p ar-cc-06 validacion de metodos analiticos

Procedimiento Aseguramiento de CalidadP-Ar-CC-06 Validacion de Metodos Analiticos

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Sergio Di TranoAsuntos Regulatorios

Mónica PampínGarantia de Calidad

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Elaboró (Nombre y Puesto) Firma FechaSergio Di TranoAsuntos Regulatorios

Revisó (Nombre y Puesto) Firma Fecha

Aprobó (Nombre y Puesto) Firma Fecha

Mónica PampinLíder de Garantia de Calidad

OBJETIVO:Establecer parámetros analíticos para evaluar la efectividad de un método de análisis, su criterio de aceptación, su registro y ver si éste es válido para la aplicación que intenta dársele.

ALCANCE:Todas las técnicas analíticas fisicoquímicas para el análisis de materia prima y producto terminado.

DEFINICIONES:

HPLC: Cromatografía liquida de alta perfomance. GC: Cromatografía gaseosa. TLC: Cromatografía en placa delgada. EUV: Espectrofotometría ultra violeta - visible Muestras complejas: Dadas por el número de activos, por la presencia de algunos extractos vegetales o

por tratarse de productos nutricionales. RSD: coeficiente de variación ( o desviación standard relativa % ) Parámetro: test a ser efectuado Técnica analítica o método analítico: se refiere a los pasos necesarios para realizar el análisis. Analito: Se refiere al compuesto de interés ( ya sea componente mayoritario o una impureza ) Concentración analítica: es la concentración del analito indicada en la técnica analítica. Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado de una determinación y el valor considerado

verdadero. Precisión: Expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre un grupo de resultados

obtenidos al aplicar repetidamente (e independientemente) el mismo método analítico a alícuotas de la misma muestra homogénea. Engloba tres niveles: Repetibilidad, Precisión intermedia y Reproducibilidad.

Reptibilidad: Estudia la variabilidad el método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra homogénea en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con el mismo equipamiento y reactivos, etc.), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto (el mismo día).





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Precisión intermedia: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma muestra homogénea pero en condiciones operativas diferentes (diferente analista, equipamiento, reactivos, días, etc) y en un mismo laboratorio.

Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del método bajo condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios.

Especifidad / Selectividad: Capacidad de una técnica analítica de originar resultados que dependan en forma exclusiva al analito en presencia de posibles interferencias como componentes de la matriz, productos de degradación y precursores de síntesis. Los precursores de sintesis son aquellos generados durante el proceso de manufactura de la droga, los cuales no se incrementan luego de completado dicho proceso. Cualquier impureza que aumente con el tiempo será referida como producto de degradación, independientemente que se generen o no durante el proceso de manufactura.

Linealidad: Capacidad del método, dentro de cierto rango, para demostrar que los resultados obtenidos son directamente proporcionales a la concentración o a la cantidad del analito en la muestra.

Rango: Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior del analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método analítico.

Robustez: La robustez de una técnica analítica es una medida de su capacidad para permanecer inalterado debido a pequeñas pero deliberadas variaciones en parámetros del método y da una indicación de su confiabilidad en el uso corriente.

Limite de detección: Es la mínima concentración de una sustancia en una muestra la cual puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo las condiciones de operación establecidas.

Limite e cuantificación: Es la menor concentración de una sustancia en una muestra que puede ser determinada con precisión y exactitud aceptables bajo las condiciones de operación establecidas.

4- PROCEDIMIENTO:

4.1- Validación de Métodos Compéndiales Los métodos Compéndiales se consideran por definición Validados por lo que los métodos de Farmacopeas y otros organismos oficiales no precisan validación, aunque si deben ser comprobados antes de su implementación rutinaria (verificación de la idoneidad en las condiciones del laboratorio). Se determinaran solamente, a fin de determinar la aplicabilidad del método: · Especificidad: (Interferencia de Placebo, Fase Móvil, Solvente de dilución) · Estabilidad de las Soluciones Analíticas · Linealidad

4.2- Validación de Métodos No Compéndiales Clasificación según la aplicación : A continuación, se detalla la clasificación de los distintos tipos de métodos a validar, y los ensayos que se realizan para cada categoría, según ICH guideline. · CATEGORIA 1 : Test de identificación. · CATEGORIA 2 : Métodos analíticos para la determinación de impurezas (incluye valoraciones cuantitativas y ensayos límites.) · CATEGORIA 3: Métodos analíticos para la determinación de contenido (ej. ensayos de, determinaciones potenciometricas, disolución de droga, etc.)





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Parámetro Categoría1 2 3

Cuantificación Ensayo LimiteEspecificidad X X X X

Precisión X XExactitud X XLinealidad X X

Rango X XRobustez (*) (*)

Limite Detección X (*)Limite Cuantificación X (*)

(*) Puede ser determinada de acuerdo a las características del método cuando se considere necesario

IMPORTANTE: La determinación de impurezas cuantificables contra un estándar de referencia del componente principal (usualmente usado como la suma de impurezas desconocidas) se considera como un test límite respecto a los parámetros a evaluar.

PARÁMETROS A VALIDAR

a) ESPECIFICIDAD La especificidad comúnmente está acompañada por la demostración de una separación adecuada de los componentes, por ejemplo: en una cromatografía, por el empleo de sistemas de detección específicos. Dicho parámetro es de cumplimiento para técnicas que dada su naturaleza lo requieran; por ejemplo, en el caso de una técnica cromatográfica, este requisito es ineludible.

(HPLC, GC) Se utiliza un cromatografo liquido con arreglo de diodos / cromatografo gaseoso. Según las características de las muestras y el analito, se pueden recurrir a los siguientes ensayos :

a.1) Interferencia del placebo Se prepara la solución placebo según preparación de la muestra en la técnica analítica correspondiente. El placebo esta compuesto por los excipientes del producto terminado, excepto el analito y se realiza según el procedimiento descrito en la guía de proceso correspondiente o en su defecto en una formula de desarrollo galenico. Debe especificarse en el protocolo el numero de guía de manufactura. Criterio de aceptación: No se debe detectar interferencias superiores al 0,5% respecto al analito, en el tiempo de retención del mismo.

a.2) Interferencia de posibles degradados Para técnicas cromatográficas: Se realiza para materia prima y producto terminado. Este procedimiento dependerá de la estabilidad del analito, de manera de degradar aproximadamente un 20-80% del mismo. El objetivo es lograr visualizar el pico del activo en presencia de los posibles degradados. Se proponen las siguientes degradaciones que serán modificadas empíricamente según la estabilidad de la droga. La concentración final de la solución a inyectar debe ser la de la técnica analítica. Generalmente se añade 1 ml de las siguientes soluciones indicadas cada 5 mg de droga a degradar presente en el matraz de reflujo, en la degradación de materia prima y producto terminado, se refluja durante 1 hora, se neutraliza en caso de degradados alcalinos o ácido, se trasvasa cuantitativamente al matraz aforado y se realiza la dilución correspondiente.

· Degradación alcalina: Se degrada con NaOH 1N y se neutraliza con igual volumen de HCl 1N. · Degradación Ácida: Se degrada con HCl 1N y se neutraliza con igual volumen de NaOH 1N.





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· Degradación oxidante:. Se degrada con peroxido de hidrógeno 10 volúmenes · Degradación acuosa: Se degrada con agua destilada. · Degradación reductora (solo se realiza en el caso que se justifique): Se degrada con HCl 1N y una punta de espátula de cinc metálico, se neutraliza con igual volumen de NaOH 1N. En el caso de no obtener la degradación necesaria o de obtener la degradación total, se procederá a modificar las siguientes variables para lograr la degradación necesaria. · Volumen de la solución degradante. · Titulo de la solución degradante. · Tiempo de reflujo..Termólisis: Se coloca en un pesafiltro 3 veces la cantidad de necesaria de muestra a pesar según la técnica analítica correspondiente, se coloca en estufa a 105 ºC durante 5 hs. Se prepara la solución según la preparación en la técnica analítica correspondiente. Se determina el peso de la muestra antes y después del tratamiento para realizar la corrección por humedad. .Fotolisis en estado sólido: Se coloca en un pesafiltro 3 veces la cantidad de necesaria de muestra a pesar según la técnica analítica correspondiente, se expone bajo lámpara a 254/366 nm durante 10 hs. Se prepara la solución según la preparación en la técnica analítica correspondiente. .Fotolisis en solución: Se prepara la solución de la materia prima y de producto terminado según la preparación en la técnica analítica correspondiente. Se somete una alícuota de la misma bajo lámpara de 254/366 nm el tiempo necesario según la estabilidad de la droga. En el caso de drogas muy estables colocar 5 horas. .Preparación de la solución estándar: Se prepara según técnica analítica correspondiente. .Valoración de muestras que excedieron el período de vencimiento, considerándose que pudieran contener degradados producidos por estabilidad natural, esta opción es de primera elección en el caso de polivitamínicos, donde dada la complejidad de las matrices, los caminos degradativos resultan excesivos para el tratamiento de la muestra.

Evaluación: Para técnicas cromatográficas, se debe plantear: · La capacidad del método para separar productos relacionados al pico principal ( donde se plantea un valor de resolución mínimo de 1.5). · La pureza del pico (planteando que la misma será determinada mediante la utilización del software disponible en el sistema cromatográfico). Debe ser similar a la pureza del analito en la muestra estándar sin degradar. · La identificación del analito (comparando espectros y tiempos de retención con respecto al estandar).· En el caso de evaluar muestras sometidas a degradaciones, se inyecta placebo, estándar muestra sin degradar y cada una de las soluciones de los degradados, junto con sus respectivos blancos. Se comparan los picos del principio activo de los cromatogramas de las soluciones degradadas con el pico del principio activo en la solución estándar, se verifica que los picos correspondientes a los degradados tengan una resolución determinada con respecto al pico del principio activo, se calcula el porcentaje de recuperación, se calcula el factor de pureza correspondiente al pico del principio activo en el estándar y en las diferentes muestras degradadas y se trata de dilucidar el origen de los degradados. En el caso de tratarse de impurezas desconocidas cuyas áreas son sumadas y cuantificadas en su totalidad, la pureza no será un parámetro critico para su determinación. Nota : En caso de concentraciones muy altas que no permitan una adecuada determinación del factor de purea, se deberá realizar una dilución conveniente (en general esto ocurre con absorbancias mayores a 1 volt). En caso de existir mas e un principio activo se deberá tener en cuenta la influencia de los degradados de uno sobre el otro, realizando diferentes degradados según las concentraciones de los activos y técnicas a validar.

(TLC) Se siembra en carriles separados el/los analito/s, placebo, mezcla.

Evaluación: No debe haber interferencias con el placebo. De haber mas de analito, deberá demostrarse la no interferencia entre ellos y resolución de las manchas. Para otro tipo de técnicas se recurre a la bibliografía más conveniente como Farmacopeas, guía ICH, etc.





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b) EXACTITUD

VALORACIÓN HPLC, GC, EUV, Volumetría: Se realiza según formula cuali-cuantitativa un placebo. Se preparan tres pilotos con placebo enriquecido con principio activo de manera que se reproduzcan las proporciones y condiciones de la técnica de elaboración, con concentraciones del activo de 80, 100 y 120% respecto al valor declarado.

Preparación de soluciones estándar: Se prepara por duplicado según técnica analítica.

Preparación de soluciones muestra: Se prepara por triplicado muestras de cada uno de los niveles de recuperación, según técnica analítica.

Inyectar o realizar la lectura por duplicado de cada una de las soluciones muestra. Calcular la cantidad de principio activo recuperado y el porcentaje de recuperación del mismo, según la formula:

% recuperación = (mg recuperados x 100)/ mg agregados (para cada nivel y global)

Graficar mg recuperados en función de mg agregados. Determinar el coeficiente de regresión lineal R 2 por método de cuadrados mínimos. Informar ordenada al origen y pendiente, y sus respectivos intervalos de confianza con nivel de significación de a 0,05.

Evaluación: Porcentaje de recuperación: 98,0 - 102,0 % (para cada nivel y global) RSD < 2,0 (para cada nivel y global) Coeficiente de regresión lineal R 2 . > 0,990 El intercepto no debe ser significantemente diferente de cero, con nivel de significación a 0,05.

VALORACIÓN (Productos con matriz compleja) HPLC, GC, EUV, Volumetría: En los casos que el producto a analizar tenga una matriz biológica (extractos vegetales), o sea un producto del cual se desconozca la composición exacta de su matriz, se procederá a analizar pilotos preparados con el método de adicción de estándar. Se prepara una muestra de recuperación a la mitad de la concentración nominal que se tomara como nivel cero o basal. A otras tres muestras de recuperación preparadas de igual manera se les agregan distintas cantidades de activo exactamente pesadas, de forma tal de obtener tres niveles de recuperación correspondientes al 80, 100 y 120 % del valor declarado.

Preparación de soluciones estándar: Se prepara por duplicado según técnica analítica.

Preparación de soluciones muestra: Se prepara por triplicado muestras de cada uno de los niveles de recuperación, según técnica analítica.


Cc teorica (mg/mL)= [{(PMtra i x CC0/100)+P Test i}/(P Mtra i + P Test i)] x 1000

Cc hallada (mg/mL)=( A Mtra i x P Std x Pot x fdx 1000)/(A Std x 100 x {P mtra i+P test i})

% recuperacion= (mg recuperados x 100)/ mg agregados (para cada nivel y global)





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Donde: P Mtra i y P Test i = Peso de muestra y testigo agregado en cada una de las muestras de recuperación, respectivamente (mg). CC 0 = Concentración de la muestra (expresada como mg/g). A Mtra i y A Std = Área o Absorbancia de la muestra de recuperación y estándar respectivamente. P Std y Pot = Peso del estándar (mg) y potencia del mismo. fd = factor de dilución.


Evaluación: Porcentaje de recuperación: 98,0 - 102,0 % (para cada nivel y global) RSD < 2,0 (para cada nivel y global) Coeficiente de regresión lineal R 2 . > 0,990 El intercepto no debe ser significantemente diferente de cero, con nivel de significación a 0,05.

IMPUREZAS (solo por requerimiento) HPLC, GC: Se preparan con el método de adicción de estándar, agregando cantidades conocidas de impurezas o productos de degradación, al activo o al producto, de manera de obtener tres niveles de recuperación correspondientes al 50 % del limite de impurezas individuales, el limite de impurezas y el limite de impurezas totales.

Preparación de soluciones estándar: Se prepara según técnica analítica.

Preparación de soluciones muestra: Se prepara por duplicado muestras de cada uno de los niveles de recuperación, según técnica analítica.


Cc teorica (mg/mL)= [{(PMtra i x CC0/100)+P Test i} / (P Mtra i + P Test i)] x 1000

Cc hallada (mg/mL)=( A Mtra i x P Std x Pot x fd x 1000)/(A Std x 100 x {P mtra i+P test i})

% recuperación = (mg recuperados x 100)/ mg agregados (para cada nivel y global)

Donde: P Mtra i y P Test i = Peso de muestra y testigo agregado en cada una de las muestras de recuperación, respectivamente (mg). CC 0 = Concentración de la muestra (expresada como mg/g). A Mtra i y A Std = Área o Absorbancia de la muestra de recuperación y estándar respectivamente. P Std y Pot = Peso del estándar (mg) y potencia del mismo. fd = factor de dilución.


Evaluación:





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90.0% - 110.0% ó 80.0% - 120.0% dependiendo de la naturaleza de la impureza, concentración evaluada, etc. En el caso de productos de alta complejidad (dada por el número de activos, por extractos vegetales o cuando el activo está en una

concentración muy baja, por ejemplo cuando el mismo se encuentra en una concentración del orden del 0.1 % de la fórmula), los valores de recuperación no pueden superar el + 10 %, con una RSD menor a 6 %.

Coeficiente de regresión lineal R 2 . > 0,990 El intercepto no debe ser significantemente diferente de cero, con nivel de significación a 0,05.

Método absoluto versus método no absoluto. En caso de validarse un método de valoración de materia prima no absoluto debe realizarse una exactitud por comparación con un método de valoración absoluto (ambos métodos por sextuplicado).

Evaluación: RSD de cada serie de mediciones < 2,0 Debe cumplir con la prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales o desiguales según la

prueba F (t<t tabla dos colas) con nivel de significación de a 0,05.

c) PRECISIÓN La precisión de un método analítico se expresa usualmente como la desviación standard relativa (RSD) Consideramos dos niveles de precisión: Repetibilidad y Precisión intermedia. Ambos parámetros son evaluados en la validación de la técnica analítica.

Metodología: · REPETIBILIDAD: Se efectúan seis análisis de una muestra homogénea y se calcula la RSD, estas determinaciones serán efectuadas por un mismo analista, en un día de trabajo con el mismo sistema y utilizando la misma calibración. · PRECISIÓN INTERMEDIA: Se efectúan seis análisis de la misma muestra homogénea y se calcula la RSD, estas determinaciones serán efectuadas por otro analista, en otro día de trabajo en el mismo laboratorio. Una vez obtenidos los 6 valores de cada analista se realiza una prueba F para determinar si las varianzas pueden considerarse iguales, luego se realiza la prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales o desiguales según el resultado anterior. · REPRODUCIBILIDAD: Se efectúan seis análisis de la misma muestra homogénea y se calcula la RSD, estas determinaciones serán efectuadas en distintos laboratorios (esto implica diferentes analistas, días, equipos, etc.). Este análisis no es obligatorio para completar los pasos a seguir en la precisión. · IMPUREZAS: Para impurezas cuantitativas, las determinaciones son evaluadas por muestras contaminadas con la misma cantidad de impurezas. La concentración debe ser el valor de impureza más probable de ser hallado (un valor entre 0 y el límite superior).

Evaluación: Para cada set de muestras deberán informarse la desviación standard (s), el coeficiente de variación porcentual (RSD %) y el intervalo de confianza (ver Cálculo del Intervalo de Confianza)

REPETIBILIDAD: Valoración: El valor de RSD debe ser < 2,0% siendo < 4,0 % para muestras complejas. Impurezas: El valor de RSD debe ser < 5,0%.

PRECISIÓN INTERMEDIA: Valoración: El valor de RSD para cada serie de mediciones debe ser < 2,0%, siendo < 4,0% para

muestras complejas.





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Debe cumplir con la prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales o desiguales según la prueba F (t<t tabla dos colas) con nivel de significación de a 0,05.

Impurezas: El valor de RSD debe ser < 5,0%.

REPRODUCIBILIDAD: Valoración: El valor de RSD debe ser < 2,0% (2 analistas/2 días) y para muestras complejas se establecen de acuerdo a la experiencia del Laboratorio originador en el uso de la técnica analítica y basados en el conocimiento de sus valores típicos de precisión. Debe cumplir con la prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales o desiguales según la prueba F (t<t tabla dos colas) con nivel de significación de a 0,05. Cálculo del Intervalo de Confianza:

X ± t 1- α /2 x (s/√n)Donde:x= promedio (resultado de las determinaciones)s= desvio estandarn= numero de determinacionest= estadistico con un alfa=0.05 (95% de confianza) el que equivale a 2.57 para 6 resultados, 2.20 para 12 resultados y 2.11 para 18 resultados.

d) LINEALIDAD

VALORACIÓN (HPLC, GC EUV): Metodología: Se preparan como mínimo 5 diluciones de una solución madre, que cubran por lo menos concentraciones desde el 50% al 150% de la concentración analítica de la técnica (siempre y cuando no se esté por debajo del límite de cuantificación). Inyectar o leer las diluciones por duplicado. Se grafica señal o lectura en función de la concentración y se efectúa el ajuste lineal por el método de los cuadrados mínimos. Se determina la homocedasticidad de los datos mediante grafico de residuos. Informar ordenada al origen y pendiente, y sus respectivos intervalos de confianza nivel de significación a 0,05. Realizar el test de linealidad de la regresión (ANOVA).

Evaluación: Coeficiente de regresión lineal R2 > 0,998 Grafico de residuos al azar. Cumple con el test de linealidad de la regresión: Modelo lineal adecuado (cumple con la ecuación y=ßx+ a ) Regresión significativa (cuando b diferente a 0)

VOLUMETRIA: Metodología: Se pesan por triplicado cantidades de principio activo equivalentes a 50, 75, 100, 125 150% del valor nominal de la técnica analítica y se tratan según la técnica analítica correspondiente. Valorar por duplicado alícuotas de cada una de las soluciones según técnica analítica, informas factor de respuesta (volumen de titulante consumido) en función del peso de principio activo. Se grafica volumen de titulante en función de la concentración y se efectúa el ajuste lineal por el método de los cuadrados mínimos. Se determina la homocedasticidad de los datos mediante grafico de residuos. Informar ordenada al origen y pendiente, y sus respectivos intervalos de Confianza nivel de significación a 0,05. Realizar el test de linealidad de la regresión (ANOVA).





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IMPUREZAS: Metodología: Se preparan como mínimo 5 diluciones de una solución madre con concentraciones que incluyan entre el LOQ y el 150% del limite de impurezas totales. Entre las concentraciones deben figurar el limite de impurezas individuales y el limite de impurezas totales. Inyectar las diluciones por duplicado. Se grafica señal en función de la concentración y se efectúa el ajuste lineal por el método de los cuadrados mínimos. Se determina la homocedasticidad de los datos mediante grafico de residuos. Informar ordenada al origen y pendiente, y sus respectivos intervalos de confianza nivel de significación a 0,05. Realizar el test de linealidad de la regresión (ANOVA).


e) ROBUSTEZUna consecuencia de la evaluación de la robustez es que los parámetros del test de adecuación se establecen para asegurar que la validez de la técnica se mantiene todas las veces que se la usa.

Metodología: Diferentes modificaciones pueden realizarse en las distintas metodologías tales como:

Cromatografía (HPLC, GC) · Cambio de equipo. · Cambio de columna en un sistema cromatográfico (diferente tiempo de uso y/o numero de platos teóricos, diferentes lotes y/o marcas). · pH del buffer de la fase móvil (±0.5 unidades de pH). · Proporción de la fase móvil (± 10% relativo a la cantidad presente o no más del 5% absoluto). · Concentración del buffer o modificadores con par iónico o tensioactivos (± 10% de la concentración). · Velocidad de flujo (±10%). · Temperatura de columna (±5°C). · Longitud de onda (±2nm). · Volumen de inyección (±10%). · Gradiente, tiempo y pendiente (cambiar la velocidad ±10% y/o variaciones en la pendiente. Incrementar o disminuir ±10% el tiempo en que permanece bajo condiciones isocráticas). · Tiempo de extracción de la muestra. · Estabilidad de soluciones de muestra y testigo. · Cambio de la rampa de temperatura del horno (G.C)





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· Incidencia del filtrado (comparación entre distintos tipos/marcas de membranas filtrantes contra una muestra sin filtrar o filtrada por la mejor opción según lo indica la experiencia de uso) · Variación del pH de la solución (±0.5 unidades de pH). · Diferentes fabricantes de solventes. · Cambio en el Split del inyector. · La estabilidad de las solución testigo y muestras se evalúan como un parametro independiente (ver Estabilidad de Soluciones). · Diferentes columnas y equipos pueden ser evaluados en la precisión intermedia.

TLC · Variaciones en la composición del eluyente. · pH de la fase móvil. · Volumen de siembra. · Desarrollo de la corrida.

EUV · Cambio de cubetas-celdas. · Variación de la longitud de onda en ± 2 nm.

Volumetrías · Cambio de electrodo. · Cambio de solución valorante (distinto factor, distinto lote de reactivos, etc.). · Variación de cantidad de agregados especiales (Acetato de mercurio, etc.).

Procedimiento: Según la naturaleza de la técnica analítica y la importancia que cada cambio pueda tener en dicha metodología se indicará en el protocolo correspondiente el procedimiento a realizar. Se valoran 3 muestras independientes bajo condiciones normales y las mismas con el cambio deliberado. Al menos deben probarse dos modificaciones, siguiendo los criterios convenientes de acuerdo a la técnica y los recursos existentes, si se conoce a priori que algunas variaciones alteran los resultados, pueden no ser demostradas pero se debe incluir una advertencia o nota en el informe de validación.

Evaluación:

% diferencia= {(Valor normal- valor cambio)/ Valor normal} x 100

La robustez del método es usualmente evaluada comparando el valor del ensayo obtenido bajo las condiciones modificadas, con aquel obtenido bajo condiciones normales. Los parámetros del test de adecuación son chequeados para cada muestra, cualquier anomalía debe ser reportada. Salvo que en el protocolo correspondiente indique otros limites establecidos por la experiencia en el uso de la técnica y basados en el conocimiento de sus valores típicos de precisión, los resultados del análisis obtenidos bajo las condiciones modificadas no deberán diferir por más del 2% con respecto al valor en la condición normal.

Se concluye la robustez de la técnica en cuanto al cambio de equipo HPLC y el cambio de columna cromatográfica si la Precisión arroja resultados satisfactorios.

En el caso de tratarse de muestras complejas el porcentaje de recuperación debe estar entre 94% -106%.

En el caso de una TLC, se deberá mantener la resolución de las manchas.





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f) Estabilidad de Soluciones: . La estabilidad de las soluciones provee una medida de cuanto tiempo las muestras y los estándares pueden ser mantenidos en un vial para inyección. Es parte de la evaluación de la robustez, pero no se introducen cambios deliberados en la metodología.

Metodología: Generalmente, dos muestras y dos testigos se inyectan a tiempo cero y las inyecciones se continúan cada dos horas (dependiendo del tiempo de corte del análisis) hasta por lo menos 24 horas. Pueden prepararse diferentes viales conteniendo las mismas soluciones e inyectarlas en serie. Las áreas al tiempo cero son consideradas como el 100% para cada solución.

Evaluación: Se concluye el tiempo de estabilidad estudiando los porcentajes relativos de las áreas de las soluciones. La solución se considerará estable siempre y cuando el valor obtenido para cada tiempo de análisis no difiera por mas de un 2% respecto del valor a tiempo cero. Si aparecen picos extraños en el comatograma deben ser informados. Los parámetros del test de adecuación son chequeados para cada muestra.

g) RANGO El rango se determina a partir de los resultados obtenidos en Linealidad, Exactitud y Precisión, se expresa como el intervalo en % o en unidades de concentración, calculadas sobre el contenido nominal del producto.

h) TEST DE ADECUACIÖN:

Los test están basados en el concepto que el equipo, las operaciones analíticas y las muestras a analizar constituyen un sistema integral y debe evaluarse como un todo. Los parámetros a ser evaluados para cada procedimiento en particular dependen del tipo de técnica a ser validada. El cumplimiento de la adecuación, como se explica en la Robustez , asegura que la técnica es válida en el momento de uso. Adoptamos como criterio de definición y cálculo los establecidos en USP. Por ejemplo, para técnicas cromatográficas: Se calculan parámetros cromatográficos tales como: · Resolución. · Tailing · RSD de 5 inyecciones consecutivas. · Platos teóricos. · Factor de capacidad, etc. Los mismos se obtienen automáticamente del software de los equipos HPLC Los valores establecidos para cada uno de estos parámetros definirán la performance típica del método, cada vez que se introduzca una modificación en el sistema, se deberá efectuar el test de adecuación para demostrar que la técnica sigue siendo válida.En otras técnicas, se definirá la necesidad de su determinación en el correspondiente protocolo

Evaluación: Los valores obtenidos deben estar comprendidos por los límites establecidos en el protocolo de validación. El procedimiento analítico puede contener todos o parte de los parámetros testeados en la validación, donde los valores típicos son reportados

i) LIMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN Se determinan para técnicas de pureza cromatografía, sustancias relacionadas o productos de degradación y para aquellas técnicas que puedan ser utilizadas en validaciones de limpieza.





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LIMITE DE DETECCION En el caso de métodos establecidos como oficiales casi nunca es necesario determinar el límite actual de detección. Preferiblemente el límite de detección de trabajo debe ser más bajo del nivel de detección requerido por la especificación. Por ejemplo, si se requiere detectar una impureza al nivel del 0.1%, se debe demostrar que el procedimiento realmente detecta la impureza a este nivel. Existen diferentes formas de determinar el límite de detección, cualquiera que sea el método utilizado, se requiere del análisis de un número adecuado de muestras conocidas que deben estar cercanas o preparadas a la concentración del límite de detección requerido para el tipo de ensayo a realizar.

Métodos no instrumentales(TLC, Volumetrías) Por comparación de blanco y blanco enriquecido a una sola concentración. El límite de detección se determina por medio del análisis comparativo de un blanco y de muestras independientes de blanco enriquecido con diferentes niveles de concentraciones conocidas del analito. Se compara el comportamiento de las muestras con el blanco y se establece el nivel mínimo al cual el analito puede ser realmente detectado. El blanco está constituido por los solventes y por la matriz de la muestra.

Métodos instrumentales (EUV) Basada en la desviación estándar de la respuesta y la curva de calibración. Se preparan no menos de 10 blancos independientes. Una vez preparadas las soluciones, se llevan a cabo las mediciones de cada una y posteriormente se calcula la desviación estándar de los datos. Se realiza una curva de calibración. Con estos datos se puede calcular el límite de detección.

LD= (Valor promedio del blanco + 3S) / C

Donde S es la desviación estándar de la muestra enriquecida y C es la pendiente de la curva de calibración.

Para técnicas cromatográficas (HPLC, GC) Basada en señal/ruido Se realiza una corrida de solvente de inyección por triplicado y se evalúa utilizando la sección de cálculo del nivel del ruido que se incluye en el software cromatográfico. El software Class VP de shimadzu permite calcular el ruido mediante criterio ASTM. El ruido se toma sobre el tiempo de retención del analito ± 20 veces el ancho medio del pico. Esa valor será tomado como la altura de detección (Hd), calculada como promedio del triplicado inyectado. Se correrán los testigos de la manera indicada por la técnica analítica de manera de calcular el factor de respuesta del testigo, donde:

Factor de respuesta testigo= Conc del testigo / Altura del testigo

El límite de detección se calcula como:

LD= 3 x Hd x F

Hd= altura de deteccionF= factor de respuesta del testigoLuego de determinar el LD se prepara una solución con dicha concentración y se verifica que la relación señal/ruido sea 3 a 6.

LIMITE DE CUANTIFICACIÓN En todos los casos se aplica el criterio utilizado para el límite de detección, pero se toma un factor de 10 para el área de detección. Por lo tanto :





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LQ= (LD x 10) / 3

Luego de determinar LQ se prepara una solución con dicha concentración y se verifica que la relación señal/ruido sea de 10 a 15. Realizar ensayo de reproducibilidad inyectando la solución LOQ por sextuplicado y calcular el RSD. Este debe ser < 5,0% Nota 1: En caso de realizar LQ para cuantificar impurezas de un producto / materia prima, se debe verificar que cuantifica soluciones con la concentración menor o igual límite de impurezas individuales. Nota 2: En caso de realizar LQ para una técnica utilizada en validación de limpieza se debe verificar que cuantifica soluciones menores al residuo máximo aceptado (RMA) y debe realizarse una ensayo de exactitud en el limite de cuantificación.

j) REVALIDACIÓN. Se considera que la validación es aplicable a la técnica analítica mientras la misma no presente un cambio de considerable importancia en sucesivas versiones o no haya una modificación galenica. La definición respecto a si un cambio incide o no en la validación quedará a cargo de Control de Calidad y Desarrollo Analítico, que evaluará si es necesaria la revalidación. En caso que se realice una revalidación, de acuerdo al cambio producido en la técnica, se elegirán los parámetros a ser revalidados. Todo esto debe constar en el protocolo anexo correspondiente a la validación original. La nueva documentación generada como anexo, se guarda con la documentación existente de la validación original. Todo cambio galénico o analítico debe ser informado a Aseguramiento de la Calidad siguiendo el procedimiento de control de cambios

Ajustes vs. Modificaciones:

a) Casos en los que no se requiere validación En caso de que un método figure en Farmacopea o se encuentre previamente validado solo se debe demostrar

que el laboratorio es capaz de alcanzar los niveles de Perfomance requeridos por el método: Se debe cumplir con el Test de adecuación del sistema.

En caso de que el método utilizado tenga los siguientes ajustes con respecto a un método oficial o validado, solo se debe demostrar que cumple con el Test de adecuación del sistema (USP 25 <621>) y robustez en caso de contar con el sistema cromatográfico original.

En caso de que el método utilizado tenga modificaciones no contempladas en de los siguientes parámetros respecto a un método oficial o validado se debe realizar su revalidación.

.b) Parámetros de métodos HPLC que pueden ser ajustados:

Fase móvil: . · pH: +/- 0,2 unidades de pH · Concentración de las sales de buffer: +/- 10 % (siempre que mantenga el pH en +/- 0.2) · Relación de solventes en la fase móvil: +/- 10 %

Columna: · Longitud: +/- 70 % · Diámetro interno: +/- 25 % · Tamaño de las partículas: Pueden reducirse hasta un 50 %

Temperatura de la columna: +/- 20 % (5 ºC para una temperatura de 20 ºC) Flujo: +/- 50 %

Volumen de inyección: .





Revisión:

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· Incrementar hasta 2 veces, manteniendo la forma del pico, resolución y tiempo de retención. · Disminuir mientras se mantengan valores aceptables de precisión y Sensibilidad

c) Parámetros de métodos GC que pueden ser ajustados

Columna: · Longitud de la columna: +/- 70 % · Diámetro interior: +/- 25 % (cambiar el flujo en forma proporcional) Caudal de flujo: +/- 50 % Volumen de inyección: Puede duplicarse o disminuirse mientras se mantenga la Precisión y Sensibilidad. Temperatura del horno: . · +/- 5 ºC cerca de los 20 ºC · +/- 6 ºC cerca de los 50 ºC · +/- 7 ºC cerca de los 100 ºC · +/- 8 ºC cerca de los 200 ºC Programa de temperatura: Ajuste de +/- 20 %.

k) DOCUMENTACIÓN:

1- Protocolo: Tomando en consideración las características de la técnica analítica a validar, se redacta un protocolo de validación. Este documento tendrá un formato que se adapte a las necesidades particulares que cada caso requiera, conteniendo los datos citados a continuación. El encabezado de cada pagina debe confeccionarse debe contener el código del protocolo, código y titulo de la técnica a validar, procedimiento al que hace referencia y titulo del documento. En el protocolo se hacen constar el objetivo, la fecha de redacción, nombre y firma del redactor, nombre y firmas de los responsables de aprobación, los parámetros a realizar, los criterios de aceptación que deben cumplirse y la metodología particular que se siguió para cada caso. La numeración sigue un orden correlativo, por lo que el protocolo de la segunda validación es VAL002P. Dicho protocolo se confecciona antes de comenzar con los distintos análisis, teniendo en cuenta los criterios establecidos en este SOP y los criterios consensuados dada la experiencia de trabajo con la técnica. Deberá estar revisado, aprobado y firmado por dos personas responsables antes de su ejecución. 2- Informe: Al irse cumplimentando los parámetros establecidos en el protocolo, se completa el informe correspondiente, donde se hace una breve reseña de procedimientos particulares utilizados en la validación y se informan los resultados, donde se completan con valores numéricos los resultados de los parámetros y se comparan dichos valores con los planteados en el protocolo con el fin de saber si la conclusión es el cumplimiento o no de dicho parámetro. Cuando se termina una validación, se guarda toda la documentación involucrada en una carpeta o se encuaderna, elprotocolo, el informe, la técnica analítica y todo documento relacionado del tipo cromatogramas, curvas, etc. Los informes son firmados por al menos dos personas responsables. Durante la validación, el método analítico puede ser cambiado y editado de nuevo, pero los parámetros deben estar cumplidos para la versión final. Cuando el informe es

editado y firmado, la validación está concluida. Toda la documentación incluyendo datos crudos (cromatogramas, espectros, etc.) y planillas de calculo, debe conservarse consolidada.

Responsabilidades

Área/ Puesto Responsabilidades

Lider de QA Responsable de la administración y utilización del SOP vigente. Aprobar el Informe de Validación.

Analista de Control de Calidad

Presentar el Protocolo de Validación en Blanco para su aprobación, ejecutar el protocolo aprobado y presentar el Informe de Validación.





Revisión:

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Aplicar el procedimiento, verificar los resultados obtenidos y el informe emitido y elevarlo a Aseguramiento de la Calidad para su aprobación.

Definiciones

No Aplica

Anexos

No Aplica

Formatos

No aplica.

Documentos de Referencia USP (1225) "Validation of Compendial Methods", USP 29. VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES -Text and methodology Q2(R1)- ICH, Nov. 2005. EURACHEM, The fitness for purpose of analytical methods, First Englisch Edition 1998. Analytical Procedures and Methods Validation -Draft Guidance FDA, 29/08/2000. Reviewer Guidance, Validation of Chromatographic Methods - CDER-FDA Nov. 1994.

Contacto

Mónica Pampin

Cuadro de Revisiones

Fecha de Efectividad

Versión Autor Descripción del cambio

01 S. Di Trano Primera Emision

p ar-cc-06 validacion de metodos analiticos

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