- L’obiettivo principale della ricerca biomedica consiste nel tentativo di comprendere, a livello molecolare, processi biologici complessi

al fine di migliorare la salute ed il benessere dell’uomo.

-  Uno dei meccanismi biologici più importanti è connesso al controllo della divisione e proliferazione cellulare.

-  Infatti, alterazioni in questo meccanismo sono alla base di molte malattie dell’uomo, in particolare dell’insorgenza di tumori.

- Tuttavia, e non solo per evidenti motivi etici, l’uomo spesso non è l’organismo più idoneo per la sperimentazione biologica.

ORGANISMI MODELLO

- Il loro utilizzo deve essere economico;

- Devono poter essere tenuti in condizioni controllate di laboratorio occupando il minor spazio possibile;

- Devono avere un ciclo di riproduzione rapido;

- Devono originare una progenie numerosa;

- La sequenza del loro genoma deve essere nota;

- Devono avere caratteristiche che permettano l’applicazione delle più moderne tecnologie genetiche e molecolari.

ORGANISMI MODELLO

conservazione evolutiva

il batterio Escherichia coli il lievito Saccharomyces cerevisiae il moscerino della frutta Drosophila melanogaster

il nematode Caenorhabditis elegans

il pesce Dania rerio (zebrafish)

il topo Mus musculus

la pianta erbacea infestante Arabidopsis thaliana

a ?

“mammifero onorario ”

LIEVITO mammifero onorario

Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano

Laboratorio 105

A cura di: Prof.ssa Cinzia Grazioli, insegnante di Scienze delle scuole secondarie di secondo grado, distaccata presso il Cus-Mi-Bio Prof.ssa Maria Grazia Fiorin, IIS “P.Levi”, Bollate Prof.ssa Cristina Gritti, Liceo Statale “G.Galilei”, Caravaggio Prof.ssa Maria Teresa Oliveira, IPSIA “Fiocchi”, Lecco Prof.ssa Olga Pecorari, ITSOS “M.Curie”, Cernusco sul Naviglio Prof.ssa Maria Rosaria Quarta, IIS “Schiapparelli”, Milano Prof.ssa Giovanna Tabita, IIS “Leonardo da Vinci”, Cologno Monzese

Supervisione di: Prof. Paolo Plevani, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie, Università degli Studi di Milano.

GRUPPO DI LAVORO

Vantaggi generali del lievito Saccharomyces cerevisiae per studi di Genetica

•  E’ un eucariote unicellulare che può essere cresciuto facilmente in terreni liquidi o solidi definiti fornendo un completo controllo dei parametri ambientali;

•  Può esistere stabilmente sia come organismo aploide che diploide: in tal modo, mutazioni recessive possono facilmente essere isolate ed analizzate in ceppi aploidi, mentre analisi di complementazione possono essere fatte in ceppi diploidi.

•  I prodotti della meiosi possono essere facilmente analizzati

•  Importanza di tali caratteristiche per screening genetici

Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cerevisiae. I due ceppi aploidi (a e alfa) possono accoppiarsi e formare il ceppo diploide a/alfa che, in condizioni limitanti di nutrienti, va incontro a sporificazione rigenerando nel processo meiotico spore aploidi.

Sporulazione e divisione meiotica

spore

asco

Il ciclo vitale del lievito Saccharomyces cereviae e la sua importanza per l’analisi genetica

Un asco che contiene le 4 spore aploidi prodotte durante il processo meiotico.

U n m i c r o s c o p i o c o n micromanipolatore utilizzato per la dissezione degli aschi.

Argomento di oggi:

Il controllo del ciclo cellulare

Perché il lievito è stato e continua ad essere il modello biologico più importante per lo studio di questo

essenziale processo

Il ciclo cellulare

Il ciclo cellulare è una sequenza ordinata di eventi che possono essere eseguiti solo quando l’evento precedente è stato

correttamente completato.

Fase S (una solo volta per ciclo) e completata prima di M.

Genome segregation

Genome duplication

iDS

Mitosi non finita

Cromosomi non ancorati alle fibre del fuso mitotico

Replicazione del DNA incompleta

I checkpoints “intrinseci” controllano la successione degli eventi in condizioni fisiologiche

Genome segregation

Genome duplication

iDS

mitosi non finita

cromosomi non ancorati alle fibre del fuso mitotico

replicazione del DNA incompleta

Checkpoints “estrinseci” si aggiungono a quelli “intrinseci” in condizioni patologiche (ad es. danni al DNA)

danni al DNA

danni al DNA danni al DNA

Il ciclo cellulare come integrazione fra eventi continui e discontinui

•  Processi continui: crescita cellulare, sintesi proteica, ribosomi, mitocondri, membrane etc.

•  Processi discontinui: replicazione dei cromosomi, segregazione dei cromosomi

L’organismo modello per lo studio dell’integrazione degli eventi del ciclo cellulare è stato il lievito S.cerevisiae

- Il lievito S.cerevisiae si divide per gemmazione - Importanza del coordinamento tra aumento della

massa e ciclo cromosomico

G1 S G2 M

Il lievito per lo studio del ciclo cellulare

S.cerevisiae si divide per gemmazione. La posizione delle cellule durante il ciclo può essere Stabilita osservando vari parametri :

–  Morfologia cellulare –  Contenuto del DNA –  Morfologia del nucleo –  Il centro di organizzazione dei microtuboli –  La morfologia delle fibre del fuso

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Il lievito per lo studio del ciclo •  Le cellule possono essere bloccate:

–  G1 con alpha-factor –  S con HU –  M con nocodazolo –  Temperatura utilizzando mutanti cdc

•  Colture sincrone possono essere ottenute mediante: -  Blocco e rilascio (alpha factor, HU, Nocodazole, temperatura) -  Possono essere analizzate mediante citofluorimetria a flusso

Avendo a disposizione cellule sincrone si possono fare molte osservazioni morfologiche e molecolari,

per es. valutare il livello di specifiche proteine

Lee Hartwell , premio Nobel 2001, per la scoperta dei mutanti “cell division cycle” (cdc)

Geni che controllano il ciclo cellulare devono essere essenziali per la vitalità cellulare.

a) Come si possono trovare mutazioni in geni essenziali per la vita della cellula?

b) Come si possono individuare (tra le mutazioni che aboliscono la vitalità di una cellula) le mutazioni che bloccano specifiche funzioni richieste per il controllo del ciclo cellulare ?

a) Come si possono trovare mutazioni in geni essenziali per la vita della cellula ?

La tecnica del replica-plating per individuare mutazioni temperatura-sensibili in lievito (vedi testo per i dettagli). La stessa tecnica è utilizzata per individuare analoghe mutazioni anche nei batteri.

ts

Ricerca di mutazioni letali-condizionali; ad es. temperatura-sensibili

Individuazione di mutanti cdc in lievito

Combinando più mutazioni cdc che informazioni possiamo ottenere ?

Mutanti cdc bloccati in diverse fasi del ciclo cellulare. Il gene CDC28 codifica per una funzione richiesta per il passaggio dalla fase G1 alla fase S. Infatti, tutte le cellule cdc28 mutanti si bloccano con la morfologia tipica di cellule in G1 (senza gemma) dopo trasferimento alla temperatura non-permissiva. Il gene CDC7 codifica una funzione richiesta per la fase S. Infatti, tutte le cellule mutanti cdc7 hanno la stessa morfologia (una gemma più piccola della cellula madre, tipica di cellule in fase S). Cellule che portano entrambe le mutazioni si bloccano con la morfologia tipica dei mutanti cdc28 e non di mutanti cdc7, indicando che il gene CDC28 agisce temporalmente prima del gene CDC7.

Il gene CDC28 agisce prima del gene CDC7

G1

G2

S M

G1

G2

S M

G1

G2

S M

G1

G2

S M

A

B

B

1st cycle

2nd cycle

A

Vantaggi generali del lievito Saccharomyces cerevisiae per studi di clonaggio e di Biologia Molecolare

Il lievito è facilmente trasformabile. Esistono una varietà di vettori di clonaggio che possono essere introdotti in lievito ed usati per esprimere geni omologhi o eterologhi;

Tali vettori possono mantenersi come elementi extracromosomici o essere indotti ad integrarsi in specifiche posizioni nel genoma di lievito;

In tal caso, l’integrazione nel genoma avviene per lo più tramite ricombinazione omologa;

Facilità di esperimenti 1) di Knock-out; 2) Knock-in; 3) mutagenesi

GENOMICA FUNZIONALE: “REVERSE GENETICS”

Clonaggio di tutti i geni CDC mediante complementazione funzionale

Cosa vuole dire ????

Costruzione di una libreria di DNA in un vettore plasmidico. Diversi frammenti di DNA di un organismo (colori diversi) sono inseriti nello stesso vettore di clonaggio, ed i plasmidi ricombinanti vengono utilizzati per trasformare cellule di E.coli o lievito. Nella popolazione di plasmidi ricombinanti è rappresentato tutto il genoma dell’organismo utilizzato per la preparazione della libreria.

Cosa succede se in una cellula di lievito porta una mutazione recessiva in una gene cdc ed in tale cellula si fa entrare un plasmide che porta il gene selvatico ?

La sviluppo di vettori per il clonaggio in lievito ha portato a scoperte estremamente importanti per l’individuazione e studio di regioni di DNA essenziali per la stabilità del genoma:

- Origini di replicazione del DNA - Centromeri - Telomeri

Vettori: YIp (Yeast Integrative plasmid) YRp (Yeast Replicative plasmid) YCp (Yeast Centromeric plasmid) YAC (Yeast Artificial Chromosome)

Un paziente può essere l’equivalente di un mutante di lievito

• 46 cromosomi; 6.5 miliardi di nucleotidi da replicare e segregare • Il DNA deve essere riparato

La stabilità del genoma: il problema

Centinaia di lesioni diverse causate da: a) Metabolismo cellulare b) Agenti chimico-fisici

Il DNA è l’unica molecola che la cellula si prende la fatica di riparare

ssDNA breaks 50000 interstrand crosslinks 10 dsDNA breaks 10

Il numero di lesioni endogene/cellula/24 ore è molto elevato: sistemi di riparazione devono essere altamente efficienti

Cellula normale Cellula tumorale

Mutazione in un gene della riparazione del

DNA

Instabilità genomica

Una singola mutazione in un gene che codifica per una funzione richiesta per la riparazione del DNA

può causare instabilità genomica

Fenotipo mutatore

Instabilità genomica in cellule tumorali

Rotture Delezioni Traslocazioni Inversioni Duplicazioni Amplificazioni

Danni al DNA

DNA damage checkpoints

Trascrizione Replicazione del DNA

Ciclo cellulare Apoptosi

•Meccanismi conservati dal lievito all’uomo

•Mutazioni nei geni dei checkpoints causano instabilità genomica

La risposta della cellula a danni al DNA è molto complessa

Riparazione