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FITOQUMICA, EFECTO ANTITUMORAL EN UN MODELO DE LINFOMA L5178Y Y TOXICIDAD AGUDA ORAL DEL Agave

lechuguilla Torrey (lechuguilla) EN RATONES CD1

UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE HIDALGOINSTITUTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

REA ACADMICA DE FARMACIA

M. en C. Almaguer Vargas GeorginaM. en C. Almaguer Vargas Georgina

1

A nivel internacional la mortalidad porcncer aumentar un 45% entre 2007y 2030 (OMS 2008).

Cncer

En Mxico durante el ao 2008 ocupoel tercer lugar de mortalidad(INEGI,2010).

2

Mxico, principal causade muerte en nios deentre 1 y 14 aos,entre 1 y 14 aos,(INEGI,2007).

3

Tratamientos actuales

El frmaco anticanceroso ideal es el quepudiera destruir slo las clulascancerosas sin daar las normales, peroeste frmaco no existe.este frmaco no existe.

4

rgano y/o sistema Reacciones Adversas del sulfato de vincristina

Nervioso central Neurotoxicidad, neuropata perifrica, parestesia, coma, crisis convulsivas, cefalea, perdida de la sensibilidad, ataxia, vrtigo.

Cardiovascular hipertensin, hipotensin, infarto al miocardio.

Dermatolgico Alopecia, rash, flebitis.

GastrointestinalNuseas, estomatitis, diarrea, estreimiento, leo paraltico,vmitos, distencin abdominal, lceras orales, necrosis intestinal.intestinal.

Respiratorio Broncoespasmo severo, disnea progresiva, parlisis respiratoria.

Hematolgico Anemia, pancitopenia, leucopenia, trombocitopenia.

Heptico Hepatotoxicidad, enfermedad heptica venooclusiva.Renal/genitourinario Incontinencia urinaria, nicturia, poliuria, retencin urinaria.

Endocrino/metablico

Hiponatremia, azoemia, deshidratacin, hiperuricemia, hipopotasemia.

Musculoesqueltico Debilidad muscular, mialgias, dolor en espalda, dolor seo.

OtrosReacciones de hipersensibilidad, necrosis, anafilaxia, ototoxicidad, ceguera, ceguera nocturna, fotofobia, nistagmus, fiebre.

Las Reacciones Adversas escritas en negritas ponen en peligro la vida del paciente, las escritas en cursiva son frecuentes y lasescritas de forma normal, son poco frecuentes.

5

Por lo tanto la baja eficiencia, altatoxicidad y elevado costo de la terapiaanticancer, son las principales causaspor las que siempre existe unapor las que siempre existe unabsqueda de tratamientos alternativos

6

Plantas utilizadas

Alcaloides de la vinca

Paclitaxel

Epipodofilotoxinas

Analogos de Camptotecina

7

En el Estado de Hidalgoalgunas de las plantas que seutilizan contra el cncer sonlas hierbas del cncerduraznillo, paete, Aranth,Apancholoa, Borraja,Cuachalalate, Palo de Brasil,

Maguey (Agave)

Cuachalalate, Palo de Brasil,Cancerina, Tlanchichinole,Maguey, etc

8

GANANCIA DE PESO POSTRANSPLANTE DE LEUCEMIA

CON DIFERENTES PLANTAS

15

20

25

gra

mo

s

CONTROL

VINCRISTINA

PENQUITA4mg/kgARANTH* *

GANANCIA DE PESO POSTRANSPLANTE DE LEUCEMIA

CON DIFERENTES PLANTAS

15

20

25

gra

mo

s

CONTROL

VINCRISTINA

PENQUITA4mg/kg

0

5

10

15

TRATAMIENTOS

gra

mo

s 4mg/kgARANTHETANOLICODURAZNILLO16.6mg/kgARANTHACUOSOPAETE 4mg/kg

DURAZNILLO 6.6mg/kg

* *

0

5

10

15

TRATAMIENTOS

gra

mo

s 4mg/kgARANTHETANOLICODURAZNILLO16.6mg/kgARANTHACUOSOPAETE 4mg/kg

DURAZNILLO 6.6mg/kg

* *

9

ANTECEDENTES

Las saponinas

responsables del

efecto antitumoral in

vitro

Fuente: Secretaria de Desarrollo Rural,Puebla, 2005-2011

1.Bianchi, E. and Cole, J. R. Antitumor Agents from Agave Schottii (Amaryllidaceae). Journal Pharmaceutical Sciences. Vol. 58, No. 5. 1969. p. 589 591 2.Yokusaka, y col. A new steridal saponin from the leaves of Agave americana. Planta Mdica. Mayo 2002 66(4):393-63.Ohtsuki T. y Col New chlorogenin hexasacharide isolated from Agave fourcroydes with cytotoxic and cell cycle inhibitory activities. Bioorg Med Chem 2004 jul 15;12(14):38441-5

10

ANTECEDENTES

lechuguilla

Agave lechuguilla Torrey

Significativa concentracin deesmilogenina (precursor esteroideo).

Origen para la manufactura dedrogas esteroideas.

Por Elia Resendiz

11

OBJETIVO

Determinar cualitativamente la presencia de metabolitos secundarios,observar el efecto antitumoral en un modelo de linfoma murino L5178Y y latoxicidad aguda oral del Agave lechuguilla Torrey (lechuguilla) en ratonestoxicidad aguda oral del Agave lechuguilla Torrey (lechuguilla) en ratonesCD1.

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OBJETIVOS ESPECFICOS

Realiz el tamizaje fitoqumico preliminar del Agave lechuguilla Torrey.

Determin el efecto en el peso de ratones CD1 con leucemia murinaL5178Y en presencia del zumo del Agave lechuguilla Torrey.

Cuantific el tiempo de sobrevida postransplante de los ratones CD1 conleucemia murina L5178Y, tras la administracin del zumo del Agavelechuguilla Torrey.

Determin la toxicidad aguda oral del zumo del Agave lechuguilla.

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METODOLOGA-Material Biolgico

a) Colecta de la penca del agave lechuguilla

6 y 6:30 a.m. en la localidad de San Jos Tepenene, Municipio de ElArenal, Hidalgo, Mxico.En el mes de abril.Clima templado y sin lluvias.Dr. Miguel ngel Villavicencio.

14


Agave (10g) + ter etlico (10 veces el peso de la penca)

48h, filtrar

Residuo slido + alcoholExtracto etreo 48h, filtrar

b) Tamizaje fitoqumico preliminar

48h, filtrar

Extracto alcohlico

Residuo slido + agua destilada

Extracto acuoso

Residuo

Desechar

15


GRUPO DE METABOLITOS

ENSAYOS EVIDENCIAS

AlcaloidesDragendorff

MayerWagner

Opalescencia (+), turbidez (++),color rojo ladrillo, blanco o amarillo(+++)

Triterpenos y

SolkowskiLieberman-Burchard

Color verde oscuro (+)Coloracin amarilla-rojiza (+)

Determinacin cualitativa de los grupos de metabolitos.

yEsteroides

BurchardRosemheim

Coloracin amarilla-rojiza (+)Color violeta-azl (+)

Quinonas Borntranger Color rosa (++), rojo (+++)

CumarinasBaljetLegalErlich

Color rojo intenso o naranja (++),precipitado rojo (+++)

Saponinas Espuma2 mm de altura que persiste por msde 2 min.

Poliurnidos Poliurnidos Precipitado (+)Resinas Resinas Precipitado (++)

Muclagos MuclagosConsistencia gomosa o gelatinosa(+)

Ref. Miranda M. Mtodo de extraccin de productos naturales. En: Farmacognosia y productosnaturales. La Habana,Cuba.2001.

16


GRUPO DE METABOLITOS

ENSAYOS EVIDENCIAS

Aceites esenciales ySubstancias grasas

Sudan IIIGotas oleosas de color rojo oscuro(++)

Azcares reductoresFehling

BenedictColor o precipitado rojo (+)

Fenoles y taninos Cloruro frricoColor o precipitado verde oscuro(+)

Determinacin cualitativa de los grupos de metabolitos. (Cont.)

Fenoles y taninos Cloruro frrico(+)

Aminocidos libres y aminas en general

Ninhidrina Color azl-violaceo (+)

Carbohidratos Molisch Anillo violceo (+)Glicsidos cardiacos Kedde Color azl o violeta por 2 h (+)

Flavonoides

c. sulfrico concentrado

ShinodaRosemheim

Color amarillo, naranja, rosado,vino, carmelita o rojo intenso,marrn (+)

Principios amargos y/o astringentes

Sabor Reconociendo el saborRef. Miranda M. Mtodo de extraccin de productos naturales. En: Farmacognosia y productosnaturales. La Habana,Cuba.2001.

17


c) Obtencin del zumo de la penca del agave lechuguilla.

Por duplicado, se cort y peso la base de la hoja del agave lechuguilla.

18


La base de una penca del agavefue asada sobre una parrillaelctrica (158C), durante 15min.

lechuguillalechuguilla

Otra base de diferente hoja delmismo agave se empleo encrudo.

19


Se realiz la extraccin del zumo de la penca asada o cruda.

20


d) Ratones CD1 inoculados con leucemia L5178Y.

Inoculacin (IP) de roedores sanos

5

Leucemia murina L5178Y

3

Conteo de leucocitos

4

6.252x106

Roedores con leucemia L5178Y (5)

1

1.563x105

2

Obtencin de leucemia

6

Integracin de lotes

NOM-062-ZOO-1999 y NOM-087-ECOL-SSA1-2002 21


e) Integracin de lotes

Roedores CD1 machos

Peso promedio de 30 gramos.4 lotes al azar; zumo de la penca asada, zumo de la penca cruda, controlnegativo con agua y control positivo con sulfato de vincristina (0.03mg/KgPV de los ratones).7 roedores cada uno.

Control negativo

Control positivo

22

METODOLOGA-Efecto antitumoral del zumo del agave lechuguilla

a) Ganancia en peso de los ratones inoculados con leucemiaL5178Y y tratados con el zumo del agave lechuguilla.

Se registr el peso de los roedores al inicio del proyecto y posteriormentecada 48h.Se administr el zumo crudo o asado de la penca del agave lechuguilla(4000mg/Kg PV).

23


b) Tiempo de sobrevida postransplante de los ratones inoculados con leucemia L5178Y y tratados con el zumo del agave

lechuguilla.

Los roedores se observaron cada 24h, con el objeto de anotar el da demuerte de cada animal.Prueba de Anlisis de Varianza (ANOVA) y de Tukey.Significancia estadstica valores de p


c) Prueba de toxicidad aguda oral dosis fijas

5 hembras nuliparas no preadas y 5 roedores machos sanos para las 4cantidades empleadas de cada uno de los zumos del agave.Peso aproximado de 30g.7 das en periodo de adaptacin.

Hembras (5)

Machos (5)

25


Los animales se mantuvieron en ayuno desde la noche anterior al inicio delproyecto y durante las siguientes 3 4h.Se registr el peso inicial de los roedores previo a la administracin delzumo de la penca del Agave, as como los das, 2, 3, 7 y 14.5, 50, 500 y 2000mg/Kg peso vivo (PV) en ambos sexos.

26


H1 H2 H3

MachosHembras

Los roedores se observaron durante los 14 das posteriores al inicio de laprueba (signos de toxicidad; piel, ojos, temblor, salivacin, diarrea,somnolencia) .

M1M2

M3

27


La evaluacin txica del zumo de Agave.

Cantidad Resultados Interpretacin

5 mg/Kg P.V.

Menos del 100% sobrevive. Muy txico.100% sobrevive; pero la toxicidad es evidente.

Txico.

100% sobrevive; sin toxicidad evidente.

Ver resultados a dosis de 50 mg/Kg.

50 mg/Kg P.V.

Menos del 100% sobrevive.Posiblemente txico o muy txico. Ver resultados a dosis de 5 mg/Kg.

100% sobrevive; pero la Daino.

Ref. Comision of the European Communities. Regulation of the European Parliament and of the Council Concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restrictions of Chemicals. Brussels. 2003.

50 mg/Kg P.V.100% sobrevive; pero la toxicidad es evidente.

Daino.



500 mg/Kg P.V.

Menos del 100% sobrevive.Posiblemente txico o daino. Ver resultados a dosis de 50 mg/Kg.

100% sobrevive; pero la toxicidad es evidente.

Presenta toxicidad aguda no significativa.



2000 mg/Kg P.V.

Menos del 100% sobrevive. Ver resultados a dosis de 500 mg/Kg.100% sobrevive; con o sin toxicidad evidente.

Sin toxicidad aguda significativa

28


Se procedi a sacrificar los roedores con pentobarbital sdico (IP).Se realiz la necropsia.Observar posible dao macroscpico en hgado, rin, bazo y testculos.

29

RESULTADOSRESULTADOS

30

Tamizaje fitoqumico preliminar del agave lechuguilla

RESULTADOS

Grupo de metabolitos secundarios

A. lechuguilla Torrey

E Al Ac

Alcaloides - - -Triterpenos y esteroides - ++ -

Cumarinas - + -Saponinas - +++ +++

Triterpenos - +++ +++

Poliurnidos - - -Resinas - - -

Muclagos - - -Aceites esenciales y sustancias

grasas - - -

Azucares reductores - +++ ++Fenoles y taninos - + ++

Aminocidos libres y aminas en general - +++ -

Carbohidratos y/o glicsidos - - +Flavonoides - - -

Principios amargos y astringentes *** Amargo. ** Inspido .

CumarinasTriterpenos y esteroidesSaponinas

Fenoles y taninos31

Ganancia en peso de los ratones con leucemia L5178Y y tratados con el zumo del agave lechuguilla

RESULTADOS

Pes

o (

g) 1 5

1 8

2 1

2 4 ******

Figura 1: Ganancia de peso en los ratones CD1 con leucemiamurina en presencia de A. lechuguilla Torrey (lechuguilla). Cadabarra representa la media error estndar de una muestra (n)igual a 7. *p

RESULTADOS

Tiempo de sobrevida de los ratones con leucemia l5178y y tratados con el zumo asado y crudo del agave lechuguilla

So

bre

vid

a (d

as)

1 41 61 82 02 22 42 62 8

T r a t a m ie n t o ( m g /K g )

So

bre

vid

a (d

as)

02468

1 01 21 4

C o n t r o ln e g a t iv o

S u lfa to d ev in c r is t in a

Z u m o a s a d o

Z u m oc r u d o

Figura 2: Das de vida de los ratones CD1 con leucemiamurina en presencia de A. lechuguilla Torrey (lechuguilla).Cada barra representa la media error estndar de unamuestra (n) igual a 7.

33

RESULTADOS

Toxicidad aguda oral en ratones CD1 en presencia de Agave lechuguilla Torrey (lechuguilla).

Zumo

Lotes

rganos

Bazo Rin HgadoTestculos /

Ovarios

Hem

bras

(H

)

1 Congestin sangunea PetequiasCongestin sangunea,

petequias, zonas de infartoNormal

2Congestin sangunea,

esplenomegaliaPetequias

Petequias, congestinsangunea, zonas de infarto

Normal

3Esplenomegalia,

congestin sangunea

Edema, congestin sangunea, grasa,

Cirrosis, congestinsangunea, chocado, Normal

Asa

do

Hem

bras

(H

)

3congestin sangunea

sangunea, grasa, petequias

sangunea, chocado, petequias, zonas de infarto

Normal

4Esplenomegalia, zonas de

infartoNormal

Congestin sangunea, necrosis, petequias, zonas

de infartoNormal

Mac

hos

(M)

1 Normal Edema, graso Graso Normal

2 EsplenomegaliaEdema, zona de

infartoCongestin sangunea, zonas de infarto, graso

Normal


esplenomegalia, edema, zonas de infarto

Congestin sangunea, edema,

petequias

Congestin sangunea, petequias, zonas de infarto

Normal


esplenomegalia

Congestin sangunea, edema,

petequias

Congestin sangunea, petequias, zonas de infarto

Congestin sangunea

Las cantidades administradas para los grupos tanto hembras (H) como machos (M) integrados por 5 roedores cada uno, fueronlas siguientes: Lote 1, 5mg/Kg PV; Lote 2, 50mg/Kg PV; Lote 3, 500mg/Kg PV; Lote 4, 2000mg/Kg PV.

34

RESULTADOS

Zumo Lotes rganos

Bazo Rin HgadoTestculos / Ovarios

Otros

Hem

bras

(H

)

1 Normal PetequiasCirrosis, petequias,

zonas de infartoNormal

2 NormalPetequias, zonas

de infartoCirrosis, petequias,

zonas de infartoNormal

Ojos: Ceguera

3 NormalEdema, petequias,

zonas de infarto

Cirrosis, edema, petequias, zonas de

infartoNormal

Ojos: Ceguera

Toxicidad aguda oral en ratones CD1 en presencia de Agave lechuguilla Torrey (lechuguilla). (Cont.)

Cru

do

Hem

bras

(H

)

zonas de infartoinfarto

Ceguera

4Congestin

sangunea, edema, zonas de infarto

Zonas de infarto, petequias

Congestin sangunea, cirrosis, zonas de infarto

NormalOjos:

Ceguera

Mac

hos

(M)

1 Normal Edema Zona de infarto, edema Normal

2 Normal Edema Congestin sangunea Normal

3 NormalCongestin

sangunea, edemaCirrosis Normal

4 Zonas de infartoCongestin

sangunea, edemaCirrosis Normal

Las cantidades administradas para los grupos tanto hembras (H) como machos (M) integrados por 5 roedores cada uno, fueronlas siguientes: Lote 1, 5mg/Kg PV; Lote 2, 50mg/Kg PV; Lote 3, 500mg/Kg PV; Lote 4, 2000mg/Kg PV.

35

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

36

CONCLUSIONES

Presencia de alcaloides, triterpenos, esteroides, azucares reductores,fenoles, taninos, aminocidos libres, carbohidratos y saponinas.

Inhibicin en el desarrollo de la leucemia murina L5178Y inoculada en losratones CD1, en presencia del zumo crudo de A. lechuguilla Torreyratones CD1, en presencia del zumo crudo de A. lechuguilla Torrey(lechuguilla).

Tiempo de sobrevida postransplante disminuy drsticamente tras laadministracin de ambos zumos de la planta.

No se observ toxicidad aguda, ya que los animales experimentales nomurieron durante la prueba toxicolgica.

Dao macroscpico observado en bazo, hgado, rin

37

Perspectivas

Tratar de disminuir la toxicidad Realizar el estudio con otras dosis Con otros agaves Con otros tipos de tumores Con otros tipos de tumores Probar si el efecto se atribuye a las

saponinas

38

DOSIS SOLA FACIT VENENUM

Todo es veneno dependiendo de la dosis

Paracelso..

POR SU ATENCIN:

G R A C I A S

39

p09.ppt [modo de compatibilidad] -...

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