Øvelsesvejledning kromosom 16 (pdf)

1

Kromosom 16 PV92 PCR Kit

Oversat af Birgit Sandermann Justesen

Revideret februar 2010

Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks kassen og læg de pågældende dele til opbevaring

ved den anbefalede temperatur.

www.biorad.com

Kopiering kun tilladt ved brug i undervisningen

Biotechnology Explorer™

Chromosome 16:PV92 PCR Informatics Kit

Catalog #166-2100EDU

explorer.bio-rad.com

Note: Kit contains temperature-sensitivereagents. Open immediately upon arrivaland store components at –20°C or at 4°C

as indicated.

For technical service, call your local Bio-Rad office or, in the U.S. call 1-800-4BIORAD (1-800-424-6723)

Duplication of any part of this document is permitted for classroom use only.

Please visit explorer.bio-rad.com to access our selection of language translations for Biotechnology Explorer kit curricula.

2

Tjekliste I nedenstående liste findes en oversigt over de dele, der følger med kittet. Desuden findes en oversigt over det udstyr, der er nødvendigt for at gennemføre forsøget. Tjek venligst udstyrslisten før forsøget udføres. Kittets indhold: Dele, der skal opbevares ved -20 oC (temperaturfølsomme komponenter) PV92 homozygot (+/+) kontrol 100 µL 1 glas PV92 homozygot (-/-) kontrol 100 µL 1 glas PV92 heterozygot (+/-) kontrol, 100 µL 1 glas PCR mastermix 2x, 1,2mL 1 glas Forward og revers primermix, 50x, 25 µL 1 glas EZ LoadTM molekyle masse lineal (DNA standard) 100 µL 1 glas Dele, der skal opbevares i køleskab (4 oC) 50x TAE buffer, 100 mL 1 Agarosepulver, 5g 1 Fast BlastTM DNA farve, 500x, 100mL 1 flaske InstaGeneTM matrix, 20mL 1 flaske PV92 XC markørfarve (loading dye), 5x, 1mL 1 glas Dele, der skal opbevares ved stuetemperatur PCR-rør 50 Skruelågsmikrocentrifugerør, 1,5mL 50 Mikrocentrifugerør – uden låg, 1,5mL 50 PCR-rør med låg, 0,5 mL 60 Skum-holdere til mikrocentrifugerørene 16 Bakker til gelfarvning 4 Manual på engelsk 1 Nødvendigt tilbehør/udstyr, som ikke er indeholdt i selve kittet Til eleverne: Mikropipetter 2-20 µL Spidser til mikropipetter Elektroforeseapparat – vandret Strømforsyning Bakker med knust is Tuscher til at mærke med Affaldsbeholdere Bægre med 10 mL 0,9 % NaCl-opløsning Pincetter Sakse Fællesudstyr i laboratoriet Mikropipetter 0-20 µL, 20-200 µL og 100-1000 µL Pipettespidser til ovennævnte Termocykler eller 3 vandbade til manuel styring

3

Mikrobølgeovn Vandbad 56o Vandbad 100o Protease (til forsøget med hårfolliklen), 1,3 mL 0,9% saltvand 500mL Destilleret eller demineraliseret vand 500 mL 1000 mL erlenmeyerkolbe eller BlueCap flaske til agarosefremstilling 1 Tape Mikrocentrifuge Udstyr det vil være rart at have Rystebord/vippebord Vortexer (reagensglasmikser) Bemærk: Det er vigtigt, at de forskellige dele opbevares ved den angivne temperatur (se de enkelte kemikalier!). Der kan rekvireres refill til kittet. Hvis man vælger hårfollikel-forsøget skal der rekvireres protease separat. I den medfølgende manual såvel som i adskillige lærebøger kan man læse om PCR-teknikken. Her vil kun dele af teorien blive taget med, hvorfor der henvises til manualen og andre kilder.

5

Lidt om PCR PCR teknikken blev udviklet i 1983 af Kary Mullis ved Cetus Corporation. PCR, der betyder polymerase chain reaction, har virkelig sat skub i molekylærbiologien som et videnskabeligt redskab. Inden man opfandt PCR-teknikken var det ofte svært at få materiale nok, når man arbejdede med DNA. PCR-teknikken har især haft betydning inden for de fire områder: Genkortlægning, kloning, DNA-sekventering og DNAanalyser. I dag bruges PCR som et medicinsk diagnostisk redskab, bl.a. ved undersøgelser af specifikke mutationer, som kan være årsag til genetiske sygdomme, ved kriminelle retsgenetiske sager og ved analyser af det humane genom. PCR og bioteknologi – hvad er det? Og hvorfor har metoden revolutioneret et helt videnskabeligt område? Ved PCR-teknikken kan man producere en særlig stor mængde af et specifikt DNA, blot man har en lille smule udgangsmateriale, en ”skabelon”. Udgangsmaterialet kan være alle former for dobbeltstrenget DNA. Selv små mængder fx en dråbe blod, en enkelt hårfollikel eller en kindcelle er nok til at blive mangedoblet ved hjælp af PCR. Netop det, at man kun behøver så ufattelig små mængder af udgangsmaterialet, har betydet et stort skridt fremad ikke mindst inden for retsgenetikken. I dette kit bruges elevernes/kursisternes egne celler som udgangsmateriale. I sig selv er PCR-teknikken simpel og relativ billig. Alt, hvad der er brug for, er en reaktionsbuffer, de fire baser, DNA-polymerase, to primere og små mængder af det udgangsmateriale, som man ønsker at undersøge. Ud fra dette mangedobles et specifikt segment af DNA’et. I PCR benyttes to principper fra molekylærgenetikken: 1. Hybridisering af komplementære DNA-strenge 2. Syntetisering af DNA-strenge ved hjælp af DNA-polymerase Man udnytter altså det, at to komplementære strenge vil gå sammen. Det DNA, der skal kopieres, udvælges vha. primers. Primers (eller proberne) består af syntetisk fremstillet oligonucleotider (korte DNA-stykker). Proberne sætter sig på de to DNA strenge og afgrænser det DNA-stykke eller segment, der skal mangfoldiggøres. Man siger, at de to DNA strenge fungerer som skabelon for syntesen af en komplementær DNA streng. PCR trin for trin PCR involverer en række gentagne cykler, der hver består af følgende tre trin: Denaturering, primer påsættelse og forlængelse af den påhæftede primer ved hjælp af Taq DNA polymerase. Før selve DNA amplifikationen påbegyndes, tages der prøve af genetisk materiale fra de enkelte elever. Det kan være et hår eller skrab fra indersiden af kinden. Efter at eleverne prøver er gjort klar, blandes skabelon DNA, primers (oligonucleotider), termostabil DNA-polymerase (Taq), de fire baser (T, A, G og C) og reaktionsbuffer i et mikrocentrifugerør. Mikrocentrifugerøret placeres i termocykleren, eller de nødvendige vandbade klargøres. Termocykleren indeholder en aluminiumsblok, hvori prøverne placeres. Denne aluminiumsblok kan lynhurtigt afkøles og opvarmes til meget forskellige temperaturer – dette kaldes termal cykling. I en cyklus opvarmes først til 94 oC, hvorved DNA-strengene vil denaturere eller adskilles. Dette kaldes denatureringstrinnet.

6

Derefter afkøles lynhurtigt til 60 oC, hvorved primeren bindes til de enkelte skabelon-DNA-strenge. Dette kaldes vedhæftningstrinnet. De to oprindelige DNA-strenge vil eventuelt samle sig igen eller konkurrere med primerens komplementære bindingssteder. Der tilsættes i dette forsøg så megen primer, at den originale DNA-streng ”udkonkurreres”. Til sidst opvarmes til 72 oC, hvorved Taq DNA polymerase forlænger de komplementære DNA strenge med start fra primeren, og den endelige færdige kopi af DNA-dobbeltstrengen kan dannes. Dette trin kaldes forlængelsestrinnet. Taq polymerasen arbejder mest effektiv ved 72oC, hvorfor det er vigtigt at ramme præcis denne temperatur. En cyklus = denaturering + vedhæftning + forlængelse De to nye sæt dobbeltstrenget DNA, der er dannet nu, danner dernæst udgangspunkt for næste cyklus og på denne måde mangedobles DNA-strengeantallet efterhånden. Ved 40 cykler dannes over en milliard kopier af det originale DNA stykke.

Fig. 4. A complete cycle of PCR.

Usually, thermal cycling continues for about 40 cycles. After each thermal cycle, the numberof template strands doubles, resulting in an exponential increase in the number of templateDNA strands. After 40 cycles there will be 1.1 x 1012 more copies of the original number of template DNA molecules.

PCR generates DNA of a precise length and sequence. On the first cycle, the two primersanneal to the original genomic template DNA strands at opposite ends and on oppositestrands. After the first complete temperature cycle, two new strands are generated that areshorter than the original template strands but still longer than the length of the DNA that theresearcher wants to amplify. It isn’t until the third thermal cycle that fragments of the preciselength are generated (Figure 5).

8

Denature strands at 94°C

Anneal primers at 60°C(Taq polymerase recognizes 3' endsof primers)

Extend at 72°C(Synthesize new strand)

Repeat cycle 40 times

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

5'5'3'

3'

Primer Taq polymerasePrimer

7

Normalt køres der 40 cykler. Ved hver cyklus fordobles antallet af DNA-strenge. Efter 40 cykler vil der således være 1,1x1012 ekstra kopier af den oprindelige stump DNA. PCR laver DNA med eksakte længder og sekvenser. I den første cyklus vedhæftes de to primere til DNA-udgangsmaterialet i hver sin ende på de to komplementære strenge. Efter den første fuldendte cyklus er der dannet to nye strenge, der er kortere end det oprindelige DNA, men længere end det specifikke DNA-stykke, som man ønsker at mangedoble. Først efter 3. cyklus er man oppe på fuld længde – se figur 5. Når man således har fået den præcise længde på DNA påbegyndes ved de næste cykler den eksponentielle fordobling (Xn, hvor X er antallet af udgangsmaterialet og n er antallet af cykler). Der vil altid være et sæt originalt udgangs-DNA-materiale, som ikke er fuldt kopieret. Dette betyder dog ikke noget, når der køres et tilstrækkeligt antal cykler.

Fig. 5. Generation of precise-length fragments.

It is the template strands of the precise length that are amplified exponentially (Xn, whereX = the number of original template strands and n = the number of cycles). There is alwaysone set of original long-template DNA molecules which is never fully duplicated. After eachthermal cycle, two intermediate-length strands are produced, but because they can only begenerated from the original template strands, the intermediate strands are not exponentiallyamplified. It is the precise-length strands generated from the intermediate strands that amplifyexponentially at each cycle. Therefore, if 20 thermal cycles were conducted from one double-stranded DNA molecule, there would be 1 set of original genomic template DNAstrands, 20 sets of intermediate template strands, and 1,048,576 sets of precise-length template strands. After 40 cycles, there would be 1 set of original genomic template DNAstrands, 40 sets of intermediate template strands, and 1.1 x 1012 sets of precise-length template strands (Figure 6).

9

Total 40 cycles

Extend new strands at 72°C

Anneal primers at 60°C

Denature at 94°C

Extend new strands at 72°C

Anneal primers at 60°C

Denature at 94°C

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'3'

3'

3'

3'

3'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5' 3'

5'

5'

5'

5'

5'5'

5'

5'

5'

5'

Extension step cycle 1

New intermediate templates

Precise length fragments

CYCLE1

CYCLE2

CYCLE3

8

Forslag til undervisningsforløb i forbindelse med PCR: Lektion 1a Isolering af kindceller Forberede udgangsgenom fra kindceller (stop-punkt) Lektion 1b Isolering af hår follikler DNA fra hårfolliklerne (forberedelse af udgangsmateriale) Lektion 2 PCR-amplifikation Start og kørsel af PCR-cykler Støbe agarosegeler Lektion 3 Gelektroforese og farvning af geler Elektroforese af geler Farvning Lektion 4 Analyse af gelerne og fortolkning af resultaterne Diskussion Hardy-Weinberg beregning Lektion 5 Fortolkning af resultaterne – Bioinformatik Analyse af resultaterne vha. PV92 Allel-Serveren (stor database – se den Engelske manual) Lærerens forberedelse: I de næste afsnit beskrives punkt for punkt hvad lærere skal forberede før de enkelte lektioner. De angivne tider er omtrentlige angivelser. Hvornår Aktivitet Tidsforbrug Straks Læs denne vejledning 2 timer Før til lektion 1 Forberedelse af kindskrabceller 30 minutter Gøre elevarbejdspladserne klar Resuspendering og fordeling af Matrix mix Før til lektion 2 Forberede master-mix Blanding og fordeling 1 time Opstilling til kontrol-PCR Klargøring af TAE-bufferen Smelte agarosen Gøre termocykleren eller de nødven- dige vandbade klar Klargøre elevarbejdspladserne Før til lektion 3 Gøre klar til DNA-farvning 20 minutter Klargøre elevarbejdspladserne Før til lektion 4 Klargøre elevarbejdspladserne 10 minutter

9

Før lektion 1: Trin for trin: Nødvendige materialer: Skruelågsmikrocentrifugerør InstaGeneTMmatrix 2-20µL mikropipette 2-200µL mikropipette Spidser Vortexer Mikrocentrifugerør Pincetter (til 1b) Sakse (til1b) Plastikkopper (til 1a) Protease (til 1b) Kindskrab – øvelse 1a

1. Fordeling af InstaGeneTMmatrix (øvelse 1a (kindskrab)) A. Bland InstaGeneTMmatrix grundigt ved at ryste eller bruge vortexeren adskille gange

for at resuspendere matrixen. Det er vigtigt at matrixen er godt blandet, når fordelingen finder sted. Perlerne bundfælder hurtigt ud i opløsningen, hvorfor det er nødvendigt at ryste adskillige gange under fordelingen.

B. Med en pipette overføres 200µL InstaGene matrix til hvert skruelågsmikrocentrifugerør. Der skal være et rør til hver elev/kursist.

2. Blanding og fordeling af saltopløsning A. Lav en 0,9 % saltopløsning. Tag 500 mL postevand og tilsæt 4,5g ikkeiodholdigt salt

(bordsalt). Bland til alt saltet er opløst B. Hver elev skal have en kop med 10mL saltopløsning

Hårfollikel – øvelse 1b: 3. Forbered og fordeling af InstaGene matrix med protease (øvelse1b – hårfollikel)

Lav en opløsning af InstaGene matrix med 66µg/mL protease. Proteasen har koncentrationen på 20mg/mL. For at få en fortynding på 66µg/mL fortyndes proteasen 1:300 med InstaGenematrix. Hvis man vil lave 5 mL af blandingen (hvilket rækker til 20 elever/kursister):

- overfør 5mL InstaGenematrix (husk at ryste det!) til et nyt rør - tilsæt 17µL koncentreret protease til de 5mL

B. Med en pipette overføres 200µL InstaGenematrix til hvert

skruelågsmikrocentrifugerør. Der skal være et rør til hver elev/kursist. Før lektion 2 – PCR-amplifikation Materialer: Mikrocentrifugerør (med hængslet låg) Skruelågsmikrocentrifugerør Mastermix Primermix PV92 homozygot kontrol (+/+) PV92 homozygot kontrol (-/-) PV92 heterozygot kontrol (+/-)

10

12 PCR-rør Elektroforesekar, støbekar og kam Elektroforesebuffer (50x TAE) Agarose Mikropipetter (20µL og 200µL) Mikropipettespidser Isbad For at opnå de bedste resultater, tilrettelægges forsøgsgangen, så elevernes prøver bliver klar 5-30 minutter før PCR-amplifikationen startes. Prøverne tager skade af at stå for længe. Fremgangsmåde: Bemærk: Før rørene med reagenser åbnes centrifugeres de kortvarigt for at sikre at indholdet er i bundet af røret. Det er almindeligt at indholdet under forsendelsen sætter sig op under låget.

1. Klargør mastermix ved at tilsætte primerne. Bemærk: For at opnå det bedste resultat udføres dette punkt først 15-30 minutter før PCR-reaktionen.

A. Med en pipette overføres 1100µL mastermix til et mærket mikrocentrifugerør. Er holdet kun

på 16 elever eller derunder deles mastermixen i 2 gange 550µL i hver sit mikrocentrifugerør. Det ene mikrocentrifugerør bruges straks – det andet kan genfryses til senere brug.

B. Marker et mikrocentrifugerør pr. gruppe og placer rørene på is. C. Tilsæt 22µL primermix til de 1100µL mastermix (eller 11µL til de 550µL, der skal bruges

ved halvering af mængden). Det er meget vigtigt at mastermix og primermix blandes grundigt. Opløsningen bliver gul.

Primeren leveres som en koncentreret gul opløsning i Tris buffer. Eftersom primere er meget mere stabile i koncentreret form end i fortynding, er det meget vigtigt, at denne tilsætning først finder sted lige før PCR-amplifikationen.

D. Fordel 95µL af den færdigblandede mastermix med primer i ét mikrocentrifugerør pr. gruppe. Gem den resterende del af mastermix blandingen til kontrolforsøgene, idet de opbevares på is.

2. Gør klar til PCR-reaktionen. A. Mærk kontrolrørene: +/+, -/- og +/-. Hvis hele kittet skal bruges laves der 4 af hver

kontrolprøve, og tilsvarende laves der 2 kontrolrør af hver, hvis kun halvdelen af kittet skal benyttes. Ubenyttede opløsninger opbevares i fryseren.

B. Tilsæt 20µl af den færdigblandede mastermix med primer til hvert kontrolrør. Husk at skifte pipettespids.

C. Rørene placeres på is, indtil de skal bruges. Kontrolprøverne skal amplificeres samtidig med elev-prøverne.

3. Gelstøbning: Gelerne støbes enten af eleverne eller af læreren. Gelerne kan støbes 1-2 dage i forvejen.

A. Fremstilling af elektroforesebuffer: Bufferen leveres som en 50x koncentreret buffer. Til støbning af gelen, skal der bruges en 1x TAE buffer, ligesom det er en 1x TAE buffer der skal bruges under selve elektroforesen. Fremstil 3L 1x TAE buffer: Tag 60 mL 50x koncentrat og tilsæt 2,94L demineraliseret vand.

B. Fremstilling af 1 % agaroseopløsning:

11

Til 1g agarose tilsættes 100mL 1x TAE buffer. Til 8 geler bruges der ca. 350 mL agaroseblanding. Gelen kan enten fremstilles i en 1L’s erlenmeyerkolbe på en varmeplade, eller gelen kan fremstilles i mikrobølgeovnen. Sørg for at al agarosen er opløst – blandingen skal være helt klar! Bemærk: Varm agaroseopløsning kan let skolde. Brug handsker e.l. til beskyttelse.

Ønsker man ikke selv at støbe gelerne, kan der købes færdigstøbte geler hos BioRad (katalognr. 161-3057EDU). Støbning af geler:

• Forsegl enderne af gel-holderen med tape. Vær sikker på at tapen er tæt og glat. Malertape kan fint benyttes.

• Sørg for at gel-holderen står vandret. • Sæt kammen i ca. 2cm fra den ene ende. • Tag 1 % agaroseopløsningen. • Lad den afkøle til ca. 60oC. • Hæld den varme gel op og lad den størkne i ca. 20 minutter. • Fjern forsigtigt kammen fra gelen ved at vippe den frem og tilbage, mens den løftes lodret

op. • Fjern tapen. • Sæt gel-holderen med gelen i elektroforesekarret.

Manuel PCR Hvis man ikke har en termocykler, gøres der 3 vandbade klar med hhv. 60oC, 72oC og 94oC varmt vand. Man kan derefter lave en manuel PCR. Her er det vigtigt at bruge PCR-rør med skruelåg eller PCR-rør, som er sikrede mod at springe op ved høj temperatur (’boil-proof’) (luk eventuelt rørene med parafilm eller malertape, som ekstra sikring). PCR-rørene duppes med en dråbe mineralsk olie for at undgå fordampning. Tidsskemaet er det samme som for PCR-maskinen. Det kan være slidsomt, men det virker! Lad eventuelt eleverne tage 10 minutter ad gangen, - så føles det ikke så slidsomt. Der køres følgende cykler: Trin 0 Pre-denaturering 94oC 2 minutter Trin 1 Denaturering 94oC 1 minut Trin 2 Vedhæftning af primer 60oC 1 minut Trin 3 Forlængelse 72oC 2 minutter Trin 1-3 gentages 40 gange! Afslutningstrin Endelig forlængelse 72oC 10 minutter

12

Før lektion 3 Elektroforese og farvning af gelerne

1. Forbered de positive kontrolprøver 2. Afpipetter PV92 XC markørfarve 3. Afpipetter DNA standarderne (EZ Load Molecular mass ruler) 4. Klargør DNA-farven 5. Gør elevarbejdspladserne samt fællesmaterialerne klar

Tidsforbrug: ca.40 minutter Materialer: 8 mikrocentrifugerør Mikropipetter 0-20µL og 2-200µL Spidser til mikropipetterne 8 skruelågs-mikrocentrifugerør Demineraliseret eller destilleret vand til at fortynde DNA-farven med 500 mL flaske Evt. gel supportfilm (hvis hurtigfarvningsmetoden benyttes) Forberedelse af kontrolprøverne: Tilsæt 10µL PV92 XC markørfarve (loading dye) til hver af de amplificerede kontrolprøver (+/+, -/-, +/-). Ved elektroforesen sørger man for, at de tre kontrolprøver også kører på hver gel, således at der dermed er referencer, når båndene skal sammenlignes. Afpipettering af DNA-størrelsesstandarder. Afpipetter 11µL DNA-standard (EZ Load molecular mass ruler) til 8 mikrocentrifugerør og mærk disse ”MMR”. Båndstørrelserne på DNA-båndene er 1000bp (basepar), 700bp, 500 bp, 200 bp og 100 bp. Se nedenstående billede:

13

Afpipettering af PV92 XC markørfarve: Mærk 8 skruelågsmikrocentrifugerør ”MF” for ”markørfarve” og afpipetter 50µL til hvert rør. Hver gruppe har et fælles rør med markørfarve. Forberedelse af DNA-farve: Farven leveres som en 500x koncentreret opløsning, som det er nødvendigt at fortynde før brug. Farven kan, såfremt den kun er fortyndet til 100x opløsning (100 mL 500xopløsning fortyndes med 400 mL demineraliseret vand) bruges til hurtig farvning af gelerne. Her kan resultatet ses allerede efter ca. 15 minutter. Alternativt kan man fortynde farven til 1x-opløsning (1mL 500xopløsning fortyndes med 499 mL demineraliseret vand) og lade farveprocessen vare natten over. Når gelen dækkes med farveopløsningen, vil de positivt ladede farvemolekyler binde sig til de negativt ladede fosfatgrupper i de DNA-molekyler, der er bundet i gelen. Dermed bliver DNA-båndene synlige og elevernes båndmønstre kan identificeres og sammenlignes med DNA-standarderne. Den farve, der benyttes er let at arbejde med, ikke giftig og et mere sikkert alternativ end ethidiumbromid, som man traditionelt har arbejdet med. DNA farves dybt blå og efterfølgende kan gelen rimelig nemt gemmes. ADVARSEL Selv om den benyttede farve ikke er giftig eller carcinogent anbefales det, at der bæres handsker for at undgå at blive farvet blå. Tilsvarende er det en fordel at bære kittel, så der ikke kommer blå farve på ens tøj. Skulle der komme farve på tøj eller bordplader e.l., tørres dette let af med sprit. Bemærkninger: Til en gel på 7x10 cm bruges ca. 120mL farveopløsning. Det vigtigste er, at gelen er helt dækket med farveopløsning. Inden farvningen tages gelen ud af elektroforeseapparatet og lægges forsigtigt over i et lille kar. Gelen er meget glat, hvorfor dette punkt skal udføres med forsigtighed, så gelen ikke går i stykker. Ved langsom farvning, hvor gelen står natten over, kan det anbefales at benytte et rystebord, da de mindste bånd har en tendens til at diffundere væk, hvis der ikke rystes. Affarvningen sker med varmt vandhanevand, men kan forbedres med affarvning ca. 5 sekunder med 70 % sprit. Såfremt man benytter den langsomme farvning, er affarvning ikke nødvendig. Før lektion 4 Analyse og fortolkning af resultaterne. Hvis man vil gemme gelerne og dermed skal tørre disse, kan man benyttes Gel supportfilm. Tag et billede af gelen, lav en tegning eller fotokopier gelen. Undgå at udsætte gelen for direkte lys, da det vil afblege båndene.

14

Før lektion 5 Inden dette modul/denne lektion, hvor der skal arbejdes datainformation fra en allel-server database. Det er vigtigt, at læreren har sat sig grundigt ind i dette. Kom godt i gang med på allelserveren: Bemærk: Allelserveren ligger på ’The Dolan DNA Learning Center, som er en webside, der konstant opdateres, hvorfor der kan forekomme ændringer i det følgende.

1. Åbn internettet og gå til www.bioservers.org 2. Find ’Allele Server’ og klik på Register’. Det er gratis at være registreret og det er nemt at

have sin egen profil der. 3. Når du er logget på følges instruktionerne i det vindue , der popper op. 4. Følg instruktionerne nøje. Som registreret bruger kan du gemme alle de grupper du har

registreret i din ’Allele Server’ og analyserer dem efter behov. Det betyder også, at man efterhånden kan få en rimelig stor database at arbejde med, hvis man eksempelvis laver Hardy-Weinberg beregninger.

I øvrigt er der rigtig meget materiale omkring DNA, tests, PCR m.m. at finde på http://www.dnalc.org/ Om at benytte Alu-sekvensen i en Hardy-Weinberg analyse Det område, Alu, der testes for i dette forsøg er et ikke-kodende område. Hvis man vil studere alleler og genotypefrekvenser hos mennesket kan det passende gøres med Alu-sekvensen, idet denne er tilfældigt placeret i PV92-locus på kromosom 16 hos mennesker. Ved at bestemme genotype frekvensen af Alu-sekvensen i klassen kan man beregne allel-frekvensen. Ydermere er det muligt at sammenholde klassen fordeling med en større populations fordeling ved at sammenholde med en allel-database. Alt i alt vil man dermed opnå resultater fra en tilpas stor population til at der kan foretages fornuftige Hardy-Weinberg beregninger. Ydermere kan brugen af allel-databasen fungere som en introduktion til disciplinen ’bioinformatik’. Den allel-database , der benyttes , ligger hos ”Cold Spring Harbor Laboratory’s Dolan DNA Learning Center” og indeholder genotypedata fra befolningsgrupper rundt omkring på kloden. Desuden kan man på websiden finde statistiske redskaber til at analysere resultaterne. Eleverne vil således kunne lave en Chi-i-anden test og dermed sammenligne deres klasses hyppighed og fordeling af Alu-sekvensen med den hyppighed som forventes i forhold til Hardy-Weinberg ligningen.

15

Elevvejledning PCR – PV92 fra Bio-rad Oprensning af DNA fra kindceller (1 lektion) Materialer Skruelågsmikrocentrifugerør InstaGeneTMmatrix 2-20µL mikropipette 2-200µL mikropipette Spidser Vortexer Mikrocentrifugerør Plastikkopper med saltvand Bæger til brugte spidser

1. Mærk et 1,5 mL mikrocentrifugerør med hængslet låg med dine initialer. Mærk derefter et skruelågs- mikrocentrifugerør med InstaGene matrix med dine initialer.

2. Tag en kop med saltvand i. Tag saltvandet i munden og rens munden grundigt i 30 sek. Spyt saltvandet ned i koppen. Saltvandet indeholder nu celler fra kindhulen

3. Overflyt 1 mL af dit saltvand til det første mikrocentrifugerør (med hængslet låg).

4. Centrifuger i 1 minut ved 12000rpm. Tag mikrocentrifugerøret ud af centrifugen. Du skulle nu gerne være i stand til at se et hvidt bundfald på størrelse med et tændstikshoved. Hvis du ikke kan se det hvide bundfald, gentages punkt 3. og 4.

1. Label one 1.5 ml micro test tube with your initials. Label one screwcap tube containing 200 µl of InstaGene matrix with your initials.

2. Obtain a cup containing saline solution fromyour instructor. Pour the saline into your mouthand rinse vigorously for 30 seconds. Expel thesaline back into the cup.

3. Transfer 1 ml of your saline rinse into the microtest tube (NOT the screwcap tube) with your initials. If a P-1000 micropipet is not available,carefully pour ~1 ml of your saline rinse intoyour micro test tube (use the graduations on theside of the micro test tube to estimate 1 ml).

4. Spin your tube in a balanced centrifuge at fullspeed for 2 minutes. When the centrifuge hascompletely stopped, remove your tube. Youshould see a match-head sized pellet of whitishcells at the bottom of the tube. If you don’t seea pellet of this size, decant the saline, refill yourtube with more of your oral rinse, and repeat thespin.

5. After pelleting your cells, pour off the saline.Being careful not to lose your pellet, blot yourtube briefly on a paper towel or tissue. It’s OKfor a small amount of saline (< 50 µl, about thesame size as your pellet) to remain in the bottom of the tube.

6. Resuspend the pellet by vortexing or flicking thetube so that no clumps of cells remain.

7. Using a 2–20 µl adjustable-volume micropipetset to 20 µl, transfer all of your resuspendedcells to the screwcap tube containingInstaGene.

8. Screw the cap tightly on the tube. Shake or vortex to mix the tube contents.

33

Quick Guide Lesson 1 Cheek Cell DNA Template Preparation

Centrifuge









33


Centrifuge









33


Centrifuge









33


Centrifuge

16

5. Fjern supernatanten (det øverste lag) ved forsigtigt at vende bunden i vejret på mikrocentri- fugerøret og lade saltvandet blive suget ud på et stykke køkkenrulle eller ved forsigtigt at suge supernatanten op med en pipette. Pas på at pellet (bundfaldet) ikke kommer med ud. Der må godt være en lille smule (< 50µL) saltvand tilbage i røret.

6. Resuspender pellet i den sidste sjat saltvand

ved at bruge vortexeren eller ved at knipse med fingeren. Der må ikke være klumper i pellet.

7. Overfør 20µL af de resuspenderede celler til skruelågsmikrocentrifugerøret med InstaGene mix.

8. Luk røret tæt. Ryst eller knips på røret for at få indholdet blandet godt.

9. Når alle i gruppen er klar, sættes jeres mikro- centrifugerør i en skumholder i vandbadet. Inkuber ved 56oC i 10 minutter. Efter 5 minutter tages skumholderen op, og der knipses på rørene. Ved denne opvarmning skilles cellerne ad, hvorved lyseringen i næste punkt lettes. Ved 56oC inaktiveres den DNAse,der naturligt er til stede i en cellesuspensio og som ville kunne ødelægge DNA og hæmme PCR-reaktionen.

10. Fjern skumholderen fra det første vandbad. Ryst/knips alle rørene. Overflyt til det 100oC varme vandbad og inkuber i 5 minutter. Ved 100oC ødelægges cellemembranerne og Cellens indhold frigøres inklusiv den DNA, der skal virke som skabelon for PCR-reaktionen









33


Centrifuge









33


Centrifuge









33


Centrifuge

9. When all members of your team have collected their samples, place the tubes in thefoam micro test-tube holder, and incubate at56°C for 10 minutes in a water bath. At thehalfway point (5 minutes), shake or vortex thetubes gently, then place back in the 56°C waterbath for the remaining 5 minutes.

10. Remove the tubes, shake or vortex, and placethe tubes in a boiling water bath (100°C).Incubate at 100°C for 5 minutes.

11. Remove the tubes from the boiling water bathand shake or vortex the contents to resuspend.Pellet the matrix by spinning at 6,000 x g for 5 minutes (or 2,000 x g for 10 minutes) in a centrifuge.

12. Store your screwcap tube in the refrigerator untilthe next laboratory period (or proceed to step 2of Lesson 2).

34

Centrifuge

56°C, 10 min

100°C, 5 min

Water bath

Water bath





34

Centrifuge

56°C, 10 min

100°C, 5 min

Water bath

Water bath

17

11. Tag rørene op af vandbadet. Ryst/knips og centrifuger derefter i 5 minutter ved 6000rpm, for at få pellet til at samle sig i bunden af røret Gå derefter videre til punkt 2 i PCR- amplifikationen. eller

12. Opbevares i køleskab indtil næste punkt. Kan opbevares i op til flere dage i køleskab.

Oprensning af DNA fra hårfolliket(1 lektion) Materialer Skruelågsmikrocentrifugerør InstaGeneTMmatrix 2-20µL mikropipette 2-200µL mikropipette Spidser Vortexer Bøtte til affald Mikrocentrifugerør Pincetter (til 1b) Sakse (til1b) Protease (til 1b)

1. Mærk et skruelågsmikrocentrifugerør indeholdende 200µL InstaGene matrix plus protease med dine initialer.

2.Tag 2 hår fra dig selv. Sørg for at der er hårrod på. Klip håret til så der er ca. 2 cm tilbage af den nederste del af håret. Læg hårene i det mær- kede skruelågsmikrocentrifugerør.





34

Centrifuge

56°C, 10 min

100°C, 5 min

Water bath

Water bath

18

3. Sæt dit skruelågsmikrocentrifugerør i skumholderen og inkuber i vandbadet ved 56oc i 10 minutter. Efter 5 minutter knipse der let til røret, så indholdet blandes.

Ved denne opvarmning skilles cellerne ad, hvorved lyseringen i næste punkt lettes. Ved 56oC inaktiveres den DNAse, der naturligt er til stede i en cellesuspension og som ville kunne ødelægge DNA og hæmme PCR-reaktionen..

4. Tag skumholderen op. Ryst røret forsigtigt og sæt derefter skumholderen over i det 100oC varme vandbad. Inkuber ved 100oC i 5 minutter.

Ved 100oC ødelægges cellemembranerne og cellens indhold frigøres inklusiv den DNA, der skal virke som skabelon for PCR-reaktionen

5. Fjern holderen med rørene fra vandbadet.

Ryst og bland indholdet grundigt. Centrifuger i 5 minutter ved 6000rpm, således at pellet samles i bunden.

Gå derefter videre til punkt 2 i PCR- amplifikationen. eller

6. Opbevares i køleskab indtil næste punkt. Kan opbevares i op til flere i dage i køleskab.

Lesson 1 Hair Follicle DNA Template Preparation (Lab Protocol)1. Each member of your team should have 1 screwcap tube containing 200 µl of InstaGene

matrix plus protease. Label the tube on the cap and side with your initials.

2. Collect 2 hairs from yourself. Choose hairs that leave noticeable sheaths (a coating ofepitheleal cells around the base of the hair). Alternatively, choose hairs that have alarge root. The root is the bulb-shaped base of the hair. Keeping the end of the hair withthe sheath and bulb, trim the hair with scissors so it is ~2 cm long. Place your trimmedhairs into the screwcap tube with your initials. Screw the cap tightly on the tube.

3. Place your tube in the foam micro test tube holder and incubate it at 56°C for 10 minutesin a water bath. At the halfway point (5 minutes), shake or vortex the tube gently, thenplace it back in the 56°C water bath for the remaining 5 minutes.

4. Remove your tube, gently shake or vortex it, then place it in a boiling water bath(100°C) 5 minutes.

47

56°C, 10 min

Sheath

Hair

Bulb

Water bath

100°C, 5 minWater bath

Lesson 1 Hair Follicle DNA Template Preparation (Lab Protocol)1. Each member of your team should have 1 screwcap tube containing 200 µl of InstaGene

matrix plus protease. Label the tube on the cap and side with your initials.

2. Collect 2 hairs from yourself. Choose hairs that leave noticeable sheaths (a coating ofepitheleal cells around the base of the hair). Alternatively, choose hairs that have alarge root. The root is the bulb-shaped base of the hair. Keeping the end of the hair withthe sheath and bulb, trim the hair with scissors so it is ~2 cm long. Place your trimmedhairs into the screwcap tube with your initials. Screw the cap tightly on the tube.

3. Place your tube in the foam micro test tube holder and incubate it at 56°C for 10 minutesin a water bath. At the halfway point (5 minutes), shake or vortex the tube gently, thenplace it back in the 56°C water bath for the remaining 5 minutes.

4. Remove your tube, gently shake or vortex it, then place it in a boiling water bath(100°C) 5 minutes.

47

56°C, 10 min

Sheath

Hair

Bulb

Water bath

100°C, 5 minWater bath

5. Remove your tube from the boiling water bath and shake or vortex to resuspend thecontents. Pellet the matrix by spinning at 6,000 x g for 5 minutes (or 2,000 x g for 10minutes).

6. Store your screwcap tube in the refrigerator until the next laboratory period (or proceedto step 2 of Lesson 2).

48

Centrifuge

19

PCR-amplifikation Materialer Mikrocentrifugerør (med hængslet låg) Skruelågsmikrocentrifugerør Mastermix Primermix PV92 homozygot kontrol (+/+) PV92 homozygot kontrol (-/-) PV92 heterozygot kontrol (+/-) 12 PCR-rør Isbad Mikropipetter Spidser Bøtte til affald Fælles: PCR-maskine 1. Tag dit DNA-rør fra køleskabet. Centrifuger i 2

minutter ved 6000 rpm.

2. Mærk et PCR-rør samt et mikrocentrifugerør uden låg med dine initialer og sæt rørene i skumholderen

3. Overfør 20µL fra skruelågsmikrocentri- fugerøret til PCR-rørets bund. VÆR FORSIGTIG! Undgå at få matrixperlerne fra bunden med. Da de vil hæmme PCR-reaktionen(Se tegningen)

Lesson 2 PCR Amplification (Lab Protocol)

1. Obtain your screwcap tube that contains your genomic DNA template from therefrigerator. Centrifuge your tubes for 2 minutes at 6,000 x g or for 5 minutes at 2,000 x g in a centrifuge.

2. Each member of the team should obtain a PCR tube and capless micro test tube. Labeleach PCR tube on the side of the tube with your initials and place the PCR tube into thecapless micro test tube as shown. Place the PCR tube in the foam micro test tube hold-er.

3. Transfer 20 µl of your DNA template from the supernatant in your screwcap tube intothe bottom of the PCR tube. Do not transfer any of the matrix beads into the PCRreaction because they will inhibit the PCR reaction.

4. Locate the tube of yellow PCR master mix (labeled “Master”) in your ice bucket.Transfer 20 µl of the master mix into your PCR tube. Mix by pipetting up and down 2–3 times. Cap the PCR tube tightly and keep it on ice until instructed to proceed to thenext step. Avoid bubbles, especially in the bottom of the tubes.

54

PCR tube Capless tube

DNA template

Supernatant

Matrix

PCR tube

Master mix






54


DNA template

Supernatant

Matrix

PCR tube

Master mix

20

4. Stil røret med den gule mastermix på is og overfør 20µL mastermix til PCR-røret. Bland ved at pipettere op og ned. Luk PCR-røret og stil det på is Blandingen vil være gul. 5. Der køres 40 PCR-cykler – enten i en termalcykler eller ved hjælp af vandbade. Din lærer vil instruere nærmere om dette. HUSK: Til sidst afsluttes med 10 minutter i 72oC vandbadet.

Elektroforese Materialer PCR-prøverne MMR (DNA standard) PV92 loading dye Elektroforesekar, støbekar og kam Elektroforesebuffer (50x TAE) Agarose Fast Blast DNA farve Mikropipetter (20µL og 200µL) Mikropipettespidser Isbad Centrifuge PVXC markørfarve Bøtte til affald Farvekar Fælles: PV92 ++ standard PV92 - - standard PV92 +- standard

1. Tag dit PCR-rør og stil det i et mikrocentrifugerør uden låg. Centrifuger i 3 sekunder ved 3000 rpm. 2. Tilsæt 10µL PV92 XC markørfarve til dit PCR-rør






54


DNA template

Supernatant

Matrix

PCR tube

Master mix

21

og bland forsigtigt. 3. Den støbte agarosegel lægges i elektroforeseapparatet. Tjek at brøndene er nær den negative pol (den ”sorte” ende). 4. Fyld elektroforesebuffer i karret således at gelen er dækket. 5. Fyld 8µL prøve i hver brønd efter følgende skema:

Brønd nr. Prøve Mængde 1 DNA-standard 10 µL 2 Homozygot +/+ kontrol 10 µL 3 Homozygot -/- kontrol 10 µL 4 Heterozygot +/- kontrol 10 µL 5 Elev 1 20 µL 6 Elev 2 20 µL 7 Elev 3 20 µL 8 Elev 4 20 µL

6. Sæt låget på elektroforesekarret og forbind ledningerne med strømforsyningen

7. Tænd for strømmen og lad elektroforesen køre i 30

minutter ved 100V. Farvning af gelerne

1. Når elektroforesen er slut slukkes strømmen, ledningerne fjernes fra strømforsyningen, og karret med gelen flyttes forsigtigt fra elektroforesekarret. Pas på! Gelen glider nemt af. Lad forsigtigt gelen glide ned i det kar, der skal bruges til farvningen. 2. Farv enten med den a)hurtige metode – ca. 15 minutter eller b) Lad gelen farve natten over.

Lesson 3 Gel Electrophoresis of Amplified PCR Samples(Lab Protocol)

1. Remove your PCR samples from the thermal cycler and place in the micro test tubeholder. If a centrifuge is available, place the PCR tubes in the capless micro test tubesand pulse-spin the tubes (~3 seconds at 2,000 x g) to bring the condensation thatformed on the lids to the bottom of the tubes.

2. Add 10 µl of PV92 XC loading dye to each PCR tube and mix gently.

3. Obtain an agarose gel (either the one you poured or one pre-poured by your teacher).Place the casting tray with the solidified gel in it, onto the platform in the gel box. Thewells should be at the cathode (–) end of the box, where the black lead is connected.Very carefully remove the comb from the gel by pulling it straight up, slowly.

4. Pour ~275 ml of electrophoresis buffer into the electrophoresis chamber, until it justcovers the wells.

5. Using a clean tip for each sample, load the samples into the 8wells of the gel in thefollowing order:

Lane Sample Load Volume1 MMR (DNA standard) 10 µl2 Homozygous (+/+) control 10 µl3 Homozygous (–/–) control 10 µl4 Heterozygous (+/–) control 10 µl5 Student 1 20 µl6 Student 2 20 µl7 Student 3 20 µl8 Student 4 20 µl

61

+–

6. Secure the lid on the gel box. The lid will attach to the base in only one orientation: redto red and black to black. Connect the electrical leads to the power supply.

7. Turn on the power supply. Set it to 100 V and electrophorese the samples for 30 minutes.

8. When electrophoresis is complete, turn off the power and remove the lid from the gelbox. Carefully remove the gel tray and the gel from the gel box. Be careful, the gel isvery slippery. Nudge the gel off the gel tray with your thumb and carefully slide it intoyour plastic staining tray.

Staining of Agarose GelsThe moment of truth has arrived. What is your genotype? Are you a homozygote or a

heterozygote? To find out, you will have to stain your agarose gel. Since DNA is naturallycolorless, it is not immediately visible in the gel. Unaided visual examination of gel afterelectrophoresis indicates only the positions of the loading dyes and not the positions of theDNA fragments. DNA fragments are visualized by staining the gel with a blue dye calledFast Blast DNA stain. The blue dye molecules are positively charged and have a high affinity for the DNA. These blue dye molecules strongly bind to the DNA fragments andallow DNA to become visible. These visible bands of DNA may then be traced, photographed,sketched, or retained as a permanently dried gel for analysis.

Directions for Using Fast Blast DNA Stain

Below are two protocols for using Fast Blast DNA stain in the classroom. Use protocol 1for quick staining of gels to visualize DNA bands in 12–15 minutes, and protocol 2 forovernight staining. Depending on the amount of time available, your teacher will decidewhich protocol to use. Two student teams will stain the gels per staining tray (you may wantto notch gel corners for identification). Mark staining trays with initials and class periodbefore beginning this activity.

WARNINGAlthough Fast Blast DNA stain is nontoxic and noncarcinogenic, latex or vinylgloves should be worn while handling the stain or stained gels to keep hands frombecoming stained blue. Lab coats or other protective clothing should be worn toavoid staining clothes.

62

+

–

6. Secure the lid on the gel box. The lid will attach to the base in only one orientation: redto red and black to black. Connect the electrical leads to the power supply.

7. Turn on the power supply. Set it to 100 V and electrophorese the samples for 30 minutes.

8. When electrophoresis is complete, turn off the power and remove the lid from the gelbox. Carefully remove the gel tray and the gel from the gel box. Be careful, the gel isvery slippery. Nudge the gel off the gel tray with your thumb and carefully slide it intoyour plastic staining tray.

Staining of Agarose GelsThe moment of truth has arrived. What is your genotype? Are you a homozygote or a

heterozygote? To find out, you will have to stain your agarose gel. Since DNA is naturallycolorless, it is not immediately visible in the gel. Unaided visual examination of gel afterelectrophoresis indicates only the positions of the loading dyes and not the positions of theDNA fragments. DNA fragments are visualized by staining the gel with a blue dye calledFast Blast DNA stain. The blue dye molecules are positively charged and have a high affinity for the DNA. These blue dye molecules strongly bind to the DNA fragments andallow DNA to become visible. These visible bands of DNA may then be traced, photographed,sketched, or retained as a permanently dried gel for analysis.

Directions for Using Fast Blast DNA Stain

Below are two protocols for using Fast Blast DNA stain in the classroom. Use protocol 1for quick staining of gels to visualize DNA bands in 12–15 minutes, and protocol 2 forovernight staining. Depending on the amount of time available, your teacher will decidewhich protocol to use. Two student teams will stain the gels per staining tray (you may wantto notch gel corners for identification). Mark staining trays with initials and class periodbefore beginning this activity.

WARNINGAlthough Fast Blast DNA stain is nontoxic and noncarcinogenic, latex or vinylgloves should be worn while handling the stain or stained gels to keep hands frombecoming stained blue. Lab coats or other protective clothing should be worn toavoid staining clothes.

62

+

–

22

Metode a: Hurtig farvning

a. Tilsæt 120 mL 100x farveopløsning til gelen. Sørg for at den er helt dækket. b. Farv gelen i 2-3 minutter. Vip forsigtigt med karret. Hæld farven tilbage på flasken. Farven kan genbruges 7 gange. c. Skyl forsigtigt gelen i 10 sekunder med varmt (40-55oC) vand fra vandhanen. d. Fyld derefter karret med varmt vand fra vandhanen i 5 minutter. Vip karret frem og tilbage. e. Gentag punkt d med nyt vand. f. Læg gelen på en lys baggrund og tegn med en tusch gelens brønde og bånd på en OH-trans- parant e.l. Tag eventuelt en fotokopi af gelen. g. Find ud, hvilken genotype du har. h. Lad gelen lufttørre og gem gelen. Undgå at udsætte gelen for direkte lys, idet det vil afblege båndene.

Metode b: Langsom farvning (gelen farver natten over)

a. Tilsæt 120 mL 1x farveopløsning til gelen. Gelen skal være dækket af farveopløsningen. b. Lad gelen stå natten over. Det bedste resultat opnås, hvis gelen rystes roligt undervejs fx på et rystebord. c. Næste dag hældes farveopløsningen fra. Farven kan ikke genbruges. d. Læg gelen på en lys baggrund og tegn med en tusch gelens brønde og bånd på en OH- transparent e.l. Tag eventuelt en fotokopi af gelen.

23

e. Find ud, hvilken genotype du har f. Lad gelen lufttørre og gem gelen. Undgå at udsætte gelen for direkte lys, idet det vil afblege båndene.

Øvelsesvejledning kromosom 16 (pdf)

Documents