGCCTGC
F18A1.7.1 + 502 526 1.59E-07 TTCGCTTCGAGACCTCCATCAAAAC
F18A1.5 − 312 336 1.59E-07 TTCGCTTCGAGACCTCCATCAAAAC
C18G1.6 − 610 634 1.60E-07 GTCGCTTTGCGACCTGCGACCTAGC
B0336.1 − 158 182 1.67E-07 GTGGCCTAGAAACCTCCGCGCCGCG
ZK617.t1 + 438 462 1.68E-07 TTTGCCTGCCCACCTACATGCCTTG
C37H5.11 + 58 82 1.72E-07 GTAGCATGGTTACGTACTTGGATAC
C37H5.4 − 187 211 1.72E-07 GTAGCATGGTTACGTACTTGGATAC
T16H5.1a − 677 701 1.82E-07 TAGGCCTGCCTACCTACCTGCCTAC
C18G1.6 − 652 676 1.91E-07 GTCGACCTGCGACCTAGAGGGTTAG
Y48C3A.5b − 630 654 2.02E-07 GAGGCCTACCAACCTACATGCCTGC
Y48C3A.5a − 630 654 2.02E-07 GAGGCCTACCAACCTACATGCCTGC
C15C6.t1 + 962 986 2.04E-07 TTCGCTACTTGACCTCCCTGCCAAG
T09B4.5b + 1147 1171 2.17E-07 GTGGTCTGGAGACCTTCATGATTGG
Y47D3B.11 + 787 811 2.29E-07 CATGCCTGCCTGCCTACATGCCTAC
C54C6.5 − 313 337 2.34E-07 CTTGTCTGCCTACCTACCTGCCTAC
Y43F8C.18 + 29 53 2.35E-07 TTTGTCTGCCTACCTACCTGCCTAC
R09E10.2 − 106 130 2.38E-07 CACGCCTGCCTGCCTATGTGCCTAC
Y105C5B.9 + 644 668 2.38E-07 CGTGCCTGCCTACCTACGTGCCTGC
T06A4.2 + 457 481 2.44E-07 CTATCCTGCCTACCTACCTGCCTAC
C36B1.13 + 411 435 2.44E-07 CATGCCTACCTACCTACATGCCCAC
C36B1.6 − 279 303 2.44E-07 CATGCCTACCTACCTACATGCCCAC
R08C7.7 − 282 306 2.56E-07 GGTGCCTACACGCCTACATGCCTAC
46
R08C7.5 + 257 281 2.56E-07 GGTGCCTACACGCCTACATGCCTAC
F57G8.6 + 40 64 2.58E-07 CTTGCCTGCCTACTTGCGTGCCAAG
F57G8.t2 + 218 242 2.58E-07 CTTGCCTGCCTACTTGCGTGCCAAG
Y65B4A.9 − 138 162 2.70E-07 GGCGCCTATCTTACTACTTGCCTAC
R13A5.11 + 650 674 2.70E-07 ACCGCGTGTCTACCTATGTGCCTAC
F26F12.5a + 393 417 2.72E-07 TTAGTCATGCTACCTACGTGCCTAC
K12H6.1 + 42 66 2.83E-07 CGTGCCTAGGTGCCTACGTGCCTAC
F42G4.3b.2 − 14 38 2.83E-07 GGCGCCTGCCTAGGTACCTGCCTAG
K07A1.5 + 845 869 2.84E-07 CAATCATGGCTACCTACGTGCCTAC
K02E7.4 + 567 591 2.94E-07 GTCTCTTAGCGACCTACAAATCTAT
F14H12.3 − 380 404 2.95E-07 GTCGCTACGTGAACTCCGCGGTAGG
R03H10.7 + 906 930 3.08E-07 ATTGCATAGTTTCCTCCATGGCAAA
C45H4.15 − 111 135 3.24E-07 CATGCCTGCATGCCTACATGCCTAC
F59H6.8 − 796 820 3.31E-07 TTCGCATGGTTAACAACGTGCTGAC
F44D12.3 − 287 311 3.32E-07 TTCTCCTACTTGCCTACATGTCAAC
F44D12.8 + 348 372 3.32E-07 TTCTCCTACTTGCCTACATGTCAAC
W05F2.7 + 1167 1191 3.38E-07 GTTACCTGCCTGCCTATGTGCCTAC
K07D8.1.1 + 1173 1197 3.48E-07 GGCTCTTGCCTGCCTACGCGCCTAC
K07D8.1.2 + 1173 1197 3.48E-07 GGCTCTTGCCTGCCTACGCGCCTAC
ZK1037.10 − 702 726 3.51E-07 GAATCCTGTTTGCCTACGTGCCTAC
Y69A2AR.19 + 599 623 3.56E-07 GCCTCATGCTTACCTATGTGCCTAC
F49E11.7 − 930 954 3.58E-07 GTCTCATGTTTCTCTACGTGGCTAG
F33E11.2 + 872 896 3.58E-07 CACGCCTACCTATCTACTTGCCTAC
F29A7.1 − 136 160 3.76E-07 CTTGCCTACGTGCCTACGTGCCTAC
B0212.6 + 122 146 3.76E-07 GGTGCCTACATGCCTTCATGCCTAC
C09B9.7 − 757 781 3.76E-07 CTTGCCTACGTGCCTACGTGCCTAC
F19B6.3 + 412 436 3.79E-07 TTTGCCTACGTGCCTACGTGCCTAC
T07G12.3 − 1102 1126 3.87E-07 GTTGTTGAAAGACCTCCATGACAAC
F38A5.6 − 560 584 3.92E-07 GCCTCATGCCTGCCTACGTGCTTAC
F38A5.10 + 304 328 3.92E-07 GCCTCATGCCTGCCTACGTGCTTAC
M03A1.3 − 638 662 3.93E-07 GATGCCTAGTTGCCTACCTGCTAGC
47
BE10.5 − 577 601 3.94E-07 AACGCCTACTTACCTACTGGCCTAC
BE10.5 − 670 694 3.94E-07 AACGCCTACTTACCTACTGGCCTAC
BE10.3 + 19 43 3.94E-07 AACGCCTACTTACCTACTGGCCTAC
BE10.3 + 112 136 3.94E-07 AACGCCTACTTACCTACTGGCCTAC
F25H2.3 + 476 500 4.02E-07 GTCTAATGCCTACCTACGTACCTAC
C05G6.t1 + 337 361 4.07E-07 TTTGCCTACTTACCTGCCTGCCTAC
C05D11.11a.2 + 393 417 4.10E-07 GTTGCTTTGATAACAACTTGGTAAC
C05D11.11a.1 + 393 417 4.10E-07 GTTGCTTTGATAACAACTTGGTAAC
C05D11.11a.3 + 393 417 4.10E-07 GTTGCTTTGATAACAACTTGGTAAC
Y105E8A.10a − 372 396 4.15E-07 TAGGCTTGCCTACCTGCGTGCCTAC
T05B4.8 − 79 103 4.31E-07 GTCGCTTAGAAATGTACATGGAATG
D2062.5 + 640 664 4.49E-07 CTGCCCTGCCTATCTACGTGCCTAC
Y65B4BL.6 − 498 522 4.59E-07 TTCGCATGGTTAAGTACGTGCTGAC
F35F11.3 + 265 289 4.59E-07 TTCGCATGGTTAAGTACGTGCTGAC
F35E8.1 + 557 581 4.62E-07 GATGCTTGGTGCCTTACATGCTAGG
F35E8.2 − 347 371 4.62E-07 GATGCTTGGTGCCTTACATGCTAGG
C49D10.2 − 458 482 4.73E-07 CTTGCCTACCTATCTACCTGCCTAC
R09E12.1 − 123 147 4.74E-07 CATGCCTACATACCTACATGTCTAC
ZK770.1 − 829 853 4.78E-07 TTGGCTCGCCTGCCTACGTGCCTAC
F52G2.2a + 552 576 4.78E-07 CACGCCTGCTTGCATACGTGGTTAC
C45H4.15 − 135 159 4.81E-07 CATGCCTAGATGCCTACATGCCTGC
C09B9.4 + 745 769 4.92E-07 TTTGCCTACTTGCCTACTTGCCTAC
F54C1.8 + 508 532 5.02E-07 ATTCCTTGGCTGCCTACGTGCCTGC
F54C1.9 − 290 314 5.02E-07 ATTCCTTGGCTGCCTACGTGCCTGC
T07D3.6 − 124 148 5.02E-07 TTGGCTTGCCTGCCTACGTGCCTGC
Y39B6A.18 − 545 569 5.09E-07 GTGCCTGCCCTACCTACATGCCTAC
Y65B4A.9 − 393 417 5.11E-07 CTCGCCTACATGCATACCTGCCTAC
C16C8.18 + 377 401 5.14E-07 CTCACCTACCTACCTACCTACCTAC
C16C8.18 + 542 566 5.14E-07 GGTACCTACTTACCTACTTGCCTAC
H39E23.1a + 131 155 5.14E-07 TATGCCTACCTACCTACGTGCCTAT
48
F54F11.2 + 463 487 5.22E-07 TTAGCCTACATGCCTACATGACTAC
Y65B4A.2 + 282 306 5.31E-07 TTCGCTTGGTTACGCACGTGCTGCC
Y39A3CR.8 − 229 253 5.47E-07 GTTACCTACGTACCTACGTACCTAC
R11G10.2 + 39 63 5.47E-07 GTTGCCTAAATGCCTACAAGGTAAA
49
Table 3. RNAi screening of candidate genes output from
computational analysis. Expressed pklp-6::gfp in eri-
1(mg366);lin-15B(n744). Compared to daf-19 RNAi
result, there was no significant change of GFP level.
Homolog in human RNAi list GFP
RFX transcription factor (control) daf-19 x
cAMP-responsive element modulator isoform u (CREB) crh-1 o
Forkhead box protein B1 pes-1 △
Msx-1 vab-15 o
c-Myc mml-1 o
Beta of Max-like protein X mxl-2 o
TAF-1 taf-1 o
MATalpha2 mat-1 o
POU2F1 unc-86 o
Zic1 ref-2 o
HOXA3 ceh-13 o
DSXF mab-3 o
USF-1 mxl-3 o
Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2 aha-1 o
Isoform 1 of Protein max mxl-1 o
p300, C/EBPa cbp-1 o
50
C-Fos (Heteromeric component of AP1) fos-1 o
C-jun (Heteromeric component of AP1) jun-1 o
POU transcription factor ceh-6 o
Pax-6 transcription factor vab-3 o
Nrf transcription factor skn-1 o
Zinc finger plus homeodomain zag-1 o
forkhead transcription factor unc-130 o
forkhead transcription factor fkh-3 o
forkhead transcription factor fkh-4 o
forkhead transcription factor fkh-2 o
Alpha-actinin associated LIM protein Enigma family of
proteins alp-1 o
RACK1(mammalian Receptor of Activated C Kinase) rack-1 o
OTX-like homeodomain ceh-37 o
Puromycin-sensitive AMinopeptidase pam-1 o
CREB atf-7 o
NFY a subunit nfya-1 o
NFY b subunit nfyb-1 o
51
Table 4. Expressing pklp-6::gfp in mutant candidates.
Homolog Mutant list GFP
Forkhead box protein B1 pes-1(leDf1) o
Forkhead box protein B1 fkh-10(ok733) o
Forkhead transcription factor fkh-7(gk793) o
Forkhead transcription factor fkh-2(ok683) o
Homeodomain transcription factor egl-5(n486) o
SMAD protein daf-3(e1376) o
52
Table 5. Yeast two hybrid analysis results. There were
no significant transcription factor.
Protein list Description
ALP-1 Alpha-actininassociated LIM protein
RACK-1 Activated C Kinase homolog
COL-80 Collagen
COL-143 Collagen
COL-180 Collagen
RPL-3 Ribosomal protein
RPL-20 Ribosomal Protein
DPY-5 Cytoskeletal protein
53
참고 헌
Bailey TL, Bodén M, Buske FA, Frith M, Grant CE, Clementi L, Ren
J, Li WW, Noble WS. (2009) "MEME SUITE: tools for motif
discovery and searching", Nucleic Acids Research, 37:W202-
W208
Burghoorn J, Piasecki BP, Crona F, Phirke P, Jeppsson KE, Swoboda
P. (2012) The in vivo dissection of direct RFX-target gene
promoters in C. elegans reveals a novel cis-regulatory element,
the C-box. Dev Biol. 15;368(2), 415-426
Efimenko E, Bubb K, Mak HY, Holzman T, Leroux MR, Ruvkun G,
Thomas JH and Swoboda P. (2005) Analysis of xbx genes in C.
elegans. Development. 132;1923-1934
Farré D, Roset R, Huerta M, Adsuara JE, Roselló L, Albà MM,
Messeguer X. (2003) Identification of patterns in biological
sequences at the ALGGEN server: PROMO and MALGEN. Nucleic
Acids Res, 31, 13, 3651-3653.
Grant CE, Bailey TL and Noble WS. (2011) FIMO: Scanning for
occurrences of a given motif", Bioinformatics, 27(7):1017-1018.
54
Hildebrandt F, Benzing T, Katsanis N. (2011) Ciliopathies. N Engl J
Med. 21;364(16), 1533-1543
Huang C, Lamitina T, Agre P, Strange K. (2007) Functional analysis
of the aquaporin gene family in C. elegans. Am J Physiol Cell
Physiol. 292:1867-1873
Iwama A, Pan J, Zhang P, Reith W, Mach B, Tenen DG, Sun Z.
(1999) Dimeric RFX proteins contribute to the activity and lineage
specificity of the interleukin-5 receptor alpha promoter through
activation and repression domains. Mol Cell Biol. 19(6), 3940-
3950
Lee H, Choi MK, Lee D, Kim HS, Hwang H, Kim H, Park S, Paik YK,
Lee J. (2011) Nictation, a dispersal behavior of the nematode
Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nat. neurosci.
15(1):107-12
Messeguer X, Escudero R, Farré D, Nuñez O, Martínez J, Albà MM.
(2002) PROMO: detection of known transcription regulatory
elements using species-tailored searches. Bioinformatics, 18, 2,
333-334
Morotomi-Yano K, Yano K, Saito H, Sun Z, Iwama A, Miki Y.
(2002) Human regulatory factor X 4 (RFX4) is a testis-specific
55
dimeric DNA-binding protein that cooperates with other human
RFX members. J Biol Chem. 277(1), 836-842.
Peden EM, Barr MM. (2005) The KLP-6 kinesin is required for
male mating behaviors and polycystin localization in Caenorhabditis
elegans. Curr Biol. 8;15(5), 394-404
Reith W, Mach B. (2001) The bare lymphocyte syndrome and the
regulation of MHC expression. Annu Rev Immunol. 19, 331-373
Mukhopadhyay S, Lu Y, Qin H, Lanjuin A, Shaham S, Sengupta P.
(2007) Distinct IFT mechanisms contribute to the generation of
ciliary structural diversity in C. elegans. EMBO J. 26(12), 2966–
2980.
Schroeder NE, Androwski RJ, Rashid A, Lee H, Lee J, Barr MM.
(2013) Dauer-specific dendrite arborization in C. elegans is
regulated by KPC-1/Furin. Curr Biol. 19;23(16), 1527-1535
Swoboda P, Adler HT, Thomas JH. (2000) The RFX-type
transcription factor DAF-19 regulates sensory neuron cilium
formation in C. elegans. Mol Cell. 3, 411-421.
Wang J, Schwartz HT, Barr MM. (2010) Functional specialization of
sensory cilia by an RFX transcription factor isoform. Genetics.
186(4), 1295-1307
56
Xie Y, Moussif M, Choi S, Xu L, Sze J. (2013) RFX Transcription
Factor DAF-19 regulates 5-HT and innate immune response to
pathogenic bacteria in C. elegans. Plos genetics. 9(3): e1003324
Yu H, Pretot RF, Burglin TR, Sternberg PW. (2003) Distinct roles
of transcription factors EGL-46 and DAF-19 in specifying the
functionality of a polycystin-expressing sensory neuron necessary
for C. elegans male vulva location behavior. Development. 130(21),
5217-5227.
57
Abstract
A novel action mechanism of DAF-
19/RFX transcription factor in C. elegans
Dongjun Park
Biological Science
The Graduate School
Seoul National University
When food is limited or the population is overcrowded, C.
elegans enters an alternative stage called the dauer and act
special behavior such as ‘nictation’. The dauer larvae climb up
onto any proejection and while standing by their posterior tip,
wave in three-dimensional spirals and loops.
Acetylcholine secretion from IL2 sensory neurons and Cilia
structure of IL2 neurons are important for nictation behavior.
Cilia is evolutionarily well conserved cellular organelle. C.
58
elegans sense chemicals, signaling molecules from other
individuals or environment via Cilia. The filamentous plasma
membrane-bound microtubule core of the cilium, or the axoneme,
is an extension of the basal body. Typically, the axoneme is
made up of nine radially arranged microtubule doublets with or
without a central pair of single microtubules – the 9+2 or the
9+0 configurations. The Axoneme is built by a dedicated kinesin
and dynein motor-based transport process called intraflagellar
transport(IFT).
In C. elegans, DAF-19/RFX transcription factor is master
regulator of cilia development. DAF-19 is expressed in 60
sensory neuons which have cilia structures. RFX transcription
factor is evoultionariliy well conserved and it is winged helix
transcription factor. Sensory neurons of cilia structure is
positioned at tip of the neurons. It functions like human’s nose
and ear. C. elegans perceive stimulus via cilia structure and
response. Winged heix DNA binding motif is well conserved in
RFX transcription factor. Targer genes of RFX contain specific
sequences called X-box.
klp-6 which is specifically expressed in IL2 neurons encodes
kinesin-3 motor protein that transport cilia structure
59
components of IFT. Despite klp-6 is a core gene of IL2
ciliogenesis, it does not contain x-box in its promoter region. So,
if klp-6 promoter contain new X-box sequence which distinct
from old X-box, this study could suggest new transcriptional
mechanism of RFX in single ciliated sensory neurons. In this
research, klp-6 promoter was analyzed and revealed where is
important for RFX regulation in promoter.
Analyzed sequences are different from wildely known X-box
in C. elegans. In this study suggested that other transcriptional
cofactor will form a huge complex with DAF-19/RFX
transcription factor. To know which transcription factors bind
analyzed sequences, computational analyses and yeast two
hybrid method were used. To find novel action mechanism of
RFX transcription factor in single cilated neuron, we employ
genomic techiniques such as next-generation sequencing and
SNP mapping, High throughput screening, and classical, effective
biological method.
Key word : C. elegans, ciliogenesis, DAF-19/RFX, klp-6, X-box,
transcriptional regulation, novel sequence
번 : 2012-20305