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Orientações para Coleta, Transporte, Processamento, Análise e Meios de Cultura.Análise e Meios de Cultura.
•• ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;ARTIGOS PARA OS SEMINÁRIOS;•• CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;CONTEÚDO PROGRAMÁTICO;•• CASOS CLÍNICOS;CASOS CLÍNICOS;
blog do professor:blog do professor:http://chitoteixeira.wordpress.comhttp://chitoteixeira.wordpress.com
Colheita de Amostras
Quando se suspeita de doença infecciosaTécnicas dirigidas à detecção
sorológica de antígenos e anticorpos
Sondas de DNA - PCR
Cultivos apropriados
Anticorpos monoclonais
Sondas de DNA - PCR
Outros procedimentos sem cultivo
Colheita de Amostras
É possível que a colheita apropriada de umaamostra para cultivo seja a etapa misimportante na confirmação final de que ummicrorganismo é responsável pelo processode enfermidade infecciosa.
Na instituição de uma terapia incorreta e aindadanosa, caso o tratamento seja dirigido paraum comensal.
Uma amostra mal colhida:
de enfermidade infecciosa.
Fracasso no isolamento demicrorganismos importantes.
Exemplo: (caso clínico)
Klebsiella pneumoniae foi isolada do escarrode um paciente com pneumonia clínica;
Escarro colhido de forma inadequada sendoconstituído principalmente de saliva;
Klebsiella pneumoniae
pneumonia Nasofaringe
O pior:
O tratamento seria inadequado e sóresultaria efetivo, por casualidade, se aespécie causadora da pneumonia tivesse umpadrão de susceptibilidade a antibióticossimilar à de K. pneumoniae.
Pseudomonas aeruginosasimilar à de K. pneumoniae.
A terapia eleita poderia ter sidoerrônea.
Pseudomonas aeruginosa
• A amostra deve ser material do sítio real deinfecção, devendo ser colhida com o mínimode contaminação dos tecidos, órgãos e
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
de contaminação dos tecidos, órgãos esecreções adjacentes;
• Deve-se estabelecer o momento ótimo para acolheita de amostras, com o objetivo decontar com melhor possibilidade de isolarmicrorganismos causadores de enfermidades;
• Deve-se obter uma quantidade suficiente deamostra para realização das técnicas de
Enviar ao laboratório swab seco ou secreções escassas é uma prática inútil e de custo
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
Calcularam que o rendimento do isolamento
Swabs retais para isolar espécies de Shigella, o material
amostra para realização das técnicas decultivo solicitadas;
escassas é uma prática inútil e de custo considerável para o paciente;
• Devem ser utilizados dispositivos de colheita,recipientes de amostras e meios de culturaapropriados para assegurar isolamento ótimode microrganismos.;
rendimento do isolamento de microrganismos a partir
de culturas de sangue aumentava em cerca de 3% por mL de sangue colhido; (Mermel e Maki).
Com demasiada freqüência, são enviados ao laboratório 0,5 mL ou menos de material identificado como “escarro” ou “lavado
brônquico”;bactérias anaeróbicas
espécies de Shigella, o material colhido deve ser inoculado
diretamente na superfície de ágar Mac Conkey ou caldo
enriquecido para gram-negativos
Considerações fundamentais na colheita de amostras.
Colheita de Amostras
• Sempre que possível, deve-se obter amostrasantes da administração de antibióticos;Etiqueta legível com nome, antes da administração de antibióticos;Etiqueta legível com nome, número de idenficacção,
origem, médico e a data/hora da colheita;
Garganta
Neisseria gonorrhoea
Amostrasgeniturinárias
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Líquido cefalorraquidiano (LCR)• O recipiente da amostra deve ser rotulado de
forma correta;
Colheita de Amostras
Outros exemplos importantes.
O objetivo primário no transporte deamostras para diagnóstico consiste emmanter a amostra o mais próximo possívelde seu estado original, com deterioração
Transporte de Amostras
de seu estado original, com deterioraçãomínima, e minimizar os riscos para ostransportadores das amostras, utilizando-sedispositivos protetores do recipiente daamostra inseridos no interior de umrecipiente adequado.
Transporte de Amostras
Deve-se evitar:
Condições ambientais adversas
Frio
Calor extremo
Mudanças na pressão
Transporte de Amostras
Se for previsto:
Um atraso prolongado (acima de 4 dias porexemplo) antes da amostra ser processada;
É preferível congelar a amostra a-70ºC, podendo ser utilizado umcongelador a -20ºC, se o períodode estocagem for breve.
Transporte de Amostras
As amostras de escarro colhidas principalmentepara o isolamento:
Podem ser remetidas sem qualquer tratamentodesde que colhidas em recipientes de propilenoou polietileno esterilizados.micobactérias fungos
Transporte de Amostras
A maioria das amostras líquidas, em particularamostra de urina, deve ser transportada aolaboratório o quanto antes possível:
Contexto hospitalar
Recomenda-se um limitemáximo de 2 horas entrea colheita e a chegada daamostra ao laboratório.
Transporte de Amostras
O limite de tempo representa um problemaquando as amostras são colhidas emconsultórios particulares.
Podem ser utilizados
Amostras de urina
Podem ser utilizados recipientes contendo uma pequena quantidade de
ácido bórico, se o transporte rápido não for
possível.
Transporte de Amostras
Para a maioria das amostras pode ser utilizadoum meio de manutenção ou transporte,seguindo-se as instruções do fabricante.
Meio detransporte Stuart
Solução tampão, isenta denutrientes e fatores decrescimento, conserva aviabilidade sem permitir amultiplicação das bactériasdurante o transporte.
Transporte de Amostras
• Tioglicolato de sódio – tem função de agenteredutor para melhorar o isolamento debactérias anaeróbias;
• Ágar (pequena quantidade) – proporcionauma consistência semi-sólida que impede aoxigenação e o derrame durante otransporte;
Transporte de Amostras
Solução de borato de sódio
Tampão com sacarose, fosfato e glutamato
Transporte de Amostras
As amostras devem ser embaladas de modo asuportar golpes ou mudanças de pressão quepodem ocorrer durante a manipulação ecausar vazamento do conteúdo;
Um recipiente que vaza não apenas predispõea amostra a uma potencial contaminação, mastambém expõe os microrganismos ao pessoalque transporta ou recebe a amostra;
Transporte de Amostras
Técnica apropriada para embalar e rotularagentes etiológicos:
Recipiente primário com tampa à prova d’água
Recipiente secundário de preferência de metal
Embalagem para envio fabricada em cartão
ondulado, cartão grosso ou gomaespuma
Recepção de Amostras
jalecos
luvas
máscaras
Processamento de Amostras
• Ingresso de dados essenciais em um livro deregistros ou em um terminal de computador;
• Exame visual e determinação do cumprimento de todos os critérios para cumprimento de todos os critérios para
aceitação da amostra;
• Para certas amostras, o exame microscópicode montagens úmidas ou de esfregaçoscorados, para estabelecer um diagnósticopresuntivo;
Processamento de Amostras
USO DE CORANTES EM MICROBIOLOGIA:
É recomendável que os microbiologistasefetuem exames microscópicos diretos dasamostras enviadas para cultivo;amostras enviadas para cultivo;
Rápido diagnóstico presuntivo Guia para selecionar os meios
de cultura apropriados
Processamento de Amostras
Coloração de Gram
• Cristal violeta – serve como coloraçãoprimária, unindo-se à parede celularbacteriana após tratamento com umasolução de iodo fraca (mordente para asolução de iodo fraca (mordente para aligação do corante);
• Descorante (mistura etanol 95% e acetona) –as bactérias que retêm o corante aparecemazuladas se observadas ao microscópio esão denominadas gram-positivas;
Processamento de Amostras
Coloração de Gram
• Contracorante Safranina – certas bactériasperdem a coloração primária com cristalvioleta quando são tratadas com odescorante e captam a contracoloração comdescorante e captam a contracoloração comsafranina e aparecem em vermelho quandoobservadas ao microscópio, denominando-se gram-negativas;
A coloração de Gram pode ser utilizada paraefetuar identificações presuntivas.
Processamento de Amostras
Colorações de àlcool-ácido-resistência
Recobertas por um espesso material ceroso que resiste à coloração,
entretanto, uma vez entretanto, uma vez coradas, resistem à
descoloração mesmo por solventes orgânicos fortes,
como o álcool-ácido.
Fenômeno descoberto por Ziehl e Neelsen (1881).
micobactérias
Processamento de Amostras
OUTROS CORANTES:
Laranja de acridina
Azul de toluidina e Azul de Metileno
Coloração com Prata
Coloração com Wright-Giemsa
Ácido periódico de Schiff
Processamento dos Cultivos
Após recebimento de amostras para cultivo nolaboratório de microbiologia, devem sertomadas as seguintes decisões:
• Selecionar os meios de cultura primários• Selecionar os meios de cultura primáriosapropriados para o tipo de amostraparticular;
• Determinar a temperatura e aatmosfera de incubação paraisolar todos os microrganismospotencialmente significativos;
Processamento dos Cultivos
• Determinar qual dos microrganismosisolados em meios primários requer umamaior caracterização;
• Determinar se são necessárias provas desuscetibilidade a antibióticos, uma vezsuscetibilidade a antibióticos, uma vezconhecida a identidade do organismo;
Comum a todos é o reconhecimento dasdificuldades envolvidas na manutenção daqualidade dos serviços, em vista das políticas deredução de custos, cada vez mais rigorosas;
Seleção de Meios de Cultura Primários
Meios não-seletivos – são isentos de inibidorese permitem o crescimento de microrganismosencontrados freqüentemente em laboratóriosclínicos;clínicos;
Ágar com 5% de sangue de carneiro
Ágar com sangue de cavalo ou de ovelha
Haemophilus influenzae
Ágar com sangue humano
Gardnerella vaginalis
Seleção de Meios de Cultura Primários
Pode-se tornar o ágar sangue seletivo mediantea adição de um ou mais antibióticos ou decertas substâncias químicas;
Ágar sangue
Colistina e o ácido nalidíxico
Inibe gram-negativos e favorece o crescimento de
gram-positivos
Ágar-KV
Canamicina e vancomicina
Bacilos gram-negativos anaeróbios (bacteroides)
Ágar McConkey Ágar EMB
Inibem gram-positivos
Seleção de Meios de Cultura Primários
O caldo de enriquecimento é empregado paraisolar microrganismos patogênicos deamostras, como fezes, nas quais existe umaelevada concentração de microrganismoselevada concentração de microrganismoscomensais;
Salmonella e Shigella
Escherichia coli e outros comensais entéricos
Fase logaritmica
Fase de latência
Uma vez que a amostra tenha ultrapassado osvários critérios para rejeição e tenha sidoaceita para cultivo, porções apropriadas damesma devem ser transferidas aos vários
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
mesma devem ser transferidas aos váriosmeios de cultura descritos no item anterior.Essa atividade também é usualmente realizadaem uma parte separada de outras áreas dolaboratório, conhecida como área de“semeadura”;jalecos
luvas
máscaras
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
O equipamento necessário para a inoculaçãoprimária de amostras é relativamente simples:
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
Espalhamento nos quatro quadrantes
UFC
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
O meio nos tubos pode ser líquido, semi-sólido(0,3 a 0,5% de ágar) ou sólido. O ágar semi-sólido é adequado para as provas demotilidade;motilidade;
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
Os microrganismos diferem quanto à temperatura ótima de incubação. Porém, a maioria dos microrganismos cresce a 35ºC;
assim, se o laboratório dispõe apenas de uma assim, se o laboratório dispõe apenas de uma estufa, esta deve estar ajustada para 35ºC;
O crescimento da maior parte dos microrganismos é potencializado por uma
atmosfera de 5% a 10% de CO2;
Transferência e Cultivo de Amostras Biológicas
Mais importante que o modo de incubação é a prevenção de amplas flutuações na
temperatura. Deve-se cuidar para que os tubos e placas fiquem protegidos de correntes de ar-e placas fiquem protegidos de correntes de ar-
condicionado ou de fluxos de calor;
O controle da umidade no interior da estufa também é importante. A maioria dos
microrganismos tem crescimento máximo quando a umidade é de 70% ou superior;
Interpretação dos Cultivos
A identificação dos cultivos primários após 24a 48 horas de incubação requer umaconsiderável habilidade;
Essa avaliação se faz:
O microbiologista deve avaliar o crescimentodas colônias e decidir se são necessáriosprocedimentos adicionais;
Interpretação dos Cultivos
• Anotando as características e o númerorelativo de cada tipo de colônia isolada emmeios de ágar;
• Determinando a pureza, reação à coloração• Determinando a pureza, reação à coloraçãode Gram e morfologia das bactérias em cadatipo de colônia;;
• Verificando mudanças no meio que circunda as colônias, o que reflete atividades metabólicas específicas de bactérias
isoladas;
Interpretação dos Cultivos
Características macroscópicas das colônias
OBRIGADOOBRIGADO