optimització de colors per anàlisi en citometria de flux · normes: 1. seleccionar els...
TRANSCRIPT
Normes:
1. Seleccionar els fluorocroms d'acord a l'instrument que es farà servir
2. Adequar la brillantor dels fluorocroms al nivell d'expressió de l'antigen.
• Fluorcroms brillants - Antígens poc expressats
• Fluorcroms dèbils - Antígens molt expressats
3. Minimitzar els solapament d'espectres entre fluorocroms que s'expressen en la
mateixa cèl·lula.
4. Evitar combinacions que generin falsos positius en el cas que es degradi el
fluorocrom.
5. Intentar, sempre que sigui possible, usar fluorocroms excitats pel LASER vermell
amb antígens que s'expressin en cèl·lules amb alta autofluorescència.
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
La brillantor depèn de:
• La brillantor relativa
• Número de fluorocroms per anticòs
• Sistema òptic de l’equip
i es defineix per l’índex de tinció SI (Stain Index). L’SI depèn del sistema òptic de l’equip i per tant pot variar d’un equip a un altre.
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
SIFluorocrom
305PE
263APC
198PE-Cy5
184AF 647
122PE-Cy7
99PerCp-Cy5.5
68AF 488
65BD Horizon V450
64AF 700
43Fitc
37AmCyan
36APC-Cy7
30PerCp
27BD HV500
25APC-H7
Intensitat
+
-
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
Els espectres d’emissió dels fluorocroms abarquen tot un rang de longituds d’ona. La senyal que detectem en els diferents detectors de l’equip ve determinada per uns filtres que deixen passar llum d’una longitud d’ona o una altra. Hi ha fluorocroms que els detectem en el detector que no volem i per tant cal compensar aquesta senyal.
El solapament d’espectres depèn, doncs, de la configuració òptica de l’equip.
Fluorocroms - Característiques
PE-Cy7
APC-Cy7
BD APC-H7
PerCp-Cy5.5
PerCp
PE-Cy5
AF 647
APC
PE
FITC
AF 488
AmCyan
BD Horizon V500
BD Horizon V450
PE-Cy7
APC-Cy7
BD APC-H7
PerCp-Cy5.5
PerCp
PE-Cy5
AF 647
APCPEFITC
AF 488
AmCyan
BD Horizon V500
BD Horizon V450
Per exemple, en un FacsCanto amb una configuració 4-2-2 tindríem aquesta taula de solapament d’espectres.
No es poden combinar
Se solapen els espectres <5%
Se solapen els espectres 5%><20%
Se solapen els espectres >20%
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
Així doncs, cal combinar fluorocroms que estiguin en verd. Si cal combinar fluorocroms que estan en groc o taronja evitar que estiguin en la mateixa cèl·lula i si no ho podem evitar procurar que sigui en marcadors que s’expressin en gran quantitat.
Si dos fluorocroms que se solapen es troben a la mateixa cèl·lula, quan compensem les senyals es produirà una dispersió de les dades que comprometràla resolució.
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
Cal evitar combinacions que permetin falsos positius en cas de degradació dels fluorocroms.
Els fluorocroms poden ser inestables degut a la llum, als agents fixadors o a altres agents. Això es tradueix en:
• Canvis en els valors de compensació
• Reducció en la intensitat de la senyal
• Dissociació dels tándems donant lloc a marcatge de les cèl·lules amb el fluorocrom parental (PE ò APC) que no podrà ser distingit del marcatge de PE ò APC original. Possibilitat de dobles positius.
Fluorocroms - Característiques
- +Estabilitat
Llum: APC-Cy7 << PE-Cy5 << PE-Cy7 << PerCp-Cy5.5 << BD APC-H7
Fixadors: APC-Cy7 << PE-Cy7 << PE-Cy5 << AmCyan
Temperatura: A Temperatura Ambient estable durants uns quants dies. Mirar condicions d’enviament. A 37ºC estable durant hores. Mai congelar un anticòs conjugat a un fluorocrom.
PH: 7,4 Òptim. La majoria són sensibles a canvis de pH (excepte els Alexa). Els buffers ja estan ajustats.
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
Els receptors Fc expressats per les cèl·lules B, els monòcits i les cèl·lules dendrítiques poden unir-se fortament al PE-Cy5 (al Cy5 del PE).
Així doncs, si volem fer servir el PE-Cy5 en immunofenotipatge cal tenir en consideració:
• Cèl·lules de Rata o Ratolí: Usar bloquejadors de Fc comercials
• Cèl·lules humanes: Cocktails d’IgGs, sèrum humà.
L’afinitat dels receptors FC pel PE-TexasRed és baixa.
L’afinitat dels receptors FC pel PerCP-Cy5.5 i pel PE-Cy7 és pràcticament nula.
Fluorocroms - Característiques
1. Brillantor
2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms
3. Estabilitat.
4. Senyal d’unió inespecífica.
5. Mida.
No influeix en els resultats de marcatges intracel·lulars. Això si, es recomana fluorocroms intensos per detecció de molècules intracel·lulars perquè la senyal dels fluorocroms es veuràdisminuïda.