Oscilatorna dinamika GTPaze Rac1 u amebi Dictyostelium discoideum

Blaz Ivsic, F-4291; Mentor: prof. dr. Igor WeberFizicki odsjek, Prirodoslovno-matematicki fakultet, Bijenicka 32, Zagreb

(Dated: 20. sijecnja 2019.)

Porodica GTPaza Rho predstavlja glavnu grupu proteina ukljucenih u regulaciju aktinskog cito-skeleta u amebama Dictyostelium discoideum. Buduci da se te amebe mogu repolarizirati najbrze odsvih eukariotskih stanica, one predstavljaju zanimljiv bioloski sustav za promatranje i proucavanjedinamike proteina tijekom stanicnog kretanja. U ovom je seminaru predstavljen reakcijsko-difuzijskimodel dinamike proteina Rac1 i DGAP1 zasnovan na njihovoj interakciji koji pripada klasi modelaprimjerenih sustavima s ocuvanom masom. Ponudeni model moze objasniti neke eksperimentalnoprimijecene obrasce u koncentracijama fluorescentno obiljezenih proteina, kao i ovisnost njihovedinamike o parametrima sustava.

UVOD

Vecini fizicara pojam oscilacija nije nimalo stran i po-javljuje se u svim granama fizike, pa tako i u biofizici.Stoga ne cudi sto su se oscilacije opazile u mnogo bi-oloskih sustava. Od makroskopskih oscilacija u ljudima izivotinjama koje reguliraju disanje, otkucaje srca itd., dooscilacija unutar pojedinacnih stanica koje omogucavajunjihovo kretanje, diobu te mnostvo drugih procesa. Ciljovog seminara je prouciti jednu vrstu oscilacija u amebiDictyostelium discoideum koja joj omogucava efikasnopretrazivanje povrsine u potrazi za hranom.

Biofizikalna osnova stanicnog kretanja lezi u aktinskomcitoskeletu. Radi se o sustavu umrezenih filamenata, kojinastaju polimerizacijom proteina aktina[1]. Pojedini fi-lamenti, a i citav sustav, mogu se vrlo brzo sastavljatii razgradivati brzinom reda velicine od 1µm/s. Aktin-ske niti medusobno su povezane specificnim proteinima,dok je citav sustav reguliran kompleksnom biokemijskommrezom proteina koji se medusobno aktiviraju i deakti-viraju.

Stanice organizma Dictyostelium discoideum predstav-ljaju odlican bioloski sustav za proucavanje stanicnogkretanja. Te su amebe vrlo pokretljive, a njihov aktinskicitoskelet s regulatornim proteinima, srodan je citoske-letu stanica sisavaca. Osim toga, njihov je zivotni cik-lus kratak i haploidni genom sekvenciran, sto omogucavaefikasnu manipulacija genima i time produkciju stanica spreizrazenim odnosno potisnutim specificnim proteinima.Takoder, metodama genetickog inzenjerstva moguce jeobiljeziti odredene proteine fuzijom s fluorescentnim pro-teinima, te je takve kimerne proteine moguce pratitiu zivim stanicama pomocu mikroskopije [5]. Kretanjeamebe Dictyostelium ugrubo mozemo razdvojiti na ke-motaksiju (usmjereno kretanje stanica u gradijentu kon-centracije odredene tvari), te neusmjereno kretanje vege-tativnih stanica u potrazi za hranom. Postoje i drugiprocesi koji se temelje na istim biofizickim osnovamai slicnim signalnim putovima, npr. citokineza, endoci-toza, transport vezikula unutar stanice i slicni, no onipremasuju opseg ovog seminara. Biokemijska pozadinaspomenutih procesa relativno je dobro poznata.

Za razumijevanje vremenskih i prostornih periodicnih

pojava u biologiji opcenito, pa tako i u sklopu stanicnogkretanja, potrebno je osmisliti fizikalne modele koji bimogli razjasniti dinamiku promatranog sustava. Prvi jepojavu samoorganizirajucih obrazaca u bioloskim susta-vima promatrao Turing. On je pokazao kako je u sis-temu s vise komponenti, koje medudjeluju i difundirajurazlicitim brzinama, interakcija izmedu kemijskih reak-cija i difuzije dovoljna da uzrokuje nestabilnosti, cak iu sustavima sa stabilnom kemijskom ravnotezom. ([17]prema [8]).

Razlikujemo dvije osnovne primjene ovog principau modeliranju unutarstanicnih dinamickih procesa: tosu tzv. modeli ”aktivator-inhibitor” te ”aktivator-deplecija”. U prvom modelu jedna od tvari igra uloguaktivatora koji djeluje autokataliticki i sporo difundirasto dovodi do lokalnog rasta njegove koncentracije. Ak-tivator pritom potice i stvaranje inhibitora koji brzodifundira i sprjecava povecanje koncentracije aktiva-tora. Ovaj model pretpostavlja da je aktivator vezanza stanicnu membranu (spora difuzija) dok se inhibitornalazi vecinom u citoplazmi (brza difuzija). Drugi pris-tup (aktivator-deplecija), umjesto inhibitora, kao drugukomponentu pretpostavlja supstrat koji se autokatalitickipretvara u aktivator. Ovaj model postulira produkcijusupstrata u citoplazmi i degradaciju aktivatora na mem-brani [8].

Ponudeno je nekoliko modela koji opisuju stanicno kre-tanja i bazirani su na spomenutim pristupima. Miaoi suradnici [13] ponudili su razradenu verziju modelaaktivator-inhibitor koji moze objasniti razlicite modovevegetativnog kretanja kao i kemotaksiju. Njihov pristupbazira se na pobudljivoj signalnoj mrezi (signal tran-sduction excitable network), pri cemu prelazak pragaekscitabilnosti mreze uzrokuje pojavu uzoraka. Slicanpristup izabrali su i Shi i suradnici [16], koji su uzinterakcije izmedu proteina u model ukljucili i defor-macije membrane. S druge strane, kombinacijom dvaaktivator-inhibitor modela, takoder je moguce reprodu-cirati odredene karakteristike stanicnog kretanja [9]. Pro-blem s gornjim pristupima je sto ne uzimaju u obzir dasu sinteza i degradacija proteina ukljucenih u signalneputove mnogo sporije od njihovih interakcija. Stoga bi-smo modele unutarstanicnih procesa trebali promatratikao sisteme s ocuvanom masom. Drugim rijecima pojava

2

obrazaca ovisi o preraspodjeli tvari unutar stanice, a neo njihovom nastajanju i raspadanju [8].

Vaznu ulogu u regulaciji aktinskog citoskeleta imajumale GTPaze Rho. To su signalni proteini koji na sebemogu vezati GTP (gvanozin-trifosfat) i hidrolizirati gau GDP (gvanozin-difosfat). Ako je na GTPazu vezanGTP govorimo o aktivnom obliku, dok u slucaju kadaje vezan GDP govorimo o inaktivnom obliku GTPaze[12]. U aktivnom obliku ti se proteini mogu vezati zaciljne molekule (efektore) i time prenositi signal. Efek-tori imaju tzv. GBD domene (GTPase Binding Doma-ins) na koje se specificno vezu odredene aktivne GTPaze.Vezanjem GTPaza efektori mijenjaju svoju konformacijucime se aktivira njihova funkcija kao npr. polimerizacijaaktina u slucaju proteina iz grupe formina. Aktivnostmalih GTPaza reguliraju sljedeci proteini: GEF proteini(Guanine-Nucleotide Exchange Factors) koji katalizirajuizmjenu molekula GDP za GTP, GAP proteini (GTPase-Activating Proteins) koji stimuliraju hidrolizu GTPa ve-zanog na GTPazu i time prekidaju prijenos signala, teGDI proteini (Guanosine nucleotide Dissociation Inhi-bitors) koji onemogucuju disocijaciju GTPaze i vezanognukleotida GDP [5].

Jedan od kljucnih proteina iz familije GTPaza Rho kojikontrolira kretanje ameba Dictyostelium je Rac1. Poka-zano je kako aktivni oblik Rac1 sudjeluje u regulaciji ak-tinskog citoskeleta na prednjem kraju stanice vezanjem iaktivacijom proteina Scar/WAVE koji dalje regulira pro-teinski kompleks Arp2/3, kao i na straznjem kraju stanicevezanjem u kompleks s proteinima DGAP1 te korteksi-linom. Arp2/3 inducira polimerizaciju aktina i stvara-nje protruzija na prednjem kraju stanice, dok komplekskoji se sastoji od proteina DGAP1, Rac1 i korteksilinasprjecava nastanak protruzija na straznjem kraju. Pri-mijeceno je kako su podrucja djelovanja ova dva kom-pleksa medusobno priblizno iskljuciva [6]. U ovom je se-minaru ponuden fizikalni model koji moze objasniti po-javu jednog ili vise podrucja djelovanja spomenutih kom-pleksa te je usporeden s eksperimentalnim rezultatima.

REZULTATI

Za teorijsku je analizu najprije napravljen detaljni me-hanisticki model stanicne polarizacije uvjetovane Rac1proteinom. Stanica je promatrana kao jednodimenzi-onalni sustav s dva odvojena podrucja: citoplazma imembrana. Iako detaljni oblik stanice moze igrati uloguu nastajanju obrazaca, buduci da su koeficijenti difuzijemnogo veci u citoplazmi nego na membrani, svaki takavtranzijentni obrazac, koji ovisi o geometriji, s vremenombiva potisnut[14]. Dodatna pretpostavka koja pojednos-tavljuje model, je da ne postoje procesi u citoplazmi kojibi izmijenili stanja proteina, kao sto je na primjer izmjenanukleotida na GTPazi.

Kao sto je vec spomenuto u ranijim su radovima pri-mijecene dvije razlicite populacije aktivnog Rac1 prote-ina na membrani [7]. Prva, pokretna i dinamicna frakcija

ukljucena je u regulaciju Arp2/3 kompleksa na membranikoji posreduje u polimerizaciji aktina i stvaranju protru-zija. Druga frakcija aktivnog Rac1 proteina sakuplja sena komplementarnim podrucjima, odnosno na straznjemkraju stanica koje se krecu i veze se u kompleks s efek-torom DGAP1. Nas reakcijsko-difuzijski model sastojise od dva glavna dijela prikazana na slici 1. Kako bi sesmanjio broj slobodnih parametara modela, kao varijablesu eksplicitno ukljucene samo koncentracije i prostornedistribucije Rac1, GAP te DGAP1. Prvi dio modelaopisuje kruzenje izmedu aktivnog oblika Rac1 GTPazena membrani i njezinog inaktivnog oblika u citoplazmiposredovano vezanjem proteina GAP. Vezanje Rac1 namembranu i njegova posljedicna aktivacija GEF prote-inom svedena je na jedan korak. Uz intrinzicnu stopuvezanja za membranu, u model je ukljucen i clan kojise odnosi na pozitivnu povratnu spregu, koja lokalnopojacava aktivaciju i vezanje Rac1 proteina. Pokazano jekako u stanicama kvasca Saccharomyces cerevisiae GT-Paza Cdc42, njezin GEF i efektor Bem1 zajedno djelujukako bi lokalno pojacali aktivaciju i akumulaciju Cdc42proteina [2]. Proces inaktivacije Rac1 GTPaze putemGAPa i njezino vracanje u citoplazmu, posredovano GDIproteinima, takoder su spojeni u jedan korak. Drugidio modela opisuje interakcije Rac1 molekula s efekto-rom DGAP1. U modelu postoje dva nacina razgradnjeRac1-DGAP1 kompleksa. U prvom se slucaju, nakonraspadanja, aktivni Rac1 ponovno veze za membranu,dok se DGAP1 vraca u citoplazmu. U drugom slucajuoba proteina vracaju se u citoplazmu. U model smotakoder ukljucili kooperativno vezanje DGAP1 proteinana mjesta na membrani gdje je koncentracija aktivnogRac1 vec povecana. Ovaj clan pomaze u kontroliranjufaznog odnosa izmedu valova Rac1 i DGAP1 proteinana membrani. Model prikazan na slici 1 sastoji se odsljedecih 7 jednadzbi:

∂

∂tRD = dR∆RD + k3Gc−RDMR(k1 + k11RT ) + k51Dc,

(1)

∂

∂tG = dG∆G+ k3Gc − k2RTG, (2)

∂

∂tD = dD∆D−MDD(k6 +k12RT ) + (k5 +k51)Dc, (3)

∂

∂tRT = k5Dc−k2RTG−k4RTDm+RDMR(k1+k11RT ),

(4)

∂

∂tDm = MDD(k6 + k12RT )− k4RTDm, (5)

∂

∂tGc = k2RTG− k3Gc, (6)

∂

∂tDc = k4RTDm − (k5 + k51)Dc, (7)

3

Slika 1. Shematski prikaz interakcija molekula Rac1, GAP i DGAP1. Oznaka Rac1D predstavlja neaktivni, citoplazmatskiRac1GDP , dok Rac1T oznacava aktivni Rac1GTP na membrani.

s nametnutim periodickim rubnim uvjetima. RD, G iD oznacavaju koncentracije Rac1-GDP, GAP i DGAP1,dok se RT , Dm, Gc te Dc odnose na koncentracije Rac1-GTP, DGAP1, Rac1-GAP kompleksa i Rac1-DGAP1kompleksa na membrani. Za sve je proteine pretpos-tavljeno da difundiraju samo u citoplazmi. Kao sto jevidljivo iz jednadzbi, ukupni broj cestica je ocuvan u vre-menu:

∂

∂t

∫(RD +RT +Gc +Dc)dx = 0 (8)

∂

∂t

∫(Gc +G)dx = 0 (9)

∂

∂t

∫(Dc +Dm +D)dx = 0 (10)

U jednadzbama, MR = (RmaxT − RT ) i MD = (Dmaxm −

Dm) oznacavaju koncentracije slobodnih vezivnih mjestaza Rac1 i DGAP1 na membrani. Za rjesavanje jednadzbiprimijenjene su analiticke i numericke metode kako bi sekvantitativno odredila prostorno-vremenska raspodjelaproteina.

Pocetak pojavljivanja obrazaca moze se prouciti linear-nom analizom stabilnosti. U tom pristupu, na homogenuraspodjelu proteina nametnuta je mala nasumicna per-turbacija. Svaku takvu perturbaciju moguce je razviti,pomocu Fourierove analize, u modove proporcionalne sacos(qx) (Slika 2). Sve dok su amplitude male, svakimod raste ili trne eksponencijalno kao exp(σqt)cos(qx),ovisno o predznaku stope rasta σq (odnosno preciznijenjezinog realnog dijela Re[σq]). Linearnom analizom sta-bilnosti moguce je izracunati stope rasta modova s bilokojim valnim brojem q te tako dobiti disperzijsku re-laciju koja definira pojas nestabilnih modova. Spome-nuti nestabilni modovi mogu otprilike predvidjeti unu-tarstanicne strukture s karakteristicnim valnim dulji-nama 2π

q . Napomenimo kako precizno odredivanje ka-

rakteristicnih prostornih skala obrazaca opcenito zah-tjeva numericko rjesavanje. Linearna analiza stabilnostipredvida jedino karakteristicne skale obrazaca koji po-tjecu iz homogenog stanja i ne bi se trebale mijesati skarakteristicnim skalama daleko od uniformnog stanja(konacnog obrasca). Na srecu, numerickim rjesavanjemoriginalnog sustava nelinearnih jednadzbi modela, poka-zalo se da nestabilni modovi, odredeni analizom stabil-nosti, prezivljavaju i daleko od ravnoteze, s amplitudamausporedivim s pravim stanicnim obrascima. Tako je ipakmoguce ovakvom analizom naseg modela predvidjeti kojise modovi stojnih valova mogu ocekivati. Rezultati nu-merickih simulacija modela usporedene su s eksperimen-talnim rezultatima. Od 42 snimljene stanice izabranesu one koje pokazuju oscilatorno ponasanje. Pronadenoje 9 oscilirajucih obrazaca s dominantnim prvim modomte 7 obrazaca s dominantnim drugim modom. Duljinemembrana izabranih stanica nalaze se unutar intervala29 − 49µm. Koristeci taj interval, u analizi stabilnosti,dok su drugi parametri bili fiksni odredeno je da su uis-tinu samo prvi i drugi mod u Fourierovom razvoju nes-tabilni. Analiza stabilnosti, osim u vec spomenutomkontekstu, korisna je i za pretrazivanje parametarskogprostora u svrhu nalazenja nestabilnosti koje dovode dopojave obrazaca, buduci da je nekoliko puta brza odprovodenja opcenitih numerickih simulacija.

Buduci da je dinamicka polarizacija stanica koju posre-duje Rac1 GTPaza vrlo kompleksna, odlucili smo pronacikarakteristicna svojstva procesa koje je moguce eksperi-mentalno potvrditi. Simulacije modela predvidaju neko-liko glavnih oblika ponasanja stanica: putujuce valove,stojne valove(prvi i drugi mod Fourierovog razvoja), tenjihove kombinacije. Uz to su za odredene vrijednostiparametara dobivena stanja stabilne polarizacije (neho-mogena stacionarna stanja). Stojni valovi su obicno tran-zijentni prilikom formacije stabilnijih putujucih valovaodnosno polarnih distribucija, iako mogu trajati i dese-tak minuta, ovisno o pocetnim uvjetima. Ovi se obrascipoklapaju s tipovima oblika stanica koje su proucavali

4

Slika 2. Svaka nasumicna perturbacija (Crna linija) prostorno uniformnog stanja (siva linija) moze se razviti po Fourierovimmodovima. Linearna analiza stabilnosti daje stope rasta amplituda σq svih modova q, sto je prikazano disperzijskom relaci-jom (plava linija). Nestabilnim modovima (oznacenim crveno) amplituda raste i odreduje obrazac koji nastaje iz nasumicneperturbacije. Preuzeto iz:[8].

Slika 3. (A) Pojava stacionarnih (gore) i putujucih valova (dolje) fluorescentne sonde za aktivni Rac1 u stanicama Dictyosteliumdivljeg tipa tijekom nasumicnog kretanja. Mjerilo iznosi 10µm. (B) Oscilacije kao prijelazni oblik rjesenja. Lijevo: eksperiment.Desno: teorija. Male slike: Autokorelacijska funkcija signala (rjesenja) – pomazu razluciti stacionarne od putujucih valova.(C) Monopolarne stanice. Lijevo: eksperiment. Desno: teorija. (D) Bipolarne stanice. Lijevo Eksperiment. Desno Teorija

Maeda i suradnici. Oni su otkrili kako stanice Dictyoste-lium u vegetativnom i agregirajucem stanju, bez vanjskihpodrazaja, obicno poprimaju tri razlicita obrasca: rota-cije, oscilacije i elongacije [11]. Kako je aktivni Rac1odgovoran za promjene stanja aktinskog citoskeleta koji

odreduje oblik, mozemo ocekivati pojavu slicnih obra-zaca u njegovoj koncentraciji. Napomenimo kako elon-gacija podrazumijeva stanja s jednim ili dva podrucjapovisene koncentracije Rac1 proteina na membrani, stonazivamo monopolarnim odnosno bipolarnim stanjima.

5

Slika 4. (A) Eksperimentalno izmjereni membranski intenziteti fluorescentnih proba za aktivni Rac1 (lijevo) i DGAP1 (sredina)prikazani u obliku kimografa. Desno: vremenska evolucija intenziteta fluorescencije na fiksnom polozaju na membrani. (B)Prikaz koncentracije aktivnog proteina Rac1 te ukupne koncentracije proteina DGAP1 (u samostalnom obliku i u kompleksu),dobivenih numerickim rjesavanjem jednadzbi modela.

Proucavanjem snimke kretanja stanica nadeni su i takviobrasci. Na slici 3 prikazana je usporedba eksperimen-talnih rezultata i simulacija modela.

Proucavanjem vremenske evolucije koncentracije pro-teina Rac1 i DGAP1 utvrdena je karakteristicna razlikau fazi izmedu Rac1 te sume koncentracija Rac1-DGAP1kompleksa i DGAP1. Ovdje u obzir moramo uzeti sumuspomenutih proteina buduci da DGAP1 proba u eks-perimentima ne moze razluciti izmedu DGAP1 i kom-pleksa Rac1-DGAP1. Ako prostorno-vremenska distri-bucija odgovara putujucim odnosno stojnim valovima,variranjem parametara modela odredeno je da Rac1 valprestize DGAP1 val za otprilike 1.5 − 3rad. Ovaj se re-zultat slaze s vec prije spomenutim radovima u kojimaje otkriveno kako se aktivni oblik Rac1 proteina loka-lizira na vodecem kraju, dok je DGAP1 ogranicen nastraznji kraj stanice. U sljedecem je koraku snimljeno 10stanica divljeg tipa s fluorescentno obiljezenim aktivnimoblicima Rac1 i DGAP1, a cija je distribucija odgovaralastojnim odnosno putujucim valovima. Rezultati ukazujukako se ove dvije distribucije zapravo djelomicno prekla-paju s faznom razlikom φ = 2.4 ± 0.4rad i nisu lokali-zirane na medusobno iskljucivim dijelovima membrane,sto je u skladu s predvidanjima naseg modela. Primjerodnosa putujucih valova Rac1 i DGAP1 proteina prika-zan je na slici 4. U sljedecem smo koraku proucili raz-liku u fazi izmedu povisenih koncentracija spomenutihproteina koristeci parametre modela koji daju monopo-larna odnosno bipolarna stanja. Ocekivali smo slicne re-

zultate kao u slucaju putujucih i stojnih valova, buducida je opcenito prihvaceno kako se te dvije populacije lo-kaliziraju na suprotnim krajevima stanice. Ispostavilose, medutim, kako su maksimumi njihovih koncentracijau fazi odnosno da se preklapaju. Proucavanjem snim-ljenih stanica ispostavilo se da se distribucije Rac1 iDGAP1 zaista preklapaju ukoliko je stanica u monopo-larnom odnosno bipolarnom stanju(slika 5A). Primjecenoje kako model reproducira polarizirana stanja ako je brojDGAP1 molekula iznad odredenog praga. S druge straneformacija stojnih i putujucih valova u koncentraciji Rac1GTPaze ne zahtjeva prisutnost DGAP1 efektora (slika5B).

DISKUSIJA

Nasi rezultati upucuju na to da deterministicka reak-cijsko difuzijska dinamika uvjetuje raspodjelu Rac1 GT-Paze u stanicama amebe Dictyostelium discoideum. Mo-del predstavljen u ovom seminaru primjer je reakcijsko-difuzijskog sustava s ocuvanom masom koji moze stvo-riti obrasce u koncentracijama. U prijasnjim je rado-vima vec ponudeno nekoliko slicnih modela. Na primjerKlunder i suradnici osmislili su model polarizacije sta-nice kvasca, koji se temelji na slicnim pretpostavkamakao i nas [10]. Bitna razlika ova dva modela je ta stou njihovom modelu glavnu ulogu u procesu polarizacijeigra Cdc42. Taj protein porodice Rho je prisutan i u

6

Slika 5. (A) Kolokalizacija proba za Rac1 i DGAP1 tijekom usmjerenog gibanja. (B) Kvalitativna ovisnost rjesenja mate-matickog modela o bifurkacijskim parametrima NRac1 i NDGAP1. Polarna stanja, odnosno neuniformna stacionarna stanjapojavljuju se kao rjesenja modela tek prelaskom praga ukupnog broja DGAP1 molekula.

drugim eukariotskim stanicama, no nema ga u amebiDictyostelium gdje njegovu ulogu igra Rac1. Nas mo-del kao kljucni dio sadrzi interakciju GTPaze s njezi-nim efektorom. Ponudeni su i modeli stanicnog kreta-nja za amebe Dictyostelium s naglaskom na kemotaksiji[3], zasnovani na aktivator-inhibitor pristupu spomenu-tom u uvodu. Ti modeli ukljucuju i interakcije s fo-sfolipidima na membrani, dok je nas fokusiran na inte-rakciju izmedu proteina. Iako spomenuti modeli mogureproducirati odredene oblike kretanja vegetativnih sta-nica, njihova je glavna mana sto varijable nisu vezane za

specificne proteine. Nas je pristup zasnovan na eksperi-mentalnim radovima koji su pokazali da je kljucna kom-ponenta signalnog puta koji promatramo protein Rac1 injegova interakcija s efektorom DGAP1 [7].

Ponudeni model uspjesno reproducira primijecenu lo-kalizaciju aktivnog Rac1 na prednjem i DGAP1 proteinana straznjem kraju stanice, uz neke nove spoznaje. Naj-prije je pokazano kako simulacije i eksperimentalni rezul-tati upucuju da te dvije populacije nisu lokalizirane namedusobno iskljucivim podrucjima, vec se mogu doneklepreklapati, ovisno o parametrima i pocetnim uvjetima.

7

Taj je zakljucak potkrijepljen snimljenim monopolarnimi bipolarnim stanjima stanica. Ponudeni model predvidakako su monopolarna i bipolarna stanja uvjetovana pra-gom kolicine DGAP1 proteina u stanici. To povlaci dastanice s potisnutim DGAP1 efektorom ne mogu formi-rati takva stanja, sto planiramo istraziti u buducnostiproucavanjem mutanata. Model opisan u ovom radupredstavlja prvi takve vrste za amebu Dictyostelium dis-coideum i moze ponuditi nekoliko razlicitih obrazaca pri-mijecenih u eksperimentima. Jedno od mogucih po-boljsanja modela je ukljucivanje stohastickih procesa kojibi mogli obogatiti dinamiku simulacija takvih sustava.

METODE

Kulture stanica, mikroskopija i obrada slika

Za odredivanje dinamike i lokalizacije aktivnog Rac1proteina, u eksperimentima su koristene stanice divljegtipa AX2 soja koje su proizvodile fluorescentno obiljezenusondu koja se veze specificno za aktivnu formu GTPazeRac1. Nadalje, za promatranje odnosa distribucija ak-tivnog Rac1 i DGAP1 na membrani koristene su sta-nice AX2 s izrazenom fluorescentnom probom za ak-tivni oblik Rac1 kao i fluorescentno obiljezenim prote-inom DGAP1. Fluorescencijska konfokalna mikroskopijazivih stanica Dictyostelium discoideum provedena je namikroskopu Leica TCS SP8 X (Leica Microsystems) natemperaturi 22◦, u malim posudicama na staklenoj pod-lozi. Stanice su dva puta isprane u fosfatnom puferu 30minuta prije snimanja. Valne duljine za pobudivanje i de-tekciju bile su: 514nm i 525−565nm za DYFP te 574nmi 605− 670nm za mRFPmars. Kvantitativna analiza flu-orescentnih signala napravljena je u programu ImageJ[15] s modulom QuimP [4].

Numericke simulacije

Sve numericke simulacije napravljene su uMATLABu[18]. Prostorna domena podijeljena je

na 50 tocaka. Za procjenu prostornih derivacija jekoristena je metoda konacnih razlika, koja je efektivnosvela problem na set 50 obicnih diferencijalnih jednadzbi.Te su jednadzbe rijesene pomocu MATLABa koristecifunkciju ode15s. Autor kodova je Marko Sostar.

Analiza korelacije

Kako bismo mogli bolje razluciti pojavu obrazacafluorescentnih proba koristena je autokorelacijska funk-cija, dok je za odredivanje fazne razlike izmedu signalaizracunata 2D krizna korelacija fluorescentnih intenzi-teta Rac1 i DGAP1. Autokorelacijska funkcija intenzi-teta Rac1 signala IRac1(x, t) i krizna korelacijska funk-cija izmedu IRac1(x, t) te IDGAP1(x, t) definirane su nasljedeci nacin:

CIRac1,IRac1(∆x,∆t) =

〈IRac1(x+ ∆x, t+ ∆t·IRac1(x, t))〉x,t〈IRac1

2(x, t)〉x,t

,

(11)

CIRac1,IDGAP1(∆x,∆t) =

〈IRac1(x+ ∆x, t+ ∆t·IDGAP1(x, t))〉x,t√〈IRac1

2(x, t)〉x,t·〈IDGAP1

2(x, t)〉x,t

.

(12)

ZAHVALE

Htio bih zahvaliti prof. dr. Igoru Weberu na njegovommentorstvu i pomoci, kao i njegovom doktorandu MarkuSostaru koji me uveo u ovo podrucje i uvelike mi pomogaos izradom seminara.

[1] A. Bretscher. Microfilament structure and function inthe cortical cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology,7(1):337–374, 1991.

[2] A. Butty, N. Perrinjaquet, A. Petit, M. Jaquenoud, J. E.Segall, K. Hofmann, C. Zwahlen, and M. Peter. A posi-tive feedback loop stabilizes the guanine-nucleotide exc-hange factor cdc24 at sites of polarization. The EMBOJournal, 21(7):1565–1576, 2002.

[3] P. N. Devreotes, S. Bhattacharya, M. Edwards, P. A.Iglesias, T. Lampert, and Y. Miao. Excitable signal tran-sduction networks in directed cell migration. Annual Re-view of Cell and Developmental Biology, 33(1):103–125,2017.

[4] D. Dormann, T. Libotte, C. J. Weijer, and T. Bretsch-neider. Simultaneous quantification of cell motility andprotein-membrane-association using active contours. CellMotility, 52(4):221–230, 2002.

[5] Rivero F. and H. Xiong. Chapter two - rho signalingin dictyostelium discoideum. In Kwang W. Jeon, editor,International Review of Cell and Molecular Biology, vo-lume 322 of International Review of Cell and MolecularBiology, pages 61 – 181. Academic Press, 2016.

[6] V. Filic, J. Marinovic, M.and Faix, and I. Weber. A dualrole for rac1 gtpases in the regulation of cell motility.Journal of Cell Science, 125(2):387–398, 2012.

8

[7] V. Filic, M. Marinovic, J. Faix, and I. Weber. The iqgap-related protein dgap1 mediates signaling to the actincytoskeleton as an effector and a sequestrator of rac1 gt-pases. Cellular and Molecular Life Sciences, 71(15):2775–2785, 2014.

[8] J. Halatek, F. Brauns, and E. Frey. Self-organizationprinciples of intracellular pattern formation. Philosophi-cal Transactions of the Royal Society B: Biological Sci-ences, 373(1747):20170107, 2018.

[9] C. Huang, C. Tang, M.and Shi, P. A. Iglesias, and P. N.Devreotes. An excitable signal integrator couples to anidling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Na-ture Cell Biology, 15(1):1307, 2013.

[10] B. Klunder, T. Freisinger, R. Wedlich-Soldner, andE. Frey. Gdi-mediated cell polarization in yeast providesprecise spatial and temporal control of cdc42 signaling.PLOS Computational Biology, 9(12):1–12, 12 2013.

[11] Y. T. Maeda, J. Inose, M. Y. Matsuo, S. Iwaya, andM. Sano. Ordered patterns of cell shape and orientationalcorrelation during spontaneous cell migration. PLOSONE, 3(11):1–14, 11 2008.

[12] M. Marinovic. Dinamika GTPaza Rac1 i njihova ulogau regulaciji polarnosti stanica Dictyostelium discoideum.PhD thesis, Bioloiski odsjek Prirodoslovno-matematiickifakultet Sveuiciliiste u Zagrebu, Rooseveltov trg 6. 10000

Zagreb, 2015.[13] Y. Miao, S. Bhattacharya, M. Edwards, H. Cai, T. Inoue,

P. A. Iglesias, and P. N. Devreotes. Altering the thresholdof an excitable signal transduction network changes cellmigratory modes. Nature Cell Biology, 19(1):329, 2017.

[14] P. Rangamani, A. Lipshtat, E. U. Azeloglu, R. C. Calizo,M. Hu, S. Ghassemi, J. Hone, S. Scarlata, S. R. Neves,and R. Iyengar. Decoding information in cell shape. Cell,154(6):1356 – 1369, 2013.

[15] Johannes Schindelin, Ignacio Arganda-Carreras, ErwinFrise, Verena Kaynig, Mark Longair, Tobias Pietzsch,Stephan Preibisch, Curtis Rueden, Stephan Saalfeld, Be-njamin Schmid, Jean-Yves Tinevez, Daniel James White,Volker Hartenstein, Kevin Eliceiri, Pavel Tomancak,and Albert Cardona. Fiji: an open-source platformfor biological-image analysis. Nature Methods, 9(1):676,2012.

[16] C. Shi, C. Huang, P. N. Devreotes, and P. A. Iglesias.Interaction of motility, directional sensing, and polaritymodules recreates the behaviors of chemotaxing cells.PLOS Computational Biology, 9(7):1–17, 07 2013.

[17] A. M. Turing. The chemical basis of morphogenesis. Bul-letin of Mathematical Biology, 52(1):153–197, Jan 1990.

[18] The MathWorks Natick MA USA. Matlab, r2017b(9.3.0.713579), 2017.