Tối ưu hóa năng suất của môi trường nuôi cấy mẻ

dựa trên dòng tế bào CHO, sử dụng môi trường có

thành phần hóa học xác định và các thiết bị sản

xuất thông dụng.

Seminar tháng 9Medium Development

Năng suất -> tối đa hóa

Quy trình -> tối ưu hóa

Nội dungI. Giới thiệu

▫ Giới thiệu chung

▫ Một số quy trình nuôi cấy quy mô công nghiệp

▫ Mục tiêu nghiên cứu và phát triển

▫ Đối tượng nghiên cứu và phát triển

II. Vật liệu phương pháp

▫ Dòng tế bào

▫ Môi trường

▫ Quy trình nuôi cấy

▫ Phương pháp phân tích

▫ Phương pháp sàn lọc nhanh các thành phần bổ sung

III. Kết quả

▫ Kết quả tối ưu hóa sinh khối

▫ Kết quả tối ưu hóa khả năng sản xuất

▫ Kết quả thẩm định sản phẩm

I. Giới thiệu•Giới thiệu chung•Một số quy trình nuôi cấy quy mô côngnghiệp•Mục tiêu nghiên cứu và phát triển•Đối tượng nghiên cứu và phát triển

Giới thiệu chung

• Sản xuất protein tái tổ hợp sử dụng tế bào động vậtđã đạt được nhiều bước tiến đáng kể trong suốt 2 thậpkỷ.

• Cuộc cách mạng về kỷ thuật kháng thể phục vụ chochuẩn đoán và liệu pháp điều trị trúng đích.

• Chinese hamster ovary (CHO), murine myeloma cell lines (NS0, SP2/0) là những dòng tế bào thông dụngcho sản xuất protein tái tổ hợp.

Một số quy trình nuôi cấy quy mô công nghiệp

• Nuôi cấy mẻ (fed-batch): Phát triển nhanh (fast development), thiết lập đơn giản (simple format), dễ

dàng scale-up, thích hợp sản xuất quy môlớn lên đến 20000 L.• Nuôi cấy liên tục (perfusion):Thể tích thu hoạch cao (high-volumetric output). Điều kiện nuôi cấy này giúp mậtđộ tế bào tăng cao và cắt ngắn thời giansản phẩm lưu trong dịch nuôi cấy. Phùhợp với các sản phẩm nhạy cảm như cácnhân tố đông máu, các protein đang bị

phân giải hoặc các trạng thái dễ bị biếntính bởi điều kiện môi trường.

Trong bài báo này sản phẩm đang sử dụng để tối ưu quy trình là kháng thể đơn dòng (loại protein có tính

chất tương đối ổn định) cho nên ưu tiên chọn sử dụng quy trình fed-batch để phát triển lên quy mô công

nghiệp.

Mục tiêu

• Tăng khả năng sản xuất

▫ Đánh giá thông qua:

Nồng độ sản phẩm (titer): g/L

Năng suất (volumetric productivity): mg/L/day

▫ Hướng tiếp cận: Tăng mật độ tế bào (increase cell mass)

Kéo dài thời gian nuôi cấy (enhance culture longevity)

Tăng cường khả năng sản xuất (improving productivity)

(Đối với dòng sx kháng thể) Ngày nay mức mong đợi thông thường ở một mẻ nuôi cấy là phải đạt nồng độ

1-5g/L hoặc năng suất 200mg/L/ngày (tương đương với >4g/L sau một mẻ 21 ngày).

Đối tượng• Môi trường nuôi cấy (media) và môi trường bổ sung (feed)

▫ Môi trường nuôi cấy đóng vai trò quyết định trong việc làm tăng nồng độ sản phẩm

▫ Nghiên cứu hướng đến kiểm soát quá trình sinh tổng hợp của tế bào theo hướng mong muốn.

Xác định công thức của môi trường dựa trên nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng của tế bào

(chemically defined formulation)

Tránh sử dụng các nguyên liệu thô có nguồn gốc động vật (animal derived raw) hoặc các sản

phẩm thủy phân có hại (ill-defined hydrolysates)

Mặc dù các sản phẩm thủy phân không bắt nguồn từ động vật vẫn đang được sử dụng rộng

rãi nhưng xu hướng hiện nay ngày càng ưu tiên sử dụng nhưng môi trường có thành phần

hóa học xác định hơn.

• Các chiến lược kiểm soát tăng trưởng (proliferation control strategies)

▫ Hạ nhiệt độ: Giảm hoặc ngăn chặn apoptosis (kéo dài thời gian nuôi cấy, tích lũy sản phẩm)

▫ Sử dụng chất ức chế apoptosis hoặc chèn gene kháng apoptosis

Kiểm soát quá trình sinh tổng hợp theo mong muốn (cứ tưởng tượng protein là Tiền cho dễ hiểu)

Giai đoạn đầu: cung cấp dinh dưỡng, cung cấp vật liệu để tổng hợp protein. (Cho nhà cửa, thức ăn, cho cả

vốn liếng làm ăn,… chỉ mong mấy đứa bằng chừng đó kiếm được càng nhiều tiền càng tốt thoi~)

Giai đoạn muộn: hướng đến mục tiêu tối thượng là bảo vệ sản phẩm, bảo vệ tế bào (Ko được tiêu tiền,

không làm mất tiền, không được làm biếng, phải kiếm thêm tiền, ngăn chặn lão hóa càng lâu càng tốt để tiếp

tục kiếm tiền và kiếm tiền… cho đến sức cùng lực kiệt nhắm mắt xuôi tay thì thoi)

*1 ví dụ minh họa cho can thiệp cần thiết vào giai đoạn muộn:

Trong quá trình đường phân, con đường từ Glucose -> pyruvate sẽ tạo ra lactate như là một hệ quả kèm theo.

Lactate tích tụ trong quá trình sẽ làm pH môi

trường ở những ngày giữa và ngày cuối giảm: gây suy thoái protein, giảm tỉ lệ sống chết của tế bào, tăng

osmo,… Vì vậy cần bổ sung sodium pyruvate vào

giai đoạn muộn của quy trình nuôi cấy nhằm giảm hình thành và tích tụ lactate theo con đường chuyển hóa

từ glucose mà vẫn đảm bảo đủ vật liệu cho hô

hấp hiếu khí.

II. Vật liệu – phương pháp• Dòng tế bào

• Môi trường

• Quy trình nuôi cấy

• Phương pháp phân tích

• Phương pháp sàn lọc nhanh các thành phần bổ sung

Dòng tế bào

• DG44 CHO

• Hệ thống biểu hiện dựa trên khuếch đại gen DHFR

• Cell line A: kháng thể đơn dòng người không cóglycosyl hóa

• Cell line B: protein dung hợp Fc (có glycosyl hóa)

Môi trường

• Môi trường cơ bản

▫ CM1: IMDM/MCDB (1:1) giàu aminoacid và TE

▫ CM2: CM1 + sản phẩm thủy phân từ thực vật

▫ CM3: CM1 + sản phẩm thủy phân + 1g/L F68

• Môi trường bổ sung

▫ CF1: có nguồn gốc từ một phần cô đặc của CM1 loại bỏ 1 số muối vô cơ.

▫ CF2: bao gồm lượng amino acid gần gấp đôi so với CF1

CF1: nồng độ aminoacid của CF1 được quyết định dựa trên tính toán mức độ hấp thu amino acid của quá

trình bổ sung hydrolysate đã được nghiên cứu trước đó.

Điều kiện nuôi cấy• Nhân giống

▫ Thaw và duy trì trong môi trường CM1 + insulin

▫ Chuyển sang flask lắc 1L

Cấy chuyền mỗi 2-3 ngày

150rpm, 36o C, 5%CO2 , độ ẩm 85%

• Điều kiện nuôi cấy trong bioreactor

▫ 5L glass bioreactor

▫ Điều kiện nuôi cấy

36o C

pH: chỉnh bằng CO2 và Na2CO3 1M (duy trì 7.0 cho dòng A, 7.1 cho dòng B)

dO: kiểm soát bằng khí air lẫn oxygen.

Tốc độ lắc: 200-350 rpm

Sục khí bề mặt: 0.01 vvm 3 ngày đầu, 0.04 vvm cho những ngày còn lại.

Bổ sung feed mỗi 24-48h kể từ ngày 3

Phương pháp phân tích

• Theo dõi trong quá trình▫ Lấy mẫu mỗi ngày từ bioreactor▫ Đo các tham số sinh tổng hợp: glucose, glutamate,

lactate, ammonium, sodium, potassium.▫ Đếm tế bào xác định mật độ và tỉ lệ sống chết▫ Đo pH, pCO2▫ Thu dịch nuôi cấy, lọc vô trùng và bảo quản 2-8oC để định lượng và kiểm tra chất lượng sau.

Phương pháp phân tích

• Nồng độ protein, nồng độ amino acid

▫ Đo bằng HPLC

• Phân tích chất lượng sản phẩm

▫ Kiểm tra sự nguyên vẹn: bộ Kit

▫ Sự kết cụm: sắc ký dựa trên kích thước

▫ Biến thể acid: Imaging capillary IEF

▫ Glycosyl hóa: Điện di mao dẫn

Phương pháp sàn lọc (screening) nhanh các thành

phần bổ sung

Phương pháp sàn lọctruyền thống

Phương pháp sànlọc nhanh

Sreening (sàn lọc) là phương pháp (hoặc kỹ thuật) dùng để chọn ra 1 đối tượng biểu hiện kiểu hình đang

quan tâm ở mức tối ưu nhất từ một nhóm các đối tượng (genetic screening, mutagenesis screening, clone

screening, component screening,…)

Phương pháp screening thông thường: nhân giống đến khi đủ số lượng tế bào -> cấy chuyền vào các thí

nghiệm lên men khác nhau (cố định feed chính và bổ sung các nhân tố khác nhau)-> sau 14-21 ngày (1 mẻ

nuôi cấy) -> thu hoạch và phân tích (DOE study) -> chọn ra nghiệm thức tối ưu nhất (chọn ra factor có ảnh

hưởng tốt nhất).

Phương pháp screening tắt: Lên men ở các bể chứa lớn (có feed) -> sau 6-7 ngày (khi tế bào đạt khoảng 10

triệu tb/mL) -> chia dịch nuôi cấy ra thành các thể tích nhỏ lẻ -> bổ sung factor khác nhau -> sau 24-48 giờ-

> thu dịch lên men và phân tích-> chọn ra nghiệm thức tối ưu nhất.

III. Kết quả• Kết quả tối ưu hóa sinh khối

• Kết quả tối ưu hóa khả năng sản xuất

• Kết quả thẩm định sản phẩm

Kết quả tối ưu hóa sinh khối Kết quả nuôi cấy dòng

A dưới 3 điều kiện

• H-1: quy trình cơ bản

có bổ sung hydrolysate

• CD-0: Quy trìn H-1

nhưng loại đi

hydrolysate

• CD-1: quy trình sau

khi đã tối ưu hóa môi

trường và feed

Chú thích hình:

A: mật độ tế bào

B: tỉ lệ sống chết

C: Nồng độ protein

D: Năng suất theo ngày

Quy trình CD-0 và CD-1 là quy trình nuôi cấy mà sử dụng từ môi trường đến feed đều có thành phần hóa

học xác định.

Bắt đầu từ việc thực hiện nuôi cấy dòng tế bào A trong H-1 đã thu được kết quả vượt trội so với CD-0.

Quyết định chọn kết quả nền thu được sau khi nuôi cấy bằng môi trường H-1 làm tiêu chuẩn để tối ưu hóa

quy trình CD-0.

Thông qua so sánh kết quả giữa H-1 và CD-0 đã cho thấy vai trò của hydrolysate giúp hỗ trợ tăng sinh tế

bào và duy trì mật độ sống chết.

Để cải thiệu khả năng tăng trưởng: người ta tiến hành đo mức hấp thu aminoacid ở cả quy trình CD lẫn quy

trình có bổ sung hydrolysate. Tiến hành điều chỉnh việc bổ sung hàm lượng cả amino acid thiết yếu lẫn

không thiết yếu trong quá trình nuôi cấy (theo tài liệu tham khảo 35)

Để kéo dài thời gian nuôi cấy: tiến hành khảo sát các nồng độ nhân tố vết (trace element) khác nhau trong

feed CF1 cho thấy các nhân tố vết có ảnh hưởng đáng kể lên khả năng duy trì tỉ lệ sống chết của quy trình.

Từ đó hình thành quy trình CD-1 cho kết quả tương đương H-1 về tối ưu hóa sinh khối và tăng vượt trội sản

lượng tích lũy 1 cách rõ rệt.

Tóm lược kết quả tối ưu hóa sinh khối

Ký hiệu Đỉnh tăngtrưởng (tb/mL)

Tỉ lệ sống ngàycuối

Tuổi thọmôi trường

Nồng độngày cuối

H-1 20 triệu 83% 12 ngày 2.5 g/L

CD-0 16 triệu 55% 11 ngày 2 g/L

CD-1 20 triệu 68% 18 ngày 4.5 g/L

Kết quả tối ưu hóa khả năng sản xuấtKết quả phát triển môi trườngnuôi cấy dòng tế bào A sau 3 lầntối ưu hóa thành phần hóa học.• CD-1: quy trình sau khi tối ưu sinhkhối thành công.• CD-2: quy trình sử dụng feed CF2a• CD-3: quy trình sử dụng feed CF2bA: Mật độ tế bào (triệu tb/mL)B: Tỉ lệ sống chết (%)C: Nồng độ sản phẩm (mg/L)D: Năng suất theo ngày (mg/L/ngày)E: Nồng độ ammonium tích tụ (mM)F: tương quan nồng độ với tích phântế bào khả kiến.

CD-1: là quy trình nuôi cấy chọn được sau quá trình nghiên cứu tối ưu hóa khả năng tăng sinh và duy trì thời

gian sống của tế bảo

Phát hiện về nồng độ ammonium tăng dần gây tác động đến chất lượng sản phẩm và sinh lý tế bào. Bằng

phương pháp sàn lọc nhanh để chọn ra nhân tố có tác động tích cực đến việc ức chế tích tụ ammonium và

ứng dụng để phát triển tạo thành feed CF2a sử dụng cho quy trình CD-2.

Thêm vào đó bổ sung thêm các chất xác định nhằm tăng cường năng suất như: acid béo, steroid, đường đôi,

đường ba, nucleotide, nucleoside, lipid ,… Dần dần hình thành feed CF2b sử dụng cho quy trình CD-3.

Tất cả những phiên bản mới của CF2 không làm tăng khả năng sản xuất nội tại ở pha tăng trưởng nhưng lại

cải thiện đáng kể khả năng sản xuất trong pha ổn định.

Tóm lược kết quả tối ưu hóa khả năng sản xuất

Ký hiệu Đỉnh tăng trưởng(tb/mL)

Tỉ lệ sốngngày cuối

Tuổi thọ môitrường

Nồng độngày cuối

CD-1 20 triệu <70% 18 ngày 4.5 g/L

CD-2 21 triệu <80% 18 ngày 8 g/L

CD-3 22 triệu >90% 18 ngày 9.8 g/L

Sử dụng dòng tế bào B dùng để xác nhận một lần nữa kết quả tối ưu hóa quy

trình đạt được khi nuôi bằng quy trình CD-2:

• Mật độ cao nhất: 24 triệu tb/mL

• Tỉ lệ lúc thu hoạch: trên 70% (ngày 18)

• Nồng độ đạt được: 11 g/L

Kết quả thẩm định sản phẩm

• Tính toàn vẹn và % kết cụm kháng thể có sự thay đổi

không đáng kể so với quy trình chuẩn

• Có sự tăng biến thể acid lên đến mức tối đa là 50%.

Hiện tượng này có thể là do sự khử amin hóa.

• Khả năng glycosyl hóa diễn ra bình thường. Quy

trình CD-2 cho khả năng galactosyl hóa cao hơn.

Chưa hiểu lắm về sự khử amin hóa gây ra do nguyên nhân nào và có những ảnh hưởng tốt hay xấu.