OR e CD

•OR Rotazione ottica (potere ottico rotatorio)

-Misura la quantità di rotazione ad una lunghezza d’onda fissa

•CD circular dichroism

-Misura la differenza di assorbimento della luce polarizzata circolarmente a destra da quella polarizzata a sinistra a differenti lunghezze d’onda

Sorgente luminosaluce non polarizzata

Filtro polarizzatore

Piano della

luce polarizzata

Luce polarizzata:

Luce che vibra in un solo piano (il vettore campo elettrico)

L’attività ottica

Polarimetro

Sorgente luminosa

Filtro polarizzatore

Piano della

luce polarizzata

Tubo contenente

il campione

Filtro ruotante

Consente di stabilire la rotazione

del piano della luce polarizzata

Compostootticamente attivo

Un enantiomero è un composto otticamente attivo

Il Polarimetro e il potere ottico rotatorio

Le Proteine e gli acidi Nucleici sono molecole chirali

•Perché tutti gli amminoacidi (escluso glicina) sono chirali

•Perchè la forma della proteina costituisce una macrostruttura non sovrapponibile alla sua immagine speculare, quindi chirale

Perciò tutte le proteine hanno una chiralità intrinseca e interagiranno con la luce polarizzata

Monocromatore

Elettro-ottici polarizzatore e rivelatore

Campione Il segnale rilevato va ad un elaboratore PC

Lo strumento CD (Dicrografo)

Spettrometro CD, una immagine reale di uno strumento

Dicroismo circolare: il segnale rilevato

• Il Dicroismo circolare è la differenza tra la luce destra e sinistra circolarmente polarizzata ed è misurata in funzione della lunghezza d’onda

• La differenza tra l’assorbimento a destra e quello a sinistra dà il dicroismo circolare

Significato del CD e struttura molecolare

•Spettri CD di proteine o acidi nucleici con strutture secondarie differenti sono differenti

•Pertanto l’analisi di spettri CD dà importanti informazioni sulla struttura secondaria di queste molecole

• La differenza di assorbanza AL-AR è molto piccola

(generalmente do circa 0.0001 unità di assorbanza)

• Necessita di apparato di rivelazione molto sensibile ecco perché uno strumento CD è più costoso di uno UV/VIS

• Questa differenza si misura in ellitticità molare r

CD: unità di misura e sensibilità

La luce polarizzataLa luce è un'onda elettromagnetica che consiste in un campo elettrico E ed un campo magnetico H oscillanti, che possono essere rappresentati da vettori perpendicolari tra loro, e perpendicolari alla direzione di propagazione.

Il piano di polarizzazione è il piano su cui oscilla il campo elettrico E, ma poiché una sorgente di luce è di solito composta da un insieme di emettitori disposti in maniera casuale, la luce emessa è un insieme di onde con tutte le possibili orientazioni del vettore E. La luce polarizzata linearmente, invece, è una radiazione elettromagnetica in cui il vettore E oscilla in un solo ben preciso piano di polarizzazione. Può sembrare strano che la luce polarizzata possa essere considerata una radiazione asimmetrica, in grado di interagire con due enantiomeri in maniera differente. In realtà la direzione di propagazione della radiazione, quella del vettore elettrico E e quella del vettore magnetico H costituiscono una terna di vettori ortogonali non sovrapponibile alla sua immagine speculare.

La seguente animazione mostra come in una luce linearmente polarizzata il vettore campo elettrico oscilla lunga una e una sola direzione (quella z, nella figura) e perpendicolare all’asse di propagazione (quello x).

Un osservatore situato sull’asse x vedrà il vettore campo elettrico raggiungere un massimo e poi diminuire fino a passare per lo zero, cambiare verso, raggiungere un minimo e poi ricrescere di nuovo. L’onda sinusoidale rimane sempre confinata nel piano xz e l’osservatore vedrebbe un vettore oscillare lungo z.

Quando due onde piano polarizzate sono presenti simultameamente in due piani perpendicalari, le proprietà dell’onda che ne risulta dipendono dall’intensità e dalle fasi delle due onde componenti. La seguente animazione mostra l’onda risultante dalla somma di due onde di stessa intensità, frequenza, lunghezza d’onda e in fase ma polarizzate secondo due piani perpendicalari (orizzontale per quella rossa e verticale per la verde)

Il risultato della somma tra le due onde, è un’altra onda piano polarizzata (quella azzurra) con il piano di polarizzazione spostato di 45° rispetto ai piani di polarizzazione delle due onde originarie

Se le due onde non sono in fase (c’è una differenza di 90° tra le loro fasi) l’onda elettromagnetica che ne risulta è circolarmente polarizzata. In pratica il vettore campo elettrico E ruota con frequenza pari alla frequenza della radiazione: il risultato è che la punta del vettore percorre una traiettoria a spirale. L’onda si propaga quindi come una funzione che descrive una traiettoria a spirale e non più sinusoidale

 

Se l’osservatore si pone lungo l’asse di propagazione.

Cosa succede quando due onde circolarmente polarizzate sono sommate?

Se le due onde hanno la stessa intensità, frequenza e lunghezza d’onda ma sono rispettivamente circolarmente polarizzate destra e sinistra la luce che ne risulterà sarà linearmente polarizzata.

Una radiazione polarizzata linearmente va vista come la somma di due onde polarizzate circolarmente, una sinistrorsa e una destrorsa.

Cosa succede quando una radiazione elettromagnetica interagisce con la materia?

parte della radiazione può essere assorbita

Può variare la velocità della radiazione (tutti i materiali hanno un indice di rifrazione!!!)

Assorbimento

Luce piano-polarizzata in un mezzo che l’assorbe ma non la rallenta. Come si può vedere varia solo l’intensità del vettore campo elettrico

Luce circolarmente-polarizzata in un mezzo che l’assorbe ma non la rallenta. Anche in questo caso varia solo l’intensità del vettore campo elettrico

Luce polarizzata in un mezzo rifrangente

Luce piano-polarizzata in un mezzo in grado di rallentarla. La luce che ne risulterà ha la stessa frequenza di quella incidente ma varierà nella lunghezza d’onda

(=c)

Stesso discorso per la luce circolarmente-polarizzata

Cosa succede se la materia assorbe preferenzialmente una delle due componenti (destra o sinistra) della luce linearmente polarizzata?

Nella figura la le due componenti circolarmente polarizzate della luce linearmente polarizzata sono assorbite differentemente: la circolarmente polarizzata destra (rossa) non è assorbita mentre la circolarmente polarizzata sinistra (verde) è assorbita.

I vettori campo elettrico escono dal mezzo con intensità differenti e il vettore somma descrive una traiettoria ellittica. La luce è detta ellitticamente polarizzata.

Cosa succede se la materia rallenta preferenzialmente una delle due componenti (destra o sinistra) della luce linearmente polarizzata?

Nella figura le due onde si propagano con velocità differenti nel mezzo e quindi usciranno dal campione l’una in ritardo rispetto all’altra cioè fuori fase (nell’esempio la componente circolarmente polarizzata sinistra (verde) è più rallentata.

Sommando settorialmente le due componenti si ottiene sempre una luce linearmente polarizzata ma la direzione di polarizzazione sarà ruotata di un angolo rispetto alla direzione originale.La differenza tra i due indici di rifrazione (nL-nR) è detta birifrangenza circolare e l’angolo di deviazione è chiamato rotazione ottica. = 180 l (nL-nR) /

= 100/cl

 

Per poter paragonare campioni a differente concentrazione è stata definita la rotazione molare.

Il dicroismo circolare è una tecnica di analisi strutturale simile alla spettrofotometria in quanto è basata sull'assorbimento da parte del campione di una radiazione UV o visibile. La differenza è che la radiazione usata in questo caso è polarizzata circolarmente, e quella che viene misurata è la differenza tra le assorbanze () riscontrate usando come radiazioni incidenti radiazioni polarizzate circolarmente nei due possibili versi orario e antiorario.Il CD permette di trarre importanti informazioni su molecole chirali. Può essere usato per determinare la configurazione assoluta di una molecola, ma anche configurazioni relative e conformazioni. È inoltre una tecnica molto più sensibile della polarimetria, e, diversamente che per quest'ultima, il segno del può essere sufficiente a trarre conclusioni sulla configurazione assoluta della molecola per specifiche classi di composti.

Il Dicroismo circolare

Lo spettro CD

Un cromoforo chirale, ma anche un cromoforo non chirale che si trovi in un intorno chirale, può assorbire le luci polarizzate circolarmente destra e sinistra in maniera diversa, cioè con assorbanze AD ed AS (e quindi anche assorbanze specifiche molari D ed S) diverse. Uno spettro CD è un grafico del dicroismo circolare, A:

o del dicroismo circolare molare, : R-S

in funzione della lunghezza d'onda. Uno spettro CD assomiglia quindi ad un normale spettro UV, ma DA e De possono anche assumere valori negativi. Naturalmente la relazione tra DA e De è ancora la legge di Lambert-Beer:

A = .l.d

dove l è espresso in cm e c è la concentrazione molare.

A= AS-AD

In generale ogni transizione elettronica che dà origine ad un assorbimento UV/visibile dà anche origine ad una banda nello spettro CD, chiamata effetto Cotton, il cui massimo (o il minimo per bande con segno negativo) si trova più o meno alla stessa lunghezza d'onda del massimo di assorbimento UV/visibile. Lo spettro CD è dato dalla sovrapposizione di bande positive e negative di questo genere. Un esempio di spettro CD è mostrato in Figura. Come ci si può aspettare da considerazioni di simmetria, gli spettri CD di enantiomeri sono uguali, ma hanno segni opposti.

A volte il dicroismo circolare è espresso sotto forma di ellitticità molare. Se la radiazione incidente sul campione è polarizzata linearmente, all'uscita del campione le due componenti hanno intensità diverse e la radiazione diventa polarizzata ellitticamente. L'ellitticità è definita come un angolo la cui tangente è uguale al rapporto tra l'asse minore ed asse maggiore dell'ellisse, e va da 0° per una luce polarizzata linearmente a 45° per una luce polarizzata circolarmente. tang=b/aTuttavia poiché la differenza di assorbanza è sempre molto piccola, anche l'angolo assume sempre valori piccoli (si possono misurare ellitticità di 1/1000 di grado), ed è quindi approssimativamente proporzionale alla concentrazione. Si può allora definire una ellitticità molare []:

dove l è espresso in dm e c è la concentrazione decimolare, ossia espressa in moli per 100 ml (o dmol/l; si notino ancora una volta le insolite unità di misura). L'ellitticità molare [] è legata al dicroismo circolare molare dalla relazione:

3300

cl

L’ellitticità può essere convertita da radianti in gradi mediante:

L’ellitticità molare [] è relazionata alla differenza tra i coefficienti Δε [] = 3298Δε

Ellitticità molare [] deg cm2 mol -1

Lo spettrofotometro CDSi usa invece una radiazione polarizzata linearmente prodotta da una lampada a Xeno (a), molto potente (150-450 W). La radiazione passa poi attraverso il monocromatore (b), che seleziona la lunghezza d'onda desiderata, e attraverso il filtro polarizzatore (c), che la polarizza linearmente. Il cuore dello spettropolarimetro CD è il cosiddetto modulatore elettro-ottico (d), costituito da un cristallo capace di far passare alternativamente la componente destra o sinistra della luce polarizzata linearmente a seconda del campo elettrico a cui è sottoposto. Il modulatore elettro-ottico è sottoposto ad un campo elettrico alternato, per cui il campione (e) è attraversato alternativamente dalle componenti destra e sinistra. Se le due componenti sono assorbite in maniera diversa, il rivelatore (f) origina un segnale di intensità oscillante. L'ampiezza di questa oscillazione permette di misurare il dicroismo circolare.

Può accadere che due cromofori, non chirali e non coniugati tra loro, siano tuttavia disposti nello spazio in maniera chirale. In questo caso i due cromofori generano un intenso spettro CD, caratterizzato da due bande di segno opposto, una a lunghezza d'onda maggiore ("primo effetto Cotton") ed una a lunghezza d'onda minore ("secondo effetto Cotton"). In questo caso si parla di "bisignate CD" o "split CD" . Inoltre, per convenzione, il segno dello split CD è definito dal segno del primo effetto Cotton: per esempio se il primo effetto Cotton è positivo (e quindi il secondo è negativo) la curva nel suo complesso è definita come positiva. Il fenomeno in sé è chiamato con l'espressione inglese "exciton coupling" (che tradurremo accoppiamento tra i cromofori) e l'insieme di regole che mette in relazione la stereochimica della molecola con lo spettro CD è detto "metodo dell'exciton chirality".

Exciton chirality

Se i due cromofori sono uguali, il centro delle due bande (dove il si annulla) corrisponde approssimativamente al massimo di assorbimento del cromoforo mentre se i due cromofori assorbono a lunghezze d'onda nettamente diverse le due bande (sempre di segno opposto) compaiono ognuna in corrispondenza di un cromoforo.

L'utilità del metodo dell'exciton chirality deriva dal fatto che il segno dello split CD è collegato in maniera molto semplice alla disposizione nello spazio dei due cromofori. In un cromoforo, per ogni transizione elettronica può essere definito un "momento di transizione" , un vettore che descrive lo spostamento di carica elettrica in seguito alla transizione. Consideriamo due cromofori i cui vettori non siano paralleli e non siano sullo stesso piano. In questo caso la disposizione nello spazio dei due vettori è chirale (non è sovrapponibile alla sua immagine speculare), ed possibile definire una elicità del sistema di due vettori. La elicità è definita come positiva, se andando dalla punta del vettore più vicino all'osservatore alla punta del vettore più lontano ci si sposta in senso orario, e negativa se ci si sposta in senso antiorario.

Il CD è una tecnica molto usata per lo studio conformazionale di peptidi e proteine. Una catena polipeptidica è formata da tanti amino acidi legati attraverso il legame peptidico. L’unico cromoforo presente è quello associato al legame peptidico, cioè quello ammidico. Le due transizioni possibili sono la n* a 210-230 nm e la * a 180-200 nm. La prima non è permessa per simmetria e quindi è caratterizzata da valori di molto piccoli (<100) mentre la seconda è più intensa.La struttura secondaria di una catena polipeptidica può essere fondamentalmente di 3 tipi: -elica, foglietto e -turn. Gli spettri CD consentono di distinguere tra queste tre differenti conformazioni .

CD di polipeptidi

Wavelength, nm

190 200 210 220 230 240 250

[]

X 1

0- 3,

de

g. cm

2. d

mo

l- 1

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

he lix-sheetType 1 turnRandom coilPoly-L-proline (P2)

La conformazione ad elica è la più comune in molte proteine soprattutto quelle globulari. Uno spettro CD di un polipeptide ad -alica è tipicamente caratterizzato da una banda negativa a 222 nm dovuta alla transizione n-* e da una banda negativa a 208 nm e una positiva a 198 nm relativa all’exciton coupling delle transizioni * del peptide.

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

[]

elica

Le misure CD di polipeptidi con struttura secondaria di tipo sono complicate dalla scarsa solubilità del peptide stesso nel solvente solitamente utilizzato per la misura e dalla possibilità che esistano catene parallele o anti parallele. In genere lo spettro CD mostra due assorbimenti uno positivo a 195 nm e uno negativo a 216 nm, di comparabile intensità.

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

[]

A causa però della maggiore variabilità conformazionale della struttura rispetto alla , i CD di polipeptidi a struttura sono molto meno riproducibili di quelli relativi a peptidi a struttura secondaria e dipendono fortemente dalla lunghezza della catena e dal solvente.

Foglietto

Le strutture secondarie definite -turn sono quelle in cui la catena peptidica va incontro ad una inversione della sua direzione. Le strutture di questo tipo sono tipicamente presenti in polipeptidi ciclici ricchi di residui di prolina. Gli spettri CD di queste strutture secondarie sono molto meno informativi dei precedenti e possono essere a secondo dei casi simili a quelli dei peptidi a conformazione di foglietto pieghettato o ad -elica

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

80

60

40

20

0

-20

-40

-60

190 200 210 220 230 240 250

-turn

• Notare il progressivo cambiamento a 222 con l’incrementare della struttura a elica

—— chemotripsin (~tutta ) —— lisozima ( & ) —— triosefosfate isomerasi

(perlopiù e poco) —— mioglobina ()

Il CD di una proteina dipende dalla sua

struttura secondaria

44

• CD signals for GCN4-p1O'Shea et al. Science (1989) 243:538

figure 3: 34M GCN4-p1 in 0.15M NaCl, 10mM phosphate pH 7.0

wavelength in nm

190 200 210 220 230 240 250 260

[ i

n 1

000

deg

cm

2 dm

ol-1

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 OC50 OC75 OC

•

•

•

•

•

•

•

• 100% di elica a 0oC

• Diventa random coil aumentando la t

Gli spettri CD dipendono dalle condizioniLa temperatura è il parametro più critico

IInfluenza delle catene laterali 

EE’ chiaro che il cromoforo peptidico non è l’unico cromoforo presente in una proteina. Ci sono infatti le catene laterali degli amminoacidi aromatici (Phe, Try, Tyr) che mostrano i caratteristici assorbimenti del cromoforo benzenico tra 250 e 300 nm. LLa Phe mostra un picco di assorbimento intorno a 250 nm. La Tyr ha un gruppo fenolico che assorbe a 280 nm per il ben noto effetto auxocromo del gruppo OH. Un fattore caratteristico è ovviamente la dipendenza dal pH del valore del massimo di assorbimento. Infatti a pH basici si osserva un notevole effetto batocromico (295 nm). Il Trp ha il cromoforo indolico che è responsabile di spettri CD ancora più complessi, infatti sono presenti differenti transizioni nella zona tra 250-300 nm.

Un esempio sulle catene Peptidiche…

•Spettri molto differenti per una -elica- a pieghe ( sheet)–“random coil” (struttura disordinata)

•I contributi sono additivi–Si può determinare il contributo della struttura elica, della a pieghe e del “random coil” mediante misure CD del peptide in soluzione

Spettro CD

•Concentrazione della proteina: circa 0.5 mg/mL

Lo spettro del collagene

Collagene destrutturato

Collagene nativa (elica)

La struttura della subtilisina ottenuta da dati CD e calcoli al computer è in accordo con la struttura trovata da dati di diffrazione di raggi X

La subtilisina è un enzima proteolitico

58% helix

26% sheet

16% coil

B-DNA o modello a nastro: 3.4 Å tra le basi dieci coppie per ogni giro d’elica 34 Å per ogni giro Solco maggiore largo 22 Å Solco minore largo 12 Å

Le strutture del DNA sono investigabili per CD

CD di DNA random coil e Duplex

CD di DNA quadruplex