INVESTIGACIONES ORIGINALESRevista de IIIPacultnd de McdicinaUniversidad Nacional de Colombia1994 - Yol. 42 WI (Pags. 5-8)

Separacidn rapida de leucocitos de sangre periferica

• Cristobal Corredor R.: Profesor Asociado, Facultad de Odontologia en comislon en la Facultad de Medicina,Departamento de Morfologia, Universidad Nacional, Santafe de Bogota, D.C.,

La obtencion rapida de leucocitos de sangre perifertcaha sido posible gracias al disefio y construccion de unacarnara receptora (esterilizable quimicamente). lome-diatamente se ha tornado la muestra de sangreanticoagulada (3 ml) con una jeringa plastica, esta seacopla a la camara receptora previamente llena de ficoll-hypaque. Durante la centrifugacion los eritrocitos pasanfenta y gradualmente a la carnara receptora y losleucocitos que dan en 13jeringa en 13zona de exclusion 0interfase (plasma/ficoll-hypaque). La obtenci6n de losPBL se realiza desacoplando la jerin~a de la camarapara proseguir el lava do y purificacion de las celulaspor separado, ahorrando tiempo y reduciendo en 10 Pv-sible el contacto de los leucocitos con superficiesadherentes 0 posibilidades de contaminackin. EI disefiode esta nueva carnara permtte obtener leucocitos sincontaminacton eritrocitaria y economiza tiempo para elprocesamiento de muestras sanguineas.

INTRODUCCION

Los leucocitos de sangre periferica PBL del bazo ynodules linfaticos son una mezcla de varias pobla-ciones celulares (I, 2), las cuales se han venido se-parando segun sus caracteristicas biol6gicas (antigenos-receptores, enzimas) (3), bioffsicas (adherentes, noadherentes, densidad, carga electrica de superficie,etc.), tal como 10 ha demostrado Shortman (4) enmurinos (5, 6). Desde el punto de vista inmunol6gicose estudian dos grandes grupos: linfocitos T y linfocitosB. Hoy dia existen avances tecnol6gicos sofisticados,como la citometria de flujo la cual separa las celulaselectr6nicamente teniendo en cuenta su volumen asfcomo uno 0 dos marcadores moleculares de mem-brana al mismo tiempo (7-9).

Se requieren tecnicas de maxima seguridad en laasepcia y gran rapidez para garantizar una viabilidadcelular 6ptima (9-11). En el presente trabajo se muestraun metodo simplificado para el aislamiento deleucocitos de sangre periferica, PBL, con el diseiioy construcci6n de una camara esterilizable para re-mover por centrifugaci6n los eritrocitos en formainmediata, dejando los leucocitos en la interfaseplasma/ficoll-hypaque facilmente separables parahacer las pruebas biol6gicas (12).

MATERIALES Y METODOS

Se toman tres ml de sangre periferica, empleandouna jeringa plastica, a3 (Figura I-A), con ernbolo decaucho. Como anticoagulante se emplean 0,2 ml deEDT A al 10%,0 heparina al 0.3% La separaci6n delas celulas se hace siguiendo las metodologias yaestablecidas (9).

Una vez esterilizadas las carnaras, se llenan comple-tamente con la solucion de ficoll-hypaque (1,3 ml),con la ayuda de una jeringa, cuidando de no dejarburbujas de aire dentro de la camara, b3 (Figura 1-B). La solucion de ficoll-hypaque tiene una densidadde 1,077 Y esta compuesta de: 20 ml de hypaques6dico 50% PlY, mas 6,34 g de ficoll (PM 400.000),todo disuelto en agua destilada, hasta un volumen de100 ml.

Se acopla la jeringa (acoples a4 y bl de la Figura 1-B) directamente a la camara y se Ie remueve elportaernbolo a2. Este conjunto se introduce en eltubo porta-camara TPC y se centrifuga ernpleandoun rotor escualizable 0 de rotacion horizontal (radiominima = siete ern, radio maximo 17 ern). Se centri-fuga a 1.000 rpm por cinco minutos y luego a 2.500rpm durante 25. Terminada la centrifugaci6n se sacael conjunto camara-jeringa del TPC. Los PBL quedanconcentrados en la interfase ficoll-hypaque/plasmaen la jeringa y se pueden ex traer de dos maneras: porgravedad 0 por aspiraci6n exclusiva de la capa deleucocitos, VI, en la interfase (Figura 2). Para laprimera se desacopla la jeringa de la camara y se vaempujando el embolo cuidadosamente, eliminandoel maximo volumen posible de ficoll-hypaque paraquedarse s610 con la capa de leucocitos los cuales serecogen en un tubo plastico y se lavan con medio decultivo, RPMI-1.640, 0 soluci6n de Hank, (HBSS).

Para extraer los leucocitos por aspiraci6n, se insertauna aguja al embolo de caucho para removerlo. Conla ayuda de una pipeta de plastico se toma cuidado-samente solo la capa de leucocitos VI, (Figura 2),

5

C. CORREDOR

®

8

Figura. J. Esquemas de los camponenses meconicos para centnfugar I1lUCS-

trw de sangre, enfonna inmediata. £11/: A = Jail/go de planico transpa-reme (3 /III). COli emboto de caucho al: B = Camara ponacetutas (eritrocitos).TPC = Tuba pana-camara. I/. Detatles de diseiio de fa camara Y porta-a/mara.

procurando tomar el mfnimo volumen de Ifquido cir-cundante interfasico, y se transfiere a tubos plasticoso placas de pozos multiples, para ser lavados porcentrifugaci6n, cuidando de no sobrepasar la FCRmayor de 400x G.

Despues de cada centrifugaci6n se elimina el maxi-mo posible de sobrenadante y se resuspenden lascelulas agitando vigorosamente el tubo 0 placa. AIfinalizar se Ie agregan 0,2 011 de soluci6n lavadora.Se calcula el mirnero de celulas por medio de unacamara de Newsbawer, ajustando el volumen totalde tal manera que una alicuota de veinte microlitrosposea unas 1.000 - 2.000 celulas. Para ver si hay

6

contaminaci6n con otro tipo de celulas se hace unextendido celular sobre un vidrio porta-objeto paraobservarlas histoqufmicamente (13). Se constata laviabilidad celular observando las celulas con el co-lorante azul tripan al 0.1 % en HBSS.

Una vez lavados, los leucocitos quedan listos parahacer las pruebas biol6gicas como las de citotoxicidado inducci6n de blastogenesis par mit6genos, MLC,fitohemaglutininas (9, 14).

Recuperaci6n de eritrocitos. Con la ayuda de unajeringa esteril (10 011 con aguja No. 18), se remue-yen par aspiraci6n los eritrocitos de la camara (b3). Selavan con PBS-SS, pH 7.0, 0 con medio de HBSSpara usarlos posteriormente en pruebas biol6gicas.

DISCUSION

La separaci6n ffsica de los distintos tipos de celu-las sangufneas es una practica biornedica que exigeprontitud y destreza para asegurar mayor viabilidadcelular. Esto es posible con el protocolo aquf descritoya que permite que una vez obtenida la muestra desangre, esta pasa de inmediato a ser centrifugada.

S610 hay que reemplazar la aguja de la jeringa porla carnara receptora 0 portacelulas (eritrocitos),esquematizada en la Figura 2, la cual habfa sidopreviamente Ilenada con la soluci6n separadora deficoll-hypaque. Durante la centrifugaci6n este me-dio de separaci6n, cuya densidad inicial es de 1.077,va siendo gradual mente desplazada de la carnara b3(Figura I-B), por la entrada gradual de los eritrocitoscomenzando por los mas densos.

La velocidad de entrada de estas celulas esta de-terminada por dos elementos: a) La fuerza centrf-fuga, la cual a su vez depende de la velocidadangular de rotaci6n (1.000- 2.500 rpm), y del ra-dio de giro. Para fines practices se caleula la fuerzacentrffuga relativa como: FCR = K x R X N' x 10'5; siendo: K = 1,118; R = radio de giro en centf-metros; N = rpm. Durante la centrifugaci6n a lavelocidad maxima (2.500 rpm), la FCR para lacapa superior de la sangre es de 5162xG, y en elfondo los eritrocitos tienen un valor de 12.537xG(Figura 2-B), (15). b) La entrada gradual de loseritrocitos a la carnara es isoc6rica e induce eldesplazamiento del ficoll-hypaque hacia la jerin-ga, 10 cual a su vez hace que vaya cambiando ladensidad del medio separador. Los eritrocitosarrastran asociados a sus 128 - 160 micras cuadra-das de superficie celular (16), solutos/solventesplasmaticos, que no pueden ser removidos por laturbulencia hidrodinarnica durante la centrifugaci6n.

SEPARACION RAPIDA DE LEUCOCITOS Rev Fac Med UN Col 1994 Vol 42 N° I

6cm

INICIAL

IFINAL

••IE' IL Ej~de

giro

V__ d' (Pr,p,1

x g18n

velocidadRadio em rprn FCR.G

® OT= 7 500 206OB= 7 500 501OT= 7 1000 826OB 7 1000 2006OT= 7 2500 5162DB= 7 2500 12537

FeR = K.R.M' (Lee- 1974)

(]J@

Figura 2. Dinamica celular ell la separacion entre eritrocitos y teucocuos de sangre periferica eli gradicnte discontinue deficott-tvypaqne usaudo fa call/ora

de seporacion cell/far. A ::: Esquema gel/era! ell ef que: Vi = Vohnnen inicial dcficoll-tiypaaue. V'i = vohunen deficott-ttypooue desptamdo por los eritrocnos.VE = votumen de cell/las eritrocitarias (-). Vs = volumen de sangre perifenco inicial. (ptasnio. celli/as). VI = votumen de cetutas lencocitorias (0). Vpp =votunien de plasma y plaauetos. 02 = Emboto de coucbo. Los radios de giro OT = 9 em; DB = /7 CIII. Los erurocnos preseutes en Vs se dingen ala almarah3 (Figura I-B), por occion de tafuerra centrtfuga desptarando parte del votumen Vi at V'i. UI altura tanto de fa interfase eritrocitoria IE. COII/O de 10 interjoseteucocitaria Jl. depende de VE eI cuat es caractertstico de las condiciones fisiotogicos de coda donante af ignol que V'1. B = vatores de tafuer;a cemr(fugaretauvo. FeR. maximas y minimas para las velocidades masfrecuentes. utithadas ell la cennifugacion celutor. catcutodas seglill Lee 1974. (20).

EI medio ficoll-hypaque asf desplazado comienza ahacer retroceder los leucocitos desde la interfase I,hasta la interfase II, a la vez que recibe pOl'sedimentacion todos los leucocitos desde T hasta II.EI volumen leucocitario VI queda en equilibrioestatico en la interfase II, enlre el ficoll-hypaque y elplasma/plaquetas (Figura 2).

La densidad especifica que cada tipo celular posee,obedece a las relaciones fisicas entre su volumenV, y su peso P, 0 sea D = P/V. A estos dos factoresfisicos, se suman las propiedades hidrodinamicasentre la topografia de las membranas plasmaticas(externas) y el medio liquido (turbulencia viscosa),distinguiendose las interacciones hidrofobicas,hidrofilicas, interacciones salinas electricas, etc.,todo 10 cual permite diferenciar fisicamente un grupode celulas de otro (16, 17).

Debemos recordar que la viscosidad de la sangresigue un comportamiento hidrodinamico no-Newtoniano y pOI'10 tanto no sigue las leyes descri-tas poria ecuacion de Poiseille. Esto se debe a lapresencia del fenomeno de Rouleaux y a la granf1exibilidad de los eritrocitos (16).

La camara receptora de las celulas ha sido disenadapara albergar en b3, todos los eritrocitos presentesen tres ml de sangre peri ferica de donantes con

hematocritos normales (X = 43% v/v). Si un donanteposee un VE mayor de 43.0% se debe disminuir elvolumen sanguineo Vs (Figura 2-A), con el fin deque el VE no sobrepase el volumen Vi de la camarab3. La interfase eritrocitaria IE, nunca debe sobre-pasar de la altura 1.

Se distinguen dos protocol os experimentales paraaislar las distintas subpoblaciones celulares ya seande sangre periferica, organos linfaticos, bazo, aspi-rados de medula osea, etc.: los que separan las ce-lulas 0 sus fragmentos pOI' gradientes de densidadpara fines bioquimicos/quimicos 0 de diagnostico, ylos que separan las celulas para cultivo ill vitro 0trasplantes isologos 0 auto logos (18, 19). Se debeprecisar las propiedades fisiologicas de las solucio-nes de separacion y lavado ya que se necesita quela viabilidad celular sea optima. Para estos proto-colos existen varios compuestos quimicos tales comosacarosa, glicerol, gelatina, etc., los cuales en ma-yor 0 men or grado pueden alterar la viabilidad ce-lular. EI uso del ficoll-hypaque y recientemente delpercol, ha aportado considerables adelantos tecni-cos, ya que se pueden ajustar mejor la fuerza ionica,el pH, la presion osmotica y la viscosidad 10 mascerca posible a las condiciones fisiologicas de cadatipo celular en cad a especie y asf garantizar que laviabilidad celular sea cercana al 100%, constatadapar media de un colorante vital, como el azul tripan.

7

C. CORREDOR

ABSTRACT

Periferal Blood Leucocites, PBL, can be easily separatedfrom Red Blood Cells (RBC), using a ficoll-hypaquedensity gradient. A three ml plastic syringe with 3ml of anticoagulated peri feral blood is readely attachedto the sterilized cell chamber full of a density gradientsolition. This device thus assembled is centrifuged,

(500 - 2.500 rpm), for 20 minutes and the RBC arereadely separated. PBLs retained at the plasma/ficoll-hypaque interphase in the plastic syringe are isolatedfollowing standard protocols and used for clinical orbiological test (HLA, microcitotoxic technique ,etc.).Details of the cell chamber are given. This procedureyields optimun PBL without other cell contaminantsand can save time in skilfull hands.

REFERENCIAS

Morella L, Mingari Me. A Maretta, Fanci A. Humanlymphocyte surface markers. Semin Hematol, 1982; 19(4):273-84.

2 Ellory Jc. Wolowyk MW. A new density gradient techniquefor age separation of human erytrocyte and reticulocytes. JPhysiol, t 979; 295: 9-10.

3 Ryder LP, Svejgaard A, Dausset J. Genetics of HLA diseaseassociation. Ann Rev Gen, 1981; 15: 169-187.

4. Shortrnan K. Physical procedures for (he separation ofanimal cells. Ann Rev Bioph Bioenginer, 1972; I: 93-130.

5. Giblett ER. Genetic pof ymorphysms in human blood. AnnRev Genet. 1977; II: 13-28.

6. Polliack A, Hammerling U, Lampen N, De Harven E. Surfacemorphology of murine Band T Iynphocytes: A comparativestudy by scanning electron microscopy. Eur J Immunol1975; 5: 32-39.

7. Greaves MF. Clinical aplications of cell surface markers.Progres in Hematology, 1975; 9: 255-305.

8. Allington RW. Breakke MK, Nelson JW, Aron CG, LarkinsBA. Optirnun conditions for high resolution gradient analysis.An Biochem, ]976; 73: 78-92.

9. Tse H, Dutton RW. Separation of Helper and Suppresor Tlymphocytes on a Ficol! velocity sedimentation gradient. JExper Medicine 1976: 143: 1]99-]2]0.

10. Shortman K.The separation of different cell clases from lymphoidorgams. I The use of glass bead columns 10 separate smalllymphocytes, remove damage cells and fractionate cellsuspensions. Austr J Exp BioI Med Sci 1966; 44: 271-286.

8

II. Kraft N, Shortman K. Diferentiation of antibody-formingcells in toad spleen. J Cel Bioi 1972; 52: 438-452.

12. Good RA, Y OW Fisher. La inreraccicn de los mecanisrnosde coagulaci6n y los inmunol6gicos. En: lnrnunobiologfa. Ed.Espax. Barcelona, Espana, 1977; 139-148.

13. Hayhoe FGJ and RJ Flemans. Lymphocites, Plasma Cells andtheir Precursors. In: An Atlas of Haematological Cytology;GB Garruhers, Edt.Wolfe Publishing Ltd. ]969; 2]2-265.

14. Wernet P, Kunkel HG. Dernostration of specific T-Iymphocytemembrane antigens associated with antibodies inhibitingthe Mixed Leucocyte Culture in man. TransplantationProceeding, ]973;5(4): ]875-]881.

15. Pertoft H, Hirtenstein M, Kagedal L. Cell separation in anew density medium, Percol. In: Cell Populations.Hethcdological Surveys, (B). Biochemistry. Ed Reid E.Edt Ellis Horweed Ltd. Chiches UK, ]979; 67-80.

16. Grimes AJ. Red cell shape. In: Human Red Cell Metabolism.London England, BlackWell Scientific Publication. 1980;57- 85.

17. Altbertson PA. Partition of cell particles and macromoleculesin polymer two-phase systems. Adv Proteim Chem 1970;24: 300-341.

18. Anderson WF. Human gene therapy. Scienc 1992; 256:808-815.

19. Watkins WM. Genetics and biochemistry of some humanblood groups. Proc Roy Soc Lond B, 1976; 202: 31,-53.

20. Lee LW. Centrifuges. In: Elementary Principles of LaboratoryInstruments, Edt. Saint Louis USA, The C.V. Mosby Co.]974; 220-224.