Paecilomyces Fumosoroseus

Universidad Autónoma de Nuevo LeónFacultad de Ciencias Químicas

Licenciado en Química Industrial

Leyda Elizabeth López García Septiembre de 2010

Fundamentos de Microbiología y Bioquímica

• Reino: Fungi • Phylum: Ascomycota

– Se les conoce como hongos de saco, sus ascas o bolsas producen una catidad determinada de esporas en su interior.

• Clase: Eurotiomycetes– Producen estructuras en forma de saco que contienen

ascosporas ya sea en un cerrado cuerpo fructífero (ascocarpo) o bolas de esporas

• Orden: Eurotiales– Hongos del saco con ascosporas dextrinoides, fases

imperfectas con fialósporas• Familia: Trichocomaceae

– Son saprobios con estrategias de colonización agresiva, adaptable a condiciones ambientales extremas.

• Género: Paecilomyces– Es un género de hongos nematófagos que mata nematodos

nocivos por patogenia, causa enfermedad en los nematodos.

Características

• Paecilomyces tiene alrededor de 35 especies diferentes.

• Es hongo filamentoso e imperfecto que habita en el suelo, las plantas decadentes, productos alimenticios, papel y tabaco.

• Paecilomyces es normalmente considerado como un contaminante.

• Son importantes industrialmente como productores de ácido cítrico y glucónico, antimicóticos y antibióticos (por ejemplo, variotin).

• Algunas especies también son importantes la agricultura, ya que pueden estimular el crecimiento de cultivos importantes como la cebada y el maíz.

• El color de la colonia y ciertas características microscópicas ayudan en la diferenciación de las especies Paecilomyces unos de otros.

• Otra característica que ayuda en la identificación de especies es que Paecilomyces fumosoroseus y variotii son termófilas y pueden crecer bien a temperaturas tan altas como 50 °C y 60 °C.

Características microscópicas• Presentan hifas hialinas, amarillosas,

septadas de paredes delgadas. • Conidióforos son a menudo verticiliados o

irregularmente ramificados con un tamaño que va desde 3 hasta 4 x 400 a 600 micras y llevan fiálides en las puntas de cada rama, las cuales pueden estar en grupos o solitarias.

• Fiálides constan de una proporción basal cilíndrica, hinchados en sus bases, alargada y delgada en las puntas para formar un cuello muy notorio, y suelen agruparse en el cepillo - estructuras como en los extremos de los Conidióforos.

• Las conidias en forma de ovoide, unicelulares, hialinas a color oscuro, lisa o rugosa, y aparecen en largas cadenas.

• Clamidosporas a veces están presentes.

Características macroscópicas

• La tasa de crecimiento es rápida y las colonias son planas, en polvo o en la textura aterciopelada y maduran dentro de tres días.

• El color de las colonias inicialmente superficie es blanca y se vuelven amarillo, amarillo - verde, amarillo - café, aceite de oliva - marrón, rosa o violeta, dependiendo de la especie, mientras que atrás está sucio, piel de ante blanco o marrón.

• Se pueden distinguir del género Penicillium relacionados muy de cerca por tener largos y delgados fiálides divergentes y colonias que no son típicamente de color verde o azul - verde.

Nutrición

Los hongos Paecilomyces poseen características muy especiales que les permiten sobrevivir en forma parasítica sobre los insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposición. El crecimiento saprofito puede dar como resultado la producción de conidióforos, conidias y desarrollo miceliano. Esta característica permite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando técnicas de producción en masa de bajo costo.

PAPA DEXTROSA AGAR (PDA)

• Es un medio muy usado que sirve para aislar todo tipo de hongos Beauveria, Paecilomyces, Lecanicillium (Verticillium) y Metarhizium, los más importantes hongos parásitos de insectos, al igual que los parásitos de plantas y los hongos saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio.

• Cuando se aíslan hongos a partir de insectos colectados del suelo, es recomendable acidificar el medio con ácido láctico al 25%. Se agregan 3 ó 4 gotas sobre el agar solidificado de la placa con el objeto de evitar el desarrollo de bacterias.

• Con los mismos ingredientes, excluyendo el agar, se obtiene el medio líquido de Papa Dextrosa (PD), muy utilizado para la preparación del inóculo en forma masiva.

• Composición:Papa sin pelar 200 g, Dextrosa 10 g, Agar 18 g, Agua destilada 1 litro

• Preparación:Lavar las papas, cortarlas y hacerlas hervir en un litro de agua destilada por 20 minutos, colar y disolver en el líquido la dextrosa y el agar. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión.

Papa Agar Levadura • Composición por litro:

papas cortadas 300.0gglucosa 20gagar 15gExtracto de levadura 5,0 g

• Preparación del medio de cultivo: Colocar las papas y en un recipiente con 500.0mL de agua hirviendo por 30 min. Colar con una gasa. Ajuste el volumen a 1.0L con agua destilada desionizada. Mezclar bien. Añadir el agar. Calentar suavemente y llevar a ebullición. Añadir 20.0g de la glucosa. Mezclar bien. Distribuir en tubos o frascos. Esterilizar en autoclave durante 15 min. a 15 psi de presión a 121 ° C. Verter en cajas Petri estériles o en tubos.Uso: para el cultivo y mantenimiento de Paecilimyces fumosoroseus.

Crecimiento

• La luz solar es probablemente el factor ambiental que más afecta la persistenia de Paecilomyces fumosoroseus; las temperaturas presentes en la mayoría de los agroecosistemas, las cuales varían entre 10 y 40 °C, generalmente no afectan adversamente a estos microorganismos, las temperaturas extremas , sin embargo, pueden afectar cuando han sido influenciados por otros factores como la luz, agua o agroquímicos. La humedad relativa (HR) es un requerimiento primordial para la germinación de las conidias y sobrevivencia de los hongos.

• Bajo condiciones de laboratorio el desarrollo más rápido de Paecilomyces fumosoroseus con HR de 100% ocurre a 30 °C, esporulando a las 72 horas sobre pupas de mosquita blanca; a 20 °C el desarrollo del hongo declina significativamente pero completa su ciclo. En general la temperatura óptima para la germinación y crecimiento del patógeno en medio artificial es de 25 °C.

• Una disminución de la HR provoca inactivación significativa de Paecilomyces fumosoroseus sobre el huésped. La activación inicial de la conidia se observa en 168 horas a 85% de HR y a 80% de HR no hay desarrollo. El crecimiento más rápido de l hongo se obtiene a 100% de HR.

• Forma en la que crecen en un huésped:El conidio de Paecilomyces fumosoroseus se adhire al dorso del insecto, el tubo germinativo penetra y la hifa está presente en el interior del huésped, el cual tiene un rango de vida entre 24 y 48 horas después de que el conidio entra en contacto con el insecto. El micelio de Paecilomyces fumosoroseus emerge del cuerpo del huésped en 48 horas y esporula a las 72 horas. Las conidias de Paecilomyces fumosoroseus son producidas en racimos secos los cuáles son fácilmente dispersados por el viento originando la infección en huéspedes sanos.

• Al cultivarlos en Papa Dextrosa más Extracto de Levadura líquido se puede obtener un crecimiento de colonia en 15 días.

Conservación• La conservación de los hongos consiste en mantenerlos

viables. En la actualidad existen varios métodos para conservar los hongos por periodos prolongados, los mismos que implican el uso de material variado.

• Existen dos principios de conservación: 1) donde se reduce el metabolismo y 2) donde se induce la dormancia de las conidias o esporas.

• La reducción del metabolismo, incluye la conservación mediante bajas temperaturas, uso del aceite mineral, agua estéril, suelo estéril, etc. En la inducción de la dormancia, se incluye el secado sobre sílica gel y la liofilización.

• Hay otros métodos más económicos, como el uso de aceite mineral, pero no es seguro, porque el hongo puede seguir creciendo en condiciones de desventaja, además, no está garantizada su pureza.

Colección

• Colectar consiste en recoger insectos vivos o muertos, en el follaje, tallos, corteza de los árboles, sobre la superficie o en el interior de éstos, en el suelo, inclusive en crianzas masivas de laboratorio; y colocarlo en una placa o frasco, pero nunca en sobre papel o en medio líquido. Se deben colectar insectos en diferentes estados de desarrollo que presenten signos iniciales o avanzados de estar parasitados.

Una vez en el laboratorio, las muestras son procesadas como se describe:

1. Remojar el insecto en hipoclorito de sodio (0.5% del producto activo) durante 5 minutos.

2. Enjuagar tres a cuatro veces con agua destilada estéril.

3. Colocar papel de filtro estéril en una caja Petri esterilizada y agregar agua destilada estéril.

4. Colocar el insecto sobre el papel de filtro dentro de la caja.

5. Sellar la placa con parafilm.6. Incubar a 20 °C durante 7 días. 7. Con una aguja de siembra, en la cámara de

flujo laminar, tocar levemente el cuerpo del insecto donde se vea crecimiento fungoso y transferir su contenido a medio de cultivo.

Aislamiento

• Para establecer una colección confiable, es necesario partir de aislamientos monospóricos que garanticen la autenticidad y pureza de los mismos y de los datos que se consigan. Los aislamientos monospóricos pueden ser por colonia o por punta de hifa.

• Sembrar el hongo que se ha aislado directamente del insecto, en un tubo inclinado con medio de cultivo e incubarlo a 20 °C durante 5 días.

• Preparar una suspensión de esporas, a partir del tubo con el hongo en desarrollo.

• Hacer las diluciones que sean necesarias para tener una suspensión a una concentración de 50 a 100 esporas por mililitro.

• Sembrar 100 μl de la concentración deseada en una placa con medio PDA y distribuirla con una espátula de Drigalski, dentro de la cámara de flujo laminar.

• Incubar a 20 °C por espacio de una semana.• Cortar con una hoja de bisturí estéril una

colonia en formación y transferirla a otra placa con PDA.

Identificación

Prueba morfológica:• Existen varias claves de identificación de

hongos, una de ellas es “CMI descriptions of pathogenic fungi and bacteria” perteneciente a la Commonwealth Micological Institute, donde se encuentran descritas las especies de hongos entomopatógenos.

• Esta caracterización se basa en la descripción de la colonia (macroscópica) así como de las estructuras del hongo (microscópica).

Descripción de la colonia1. Con un asa de siembra, tocar ligeramente el

hongo a propagar y sembrar por punción en ángulo recto en el centro de la placa conteniendo el medio de cultivo PDA.

2. Incubar a 20 °C durante 15 días.3. Observar la forma de crecimiento de la colonia,

tamaño (el cual se mide de lado a lado pasando por el centro en dos puntos de la colonia), aspecto, textura y coloración de ambas caras y la producción de pigmentos.

• Colonia : en PDA inicialmente blanca, luego adquiere un tinte rosado muy tenue. El revés de la colonia es al comienzo ligeramente amarillento, pero a medida que pasa el tiempo se vuelve de color anaranjado intenso.

Descripción del hongoPara la descripción del hongo mediante una observación microscópica de sus estructuras, es necesario realizar una tinción o coloración, siendo el procedimiento el siguiente:

1. Sembrar el hongo en una placa con medio de cultivo PDA.2. Esperar el crecimiento por espacio de 15 días.3. En una lámina portaobjetos colocar una pequeña muestra del tejido

hifal, dispersarla y colocarle un cubreobjeto.4. Observar al microscopio las estructuras.5. Medir la longitud y el diámetro de cualquier estructura de interés.

Este método permite ver las estructuras sin que pierda su disposición natural y sin perturbar mucho su morfología.

• Conidióforos: generalmente terminales pero también se forman en cualquier parte del micelio. Alcanzan hasta 100μde largo x 1.5 a 3 μ de diámetro.

• Fiálides: son estructuras en cuyo interior se forman las conidias. Se insertan en el ápice de los conidióforos en grupos compactos de tres a seis. También tienen forma de botella con la base ancha que se va adelgazando. Miden de 5 a 7 μm de largo x 2.5 a 3 μm de diámetro, que se reduce a 0.5 μm en el extremo superior.

• Conidia: cilíndrica a fusiforme de extremos redondeados, miden de 3 a 5 x 1 a 2 μ, se observan en cadenas largas.

CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA:Esta caracterización se basa en la evaluación de rendimiento en número de conidias y viabilidad de las mismas (porcentaje de germinación).Número de conidias

1. Sembrar 10 μl de una suspensión de conidias con una concentración de 106 conidias/ml en medio PDA.

2. Incubar a 20 °C durante 15 días.3. Realizar diluciones seriadas con un factor de 0.14. Cargar la cámara de Neubauer y contar el número de

conidias/ml.5. Realizar por lo menos cuatro repeticiones por

aislamiento.6. Realizar los cálculos respectivos para obtener la

información.

Viabilidad de conidias1. Sembrar 5 alícuotas de 5μl de una suspensión de

conidias con una concentración de 106 conidias/ml en medio PDA.

2. Incubar a 20 °C durante 24 horas.3. Agregar azul de lactofenol para detener la germinación.4. Cortar la porción de agar conteniendo la alícuota de la

suspensión de conidias y colocarla sobre una lamina portaobjetos. Cubrir con un cubre objetos.

5. Registrar el número de conidias germinadas (aquellas cuyo tubo germinativo sea dos veces mayor al diámetro de la conidia).

6. Por cada aislamiento no se debe hacer menos de cinco repeticiones. En caso de que el rendimiento sea muy bajo, debido a la pérdida de sus características por ser un aislamiento muy viejo, se recomienda reactivarlo en el insecto hospedante.

Referencias

• http://www.gefor.4t.com/hongos/paecilomycesvariotii.html• http://www.siac.net.co/sib/catalogoespecies/especie.do?

idBuscar=540&method=displayAAT• http://doctor-obregon.com/paecilomyces.aspx• http://www.mycology.adelaide.edu.au/

Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_(hyaline)/Paecilomyces/

• http://www.mold.ph/paecilomyces.htm• http://elreinofungi.blogspot.com/2006/07/hongos-

ascomicetes.html• http://pt.wikipedia.org/wiki/Trichocomaceae• http://www.britannica.com/EBchecked/topic/1397770/

Eurotiomycetes

• http://en.wikipedia.org/wiki/Eurotiomycetes• http://pasteurlaboratory.com/common3.htm• VERÓNICA CAÑEDO y TERESA AMES, Manual de

Laboratorio para el Manejo de Hongos Entomopatógenos. Lima, Perú; Centro Internacional de la Papa (CIP), Lima, Perú, 62 p. Edición: Cañedo V., Ames T. 2004.

• Chan-Cupul, Wilberth; DESARROLLO in vitro DE CUATRO CEPAS NATIVAS DE Paecilomyces fumosoroseus Y SU PATOGENICIDAD EN ESTADOS INMADUROS DE MOSQUITA BLANCA; AGROCIENCIA, 1 de julio - 15 de agosto, 2010

• Alí Asaff Torres, Yolanda Reyes Vidal, V. Eric López y López y Mayra de la Torre; Guerra entre insectos y microorganismos: una estrategia natural para el control de plagas; Avance y Perspectiva vol. 21 pags. 291-295

• IRINA ALEAN CARREÑO; EVALUACION DE LA PATOGENICIDAD DE DIFERENTES HONGOS ENTOMOPATOGENOS PARA EL CONTROL DE LA MOSCA BLANCA DE LA YUCA Aleurotrachelus socialis Bondar (Homoptera: Aleyrodidae) BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO, PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA, FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA; Bogotá, D. C. Colombia 2003; tesis de Licenciatura

• Leonor Carrillo; LOS HONGOS DE LOS ALIMENTOS Y FORRAJES; pags. 99-118

• Quintero Zapata, Isela; Producción de esporas de Paecilomyces fumosoroseus en diferentes medios de cultivos líquidos, UANL, Facultad de Ciencias Biológicas, Unidad de estudios de Post-grado, 1998, Tesis de Maestría.

• Hernández Torres, Ismael; Cepa mutante de Paecilomyces fumosoroseus sobrepuductora de quitinasas con mayor virulencia contra mosquita blanca (Bemicia Tabaci) y falso medidor de la col (Trichoplusia Ni), UANL, Facultad de Ciencias Biológicas, Unidad de estudios de Post-grado, 1999, Tesis de Doctorado.