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Outil PCR et surveillance de laOutil PCR et surveillance de la
résistances des pathogènesrésistances des pathogènes
responsablesresponsables
de maladies infectieuses SIMRde maladies infectieuses SIMR
Pr DossoPr Dosso
IntroductionIntroduction
Détection et/ ou Quantification acidesDétection et/ ou Quantification acidesnucléiques joue un rôle majeur dans denucléiques joue un rôle majeur dans de
nombreux domaines de la biolo ienombreux domaines de la biolo ie
Intérêt de la biologie moléculaireIntérêt de la biologie moléculaireen infectiologieen infectiologie
Détection d’agent pathogèneDétection d’agent pathogène
’’
ypage agen pa og neypage agen pa og ne
Evaluation de la charge viraleEvaluation de la charge virale
EpidémiologieEpidémiologie
Agents pathogènesAgents pathogènes
H elminthes Ascaris lumbricoides AD N + ARN
Protozoaires Plasmodium falciparum ADN + ARN
amp gnons sperg us um ga us +
Escherichia coli ADN + ARNBactériesChlamydia pneumoniae ADN + ARN
Herpès simplex AD NVirus
Haemophilus influenzae ARN
Techniques moléculaires et biologieTechniques moléculaires et biologie
Diagnostic des maladiesDiagnostic des maladies
– – Infectieuses , Cancers, Génétique… Infectieuses , Cancers, Génétique…
Facteurs de virulence:Facteurs de virulence: Toxine, Enzymes, Capsule…Toxine, Enzymes, Capsule…
Résistances :Résistances :
Antibioti uesAntibioti ues
AntivirauxAntiviraux
AntiparasitaireAntiparasitaire
Diversité génétiqueDiversité génétique
– – Tracabilité des épidémiesTracabilité des épidémies – – RéinfectionRéinfection
– – CoinfectionCoinfection
– – RechuteRechute
Techniques moléculaires et biologie (2)Techniques moléculaires et biologie (2)
Détermination de la charge virale:Détermination de la charge virale:
Suivi des thérapeutiques et appréciation de laSuivi des thérapeutiques et appréciation de la
gravitégravité
– – VIH (efficacité du traitement)VIH (efficacité du traitement)
– – VHC (pronostic de réponse au traitement)VHC (pronostic de réponse au traitement)
– – Virus herpétiques (détection de réactivation)Virus herpétiques (détection de réactivation)
Diagnostic anténataux : Biologie prédictiveDiagnostic anténataux : Biologie prédictive
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Liste révisée des maladies prioritaires, des affections et des évènements
Maladies à potentiel épidémique, affections et évènements recommandés par le RSI
1.Choléra
2.Dysenterie
3.Rougeole
4.Méningite
5.Peste
6.Fièvres hémorragiques virales (Ebola, Marburg, fièvre de la
vallée du Rift…)
7.Grippe humaine due à un nouveau sous type
1.Fièvre jaune
2.SRAS
3.Variole
4.Dengue
5.Trachome
6.Chikungunya
7.Anthrax
8.Fièvre Typhoïde
9.Hépatite-B
Maladies à Eradiquer et à Eliminer
. o iomyéi te
2.Dracunculose
3.Lèpre
1.Tétanos néonatal
2.Noma
Autres Maladies d’Importance en Santé Publique
1.Diarrhée chez les enfants de moins de 5 ans
2.Pneumonie chez les enfants de moins de 5 ans
3.VIH/SIDA
4.Paludisme
5.Onchocercose
6.Infections sexuellement transmissible (IST)
7.Trypanosomiase
1.Tuberculose
2.Filarioses
3.Ulcère de Buruli
4.Asthme
5.Diabète sucré
6.Epilepsie
7.Hypertension artérielle
8.Drépanocytose
9.Malnutrition
10.Cancers
11.Rage
12.Schistosomiase
INTERET DE L’UTILISATION DE LA PCR MULTIPLEX DANSINTERET DE L’UTILISATION DE LA PCR MULTIPLEX DANSLE DIAGNOSTIC DE LA VIRULENCE DESLE DIAGNOSTIC DE LA VIRULENCE DES
ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BETALACTAMASESENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BETALACTAMASESA SPECTRE ETENDU (B.L.S.E).A SPECTRE ETENDU (B.L.S.E).
COULIBALY N.COULIBALY N.abab,, EKAZAEKAZAaa, W. LOUBIENGA, W. LOUBIENGAbb, GUESSENND, GUESSENNDbb, DOSSO., DOSSO.abab
INTRODUCTION
Variabilité profil biochimique Problèmes identification classique
Utilisation autres méthodes de caractérisation des micro-organismes :
Bactéries résistantes et virulentes = Problème de santé publique
es marqueurs mo cu a res
Génome = succession de gènes nécessaires pour multiplication et adaptation
Gènes spécifiques Utilisation comme empreintes génétiques
Identification, caractérisation des micro-organismes
Marqueurs moléculaires = gène, groupe de gènes ou séquences spécifiqu
Détection et caractérisation d’organisme (empreinte génétique)
Prédiction d’activité chez l’hôte (pathogénèse, virulence)
Nature marqueurs moléculaires = facteurs de virulence, gènes de régulatio
sé uences d’insertion sé uences ré été
LES FACTEURS DE VIRULENCE
Eléments microbien qui participent à leur capacité à infecter et à
provoquer une maladie chez une espèce donnée.
Exemple:facteur K des E.coli sur les pili…
,
ObjectifObjectif
Caractériser chez des souches productrice de bêta-lactamases
à spectre étendu (BLSE), des facteurs de virulence
(facteurs favorisant la résistance)
Méthodologie:Echantillons:
28 Souches E. coli BLSE
23 Souches K. pneumoniae BLSE
Extraction d’ADN plasmidiqueUtilisation de la technique d’amplification in-vitro: PCR multiplex (+s cibles
Extraction d’ADN par Choc Thermique’
Gènes cibles = facteurs de virulencesta (Heat-stable toxine) = souches entérotoxinogènesLT (Heat-labile toxine) = souches entérotoxinogènesipaH = souches entéroinvasives
sa on amorces sp c ques es ac eurs e v ruence c esAmplification spécifique in-vitro et révélation sur gel d’agarose.
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18 19 20 21 22 23 24 25 M 26 28 (+)
1 2 3 4 5 6 7 9 M 10 11 12 13 14 15
27
16 17
(-)
424 pbipaH
8
Résultats (1)
424 pb218 pb
RésultatsRésultats (2)(2)
Présence de plasmide :Présence de plasmide :
10 souches10 souches K. pneumoniaeK. pneumoniae (origine résistance?)(origine résistance?)
00 souches00 souches E. coli E. coli
Facteurs de virulenceFacteurs de virulence
Souches entérotoxinogènesSouches entérotoxinogènes
15 % (15 % (stasta))
00 (00 (LT LT ))
Souches entéroinvasivesSouches entéroinvasives51 % (51 % (ipaipaH,H, E. coli E. coli +++)+++)
Tuberculose :Tuberculose :Méthodes de diagnosticMéthodes de diagnostic
Méthodes phénotypiquesMéthodes phénotypiques
– – Microscopie: examen de baseMicroscopie: examen de base
– – Culture et identification d’espèceCulture et identification d’espèce
– – MycobiogrammeMycobiogramme
Méthodes génotypiquesMéthodes génotypiques
– – Génotypage des souches :Génotypage des souches : gènegène rpoB, cat G…rpoB, cat G…
Méthodes génétiquesMéthodes génétiques : études des gènes: études des gènes
INTERET DE LA PCR COMME OUTIL DEINTERET DE LA PCR COMME OUTIL DE
DETECTION DES ENTEROCOQUES RESISTANTSDETECTION DES ENTEROCOQUES RESISTANTS
A LA VANCOMYCINE (VRE)A LA VANCOMYCINE (VRE)
EN SITUATION DE COLONISATION DANS LES SERVICESEN SITUATION DE COLONISATION DANS LES SERVICES
DE REANIMATION DES CHU D’ABIDJANDE REANIMATION DES CHU D’ABIDJAN
IntroductionIntroductionENTEROCOQUESENTEROCOQUES = Bactéries ubiquistes= Bactéries ubiquistes(intestin/homme, animaux, environnement)(intestin/homme, animaux, environnement)
BACTERIES PATHOGENES OPPORTUNISTESBACTERIES PATHOGENES OPPORTUNISTES
·· Infection graves / septicémie, endocardite,Infection graves / septicémie, endocardite,
·· Surinfection plaies chirurgicalesSurinfection plaies chirurgicales
·· Infections nosocomialesInfections nosocomiales ++++++ ( resp 10% Inf.( resp 10% Inf.urinaires nosocomiales)urinaires nosocomiales)
ENTEROCOCCUS FAECALIS ENTEROCOCCUS FAECALIS ++++++
(85(85--90%)90%)AUTRESAUTRES:: E.faecium, avium, duransE.faecium, avium, durans ……
Introduction (2)Introduction (2)
VREVRE = Entérocoques portant des gènes de= Entérocoques portant des gènes derésistance à la vancomycine (van)résistance à la vancomycine (van)
6 Types6 Types
Acquis:Acquis: VanVan A, B, D, E, GA, B, D, E, G
Intrinsèques:Intrinsèques: VanVan CC ((E. gallinarum,E. gallinarum,
casseliflavus, flavescenscasseliflavus, flavescens))
Gènes mobilesGènes mobiles portés par des plasmides ou deportés par des plasmides ou detransposons transfert de la résistancetransposons transfert de la résistanceà d’autres espèces (à d’autres espèces (S. aureusS. aureus))
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OBJECTIFSOBJECTIFS
Déterminer le génotype des souches deDéterminer le génotype des souches de
colonisation digestive de VRE isoléescolonisation digestive de VRE isolées
c ez es pa en s osp a s s ans esc ez es pa en s osp a s s ans es
services de réanimation des 3 CHUservices de réanimation des 3 CHUd’Abidjand’Abidjan
MATERIELMATERIEL
TYPE D’ETUDETYPE D’ETUDE
Etude expérimentale: Septembre 2004Etude expérimentale: Septembre 2004
ECHANTILLONSECHANTILLONS
11 Souches d’11 Souches d’Enterococcus faecalisEnterococcus faecalis VRE isolées en 2002VRE isolées en 2002
-- Ecouvillonnage rectal de patients hospitalisés dans lesEcouvillonnage rectal de patients hospitalisés dans les
services de réanimation des CHU de Cocody,services de réanimation des CHU de Cocody,
Yopougon et TreichvilleYopougon et Treichville
-- Méthodes bactériologiquesMéthodes bactériologiques
conventionnellesconventionnelles
-- Résistantes à la vancomycine à l’ATBRésistantes à la vancomycine à l’ATB
-- CMI > 256 µg/ml par la méthode des E testCMI > 256 µg/ml par la méthode des E test
METHODESMETHODES
PCR MULTIPLEXPCR MULTIPLEX Typage / IdentificationTypage / Identification
Extraction d’ADNExtraction d’ADNMéthode physique: Choc thermiqueMéthode physique: Choc thermique
Amplification génique: Type PCR multiplexAmplification génique: Type PCR multiplex
Amorces spécifiques / SéquencesAmorces spécifiques / SéquencesE. faecalisE. faecalis
55’’--ATCATC AAGAAG TACTAC AGTAGT TAGTAG TCTTCT--33’’
55’’--ACGACG ATTATT CAACAA AGCAGC TAATAA CTGCTG--33’’
E. faeciumE. faecium
5’5’--TCG AAT GTG CTA CAA TCTCG AAT GTG CTA CAA TC--3’3’
5’5’--TAG AGA CAT TGA ATA TGC CTAG AGA CAT TGA ATA TGC C--3’3’
RESULTATSRESULTATS
11 souches11 souches déclarées VRE à l’antibiogrammedéclarées VRE à l’antibiogramme
GENESGENESVanVan A = 0/11A = 0/11VanVan B = 0/11B = 0/11
VanVan D = 0/11D = 0/11
ESPECESESPECESE. faecalisE. faecalis = 10/11,= 10/11, E. faeciumE. faecium = 0/11= 0/11
DISCUSSIONDISCUSSION
LL’’analyse des produits danalyse des produits d’’amplification namplification n’’aa
permis de dpermis de déétecter tecter aucun des gaucun des gèènesnes
E.E. faecalisfaecalis ontont ééttéé confirmconfirmééeses..
Les gènesLes gènes VanVan G et E n’ont pas étéG et E n’ont pas été
recherchésrecherchés
Cas des techniques
PCR en temps réel
Maladies virales
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ConclusionsConclusionsL’utilisation en routine des marqueurs moléculaires est d’ungrand intérêt en région tropicale où sévissent de nombreusesmaladies infectieuses causées par les micro-organismes :
Diagnostic de virulence (PCR multiplex)
Recherche de réservoir environnemental
Acquisition de nouvelles propriétés
Contribution à la traçabilité microbiologique dans les écosystèm
Compréhension de la virulence bactérienne dans les écosystèm