docx

Tulang: batas akhir penetrasi Staphylococcus aureus dalam rinosinusitis kronis.Rogrio Pezato1,3, Luciano Bottura2, Rodrigo de Paula Santos3, Richard Louis Voegels1, Andre Luis Lacerda Bachi4 and Luis Carlos Gregrio3AbstrakSifat superantigenik dari Staphylococcus aureus telah terlibat dalam meningkatkan proses inflamasi pada penyakit saluran pernapasan. Pembentukan lokal antibodi IgE terhadap enterotoksin staphylococcal oleh jaringan limfoid sekunder polip hidung telah dibuktikan. Staphylococcus aureus dikenal menyerang mukosa hidung, dan ditemukan menyerang submukosa hidung dan intraseluler.Tujuan: Untuk mengevaluasi batas invasi Staphylococcus aureus di saluran napas bagian atas.Bahan dan cara : sampel konka Inferior dari 3 pasien tanpa penyakit sinus, sebanyak 6 sampel dari ethmoid pada pasien dengan rinosinusitis kronis dengan poliposis hidung, dan 6 sampel ethmoid dari pasien dengan rinosinusitis kronis tanpa poliposis hidung dipelajari. Sebuah penyelidkan fluorescein ditandai PNA terhadap Staphylococcus aureus adalah digunakan untuk menguji keberadaan bakteri di tulang ( setelah dekalsifikasi ) dan mukosa.Hasil: Kami menemukan Staphylococcus aureus menyerang submukosa hidung pada pasien dengan poliposis hidung, tapi tidak ada kasus dari Staphylococcus aureus positif dalam tulang. Sebagai kesimpulan, kami tidak dapat mendukung hipotesis dari tulang hidung sebagai penyimpanan untuk Staphylococcus aureus, melepaskan sejumlah besar enterotoksin staphylococcal dan memunculkan suatu reaksi inflamasi, seperti yang terjadi dengan mukosa hidung.Kata kunci: Rhinosinusitis, Tulang, Staphylococcus aureus, Jalan napas.PendahuluanSifat superantigenik dari Staphylococcus aureus (SA) telah terlibat dalam meningkatkan proses inflamasi dan memodifikasi perilaku sel imun pada penyakit saluran napas. Secara khusus, studi pasien dengan rinosinusitis kronis dengan poliposis hidung (CRSwNP) mendukung peran enterotoksin Staphylococcus aureus (SE) pada pergeseran keseimbangan Th (Th1/Th2) ke Th2 sebagai respon dari inflamasi [1,2]. Selain itu, ada bukti jelas bahwa IgE dan antibodi IgE spesifik terhadap SE (SE-IgE) ditemukan di tingkat yang lebih tinggi dalam jaringan hidung pasien dengan CRSwNP dibandingkan dengan subyek sehat atau pasien dengan rinosinusitis kronis tanpa poliposis hidung (CRSsNP) [3]. Ekspresi SE-IgE oleh jaringan limfoid sekunder polip hidung telah ditunjukkan di tempat lain [4]. SA telah lama digambarkan sebagai salah satu mikroorganisme yang paling sering diisolasi dari sinus pasien rinosinusitis kronis [5]. Menariknya, SA juga berkolonisasi pada rongga hidung dari subyek sehat, dan beberapa penulis telah melaporkan tidak ada perbedaan dalam tingkat kolonisasi SA antara kontrol dan pasien dengan hidung poliposis [6-8]. Hubungan antara SE-IgE dan keberadaan SA tidak sepenuhnya jelas; namun, pasien dengan SE-IgE positif pada penderita CRSwNP yang tidak terinfeksi oleh SA telah dijelaskan [4]. Dalam upaya untuk lebih memahami hubungan antara SA dan respon imun SE-IgE pada pasien dengan CRSwNP, mungkin reservoir untuk SA telah dievaluasi. Reservoir tersebut dapat melepaskan sejumlah besar SE, memunculkan reaksi inflamasi melalui agen superantigenik mereka dan dengan demikian mengakibatkan aktivasi poliklonal dari limfosit-T dan B, produksi SE-IgE, dan berkembangnya proses inflamasi.

Gambar 1. Kontrol Positif. A, S. epidermidis (merah); B, S. aureus (hijau).Sebuah biofilm dapat didefinisikan sebagai kelompok dari bakteri yang saling berlengketan secara ireversibel menempel ke permukaan dan tertutup dalam matriks eksopolisakarida [9]. Biofilm SA biasanya ditemukan pada polip hidung sebagai nidus dari mana SE bisa dilepaskan ke dalam sinus paranasal, dan kehadiran mereka dikaitkan dengan peradangan eosinophilik dan peningkatan yang tinggi dari IL-5 dan ECP [10]. Meskipun peningkatan produksi IgE poliklonal dan SE-IgE telah dibuktikan dalam pasien CRSwNP, apakah biofilm SA yang lebih banyak pada pasien CRSwNP dibandingkan dengan subyek yang sehat atau pasien CRSsNP masih belum jelas [11]. Penelitian terbaru telah menunjukkan adanya SA tidak hanya pada lapisan epitel hidung, tetapi juga di submukosa hidung [12], menunjukkan bahwa invasi SA terjadi istimewa dalam mukosa CRSwNP terinfeksi dibandingkan dengan mukosa yang sehat atau mukosa yang terkena CRSsNP [ 13]. Menguatkan temuan ini, beberapa penulis telah menyarankan bahwa SA mungkin terdapat pada intraseluler [13,14]. Karena pentingnya reaksi kekebalan anti-SA dalam patogenesis CRS dan asosiasi yang tidak jelas dengan adanya SA, penelitian ini diangkat untuk mengevaluasi apakah tulang bisa berfungsi sebagai reservoir untuk Staphylococcus aureus, sehingga memberikan gambaran yang lengkap dari invasi staphylococcal dari rongga hidung. Bahan dan MetodePasienPasien di ambil dari Departemen otorhinolaryngology Rumah sakit Universitas Ghent, Ghent, Belgium, dan Universitas Federal Sao Paulo, Sao Paulo, Brasil.Sampel konka inferior diambil dari pasien dewasa tanpa penyakit sinus yang menjalani septoplasty dikumpulkan dan digunakan sebagai kontrol (n=3). Sampel ethmoid dari pasien dewasa dengan CRSwNP (n=6) dan tanpa poliposis hidung (CRSsNP) (n=6) telah ditemukan selama prosedur operasi sinus endoskopi fungsional (Functional endoscopic sinus surgery/ FESS). Diagnosis dari penyakit sinus berdasarkan riwayat penyakit, pemeriksaan fisis, endoskopi hidung dan pencitraan tomografi dari rongga sinusparanasal, sesuai petunjuk EPOS. [15]. Studi ini telah disetujui oleh Komite Etik Penelitian dari Universitas Federal Sao Paulo (protokol no.: 06808412.2.0000.5505), dan tercatat dalam bentuk surat persetujuan telah diperoleh dari setiap pasien sebelum mengumpulkan spesimen.

Gambar 2 Pewarnaan mukosa hidung dengan hematoxylin dan eosin. A, menunjukan kelenjar pensekresi mukus, fokus hemoragik dan infiltrasi limfositik pada mukosa konka inferior dari subyek yang sehat (pembesraan 400x); B, infiltrasi limfoplasmatik dan eosinofil dari mukosa ethmoid pada pasien dengan CRSsNP(pembesaran 400x); C, Inset, epitel kolumnar semu dengan edema lamina propria dan limfositik dan infiltrasi eosinofil polip hidung pada pasien dengan CRSwNP (pembesaran 100 ).

Gambar 3 Pewarnaan tulang dengan hematoxylin dan eosin. A, osteosit dikelilingi oleh matriks tulang pada tulang ethmoid dari subyek yang sehat (pembesaran 400 x); B,; osteosit dikelilingi oleh matriks tulang pada tulang ethmoid dari pasien dengan CRSsNP (pembesaran 400 x) C, osteosit dikelilingi oleh matriks tulang pada pasien dengan CRSwNP (pembesaran 100x).

Pengawetan Jaringan dan persiapan pewarnaanMukosa konka inferior dan tulang konka inferior dari subyek sehat dan mukosa ethmoid dan tulang ethmoid dari pasien CRSwNP dan CRSsNP ditempatkan segera pada 10% asetaldehida setelah operasi pemindahan dan diletakan selama 24 jam pada suhu ruangan.

Spesimen kemudian diawetkan dalam 70% ethanol pada suhu 4C, tertanam dalam parafin, dan dipotong menjadi ketebalan 4um dengan mikrotom. Bagian itu kemudian ditempelkan ke Superfrost Plus glass Slides (Menzel Glaser, Braunschweig, Jerman). Setelah dipasang, slide dikeringkan pada 60C selama beberapa jam.Dekalsifikasi tulangSuatu larutan 10% asam etilendiamin tetraacetic (EDTA) dalam air suling, pH 7,4, digunakan untuk menghilangkan kalsium dari semua spesimen tulang sebelum penyiapan dalam etanol 70%. Spesimen disimpan dalam larutan ini dengan pengadukan terus menerus, pada 4C, selama beberapa hari (rata-rata 10 hari), tergantung pada ukuran dan tingkat mineralisasi. Solusi pengkhelat (EDTA 10%) diganti sekali sehari. Pewarnaan hematoxylin dan eosin Setelah dekalsifikasi, bagian dibilas dengan air suling. Inti diwarnai dengan alum hematoxylin (Lillie - solusi Mayer 's) selama 5 menit dan dibilas dengan air keran. Diferensiasi dilakukan dengan asam 0,3% alkohol dan bagian dibilas lagi dalam air keran dan, kemudian, di Scott 's pengganti air keran (natrium hidrogen karbonat 10 g, magnesium sulfat 100 g, air suling 5 L). Setelah membilas di air keran, bagian diwarnai dengan larutan eosin (1% eosin Y 400 mL, 1% aq. Phloxine 40 mL, 95% alkohol 3100 mL, dan glasial asam asetat 16 mL) selama 2 menit, didehidrasi, dan dibersihkan. Pewarnaan imunohistokimia Untuk deparafinisasi, slide dicuci berturut-turut dalam xylene (3 kali selama 10 menit), 100% etanol (2 kali selama 5 menit), 90% etanol (2 kali selama 5 menit), dan 70% etanol (2 kali selama 5 menit) . Setelah pengeringan dengan udara, dihibridisasi pada 55C selama 90 menit di ruang dilembabkan dengan 100-500 NM dari fluorescein-berlabel PNA Probe (S. aureus/ SSP PNA-Ikan kit, LOT 03912A-AS, AdvanDx, Woburn , MA, USA). Setelah hibridisasi, coverslips dihilangkan dengan merendam setiap slide dalam buffer pencuci disediakan dengan kit dan dicuci selama 30 menit di kamar mandi pada 50C. Setiap slide dipasang di Vectashield (Vektor, Burlingame, CA) yang mengandung 4,6-diamidino-2-phenylindole dihidroklorida (Roche Molecular Biokimia, Brussels, Belgia) untuk pewarnaan inti. Kontrol positif baik terkandung Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis untuk mengkonfirmasi spesifitas tinggi dari probe untuk membedakan SA dari koagulase-negatif staphylococcus.

Gambar 4. Pewarnaan Positif (Hijau) untuk menunjukan Staphylococcus aureus pada mukosa hidung. A) pada epitel, B) intramukosa.SA harus menguji positif hijau, sedangkan S. epidermidis harus menguji merah positif (S. aureus / SSP Kontrol Slides kit, LOT QST-0099-US, AdvanDx, Woburn, MA, USA, Gambar 1). Kontrol negatif juga terkandung S. agalactiae. Pemeriksaan mikroskopis dilakukan dengan epifluorescence mikroskop Zeiss Axioplan (Carl Zeiss, Gttingen, Jerman) dilengkapi dengan kamera CCD (IMACCCD S30; SONY, Jerman) menggunakan fluorescein isothiocyanate filter-spesifik. Gambar ditangkap menggunakan pencitraan Isis dan sistem perangkat lunak (metasystems, Sandhausen, Jerman). Statistika Data yang dihasilkan dalam penelitian ini dianalisis dalam SPSS 18 (IBM Corporation, NY, USA). Uji Fisher 's digunakan untuk mengevaluasi perbedaan antara kelompok dalam dua variabel kategori. P-nilai kurang dari 0,05 dianggap signifikan. Hasil Pewarnaan Hematoxylin dan Eosin Pewarnaan hematoxylin dan eosin (H & E) digunakan untuk menilai adanya sel-sel dalam spesimen mukosa dan, terutama, dalam spesimen tulang setelah dekalsifikasi. Pewarnaan H & E menunjukkan epitel pada mukosa hidung dan submukosa dari sampel kami (Gambar 2), dan sel-sel tulang pada dekalsifikasi tulang ethmoid dan spesimen konka inferior (Gambar 3). PNA-fishDari total 15 subyek (Tabel 1), kami mengidentifikasi SA pada mukosa dari 2 pasien dengan CRSwNP (33%). Pada satu pasien, sekelompok SA terlihat pada epitel hidung, dan di sisi lain, sekelompok SA terdeteksi di submukosa (Gambar 4). Kami tidak menemukan SA di mukosa kontrol atau pasien dengan CRSsNP. Kehadiran SA di mukosa pasien CRSwNP secara statistik tidak signifikan dibandingkan dengan pasien CRSsNP dan kontrol.Kami tidak mendeteksi SA dalam spesimen tulang (0 dari 15), terlepas dari diagnosis atau kelompok (Gambar 5). Diskusi Peran Staphylococcus aureus bertindak sebagai superantigen di CRS telah ditunjukkan dengan baik [1,16], karena memiliki korelasi yang tidak perlu dipertanyakan antara tingkat SE-IgE dan CRSwNP [3]. Berdasarkan temuan ini, akan masuk akal untuk menganggap bahwa prevalensi SA lebih tinggi dalam mikrobiologi pasien dengan CRSwNP dibandingkan dengan subyek sehat atau pasien dengan CRSsNP, tetapi banyak penelitian telah gagal untuk menunjukkan perbedaan dalam sinus mikrobiologi antara CRSwNP dan CRSsNP [6-8]. Selain itu, bentuk-bentuk kompleks koloni, seperti biofilm SA di mukosa sinus, tidak jelas terkait dengan CRSwNP [11]. Dalam upaya untuk menjelaskan tingginya tingkat SE-IgE dan adanya jaringan limfoid sekunder ditemukan secara lokal di jaringan polip hidung, penelitian telah dilakukan ke kemungkinan reservoir yang dapat bertindak sebagai sumber berkelanjutan SE dan, akibatnya, memperpanjang proses inflamasi yang berat.

Gambar 5 Hasil tidak adanya pewarnaan untuk Staphylococcus aureus pada tulang.Penetrasi SA ke dalam mukosa hidung telah dikonfirmasi [12,13] dan menunjukkan lebih tinggi pada pasien CRSwNP daripada kelompok kontrol dan pasien dengan CRSsNP. Menguatkan temuan ini, penelitian kami menemukan SA hanya dalam mukosa pasien dengan CRSwNP. Kontribusi Novel utama dari penelitian ini adalah mencari SA luar mukosa sinus, yaitu, dalam tulang. Evaluasi jaringan tulang masih menantang karena mineralisasi nya. Agen chelating yang dipilih adalah EDTA, karena cocok untuk pewarnaan imunohistokimia, karena lebih baik mempertahankan protein matriks tulang dan materi genetik untuk analisis masa depan [17]. Hematoxylin dan eosin pewarnaan memainkan peran penting dalam mengkonfirmasikan bahwa protokol dekalsifikasi yang digunakan tidak mempengaruhi kehadiran osteosit. Dalam pandangan dari temuan kami, kami menyarankan bahwa, tidak seperti mukosa hidung, tulang tidak berperan sebagai reservoir untuk SA. Namun demikian, penelitian lain dengan sampel yang lebih besar dan teknik alternatif yang diperlukan untuk mengkonfirmasi hasil kami. Persaingan kepentinganTidak satupun penulis mempunyai konflik kepentinganKontribusi penulisRP terlibat dalam semua tahap penelitian. LB, ALLB, dan RPS terlibat dalam pengumpulan data dan pewarnaan imunohistokimia. RLV dan LCG terlibat dalam penyusunan naskah dan merevisi secara kritis. Semua penulis memberikan persetujuan akhir untuk penerbitan naskah ini. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.Rincian penulis

1. Departmen Otorhinolaryngology, Universitas So Paulo, So Paulo, Brasil.2. Rumah Sakit Polisi Militer, So Paulo Polisi Militer Negara, So Paulo, Brasil. 3. Departmen Otorhinolaryngology, Universitas Federal Sao Paulo - Unifesp, So Paulo, Brasil. 4. Department Imunologi, Universitas Federal Sao Paulo - Unifesp, So Paulo, Brasil.Diterima: 24 January 2013 Mendapat pengakuan: 11 Juli 2013

Publikasi: 19 Juli2013References

1. Bachert C, Zhang N, Patou J, Van Zele T, Gevaert P: Role of staphylococcal superantigens in upper airway disease. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2008, 8(1):3438.2. Bachert C, Zhang N, Van Zele T, Gevaert P, Patou J, Van Cauwenberge P: Staphylococcus aureus enterotoxins as immune stimulants in chronic rhinosinusitis. Clin Allergy Immunol 2007, 20:163175.3. Van Zele T, Gevaert P, Watelet JB, Claeys G, Holtappels G, Claeys C, Van Cauwenberge P, Bachert C: Staphylococcus aureus colonization and IgE antibody formation to enterotoxins is increased in nasal polyposis. J Allergy Clin Immunol 2004, 114(4):981983.4. Gevaert P, Holtappels G, Johansson SG, Cuvelier C, Cauwenberge P, Bachert C: Organization of secondary lymphoid tissue and local IgE formation to Staphylococcus aureus enterotoxins in nasal polyp tissue. Allergy 2005, 60(1):7179. 5. Feazel LM, Robertson CE, Ramakrishnan VR, Frank DN: Microbiome complexity and Staphylococcus aureus in chronic rhinosinusitis. Laryngoscope 2012, 122(2):467472.6. Kremer B, Jacobs JA, Soudijn ER, van der Ven AJ: Clinical value of bacteriological examinations of nasal and paranasal mucosa in patients with chronic sinusitis. Eur Arch Otorhinolaryngol 2001, 258(5):220225.7. Brook I: Microbiology of sinusitis. Proc Am Thorac Soc 2011, 8(1):90100. 8. Bucholtz GA, Salzman SA, Bersalona FB, Boyle TR, Ejercito VS, Penno L, Peterson DW, Stone GE, Urquhart A, Shukla SK, Burmester JK: PCR analysis of nasal polyps, chronic sinusitis, and hypertrophied turbinates for DNA encoding bacterial 16S rRNA. Am J Rhinol 2002, 16(3):169173.9. Singhal D, Foreman A, Bardy JJ, Wormald PJ: Staphylococcus aureus biofilms: Nemesis of endoscopic sinus surgery. Laryngoscope 2011, 121(7):15781583.10. Foreman A, Holtappels G, Psaltis AJ, Jervis-Bardy J, Field J, Wormald PJ, Bachert C: Adaptive immune responses in Staphylococcus aureus biofilm-associated chronic rhinosinusitis. Allergy 2011, 66(11):14491456. 11. Bezerra TF, Padua FG, Gebrim EM, Saldiva PH, Voegels RL: Biofilms in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. Otolaryngol Head Neck Surg 2011, 144(4):612616.12. Corriveau MN, Zhang N, Holtappels G, Van Roy N, Bachert C: Detection of Staphylococcus aureus in nasal tissue with peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization. Am J Rhinol Allergy 2009, 23(5):461465. 13. Sachse F, Becker K, Von Eiff C, Metze D, Rudack C: Staphylococcus aureus invades the epithelium in nasal polyposis and induces IL-6 in nasal epithelial cells in vitro. Allergy 2010, 65(11):14301437.14. Zautner AE, Krause M, Stropahl G, Holtfreter S, Frickmann H, Maletzki C, Kreikemeyer B, Pau HW, Podbielski A: Intracellular persisting Staphylococcus aureus is the major pathogen in recurrent tonsillitis. PLoS One 2010, 5(3):e9452.15. Fokkens WJ, Lund VJ, Mullol J, et al: EPOS 2012: European position paper on rhinosinusitis and nasal polyps 2012. A summary for otorhinolaryngologists. Rhinology 2012, 50(1):112.16. Pezato R, wierczyska-Krpa M, Niankowska-Mogilnicka E, Derycke L, Bachert C, Prez-Novo CA: Role of imbalance of eicosanoid pathways and staphylococcal superantigens in chronic rhinosinusitis. Allergy 2012, 67(11):13471356.17. Hosoya A, Hoshi K, Sahara N, Ninomiya T, Akahane S, Kawamoto T, Ozawa H: Effects of fixation and decalcification on the immunohistochemical localization of bone matrix proteins in fresh-frozen bone sections.18. Histochem Cell Biol 2005, 123(6):639646.

ARTIKEL PENELITIAN ASLI

1