한약재추출물에의한mouse hepatitisvirusa-59의증식억제와...
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이학 석사학 논문
한약재 추출물에 의한 Mouse
HepatitisVirusA-59의 증식억제 와
기작규명
아 주 학 교 학 원
의생명과학과/분자의학 공
어 은
한약재 추출물에 의한 Mouse
HepatitisVirusA-59의 증식억제
와 기작규명
지도교수 김 경 민
이 논문을 이학 석사학 논문으로 제출함.
2011년 8월
아 주 학 교 학 원
의생명과학과/분자의학 공
어 은
어은 의 이학 석사학 논문을 인 함.
심사 원장 김 경 민 인
심사 원 신 호 인
심사 원 박 선 인
아 주 학 교 학 원
2011년 06월 23일
i
- 국 요약 -
한약재 추출 (TCM-33)에 한 Mouse hepatitis virus A-59
증식억 작규명
재 지 연구에 승마 (cimicifuga fhizoma), 고 피 (meliae cortex), 황
(coptidis rhizoma), 황 (phellodendeon cortex), 고삼 (sophorae radix), 가피
(acanthopanacis cortex), 지 (sanguisorbae radix), 사상자 (torilis fructus)가 항 나
이러스 효과가 있다고 보고 었다. 본 연구에 는 TCM-33이 in vitro에 항
나 이러스 효과가 있는지 알아보고자 하 다. TCM-33는 마우스
간염 이러스 (mouse hepatitis virus-A59, MHV-A59) 생산 억 하 며, TCM-
33 농도에 라 MHV-A59 증식이 억 었다. 이 , 이러스 mRNA
단 질 합 이 히 감소하 다. TCM-33 EC50(effective concentration)과
CC50(cytotoxic concentration)는 각각 4.8±1.4μg/ml, 519.7±50.3μg/ml이고, SI (selectirity
index)는 107.6이었다. TCM-33 항 나 이러스 효과 작 알아보
하여 TCM-33이 MHV-A59 증식단계 어느 단계에 효과를 나타내는지
찰하 다. TCM-33이 이러스 진입에는 부분 향 미 것
추 지만, 주요 작 아니라고 생각 었다. 한 TCM-33 이러스
가닥 RNA 합 하게 감소시 나 포 단 질 합 감소하지
않았다. 라 이러스 단 질 합 에는 향이 거 없 것
추 하 다. 즉, TCM-33이 아마도 MHV-A59 증식에 단계에 억 효과를
보이는 것 생각 며, 구조 protein processing 과/ 는 RNA 합 일 것
ii
추 하 다.
핵심어 : 한약재 추출 , mouse hepatitis virus, minus-strand RNA 합
iii
차
국 요약 ················································································································ ⅰ
차 ························································································································ ⅲ
그림차 ················································································································ ⅴ
차 ···················································································································· ⅵ
Ⅰ. ···················································································································· 1
Ⅱ. 재료 법···································································································· 10
A. 포 양과 이러스················································································· 10
B. 한약재 추출 ······························································································ 10
C. plaque assay ···································································································· 10
D. MTT assay ······································································································ 11
E. Intracellular RNA 추출과 Northern blot ························································ 11
F. SDS-PAGE Western blot ············································································ 12
G. RNA 추출과 RT-PCR ··················································································· 12
H. Virion 분리 RNA 추출 ········································································· 13
I. 포 단 질 합 조사 ·············································································· 14
J. Preteinase 억 실험 ·················································································· 15
iv
Ⅲ. 결과 ················································································································· 16
A. TCM-33 추출 에 한 이러스 생산에 미 는 향 ·························· 16
B. TCM-33 추출 에 한 이러스 진입 (entry)에 미 는 향 ··············· 22
C. TCM-33 추출 에 한 가닥 RNA 합 향 ································ 27
D. TCM-33 추출 에 한 포 내 단 질 합 향 ···························· 30
E. non-structural protein processing 에 한 RNA 합 ····································· 33
Ⅳ. 고찰 ················································································································· 35
Ⅴ. 결 ················································································································· 40
참고 헌 ················································································································ 41
ABSTRACT ··········································································································· 46
v
그림 차
Fig. 1. Structure of coronavirus genome and virion ···················································· 2
Fig. 2. Replication cycle of MHV-A59 ······································································ 7
Fig. 3. Does-dependent inhibition of MHV-A59 replication by TCM-33 extract ······ 17
Fig. 4. Effect of TCM-33 extract on MHV-A59 RNA and protein expression ·········· 19
Fig. 5. Inhibitory effects of TCM-33 extract on MHV-A59 entry ······························· 24
Fig. 6. Direct effect of TCM-33 on MHV-A59 entry ················································· 26
Fig. 7. Inhibitory effect of the TCM-33 extract on the minus-strand RNA synthesis · 29
Fig. 8. Affect of intracellular protein translation by TCM-33 extract treatment ········ 32
Fig. 9. minus-strand RNA synthesis by non-structural protein processing ················ 34
Fig. 10. Proposed model for inhibition of MHV-A59 replication by TCM-33 extract · 37
vi
차
Table 1. Coronavirus non-structural proteins and their function ································ 4
Table 2. Effect of TCM-33 extract on MHV-A59 ····················································· 21
- 1 -
Ⅰ.
A. 나 이러스
나 이러스는 60 에 처 지만, 2002~2003 에 한
증 증후근 (severe acute respiratory syndrome, SARS)이 SARS
나 이러스에 해 다는 것이 알 지면 일 인들에게 리
알 지게 었다. 나 이러스는 척추동 에 조 에 이르 지 사람과
동 에게 모 감염 고, 장염, 간염, 계 질병, 신경계 질병 등 다양한
질병 일 킨다 (Weiss and Navas-Martin, 2005). 나 이어스 MHV (mouse
hepatitis virus)는 포 양이 용이하여 가장 많 연구가 이루어진 이러스이다.
한 MHV 는 SARS-CoV 분 상 같 그룹에 속하고, 항원 염 열이
높 사 (homology)를 가진다.
나 이러스는 coronaviridae 과에 속하며, 구 외피를 가진
이러스이며, 양 단일 가닥 RNA 체를 가진다. 체 크 는
략 27~32kb 이며, 체 2/3 를 차지하는 Gene 1 (ORF1a/ab) 증식에 필요한
여러 구조 단 질 (non-structural protein) 암 하고 있고, 나 지 체
1/3 구조 단 질 (structural protein) 암 하고있다: spike (S), envelope(E),
membrane (M), nucleocapside (N) 일부 group 2 나 이러스 에는
haemagglutinin-esterase (HE)를 암 하고 있는 것도 있다 (Perlman and Netland, 2009)
(Fig. 1).
- 2 -
A
Fig. 1. Organization and expression of coronavirus genome and virion. (A) Schematic
diagram of MHV-A59. Approximately the first two-thirds of the 32kb, positive-sense RNA
genome encodes a large polyprotein (ORF1a/b) that is proteolytically cleaved to generated
16 non-structural proteins. The 3’-end one-third of the genome encodes four structural
proteins-spike (S), membrane (M), envelope (E), nucleocapsid (N) and haemagglutitin-
esterase (HE). (B) Schematic diagram of the coronavirus virion (Stadler et al., 2003; Sawicki
et al., 2005).
- 3 -
B. 구조 단 질과 구조 단 질
나 이러스는 15- 16 개 구조 단 질 (non -structural protein, nsp)를
암 하고 있다. 구조 단 질들 증식에 여한다고 알 있지만, 몇몇
구조 단 질 능만이 진 상태이고, 모든 구조 단 질 능
아직 지 히 지지 않았다. nsp3 는 papain like proteases 능 가지고
있어 protein processing 에 여한다고 알 있고, protease domain 에
deubiquitylating 이 있다. nsp 5 는 3CLpro (chymotrypsin-like protease) 는 Mpro
(main protease)라고 알 진 protease 가지고 있다. nsp 12 는 RNA-dependent
RNA polymerase (RdRp) 작용 하고, nsp 13 helicase 작용 한다. nsp
8 RNA 증식에 필요한 RNA primer 합 하는 primase 작용 하고
(Imbert et al., 2006), nsp 7, nsp8, nsp9, nsp10 subgenomic mRNA genomic RNA
증식에 여한다고 알 있다 (Deming et al., 2007). nsp7 과 nsp 8
hexadecameric 구조이며, RNA 에 결합할 있는 가지고 있다 (Zhai et al.,
2005). nsp 14 는 3’→5’ exonuclease 능 가지고 있 며, (guanine-N7)-methyl
transferase (N7-MTase) 가지고 있어 RNA cap 에 여한다고 알
있다 (Chen et al., 2009). nsp 15 는 uridylate-specific endoribonuclease (Nendo U)
가지고 있어 RNA cleavage 에 여하지만 이러스 증식에 향
알 지지 않았다 (Ivanov et al., 2004). nsp 16 S-adenosyl-L- methionie-dependent
RNA (nucleoside-2’O)-methyltransferase (2’O-MTase) 라는 nsp 14 사한 능
하며, RNA cap 에 여한다고 알 있다 (Decroly et al., 2008) (Table. 1).
- 4 -
Table 1. Coronavirus non-structural proteins and their functions.
DMV, double-membrane vesicle; IFN, interferon. (Perlman and Netland, 2009)
Protein Function
nsp1 Host mRNA degradation; translation inhibition; cell cycle arrest; inhibition of
IFN signaling
nsp2 Unknown
nsp3 Papain-like proteases (PLP1pro, PLP2pro)(polyprotein processing);poly(ADP-
ribose) binding; DMV formation(?); IFN antnagonist; nucleic acid binding;
deubiquitinating activity
nsp4 DMV formation (?)
nsp5 Main protease (Mpro,3CLpro); polyprotein processing
nsp6 DMV formation(?)
nsp7 Single-stranded RNA binding
nsp8 Primase
nsp9 Part of replicase complex
nsp10 Part of replicase complex
nsp11 Unknown
nsp12 RNA-dependent RNA polymerase
nsp13 Helicase; nucleoside triphosphatase activity; RNA 5’-triphosphatase activity
nsp14 3’→5’ exoribonuclease; RNA cap formation (guanine-N7)-methyltransferase
nsp15 Endonuclease
nsp16 RNA cap formation (2’O-methyltransferase)
- 5 -
나 이러스 이러스 입자에는 4 개 는 5 개 구조 단 질이 있다:
spike (S), membrane (M), haemagglutinin-esterase (HE), nucleocapsid (N), envelope (E).
S (spike) 단 질 이러스 외피에 spike 를 구 하며, 분자량 180kDa 이다. S
단 질 N-말단에 signal sequence, C-말단에 소 transmembrane domain, 다
potential N-linked glycosylation site 가 있다 (Stern and Sefton, 1982). S 단 질
포상에 이러스를 인식하는 용체에 나 이러스를 부착시키는데
여한다. M (membrane) 단 질 막 3 번 통과하는 당 단 질이며, 분자량이
20~30kDa 이다. M 단 질 포질 쪽에 큰 카르복실 말단 가지고 있고,
포질에 어 소포체 cis-Golgi 에 하 에 나 이러스
조립에 있어 주요한 인자라고 추 다고 보고 었다 (Tooze et al., 1984). N
(nucleocapsid) 단 질 virion RNA 결합하며, 분자량이 50~60kDa 인 인산
단 질 (phosphoprotein)이다. N 단 질 인산 는 사 후에 일어나며, 이런
인산 는 N 단 질과 virion RNA 사이 결합 강하게 해 것이라고
보고 었다 (Stohlman and Lai, 1979). 한 N 단 질 다른 N, M 단 질과
결합하며, interferon (IFN) antagonist 작용 한다. E (envelope) 단 질 작
막 단 질이며, 태 , 조립, 출에 여한다. E 단 질 ion channel
가지고 있어 , 이러스 증식에 여한다고 알 있다 (Wilson et al., 2004;
Madan et al., 2005). HE (haemagglutitin-esterase) 단 질 분자량이 65kDa 이고,
virion 작 spike 를 구 한다. Bovine coronavirus (BCoV), Turkey coronavirus
(TCoV), Human coronavirus (HCoV), Mouse hepatitis virus (MHV)에 는 존재하지만,
IBV TGEV 에는 존재하지 않는다. BCoV HE 단 질 haemagglutinating 과
esterase 가진다. 그러나 이러스 증식에는 필요하지 않지만 주 포에
감염할 요한 역할 할 것이라고 보고 었다 (Lai, 1990).
- 6 -
C. 나 이러스 증식
나 이러스는 포질에 증식 하며, 나 이러스 MHV 는
포 양이 용이하여 가장 많 연구가 이루어진 이러스이다. MHV 증식
자신 S 단 질과 포 면에 있는 CEACAM-1 이라는 용체 상 작용하여
포 면에 부착하면 시작 다. 포 안 들어간 MHV 는 자신 virion
벗고, genomic RNA 를 포질에 출한다. 출 genomic RNA 는 양 단일 가닥
RNA 이 에 번역이 일어나 polypeptide 를 한다. MHV-A59
gene 1 genome 2/3 를 차지하고, ORF1a ORF1b 가 overlapping 어 있 며
(Bredenbeek et al., 1990), fameshift 에 하여 ORF1ab 가 번역 어 800kDa 거 한
polypeptid (ORF1ab)가 합 다. ORF1a 에는 3 가지 protease domain 이 있고: cysteine
proteases 인 PLP1 과 PLP2, poliovirus 3C-like protease, ORF1b 에는 RNA-dependent
RNA polymerase (RdRp)가 있다. 이 polypeptide (ORF1a/ab)는 이러스 체에
암 어있는 3CLpro 는 추가 PLP1pro/PLP2pro 에 하여 autoproteolytic
processing 이라는 과 에 하여 16 개 구조 단 질이 만들어 진다 (Masters,
2006). 여러 증식에 여하는 이러스 단 질과 주 포 단 질들이
조립 어 하나 특 replicase-transcriptase complex 를 이루며 (Sawicki et al., 2005),
이 복합체에 하여 genomic RNA 부 체 genomic 크 가닥 RNA
sub-genomic 크 가닥 RNA 를 합 한다 (Sawicki and Sawicki, 1986; Sawicki
et al., 2001). 이 가닥 RNA 를 주 하여 genomic RNA subgenomic
mRNA 를 합 한다. Subgenomic mRNA 에 각각 N, M, E, S, HE 단 질들이
합 고, N 단 질이 새 이 합 genomic RNA 포질에 조립 어
helical nucleocapsid 를 한다. 소포체 골지체에 M 과 E 단 질이
nucleocapsid 결합하고, S HE 단 질도 소포체에 골지체 이동하는 동안에
- 7 -
결합하여 한 virion 하게 다. 만들어진 virion 주 포에
출 다 (Fig. 2).
- 8 -
Fig. 2. Replicaiton cycle of MHV-A59. The life cycle of MHV-A59 starts when the spike (S)
protein interacts with a receptor. The RNA genome is then release into the cytoplasm where
replication take place. The host translation machinery translates the overlapping ORF1a and
ORF1b by a ribosomal frame-shifting mechanism to produce a single polyprotein. Cleavage
by virally encoded proteinases yields the components that are necessary to assemble the viral
replication complex, which synthesizes full-length negative-strand RNA. In addition, a
discontinuous transcription strategy during negative-strand synthesis produces a nested set of
sub-genomic negative-sense RNAs. These discontinuously synthesized minus strands then
act as templates for the synthesis of positive-sense mRNAs. An alternative hypothesis
proposes that these mRNA molecules are generated by discontinuous transcription during
positive-strand synthesis. Nucleocapsid (N) protein and genomic RNA assemble in the
cytoplasm to form the helical nucleocapsid. This core structure acquires its envelope by
budding through intracellular membranes between the endoplasmic reticulum (ER) and the
golgi apparatus. The membrane (M), envelope (E) and S protein are transported through the
ER to the budding compartment, where the nucleocapsid probably interacts with the M
protein to trigger assembly. Finally, the virus is released from the host cell by fusion of
virion-containinig vesicles with the plasma membrane.
- 9 -
2002~2003 SARS 창궐 이 에는 나 이러스가 동 에 다양한
질병 하고, 사람에 는 일 인 감 만 한다고 알 있었다.
그러나 SARS 원인이 SARS 나 이러스 (SARS-CoV)라고 지면
나 이러스에 한 한 연구가 이루어지고있다. 한 SARS 이후 몇
가지 항 SARS 나 이러스 연구가 진행 어 지만, 효과 인 항
이러스 는 아직 지 보고 가 없다. 합 리보 핵산 일종인 ribavirin 이
SARS 에 한 항 이러스 사용 고 있지만, 아직 지 실한 효과는
불분명하다. 그러나 in vitro 에 는 SARS 에 해 약간 항 이러스 효과를
보 다 (Groneberg et al., 2005). Glycyrrhizin, pyridine N-oxidederivatives, ATPase,
helicase inhibitor, 4-aminoquinoline 이 in vitro 에 SARS-CoV 증식 억 한다고
다 (Cinatl et al., 2003; Keyaerts et al., 2004; Cinatl et al., 2005; Tanner et al., 2005;
Balzarini et al., 2006).
근에 한약재 추출 인 승마 (cimicifuga fhizoma), 고 피 (meliae cortex),
황 (coptidis rhizoma), 황 (phellodendeon cortex), 고삼 (sophorae radix), 가피
(acanthopanacis cortex), 지 (sanguisorbae radix), 사상자 (torilis fructus)가 in
vitro 에 나 이러스 증식 억 한다고 보고하 다 (Kim et al., 2008; Kim et
al., 2010). 본 연구에 는 새 운 한약재 추출 (TCM-33 extract)이
나 이러스에 한 항 나 이러스 효과가 있는지를 알아보고, 항
나 이러스 효과가 있다면, 한약재 추출 이 이러스 증식과 어느
단계에 효과를 나타내는지를 규명하고자 하 다.
- 10 -
Ⅱ. 재료 법
A. 포 양과 이러스 감염
Delayed brain tumor (DBT) 포를 MEM (minimum essential medium, Gibco BRL,
Grand Island, NY) 8% bovine serum (Gibco BRL, Grand Island), 10% tryptose phosphate
broth (TPB) (Sigma Aldrich), penicillin 과 streptomysin (Gibco BRL, Grand Island)
지에 양하 다. 이러스는 mouse hepatitis virus-A59 (MHV-A59) strain를
사용하 다. MHV-A59 DBT 포에 증식하 고, 이러스 titer는 plaque
assay를 통하여 plaque formation unit (PFU) 나타내었다. 이러스 감염
DBT 포에 2MOI (multiplicity of infection) MHV-A59 37℃에 한 시간 동안
감염시 다. 종원 거 한 후, 지 (2% FBS, 10% TPB, 1% PS, 87% MEM) 를
첨가하고 37℃에 양하 다.
B. 한약재 추출
실험에 사용한 한약재 추출 원 부 았다. 각각 식
탄 추출한 뒤 여과를 하고, 각각 용매를 증 시 다. 그 후 남 한약재
천연약 추출 DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma Aldrich)에 녹 다.
C. Plaque assay
약재에 한 이러스 titer 변 를 알아보 하여, 이러스를 포에
감염시킬 , 약재를 같이 처리하여 37℃에 12시간 동안 양한 후,
이러스가 출 포 양액를 하 다. 한 이러스를 MEM
- 11 -
10 씩 차 희 하 고, 희 한 이러스를 DBT 포가 90% 도 자란
6 well plate에 처리한 후, 37℃ 에 1시간 동안 양하 다. 0.9% noble agar (USB,
10907)가 포함 지를 어 후, noble agar가 굳 면 뒤집어 37℃에
48시간 동안 양하 다. 0.25% neutral red를 이용하여 염색 한 다 plaque
보았다.
D. MTT assay
MTT(3-[4,5-dimethylththiaxol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를
통해 TCM-33 추출 이 DBT 포에 포독 효과를 보이는지를 알아보고자
하 다. DBT 포를 96-well microplates에 히 부착시킨 후 각각 천연약재
추출 알맞 농도 희 한 후 12시간 동안 37℃에 양시 다.
포독 알아보 해 1.5 mg/ml MTT를 후 3시간 동안 양한 후
Fomazen DMSO에 녹여 ELISA plate reader 595 nm에 하 다.
E. 포 내 RNA 추출과 Northern blot
이러스가 감염 포에 이러스 mRNA를 인하 하여, MHV-
A59를 5시간 30분 동안 양시킨 포 부 포 내 RNA를 추출하 다.
간단히 명하면, 포를 PBS를 이용하여 부 시 고, 포를 침 시 lysis
buffer (100mM NaCl, 10mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM EDTA, 0.5% NP-40) 용해하 다.
용해 (lysates)에 2X protease K buffer(0.3M NaCl, 0.2M Tris-HCl (pH 7.5), 25mM
EDTA, 2% SDS) proteinase K (100㎍/ml)를 37℃에 30분간 처리 한 뒤, phenol
과 chloroform 추출 법 이용하여 RNA를 추출하 다. 3 ㎍ RNA를 1% agarose
gel에 동 한 뒤, nylon membrane에 이동시킨 후, MHV gene 7에 특이 인
- 12 -
32P-labeled random primed probe를 사용하여 Northern blot를 행하 다.
F. SDS-PAGE Western blot
MHV-A59 DBT 포에 5시간 30분 동안 양 시킨 후, 포에 lysis buffer
(1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 100mM
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF))를 처리하여 포를 용해시 고, 용해 에
19G 주사 5번 통과시 뒤에 포를 침 시킨 후 용해 하 다.
용해 에 2X sample buffer (0.5M Tris-HCl (pH 6.8), 10% SDS, 10% glycerol, 0.2 %
bromophenol, 4% β-mercaptoethanol)를 첨가하여 100℃에 6분 동안 처리 한 후에,
10% SDS-PAGE하고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane 이동시 다.
각각 MHV N 단 질에 한 단일클 항체 (monoclonal antibody)는 5% skim
milk in PBS.T에 1:2000 희 하여 사용하 고, M 단 질에 한 단일클
항체 (monoclonal antibody)는 원액 사용하 고, α-tubulin (Anti-α-tubulin mouse mAb
(DM1A): CALBIOCHEM, USA, Cat. # cp06)에 한 항체는 5% skim milk in PBS.T에
1:1000 희 하여 1차 항체 사용하 고, polyclonal rabbit anti-mouse
immunoglobulin/HRP, (Dako Cytomation Denmark, Cat. P0260)) 5% skim milk in
PBS.T에 1:2000 희 하여 2차 항체 사용하 다. N과 M 단일클 항체는
JO Fleming (university of Wisconsin school of medicine and public health, Madison, WI,
USA) 부 았다.
G. 체 RNA 추출과 RT-PCR
DBT 포에 2MOI MHV-A59를 1시간 동안 감염시킨 다 , 3시간 동안
양 후, DBT 포를 RNA iso plus (TaKaRa, Cat. #9108)를 사용하여 체 RNA를
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추출하 다. 3 ㎍ Total RNA 를 RevertAidTM First strand cDNA synthesis kit
(Fermentas) 사용하여 cDNA를 합 하 다. 가닥 RNA 찰하 하여
사용한 primer (435-456nt): 5’-ATA ATC CGT GAT ATT TTT GAT G-3’, 양 가닥
RNA 찰하 하여 사용한 primer(744-766nt): 5’-TGC AAC CAC TGC TTC
GCA TAC TC-3’, actin 찰하 하여 oligo(dT)를 사용하여 reverse transcription
(RT)를하여 cDNA를 합 하 다. 2 ㎕ cDNA를 사용하여 가닥 RNA
양 가닥 RNA는 forward: 5’-ATA ATC CGT GAT ATT TTT GAT G-3’, reverse: 5’-TGC
AAC CAC TGC TTC GCA TAC TC-3’ 사용하여 증폭하 고, actin forward: 5’-
CAG GTC ATC ACC ATT GGC AAT GAG-3’, reverse: 5’-CAG CAC TGT GTT GGC GTA
CAG GTC-3’ 사용하여 증폭하 다. PCR 94℃에 40 52℃에 40
72℃에 1분 동안 35사이클 (cycle) 하 다.
H. Virion 분리 RNA추출
MHV-A59 DBT 포에 12시간 동안 양한 뒤, 이러스가 출 포
양액 하 다. 한 이러스 부 액 부 sucrose gradient 원심분리
법 이용하여 virion 분리하 다. 간단히 명하면, 20% sucrose 에
이러스 부 액 리고 4℃에 26,000 rpm 3시간 동안 원심분리 하 다.
상 액 버리고 침 (pellet) NTE buffer (0.1M NaCl, 10mM Tris-HCl (pH 7.5),
1mM EDTA) 부 시 다. 이 부 액 닥부 60%, 50%, 30%, 20%
만든 sucrose 에 놓고 4℃에 26,000 rpm 3시간 동안 원심분리 하 다.
30~50% sucrose 사이 취한 후 NTE buffer 희 시 주었다. 20%
sucrose 에 이 부 액 리고 4℃에 26,000 rpm 3시간 동안 원심분리
하 다. 침 T.E buffer (10mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM EDTA) 부 시킨 후,
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2X protease K buffer (0.3M NaCl, 0.2M Tris-HCl (pH 7.5), 25mM EDTA, 2% SDS),
protease K (100㎍/ml)를 고 37℃에 30분 동안 시킨 후, phenol과 chloroform
추출 법 통하여 virion RNA 추출하 다.
I. 포 단 질 합 조사
이러스를 포에 감염 시 약재를 처리하 , 포 단 질
합 이 향 는지 알아보 하여, MHV-A59를 DBT 포에 4℃에 1시간
동안 처리하여 이러스가 주 포 막에만 부착 고 포내 들어가는 것
억 하 다. MEM 지 (2% FBS, 1X TPB, 1% PS)를 첨가할 , 약재를 50㎍/ml
처리하여 37℃에 2시간 10분 동안 양한 후, methionine free media를 고
37℃에 30분 동안 처리하 다. L-35S methionine (NEG-709)를 100 μci/ml
37℃에 20분 동안 처리한 후, 단 질 lysis buffer를 처리하여 용해시 고, 19G
주사 5번 통과하 다. 13,000 rpm에 30 간 원심분리하여 상 액
분리하 다. 용해 에 2X sample buffer를 처리하여 100℃에 7분 동안 처리한 후,
10% SDS-PAGE 하 다. Destaining solution (45% methanol, 10% glacial acetic acid)
고 25℃에 1시간 동안 처리한 후, Enhance solution (1M sodium salicylate)
25℃에 1시간 동안 처리하 다. Gel 80℃에 90분 동안 건조시 주고,
자가 사도법 (autoradiographic) 인하 다.
약재에 한 체 단 질 합 조사하 하여, MHV-A59를 DBT
포에 4℃에 1시간 동안 처리하 다. MEM media (2% FBS, 1X TPB, 1% PS)를
첨가할 , 약재를 동시에 처리한 후 37℃에 3시간 동안 처리하 다. 감염
포에 lysis buffer를 처리하여 용해시킨 후, 19G 주사 5번 통과하 다. 13,000
rpm 30 간 원심분리하여 상 액 분리하 다. 용해 에 2X sample buffer를
- 15 -
처리하여 100℃에 7분 동안 처리한 후, 10% SDS-PAGE 하 다. Coomassie
staining solution (0.25% coomassie brilliant blue R-250 (v/v), 10% glacial acetic acid, 90%
methanol) 25℃에 1시간 동안 처리한 후, destaining solution (45% methanol, 10%
glacial acetic acid) 25℃에 처리하 다.
J. Proteinase 억 (inhibitor) 실험
Proteinase proteasome 억 를 처리하 , 가닥 RNA 합
알아보 하여, DBT 포에 2MOI MHV-A59 4℃에 1시간 동안 처리한
후, proteinase proteasome 억 를 Antipain 100μM, chymostatin 50 μM, E-
64는 1μM, E-64는 100㎍/ml, epoxomicin 1μM, MG132는 10μM 처리하고
37℃에 3시간 동안 양하 다. 체 RNA 추출한 뒤, 가닥 RNA
알아보 하여 RT-PCR 행하 다. 사용한 억 , Antipain
(sigma Aldrich), chymostatin (sigma Aldrich), E-64 (sigma Aldrich), E-64 (Santa Cruz
Biotechnology, Inc.), epoxomicin (sigma Aldrich), MG132(sigma Aldrich) 사용하 고,
모 DMSO에 녹 다.
- 16 -
Ⅲ. 결과
A. TCM-33 추출 이 이러스 생산에 미 는 향.
TCM-33 추출 이 MHV-A59에 항 이러스 효과가 있는지 알아보았다. TCM-
33 추출 처리했 , 이러스 생산에 어떠한 향 미 는지 알아보
하여, DBT 포에 2MOI MHV-A59를 감염시킬 TCM-33 추출 를
처리하 다. 12시간 동안 양 후에, 이러스가 출 양액 한 뒤
plaque assay를 하여 이러스 titer를 찰하 다. TCM-9 추출 MHV-A59에
억 효과가 없다고 진 약재 조군 사용하 고, ribavirin
항 이러스 리 알 진 약재 양 조군 사용하 다. 이러스
titer가 TCM-33 추출 농도에 라 감소하 다. TCM-33 추출 50 ㎍/ml
처리했 , 이러스만 처리했 하여 3 log 이상 감소를 하 고, 100
㎍/ml 처리했 는 5 log 이상 감소하 다. 한 TCM-33 추출 항
이러스 효과가 있다고 보고 ribavirin보다 50 ㎍/ml 처리했 는 1 log이상,
100 ㎍/ml 처리했 는 2 log 이상 감소하 다 (Fig. 3).
- 17 -
Fig. 3. Does-dependent inhibition of MHV-A59 replication by TCM-33 extract. Varying
concentrations (1,10,30,50,70,100㎍/ml) of TCM-33 extract was applied to DBT cells, while
they were simultaneously infected with MHV-A59 at 2MOI, for 12hr at 37 . The virus titer ℃
was measured by plaque assay. Error bars represent the standard deviations from three
independent experiments.
- 18 -
이러스 생산이 TCM-33 추출 에 하여 히 감소하 다. 그래 TCM-
33 추출 이 이러스 mRNA나 단 질 합 에도 향 미 는지 알아
보았다. 포에 이러스를 감염시킬 , 동시에 TCM-33 추출 50㎍/ml
처리한 뒤, 5시간 30분 동안 양하 다. 이러스 mRNA 단 질 합
Northern blot과 Western blot 찰하 다. Northern blot에 사용 probe는
이러스 gene 7에 특이 결합하는 probe mRNA1에 부 mRNA7 지
찰할 있다. 이러스가 감염 었 , 이러스 mRNA 1에 mRNA
7 지 찰 었 나, TCM-33 추출 처리하 , 이러스 mRNA
이 히 감소하 고, ribavirin보다 감소효과를 보 다 (Fig. 4A).
이러스 mRNA 에 찰한 결과 동일한 결과를 이러스 단 질
합 에 도 찰 었다. TCM-33 추출 처리하 , 이러스 N 단 질과
M 단 질이 히 감소하 다 (Fig. 4B). 라 TCM-33 추출 이 이러스
mRNA 합 억 하여 단 질 합 이 억 었고, 종 이러스
생산이 감소 었다고 추 하 다.
- 19 -
Fig.4. Effect of TCM-33 extract on MHV-A59 RNA and protein expression. (A)
Northern blot to detect MHV-A59 RNA expression in response to treatment with 50 ㎍/ml of
TCM-33 extract. Intracellular RNAs from mock-infected, MHV- infected without TCM-33
extract, MHV-infected with DMSO, MHV- infected with ribavirin, MHV- infected with
TCM-9 extract, MHV- infected with TCM-33 extract were extracted at 5hr 30min post-
infection and analyzed by northern blot analysis using a gene-7-specific probe. Seven species
of mRNAs and 28S and 18S ribosomal RNAs are indicated. (B) Western blot analysis to
detect MHV-A59 nucleocapsid (N) protein and membrane (M) protein in response to
treatment with 50 ㎍/ml of TCM-33 extract. Lysates at 5hr 30min post-infection were
subjected to 10% SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes and incubated with
monoclonal antibodies against NHV N and M protein.
A
B
- 20 -
TCM-33 추출 효과를 알아보 하여, 50% effective concentration (EC50)
50% cytotoxic concentration (CC50)를 계산하 다. EC50 는 약재에 하여 이러스
titer 가 50% 감소 는 농도를 말하는 것 , TCM-9 추출 90.4±28.0 ㎍/ml,
TCM-33 추출 4.8±1.4 ㎍/ml, ribavirin 3.1±1.8 ㎍/ml 이다 (Table 2). CC50 는
약재에 하여 포 생존능 (viability)이 50% 감소 는 농도를 말하는 것 ,
TCM-33 추출 519.7±50.3 ㎍/ml, ribavirin 919.5±61.9 ㎍/ml 이 나, TCM-
9 추출 CC50 값 농도를 2000 ㎍/ml 지 처리하 는데도 불구하고 구하지
못하 다. selectivity index (SI: CC50/EC50)는 이러스에 한 약재 항 이러스
효과를 나타내며, TMC-33 추출 107.6 이며, ribavirin 경우 297.5 이다.
일 약재에 하여 이러스 생산이 10% 감소 면 항 이러스 효과가
있다고 말한다. 그래 약재 EC90 값 알아보니 TCM-33 추출
17.3±2.3 ㎍/ml 이고, Ribavirin 26±5.6 ㎍/ml 이다. 포 생존능 (viability)
MTT assay 이외에, 약재에 하여 포 증식 (proliferation)에 변 가 있는지를
포 개체 가 늘어나는 시간 하여 찰하 다. TCM-33
추출 처리하 , 포 증식에 크게 향 보이지 않았다. 라
TCM-33 추출 이 MHV-A59 에 하여 효과 인 약재라고 추 며, 항
나 이러스 약재 가능 시하 다.
- 21 -
Table 2. Effect of TCM-33 extract on MHV-A59
sample
MHV-A59
EC50 ㎍/ml a CC50 ㎍/ml b SI c
TCM-9 90.4±28.0 2000< nd
TCM-33 4.8±1.4 519.7±50.3 107.6
Ribavirin 3.1±1.8 919.5±61.9 297.5
each value represents the mean ±SD from three independent experiments. aThe 50% effective
concentration (EC50) was determined as the concentration of extract needed to inhibit the
virus titer by 50% of the control value (cell without addition of extract). bThe 50% cytotoxic
concentrarion (CC50) was determined as the concentration of extract necessary to reduce the
cell viability to 50% of the control (cell without addition of extract). cThe selectivity index
(SI) was calculated by CC50/EC50. MHV-A59, mouse hepatitis virus A59 strain. nd, not
detected
- 22 -
B. TCM- 33 추출 이 이러스 진입 (entry)에 미 는 향.
앞에 , TCM-33 추출 이 이러스 mRNA 합 억 하 므 , TCM-33
추출 이러스 증식에 mRNA 합 단계에 향 미 것이라
생각하 다. MHV-A59 주 포 막에 어 있는 CEACAM-1 용체
virion에 어 있는 S 단 질과 상 작용에 하여 이러스가 주 포
내 들어 게 고, 이러스는 자신 체를 포질에 출한다. 그래
TCM-33 추출 이 이러스 진입에 향 주는지 알아 보았다.
TCM-33 추출 이 이러스 진입에 향 미 는지 알아보 하여, DBT
포에 MHV-A59 4℃에 1시간 동안 처리하여 이러스가 주 포 막에만
부착 있게 하 고, 부착 지 않 이러스는 척하여 거하 다. 그
후에 TCM-33 추출 50㎍/ml 처리하여 37℃에 양하여 주 포 막에
부착 어 있 이러스가 동시에 포 내 들어갈 있게 하 다. 다른
조군 DBT 포에 MHV-A59 4℃에 1시간 동안 처리할 , 동시에
TCM-33 추출 처리한 후에 37℃에 양하여, 직 TCM-33 추출 에
한 이러스 진입에 향 알아보았다. TCM-33 추출 이 이러스
진입에 향이 있다면, TCM-33 추출 처리했 보다 4℃에 이러스만
처리했 , 이러스 mRNA 단 질 합 이 높 것이라고 상하 다.
37℃에 이러스를 처리했 보다 4℃에 처리했 , 이러스
mRNA 이 약간 낮게 찰 었다. DMSO, TCM-9 추출 과 ribavirin
처리했 , 각각 조군에 이러스 mRNA 변 는 없었다.
그러나 TCM-33 추출 처리했 , 4℃에 이러스만 처리한 포에
이러스 mRNA 이 강하 다 (Fig. 5A). 이러스 mRNA에
마찬가지 , 이러스 단 질 합 도 동일한 결과를 보 다 (Fig. 5B). 라
- 23 -
TCM-33 추출 이 이러스 진입에 부분 향 미 것이라 추 하 다.
그러나 이러스 진입 히 인한 것이 아니라 이러스가 포에
부착하는 단계를 본 것이고, TCM33 추출 약하지만 포독 이 있 므
약재가 이러스 감염 에 미 는 향 할 없다. 라 TCM-33
추출 이 이러스에 직 인 향 미 는지 알아보 하여 이러스에
약재를 처리한 후에 포에 감염시 이러스 titer를 알아보았다.
약재를 처리하지 않았 약재를 처리하 를 하면, 이러스 titer
변 가 없었다 (Fig. 6A). 한 이러스 RNA에 약재가 직 향
주는지 알아보 하여 virion 부 이러스 RNA를 추출하여, RNA에
약재를 처리하여 약재에 한 이러스 RNA 향 알아보았다. 약재에
하여 이러스 RNA가 향 것 아니라는 것 찰 할 있었다
(Fig. 6B). 이 결과 약재는 직 이러스 감염 는 이러스
RNA에 향 주지 않 것이라 추 하 다.
- 24 -
- 25 -
Fig. 5. Inhibitory effects of the TCM-33 extract on MHV-A59 entry. (A) Northern blot to
detect MHV-A59 RNA expression in response to treatment with 50 ㎍/ml of TCM-33 extract.
Intracellular RNAs from mock-infected, MHV- infected without TCM-33 extract, MHV-
infected with DMSO, MHV- infected with ribavirin, MHV- infected with TCM-9 extract,
MHV- infected with TCM-33 extract that MHV treatment at 4 and tempe℃ rature shift 37 , ℃
or 37 were extracted at 5hr℃ 30min post-infection and analyzed by northern blot analysis
using a gene-7-specific probe. Seven species of mRNAs and 28S and 18S ribosomal RNAs
are indicated. (B) Western blot analysis to detect MHV-A59 nucleocapsid (N) protein and
membrane (M) protein in response to treatment with 50 ㎍/ml of TCM-33 extract. Lysates at
5hr 30min post-infection were subjected to 10% SDS-PAGE, transferred to PVDF
membranes and incubated with monoclonal antibodies against NHV N and M protein.
- 26 -
Fig. 6. Direct effect of TCM-33 extract on MHV-A59 entry. (A) To direct effect of TCM-
33 extract on MHV-A59 entry, virus were pretreatment with TCM-33 extract for 1hr at RT
then 10 fold diluted virus infected to DBT cell for 12hr at 37℃. The virus titer was measured
by plaque assay. (B) To degradation of virion RNA by TCM-33 extract, genomic RNA from
partially purified viron incubated with TCM-33 extract for 1hr at RT.
A-59 DMSO TCM-33 Ribavirin
100
101
102
103
104
105
106
107
108
vir
us
tite
r (P
FU
/ml)
A
B
- 27 -
C. TCM-33 추출 에 한 가닥 RNA 합 향.
TCM-33 추출 이 MHV-A59 증식단계 어느 단계에 주요하게 향
미 는지 알아보았다. MHV-A59 증식에 mRNA 합 단계가 가닥
RNA 합 이다. 이러스는 체 부 가닥 RNA를 합 한 뒤,
양 가닥 RNA subgenomic mRNA를 합 한다. 그래 TCM-33 추출 이
가닥 RNA 합 에 향 미 는지 알아보았다.
가닥 RNA 합 이러스가 포 내 들어가 증식이 일어나는
과 에 볼 , 포 내 들어 른 시간 안에 일어날 것이라 생각하 다.
그래 DBT 포에 2MOI MHV-A59 4℃에 1시간 동안 처리하여 TCM-33
추출 에 한 이러스 진입 과 에 억 효과를 하 다. 그런 다
37℃에 양한 후, 체 RNA 추출하여 RT-PCR 통하여 가닥 RNA
합 알아보았다. RT-PCR 통해 가닥 RNA를 찰하는데, 가닥
RNA 만 택 찰 할 있게 하 하여 primer를 작하 다.
그런데 이 primer가 택 가닥 RNA만 찰 할 있는지 알아보
하여, virion 부 추출한 이러스 genomic RNA를 조군 사용하 다.
virion 부 이러스 genomic RNA 추출 sucrose gradient를 통해
virion 분리한 후, virion 부 genomic RNA를 추출하 다. Virion 부
추출한 이러스 genomic RNA는 양 가닥 RNA이 에 가닥 RNA는
인 할 없다. 이러스가 포 내 들어 고 나 어느 시간에 가닥
RNA가 찰 는지를 알아보 하여 1시간, 2시간, 3시간 동안 양하 다.
이러스가 포 내 들어 후, 3시간 양하 가장 하게 가닥
RNA를 찰 할 있었다. 라 TCM-33에 한 가닥 RNA 합
향 보 한 실험에 는 3시간 동안 양하 다.
- 28 -
TCM-33 추출 에 한 가닥 RNA 합 향 알아보 하여,
이러스를 양하는 동안 약재를 같이 처리하 다. virion 부 추출한
이러스 genomic RNA는 양 가닥 RNA만이 인 고, 가닥 RNA는
찰 지 않는 것 인하 다. 이러스가 감염 포에 는 가닥 RNA
합 이 강하게 이루지는 것 볼 있는데, TCM-33 추출 처리했 는
가닥 RNA 합 이 히 감소하 다 (Fig. 7). 이러스만 감염 었
하면, TCM-33 처리하 략 80% 도 감소하 다. 결과
가닥 RNA 합 이 TCM-33 추출 에 하여 히 감소하 에 TCM-33
추출 이 가닥이 합 단계에 향 미 것이라 추 하 다.
- 29 -
Fig. 7. Inhibitory effect of the TCM-33 extract on the minus-strand RNA synthesis.
Reverse transcriptase (RT)-PCR was used to detect viral minus-strand RNA expression.
MHV-A59 treatment to DBT cell of 2MOI for 1hr at 4 .℃ Temperature shift at 37 50℃ ㎍/ml
of TCM-33 extract. Total RNA extracted at 3hr post-infection and analyzed by RT-PCR
using minus-strand RNA specific probe. The mean ±SD of RNA expression levels from five
independent experiments are shown.
- 30 -
D. TCM-33 추출 에 한 포 단 질 합 향
TCM-33 추출 이 이러스 가닥 RNA 합 억 시 다. 라
TCM-33 추출 이 가닥 RNA 합 이 단계에 향 미 것이라
추 하 다. MHV-A59는 주 포 내 들어 면 번역이 일어난다. 이
번역 주 포 translation machinery를 이용하여 일어난다. 그래 포
단 질 합 억 하면 이러스 번역도 억 가 는지를 알아보았다.
번역 억 잘 알 진 cyclohexamide를 처리하여 포 번역 억 하 다.
Cyclohexamide를 처리하 , 이러스 가닥 RNA 합 이 이루어지지
않는 것 찰하 다 (Fig. 8A). 라 포 번역 억 하면 이러스
증식 한 억 며, 이러스 번역 포 translation machinery를
이용한다는 것 인 할 있었다.
TCM-33 추출 이 이러스 번역에 향 미 는지 알아보았다.
그러나 직 이러스 번역 보는 것 불가능하여, 간
주 포 단 질 합 향 알아보았다. 포 단 질 합 향
알아보 하여, DBT 포에 2MOI MHV-A59 감염시킬 , TCM-33
추출 처리를 하 다. 3시간 양 후에, lysis buffer를 이용하여 포를
용해시 다. 용해 10% SDS-PAGE 한 후, gel coomassie blue 사용하여
포 단 질 합 찰하 다. 이러스가 감염 지 않 포
이러스가 감염 포간 단 질 합 차이는 보이지 않았고, 한 TCM-33
추출 처리하 도 이러스 감염여부 상 없이 포 단 질
합 에는 향이 없었다 (Fig. 8B). Coomassie blue를 이용하여 본 포 단 질
포 단 질 본 것이 에, 이러스가 감염 고 나 새 이
합 는 단 질 향 알아보았다. DBT 포에 2MOI MHV-A59 4℃에
- 31 -
1시간 동안 처리한 후, TCM-33 추출 처리하여 37℃에 2시간 10동안
양하 다. 이러스가 감염 후에 20분간 포 단 질 합 향
알아보 하여 methionine free media를 37℃에 30분간 처리한 후에,
100μci/ml L-35S methionine 37℃에 20분간 pulse labeling한 뒤, 10% SDS-
PAGE하여 단 질 합 찰하 다. 이러스가 감염 었 이러스가
감염 지 않았 , 30분간 새 이 합 단 질 합 차이가 없었다.
한 TCM-33추출 처리하 도, 이러스 감염여부에 상 없이 새 이
합 단 질 합 에는 차이가 없었다 (Fig. 8C). 라 TCM-33 추출
포 단 질 합 에는 향 주지 않는다고 생각 며, 한 이러스
번역에도 향 미 지 않 것이라고 추 하 다. 결과를 종합해보면, TCM-33
추출 이러스가 포질에 에 일어나는 번역에는 향 미 지 않
것이라 생각 며, 결국에는 번역 뒤에 일어나는 과 에 부 가닥 RNA가
합 는 과 에 향 미 것이라 추 하 다.
- 32 -
Fig. 8. Affect of intracellular protein translation by TCM-33 extract treatment. (A)
Reverse transcriptase (RT)-PCR was used to detect viral minus-strand RNA expression. DBT
cell infected 2MOI of MHV-A59 at 4 for 1hr and then temperature shift at 37 with 1mM ℃ ℃
cyclohexamide. Total RNA extracted at 3hr post-infection and analyzed by RT-PCR using
minus-strand RNA specific probe. (B) Coomassie blue staining to detect cellular protein
translation in the TCM-33 extract. DBT cell infected 2MOI of MHV-A59 at 4 for 1hr and ℃
then temperature shift at 37 with TCM℃ -33 extract. Lysates at 3hr post-infection were
subjected to 10% SDS-PAGE, coomassie blue stain. (C) metabolic labeling to detect cellular
protein translation for 30min in the TCM-33 extract. DBT cell infected 2MOI of MHV-A59
at 4 for 1hr and then temperature shift at 37 with TCM℃ ℃ -33 extract for 2hr 10min and
then change the methionine free media at 37 for 30min. L℃ -35S methionine (100μci/ml)
treatment at 37 for 20min. lyastes were subjected to 10% SDS℃ -PAGE, destainnig solution
at 25 for 1hr, enhance solution 25 for 1hr, drying at 80℃ ℃ for 90min. ℃
- 33 -
E. non-structural protein processing 에 한 RNA 합
MHV-A59 증식에 가닥 RNA 단계는 번역 어 합
polypeptide non-structural protein processing 이다. non-structural Protein processing
이러스가 자신 체에 암 하고 있는 proteinase 에 하여 일어난다. MHV-
A59 체에 3 가지 proteinase 가지고있다 (PLP1, PLP2, 3CLpro). PLP1 과
PLP2 는 papain-like proteinase 이고, 3CLpro 는 chymotrypsin-like proteinase 이며,
PLP1 과 PLP2 는 polypeptide nsp1~4 부분 자르고, 3CLpro 는 polypeptide
나 지 부분 자른다. non-structural Protein processing 이 일어나지 않게 면,
가닥 RNA 합 이 일어나지 않는지 알아 보았다. 이를 해 cystein/serine
proteinase 억 알 진 antipain, chymostatin, E-64, E64-d 를 사용하 고,
proteasome chymotrypsin-like prteinase 억 알 진 epoxomicin 과
MG132 를 사용하 다.
각각 억 를 처리하 , 가닥 RNA 합 이 억 는지를
알아보 하여, DBT 포에 MHV-A59 4℃에 1 시간 동안 처리한 뒤,
억 를 37℃에 3 시간 동안 처리하여 가닥 RNA 합 찰하 다.
Antipain, chymostatin, E-64 를 처리하 , 이러스 가닥 RNA 합
감소하지 않았지만, E-63-d, epoxomicin, MG132 를 처리하 에는 이러스
가닥 RNA 합 이 히 감소하 다. 이러스만 감염시
하여, E-64-d epoxomicin 70% 감소하 고, MG132 는 80% 도
감소하 다 (Fig. 9). E-64 E-64-d 는 동일한 억 이나 E-64-d 가 포 과 이
높 억 이다. 그래 E-64 는 가닥 RNA 가 감소하지 않았지만, E-64-
d 는 포에 한 과 이 높아 가닥 RNA 합 에 보다 효과
억 효과를 보이는 것 생각 었다. 이 결과 proteinase 이 억 가
- 34 -
면, 가닥 RNA 합 이 하게 감소하는 것 찰하 다. 라
가닥 RNA 합 protein processing 이 일어난 후 합 다는 것
인하 다.
Fig. 9. Minus-strand RNA synthesis by non-structural protein processing. Reverse
transcriptase (RT)-PCR was used to detect viral minus-strand RNA expression in the
proteinase inhibitors. MHV-A59 treatment to DBT cell of 2MOI for 1hr at 4 . Temperature ℃
shift at 37 50℃ ㎍/ml of TCM-33 extract, Ribavirin and proteinase inhibitors. Total RNA
extracted at 3hr post-infection and analyzed by RT-PCR using minus-strand RNA specific
probe. The mean ±SD of RNA expression levels from five independent experiments are
shown.
A59
DM
SO
TCM
-9
TCM
-33
Rib
aviri
n
Antip
ain
Chym
ostat
inE-6
4
E-64-
d
epoxo
mic
in
MG-1
32
0
20
40
60
80
100
120
140
- 35 -
Ⅳ. 고찰
SARS가 창궐한 후에 나 이러스 감염에 한 료연구가 해
다(Haagmans and Osterhaus, 2006; Stockman et al., 2006). 그 , traditional Chinese
medicine (TCM) 부 얻 몇몇 분들과 여러 개 작 허 분이 in
vitro에 항 SARS 나 이러스 효과가 있다고 고, 이 논 에 TCM이
SARS 자에 도 효과가 있다고 보고 하 다(Cinatl et al., 2003; Chen et al., 2004;
Wu et al., 2004; Cinatl et al., 2005). 근에 승마 (cimicifuga fhizoma), 고 피 (meliae
cortex), 황 (coptidis rhizoma), 황 (phellodendeon cortex), 고삼 (sophorae radix),
가피 (acanthopanacis cortex), 지 (sanguisorbae radix), 사상자 (torilis fructus)가 항
나 이러스 효과가 있다고 보고하 다(Kim et al., 2008; Kim et al., 2010).
그러나 아직 지 이런 항 나 이러스 효과가 있는 약재들이 어떠한 작
통해 효과를 보이는지에 한 것 지지 않았다. 그래 새 운 항
나 이러스 약재를 찾아내 하여 TCM-33 추출 이용하여 항
나 이러스 효과 그 작 알아보았다.
본 연구에 TCM-33 추출 이 나 이러스 MHV-A59 이러스
증식 효과 감소시키는 것 인 하 고 (Table 1), 이러한 감소효과는
이러스 mRNA 단 질 합 이 감소 어 나타난 것 이라는 것 다
(Fig 4). TCM-33 추출 이 MHV-A59에 보인 항 이러스 효과가 이러스
증식에 보았 , 어느 단계에 억 효과를 보이는지 알아 보았다. Fig 5.에
TCM-33 추출 이 이러스가 포막에 부착하는 단계에 약하지만 향
미 는 것 찰하 다. 그러나 이러한 TCM-33 억 효과는 Fig 4에
인하 억 효과를 생각하면 충분한 억 효과를 보인다고는 볼 없고,
- 36 -
TCM-33이 포에 약간 포독 가지고 있고, 이러스 감염 는
이러스 RNA에 향 미 지 않 것이라 추 하 다. 라 이러스가
포막 통과하여 포질 들어가고 나 과 에 TCM-33이 향 미
것이라 생각하 다. 이러스가 포 들어 일어나는 과 번역 ,
번역 주 포 translation machinery를 이용하여 일어난다. 그러나 TCM-33
포 단 질 합 에도 향 주지 않았고, 이러스가 감염 고 나 새 이
합 단 질에도 향 주지 않았다 (Fig. 8). 라 TCM-33 추출 이
이러스 번역에 향 미 지 않 것이라 추 하 다. TCM-33이
이러스 번역에 향 주지 않는다면, non-structural protein processing이나
RdRp에 한 가닥 RNA 합 에 향 미 것이라 추 하 다. Fig. 7에
TCM-33 추출 에 하여 이러스 가닥 RNA 합 이 히 감소하는
것 찰하 다. 결과 TCM-33 이러스가 포질에 번역이 일어난
다 단계:non-structural protein processing, RdRp 에 향 미 것이라
추 하 다 (Fig 10.).
- 37 -
Fig. 10. Proposed model for inhibition of MHV-A59 replication by TCM-33 extract.
TCM-33 extract might inhibit early stage of MHV-A59 replication, which involved entry,
translation, protein processing, negative-strand RNA synthesis.
- 38 -
근 아연이 (Zn2+)이 나 이러스 arterivirus RNA polymerase
억 시키고, zinc ionophores가 이런 이러스 증식 해한다고
보고 었다. 이 논 에 아연이 이 eqine arteritis virus (EAV) RNA 합
개시단계에 택 인 억 라는 것 보여주었고, SARS 나 이러스
경우에는 RNA 합 신장단계를 억 하여 증식 억 한다고 보고하 다. 한
SARS 나 이러스에 아연 효과가 RdRp가 주 에 결합하는 단계에
직 향 주어 나타나는 것이라고 말하고 있 며, SARS
나 이러스 RdRp 3차원 구조에 아연이 결합할 있는 특 부분
(motif)이 있다는 것 다. 라 아연이 RdRp에 결합하여 RdRp가 주 과
결합 해하는지에 한 것 추후 연구를 해야 할 것이다라고 보고를
하 다 (te Velthuis et al., 2010). 본 연구에 사용 TCM-33 추출 한 이
논 에 처럼 MHV-A59 RNA 합 과 에 RdRp 에 향 주는지에
한 것 추후에 실험 해야 할 것이다.
나 이러스 RNA 합 polypeptide가 proteinase에 하여 protein
processing이 일어난 후, RNA 합 이 일어난다. 그래 Fig 6에 본 가닥
RNA 합 감소는 RdRp 에 한 것 일 도 있지만 protein processing이
일어나지 않아 나타난 결과일 있다고 추 하 다. protein processing
이러스가 체에 암 어 있는 proteinase 에 하여 일어나며, 재 지
알 진 는 PLP1/2에 하여 nsp1~3 단 질이 며 (Schiller et al., 1998;
Brockway et al., 2004; Harcourt et al., 2004; Brockway and Denison, 2005), 3CL에 하여
나 지 nsp가 다 (Denison et al., 1998). RNA 합 에 필요한 RdRp는 nsp12에
암 어 있 에 3CL에 하여 protein processing이 일어나야 한다.
하지만 효 인 RNA 합 이 이루어 지 해 는 3CL에 한 protein
- 39 -
processing만이 일어나는 것이 아니라 PLP1/2에 한 protein procesisng도 같이
일어나야 효 인 RNA 합 이 이루어 질 있다 (Gadlage et al., 2010). 이 에
cysteine proteinase inhibitor인 E64d가 나 이러스 protein processing과 RNA
합 억 한다는 보고 있었다 (Kim et al., 1995). 본 실험에 사용 TCM-33
추출 이 이런 protein processing에 여하는지에 한 내용 추후에 실험
해야 할 것이다.
Proteasome 억 사용 었 MG132가 MHV-JHM entry를 억 한다고
보도 가 있다 (Yu and Lai, 2005). MG132가 포 내에 존재하면, MHV-JHM이
포 내 들어 포질 출 지 않아 증식 할 없게 며,
MG132에 하여 이러스가 포 내 들어 는 과 포내이입
(endocytosis) 통하여 들어 며 엔도좀 (endosome)과 리소좀 (lysosome)에
르게 하고 포질 출 억 하는 것 다. 라 unbiqutin-
proteasome system이 이러스 진입에 여할 것이라고 시하 며, 이러한
향 이러스 에 도 포내이입 이용하는 이러스 한에 이루어 질
것이라고 시하 다. MHV-A59 포내이입 이용하지 않 에 이러한
향 찰 할 없었다고 하 다. 라 Fig. 9.에 proteasome 억 를
처리하 , 이러스 가닥 RNA 합 감소는 억 가 이러스
진입에 향 미쳐 나타난 결과가 아닐 것이라고 추 하 지만 하게
알아보는 실험 추후에 해야 할 것이다.
종합하면, TCM-33 추출 이 MHV-A59 증식 효과 억 하 고,
TCM-33 추출 이 이러스가 포질에 번역이 후, 는
polypeptide protein processing과/ 는 RdRp 에 향 미쳐 가닥
RNA 합 감소시킨 것이라 추 하 다.
- 40 -
. Ⅴ 결
본 연구에 , TCM-33 추출 이 MHV-A59 증식 효과 억 하 다.
TCM-33 추출 MHV-A59 증식과 에 이러스 진입 (부착 단계)에
부분 효과를 보일 것이라 추 하 다. 한 TCM-33 추출 가닥
RNA 합 히 억 하 며, proteinase 억 를 통하여 protein
processing 후에 가닥 RNA 가 합 보았다. 그러나 TCM-33 추출
포 단 질 합 에는 아 런 향이 없었다. 라 TCM-33 추출 MHV-
A59 증식 단계 (early stage)에 향 미 것이라 생각 며, 아마도
protein processing 과/ 는 RdRp 일 것이라고 추 하 다.
- 41 -
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- 46 -
- ABSTRACT -
In Vitro Inhibition of Mouse Hepatitis Virus A-59 Replication by
Medicinal Herbal Extract.
Eun Young Eo
Department of Biomedical Sciences
The Graduate School, Ajou University
(Supervised by Associate Professor Kyongmin Kim)
Previously, we have demonstrated that Cimicifuga rhizome, Meliae cortex, Coptidis
rhizome, Phellodendron cortex, Sophorae radix, Acanthopanacis cortex, Sanguisorbae radix
and Torilis fructus exhibited anti-coronavirus activity. In this study, an additional medicinal
herbal extract (TCM-33) was assessed for antiviral activities in vitro. TCM-33 reduced the
mouse hepatitis virus A59 (MHV-A59) productions in dose dependent manner. Also, the
significantly reduced expressions of viral mRNAs and proteins in the MHV-A59-infected
cell were demonstrated by Northern blot and Western blot analyses. The 50% effective
concentration (EC50) and the 50% cytotoxic concentration (CC50) of TCM-33 were
determined as 4.8 ± 1.4 μg/ml and 519.7 ± 50.3μg/ml, respectively, resulting the selectivity
index (SI) of 107.6. To determine the mechanism of anti-coronaviral activity of TCM-33, we
further assessed whether TCM-33 inhibits the early stages of MHV-A59 infection cycle
- 47 -
which contains entry, translation and processing and minus-strand RNA synthesis. We found
that viral entry might be inhibited partly by TCM-33. When we blocked the cellular protein
synthesis by cycloheximide, minus-strand RNA synthesis was not detected at all. However,
minus-strand RNA synthesis was reduced in TCM-33-treated MHV-A59-infected cells by
RT-PCR, even though the total cellular protein levels or the new protein synthesis were not
reduced in both the MHV-A59-infected and the TCM-33-treated MHV-A59-infected cells.
Collectively, our data suggest that TCM-33 might inhibit in the early stages of MHV-A59
replication, putatively viral nonstructural protein processing and/or viral RNA synthesis.
Key words: mouse hepatitis virus, medicinal herbal extract, minus-strand RNA