optická (světelná) mikroskopie pro tm...
TRANSCRIPT
![Page 1: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/1.jpg)
Ústav skla a keramiky VŠCHT Praha
+42- 0- 22044- 4151
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Optická (světelná) Mikroskopie pro TM I
![Page 2: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/2.jpg)
Osnova přednášky
Typy klasických biologických a polarizačních mikroskopů
Přehled součástí polarizačního mikroskopu
Osvětlení, filtry
Clony, kondenzor
Objektivy, okuláry
Kompenzátory
Údržba mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
![Page 3: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/3.jpg)
Technické vybavení - typy optických mikroskopů
biologické mikroskopy polarizační mikroskop
stereomikroskop
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
/Nikon/
![Page 4: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/4.jpg)
Technické vybavení - polarizační mikroskopy na ÚSK
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
NIKON Eclipse
E400POL Jenapol Amplival
- další mikroskopy: Meopta 565, aj.
![Page 5: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/5.jpg)
Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
- stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okulár
/microscopy primer/
![Page 6: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/6.jpg)
Technické vybavení - popis polarizačního mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
- stativ - zdroj světla - kolektorová čočka - filtry - světelná clona - zrcátko - polarizátor - aperturní clona - kondenzor + otočný stolek - křížový vodič + tubus - držák objektivů - kompenzátory - analyzátor - Bertrandova čočka - okuláry
/microscopy primer/
![Page 7: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/7.jpg)
Technické vybavení - osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Dolní osvětlení - (diaskopické) - procházející světlo
- průhledné preparáty, výbrusy
/microscopy primer/
![Page 8: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/8.jpg)
Technické vybavení - osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Horní osvětlení - (episkopické) - odražené světlo
- neprůhledné preparáty, nábrusy, reliéf
- polopropustné zrcadlo
- objektiv je zároveň kondenzorem
/microscopy primer/
![Page 9: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/9.jpg)
Technické vybavení - osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Boční osvětlení - episkopické - odražené světlo
- zvýraznění morfologie povrchu
- lampa - (pro stereomikroskopy)
- vláknová optika - přenos světla svazkem vláken ale i kapalinou flexibilní osvětlení, vysoká intenzita
- LED kroužky na objektivy pokrytí 360°
/Olympus/
/Olympus/ /Edmund Optics/
![Page 10: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/10.jpg)
Technické vybavení - zdroje světla
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Žárovky - s wolframovým vláknem - halogenové
- přibližuje se bodovému zdroji světla
- nízké stejnosměrné napětí (~ 20 V), velký proud, výkon kolem 100 W
- jednoduchá regulace intenzity potenciometrem - spojité barevné spektrum - barva světla se mění s teplotou vlákna - limitovaná životnost vlákna (1000 h)
/microscopy primer/
/microscopy primer/
![Page 11: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/11.jpg)
Technické vybavení - zdroje světla
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
LED diody -
- bodový zdroj intenzivního bílého světla
- nízké stejnosměrné napětí
- zanedbatelné teplo
- regulace intenzity
- vysoká životnost (10000 h)
- sestavení plošných zdrojů
- více principů vzniku - 1) RGB míchání 2) fosforescence →
/Edmund Optics/
/wiki/
![Page 12: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/12.jpg)
Technické vybavení - zdroje světla
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Výbojky - rtuťová, xenonová
- pro luminiscenční mikroskopy
- UV oblast, ale i blízké IČ
- monochromatické světlo (s filtry)
- nízká životnost (200 h)
/microscopy primer/
![Page 13: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/13.jpg)
Technické vybavení - osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Kolektorová čočka
- spojka, z bodového zdroje vytváří rovnoběžné paprsky světla
Polní (světelná) clona
- zužuje svazek světla, eliminace odlesků
- neslouží k regulaci intenzity světla
- obraz se ostře promítá do roviny předmětu
- okraj clony by se měl krýt s okrajem zorného pole
Filtry
- matový filtr - rozptyluje světlo - lepší homogenita
- neutrální filtr - snižuje intenzitu světla, spektrum nemění
- absorpční filtry - korekce barevného spektra např. modrý filtr pro žluté světlo žárovky → bílé světlo
![Page 14: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/14.jpg)
Technické vybavení - osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
- interferenční filtry - tenká vrstva, propustí úzký interval spektra
Polarizátor - polarizační filtr
- extrémně pleochroické látky, orientované polymerní molekuly
- poměrně nízká propustnost, cca 38%
- výklopný, otočný
- většinou předozadní rovina kmitu
Aperturní clona
- reguluje vstupní průměr kondenzoru (vrcholový úhel kužele paprsků vystupujících z kondenzoru)
- otevřená - vysoká rozlišovací schopnost, malý kontrast, malá hloubka o.
- zavřená - ohybové jevy na rozhraních, vysoký kontrast
- neslouží k regulaci osvětlení
![Page 15: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/15.jpg)
Technické vybavení - osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Kondenzor
- soustřeďuje světelné paprsky do preparátu
- numerická apertura (NA = 𝑛 sin 𝜃 ) větší či stejná jako u objektivu
- vlákno osvětlení se má ostře zobrazovat v rovině aperturní clony
- kondenzory pro fázový kontrast a temné pole
/microscopy primer/
![Page 16: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/16.jpg)
Technické vybavení - osvětlení
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Köhlerův princip osvětlení
- nejčastější způsob osvětlení
- roviny, kde dochází k ostrému zobrazení předmětu a vlákna
- roviny zobrazení vlákna lze pozorovat po vyjmutí okuláru nebo zasunutím Bertrandovy čočky
/microscopy primer/
![Page 17: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/17.jpg)
Technické vybavení - stolek, stativ
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Otočný stolek
- dělení na 360°, nonium 0,1°,
- aretace šroubem, někdy centrovatelný
- křížový vodič se stupnicí
- přítlačné pružiny
- motorizovaný z-posuv, automatické ostření
Zaostřování
- šroub na hrubé a jemné ostření, mikrometrická stupnice
- zaostřuje se zásadně zdola - tubus se postupně zvedá
Držák objektivů
- sáňkový, revolverový - 5 objektivů
- centrovatelný, centrace se provádí iterativně
![Page 18: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/18.jpg)
Technické vybavení - stolek, stativ
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Zaostřování - test zručnosti - měření tloušťky vzorku, indexu lomu
![Page 19: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/19.jpg)
Technické vybavení - objektivy
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Objektivy
- nejdůležitější součást mikroskopu - určuje kvalitu obrazu - rozdělení suché × imerzní (I) - konstrukce →
charakteristiky:
- výrobce - Nikon, Olympus, aj. - korekce objektivu - Plan, Apo, aj. - zvětšení 𝑍0 (4x – 100x)
tj. ohnisk. vzdálenost (1,5 – > 20 mm) - numerická apertura - NA = 𝑛 ⋅ sin 𝛼, 𝛼 je polovina
vstupního úhlu - délka tubusu v mm, ∝ pro nekonečnou optiku
- tloušťka krycího skla, 0 pro preparáty bez skla - polarizační objektiv - (Pol, P) - menší počet čoček, nesmí být napětí - ovlivňuje dvojlom
/microscopy primer/
![Page 20: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/20.jpg)
Technické vybavení - objektivy
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
- rozlišení objektivu: 𝑑 =𝜆
NA, 𝜆 je vlnová délka světla
Korigované optické vady:
- Aplanát – korigovaná sférická vada a koma
- Anastigmát – korigován astigmatismus
- Ortoskopický objektiv – korigováno zkreslení
- Achromát – sférická vada a longitudinální chromatická vada pro 2λ (žlutá a zelená oblast)
- Planachromát – navíc zklenutí zorného pole (vhodný pro mikrofotografii)
- Apochromát – longitudinální chromatická vada pro 3λ
- Planapochromát – má navíc odstraněno zklenutí
![Page 21: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/21.jpg)
Technické vybavení - objektivy
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Imerzní objektivy:
- zvýšení numerické apertury (>1)
- eliminace totálního odrazu, vyšší rozlišení - více detailů
- imerze - vysoký index lomu - bromnaftalen (1,658), methylenjodid (1,740)
/microscopy primer/
![Page 22: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/22.jpg)
Technické vybavení - okulár
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
/microscopy primer/
Okulár
- zvětšuje obraz vytvořený objektivem včetně vad
- zvětšení 10x - 20x
- nejčastěji Huygensův okulár (dvě spojky, obr. rovina mezi)
- kompenzační okuláry - vyrovnávají vady objektivů
- nitkový kříž, příp. stupnice
- kamerový adaptér C-mount
![Page 23: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/23.jpg)
Technické vybavení - kompenzátory
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
- slídová destička - původně planparalelní lupínek muskovitu, kolmý k ostré středné, nyní křemen, fázové zpoždění je 1/4𝜆 (~150 nm)
- sádrovcová destička - nyní křemen, fázové zpoždění je 1𝜆,
červenofialová barva I. řádu (~560 nm)
- křemenný klín - klín vybroušený z křišťálu rovnoběžně s optickou osou plynulá změna fázového zpoždění, I. - III. řád
- Berekův kompenzátor - destička kalcitu, řez kolmo k ose c, nulový dvojlom, otáčením dojde ke změně fázového zpoždění, 4 řády
- Sénarmontův kompenzátor - polarizátor s 1/4𝜆 destičkou
otočenou o 45°
- Bertrandova čočka - spojná čočka - umožňuje pozorování: konoskopické obrázky, vlákno osvětlení, zadní ohnisková rovina objektivu, aperturní clona
- Analyzátor - otočný polarizátor se stupnicí
![Page 24: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/24.jpg)
Údržba mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
Prevence
- chránit před kontaminací prachem, otisky prstů, zbytky vzorků
- chránit před mechanickým (hrubé zacházení), chemickým (leptání) a tepelným poškozením (degradace filtrů)
Údržba
- servis, mazání a čištění mechanických dílů
- čištění optických dílů
Literatura: M. Zölffel, The clean microscope, Zeiss.
![Page 25: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/25.jpg)
Údržba mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
čistý mikroskop (vlevo), špína v místě polní clony (vpravo nahoře), prach na čipu kamery (vpravo dole)
![Page 26: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/26.jpg)
Údržba mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
1. roztok detergentu,
2. líh, ether, n-hexan, aj. (pozor na leptání tmelů!)
2. špejle
3. balónek
4. vata, mikrovlákna
![Page 27: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/27.jpg)
Údržba mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
příprava vatových tamponů
![Page 28: Optická (světelná) Mikroskopie pro TM Itresen.vscht.cz/sil/sites/default/files/prednaska_TM_4_mikroskopie... · Technické vybavení - typy optických mikroskopů biologické mikroskopy](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022022021/5ba0883809d3f2c2598ceb49/html5/thumbnails/28.jpg)
Údržba mikroskopu
4. přednáška - Optická mikroskopie pro TM I
správné čištění čoček