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149AVANCES EN PERIODONCIA/

Vernal R, Dutzan N, León R, Gamonal J.Papel de los linfocitos T CD4+ en la destrucción ósea observada durante la periodontitis crónica

* Profesor Asistente. Departamento de Odontología Conservadora. Facultad de Odontología. Universidad de Chile.** Ayudante. Departamento de Odontología Conservadora. Facultad de Odontología. Universidad de Chile.*** Profesor Asistente. Departamento de Ciencias Físicas y Químicas. Facultad de Odontología. Universidad de Chile.**** Profesor Asociado. Departamento de Odontología Conservadora. Facultad de Odontología. Universidad de Chile.

Papel de los linfocitos T CD4+ en la destrucción óseaobservada durante la periodontitis crónica

VERNAL R*DUTZAN N**LEÓN R***GAMONAL J****

RESUMEN

Propósito: La periodontitis crónica es una enfermedad de naturaleza inflamatoria y etiologíainfecciosa, caracterizada por la destrucción del aparato de inserción del diente, cemento ra-dicular, ligamento periodontal y hueso alveolar, y que causa la pérdida de los dientes. Duran-te su desarrollo se establece un denso infiltrado inflamatorio celular, constituido principal-mente por linfocitos T, con la capacidad de secretar una serie de citoquinas que participan enlos eventos patogénicos de la enfermedad, regulando la inflamación de los tejidos periodon-tales y la destrucción del hueso alveolar. En la artritis reumatoide, la citoquina recientementeidentificada RANKL (Ligando del receptor activador del factor nuclear κB) es expresada porlos linfocitos T CD4+, participando directamente en los procesos de estimulación de la dife-renciación osteoclástica y en la activación de osteoclastos maduros, y por lo tanto, en la des-trucción ósea articular. El objetivo del presente estudio es determinar si mayores niveles deRANKL se encuentran asociados a la periodontitis crónica y si estos son sintetizados por loslinfocitos T CD4+ reclutados en los sitios con periodontitis crónica.

Material y métodos: En 33 pacientes mayores de 35 años de edad afectados de periodontitiscrónica y 20 individuos controles sanos, se determinaron los niveles de mensajero de ácidodesoxiribonucleico (mARN) de RANKL en biopsias de encía mediante transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real. A partir de las mismas biopsias,células gingivales totales fueron aisladas para inmunotipificar y cuantificar los leucocitos infil-trantes gingivales e identificar las células responsables de la expresión de RANKL mediantedoble tinción por citometría de flujo.

Resultados: Los pacientes con periodontitis mostraron mayores niveles de mARN de RANKL encomparación a individuos sanos, observándose que la expresión de RANKL se incrementó en238,3 veces con relación a los sujetos controles. Los individuos con periodontitis mostraronmayores porcentajes de linfocitos T CD4+ y CD8+. Además, una asociación entre RANKL y loslinfocitos T CD4+ fue determinada mediante doble tinción por citometría de flujo.

Conclusión: Estos datos demuestran que mayores niveles de RANKL se encuentran asociados ala periodontitis y que estos mayores niveles se pueden explicar en parte a la actividad de los

Vernal R, Dutzan N, León R, Gamonal J. Papel de los linfocitos T CD4+

en la destrucción ósea observada durante la periodontitis crónica.Av Periodon Implantol. 2006; 18, 3: 149-162.

Volumen 18 - Nº 3 - Diciembre 2006

150/AVANCES EN PERIODONCIA

INTRODUCCIÓN

En el individuo adulto normal, el tejido óseo madurose encuentra en un constante, balanceado, celularmen-te acoplado, y local y molecularmente controlado pro-ceso de remodelación ósea1. En la mayoría de las pa-tologías óseas existe un desbalance en los nivelesfisiológicos de los factores osteomoduladores localesque provoca una mayor tasa de reabsorción ósea y laconsecutiva pérdida de hueso2,3. En la periodontitis hasido propuesto un desbalance local en los niveles deRANKL inducido por la actividad de las células resi-dentes locales, tal como osteoblastos, y los linfocitos TCD4+ predominantes en el infiltrado inflamatorio enlos tejidos afectados4,5.

Aunque los reguladores moleculares de las distintasfases de vida y actividad de los osteoclastos no hansido completamente dilucidados, por décadas variossistemas de citoquinas han sido sugeridos como im-portantes reguladores de la reabsorción ósea. En laactualidad un nuevo sistema de citoquinas reciente-mente identificado como nuevos miembros de la su-perfamilia TNF (factor de necrosis tumoral) y TNFR(TNF-receptor), han sido propuestos como esencialespara la biología osteoclástica4,5.

Los componentes de este sistema de citoquinas con-sisten de un ligando RANKL (ligando de RANK), un re-ceptor unido a membrana RANK (receptor activadordel factor nuclear κB) y un receptor soluble denomi-nado OPG (osteoprotegerina)4,5. Se ha demostrado queRANKL estimula directamente la diferenciación y acti-vación de osteoclastos a través de la interacción consu receptor específico RANK en la superficie de las

células progenitoras del linaje osteoclástico y en lososteoclastos maduros6,7. RANK, también denominadoTRANCE-R (Receptor de TRANCE) y ODAR (Receptorde diferenciación y activación de osteoclastos), es elmiembro TNFRSF11A de la superfamilia TNF5. El ligan-do RANKL, también denominado TRANCE (Citoquinainductora de activación relacionada a TNF), OPGL (Li-gando de OPG) y ODF (Factor de diferenciación deosteoclastos), miembro TNFSF11 de la superfamiliaTNF, es expresado en la superficie de células estroma-les, osteoblastos, células T, y/o liberado por acción dela enzima TACE (Metaloproteinasa desintegrina TNFαconvertasa)5,8,9. La identificación del nuevo receptorOPG, también denominado OCIF (Factor inhibidor dela osteoclastogénesis), miembro TNFRSF11B de la su-perfamilia TNF, ha revelado un mecanismo reguladorclave en la diferenciación y actividad de los osteoclas-tos5.

La mayoría de las patologías óseas corresponden a undesbalance en los procesos celulares acoplados de laremodelación ósea provocados por la pérdida de losniveles fisiológicos de los factores regulatorios loca-les, que provoca una alteración en el número y activi-dad de los osteoclastos y resulta en una inapropiadaalta tasa de reabsorción ósea que excede la capaci-dad compensatoria de los osteoblastos2,3,10.

Se ha demostrado la participación del complejo decitoquinas RANKL-RANK-OPG en diversas patologíasque comprometen el tejido óseo4,5. La evidencia delrol esencial de RANKL en la patología ósea se basafundamentalmente en estudios in vitro, sistemas trans-génicos y knock-out y modelos animales de enferme-dades óseas metabólicas4-9. Así mismo, la información

linfocitos T CD4+ en el sitio de la infección. La determinación de la asociación entre la perio-dontitis crónica y la síntesis de RANKL constituye un interesante mecanismo molecular quecontribuye a explicar en parte la destrucción tisular asociada y permite proyectar posiblesnuevas estrategias inmunoterapéuticas que ayudarían a controlar la pérdida de tejido carac-terística de la enfermedad periodontal.

PALABRAS CLAVE

Periodontitis, RANKL, Linfocitos, CD4.

Aceptado para publicación: Enero 2006.



respecto de su participación en enfermedades huma-nas in vivo es aún limitada.

En enfermedades de carácter crónico, tal como la ar-tritis reumatoide, y en modelos experimentales ani-males se ha demostrado que los linfocitos T CD4+ par-ticipan directamente, mediante la expresión yliberación de RANKL, e indirectamente, mediante laliberación de citoquinas específicas, IL-1 y TNFα queinducen la producción de RANKL por las células dellinaje osteoblástico, en los procesos de destrucciónósea11-14. Ha sido recientemente demostrado queRANKL es suficiente para la completa diferenciaciónde células precursoras osteoclásticas y para la activa-ción de los osteoclastos maduros15,16. La expresión deRANKL, de su receptor específico RANK en estos tiposcelulares, y la actividad de OPG, competidor naturalde RANK, conformarían el eje RANKL-RANK-OPG queregularía la destrucción en la artritis reumatoide, asícomo en otras enfermedades caracterizadas por ladestrucción de tejido óseo11-14.

Las periodontitis constituyen un grupo heterogéneo deenfermedades periodontales que se manifiestan enrespuesta a la infección bacteriana por patógenos es-pecíficos que colonizan el área del surco gingivoden-tario17. Se caracterizan por presentar una variada his-toria natural, progresión y respuesta a la terapia, y porprovocar la destrucción del aparato de inserción den-tario, compuesto por ligamento periodontal, cementoradicular y hueso alveolar, que lleva finalmente a lapérdida del diente17,18.

Aunque la patogénesis de la enfermedad periodontalno está completamente dilucidada se sabe que la in-teracción de los mecanismos defensivos del hospede-ro y los agentes bacterianos etiológicos son importan-tes en el inicio y progresión de la periodontitis17. Existeevidencia bien documentada que bacterias Gram (-),tales como Actinobacilus actinomicetencomitans (Aa) yPorphyromonas gingivalis (Pg), que forman parte de laplaca bacteriana patogénica, son los agentes etiológi-cos primarios responsables de la enfermedad19,20. Es-tos son capaces de producir una variedad de molécu-las bioactivas, tal como lipopolisacáridos (LPS),enzimas y factores citotóxicos moleculares, que direc-tamente afectan al individuo19,20. La interacción de es-tas moléculas y la respuesta inmunitaria de hospede-ro determinará el resultado patológico de la infección21.

En los tejidos periodontales enfermos, en respuesta ala infección se constituye un denso infiltrado inflama-torio mononuclear caracterizado por la presencia de

leucocitos polimorfonucleares neutrófilos, macrófagos,plasmocitos y linfocitos de la serie B y T21. En las lesio-nes periodontales activas, en los sitios que evidencianprogresión de la enfermedad periodontal, el 70% delas células mononucleares lo constituyen linfocitos deltipo T, con la capacidad de secretar una serie de cito-quinas que participan en los eventos etiopatogénicosde la enfermedad22-24.

La acumulación de linfocitos T CD4+, atraídos al sitiode la infección por factores quimiotácticos específi-cos y activados durante los periodos de destruccióntisular, regularía la inflamación de los tejidos perio-dontales inducida por la infección bacteriana subgin-gival, a través de la liberación de citoquinas proinfla-matorias, y podría estar asociada a la destrucción delhueso alveolar y la consecuente pérdida de nivel deinserción clínico, a través de la expresión y secreciónde RANKL13.

En la actualidad no existen estudios in vivo que hayanevaluado el rol de las células T y de RANKL en la en-fermedad periodontal. Por otro lado, numerosas revi-siones bibliográficas que analizan el rol de RANKL enla destrucción ósea asociada a trastornos metabólicosóseos, como por ejemplo artritis reumatoide y destruc-ción ósea asociada a metástasis de lesiones cancero-sas, proponen una participación de RANKL en la des-trucción ósea y la pérdida de inserción clínica asociadaa la enfermedad periodontal4,7,13. El objetivo del pre-sente trabajo es estudiar el real rol de los linfocitos TCD4+ en la periodontitis en humanos, y dilucidar si sin-tetizan RANKL, que desencadenaría la diferenciacióny activación de osteoclastos, la pérdida de hueso al-veolar y la consecutiva pérdida de inserción clínicadurante la periodontitis.

MATERIAL Y MÉTODOS

Selección de los sujetos

Se estudió a 33 individuos mayores de 35 años de edadcon diagnóstico clínico de periodontitis crónica conniveles de severidad de enfermedad moderada a avan-zada, los que fueron seleccionados mediante el méto-do no probabilístico de casos consecutivos en el Cen-tro de Diagnóstico y Tratamiento Dra. Eloisa Díaz delServicio de Salud Metropolitano Norte.

La selección de los pacientes se realizó de acuerdo alos siguientes criterios de inclusión: Tener al menos14 dientes, sin contabilizar los terceros molares, de los



cuales al menos 10 tenían que ser dientes posteriores.Para el diagnóstico de periodontitis crónica al menos5 a 6 dientes debían tener bolsas periodontales deprofundidad de sondaje ≥5 mm, pérdida de inserciónclínica ≥3 mm y evidencia radiográfica de destrucciónósea alveolar. Los individuos no sufrían de enferme-dades sistémicas, ni tenían antecedentes de terapiaperiodontal, no habían recibido terapia de antibióti-cos, antiinflamatorios esteroidales o no esteroidales enel período de 3 meses previos al examen clínico ini-cial y su incorporación al estudio, y si era de génerofemenino no estar embarazada. Como grupo controlse estudió a 20 individuos voluntarios con periodontosano, determinado por la ausencia de bolsas periodon-tales y de pérdida de inserción clínica asociada a in-fección. Todos los sujetos recibieron una clara expli-cación del protocolo de investigación y firmaron unconsentimiento informado aprobado por el Comité deÉtica de la Facultad de Odontología de la Universidadde Chile.

Evaluación clínica

Todos los pacientes recibieron previo al examen clí-nico una profilaxis para remover el cálculo supra-gingival y permitir una correcta evaluación clínica.Los parámetros clínicos fueron medidos en todos losdientes por un investigador entrenado y calibrado,excluyendo los terceros molares. Se realizaron me-diciones replicadas de la profundidad de las bolsasperiodontales y del nivel de inserción clínica, y me-diciones dicotómicas respecto de la presencia deplaca bacteriana supragingival, sangramiento y su-puración al sondaje, en 6 sitios por diente (mesio-bucal, bucal, distobucal, distolingual, lingual, mesio-lingual). Se utilizó una sonda periodontal de tercerageneración (Florida Probe Corporation, Gainesville,FL, USA), de fuerza de sondaje controlada y registroautomatizado, para reducir los errores asociados ala presión de sondaje y la subjetividad en el regis-tro de los datos inherente a la técnica de sondajemanual.

Para la toma de biopsias de encía, de cada individuodel grupo con periodontitis se seleccionaron 2 sitiosperiodontales afectados en dientes posteriores, carac-terizados por presentar una profundidad de sondaje≥5 mm y una pérdida de inserción clínica asociada a lainfección ≥3 mm, y de acuerdo a las necesidades qui-rúrgicas del tratamiento establecido. En los individuoscontroles sanos, los sitios seleccionados fueron aque-llos con indicación de cirugía periodontal para proce-

dimientos de elongación coronaria por indicación pro-tésica o de encía sana asociada a terceros molares conindicación de exodoncia.

Procesamiento de las biopsias

Con hoja de bisturí número 15 se obtuvo una biopsiadel margen gingival de acuerdo a las necesidadesquirúrgicas particulares de cada paciente. Previo la-vado con PBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,USA.), para la eliminación de detritus y restos de san-gre, la biopsia fue hemiseccionada. Una hemisecciónfue inmediatamente sumergida en 1 mL de ARN-later(Ambion Inc., Austin, TX, USA) y almacenada a 4ºC,para posterior cuantificación de mARN de RANKL me-diante RT-PCR cuantitativa. La otra hemisección fuesumergida en 5 mL de medio de cultivo RPMI 1640estéril, suplementado con 50 UI/mL de penicilina, 50µg/mL de estreptomicina y L-glutamina 200 mM (SIG-MA Chemical Co., St. Louis, MO, USA.) y almacenadaa 4°C hasta el momento de su procesamiento, paraposterior cuantificación de la población celular infil-trante gingival y determinación del tipo celular res-ponsable de la síntesis de RANKL mediante doble tin-ción por citometría de flujo.

Extracción de ARN total

El procesamiento de las biopsias a ser analizadas me-diante RT-PCR cuantitativa fue realizado como ha sidopreviamente publicado25. Brevemente, las biopsias fue-ron seccionadas en fragmentos de aproximadamen-te 1 mm3 y homogeneizadas en TRIzol (InvitrogenCorp., Barcelona, España), para posteriormente serincubadas en 0,2 mL de cloroformo durante 3 minu-tos. Luego, a partir de la fase acuosa, el ARN total fueprecipitado mediante incubación en 0,5 mL de alco-hol isopropílico durante 10 minutos. El ARN fue lava-do en 1 mL de alcohol 75% y resuspendido en 50 µLde agua libre de ARNasas tratada con dietilpirocar-bonato (DEPC) 0,1% (Sigma Chemical Co.) durante10 minutos a 60ºC. Previa cuantificación en espectro-fotómetro, las muestras de ARN total fueron almace-nadas a –80ºC en una concentración de 250 ng/µLhasta posterior análisis.

Transcripción Reversa

La primera cadena de ácido desoxirribonucleicocomplementario (cADN) fue sintetizada usando 500



ng de ARN total utilizando el kit TaqMan® ReverseTranscription Reagents (Roche Molecular SystemsInc., NJ, USA). 30 µL de reacción que contenía: 3 µL deamortiguador RT 10x, 6,6 µL de MgCl2 25 mM, 6 µL demezcla de dNTP, 1,5 µL de Oligo d(T), 0,6 µL de inhi-bidor de ARNasas, 0,75 µL de enzima transcriptasareversa Multi ScribeTM, 9,55 µL de agua libre deARNasas DEPC 0,1% y 2 µL de ARN total, fueronretrotranscritas en termociclador Primus 96 plusTermal Cycler (MWG AG Biotech, Germany) bajo lassiguientes condiciones: 10 min. a 25ºC, 30 min. a 48ºCy 5 min. a 95ºC.

RT-PCR en tiempo real

Para examinar la expresión de mARN de RANKL, 83,3ng de cADN, en diluciones de 1x y 0,1x y en duplica-do, fueron amplificadas por PCR en tiempo real utili-zando en ensayo específico Assay-on-DemandTM GeneExpression Products (Applied Biosystems, CA, USA),que contiene partidores forward y reverse en concen-traciones no limitantes y una sonda TaqMan® MGB 6-FAM fluorescentemente marcada, específicamente di-señada para detectar y cuantificar secuencias de cADNdel gen RANKL multiexónico sin amplificar ADN ge-nómico. 25 µL de volumen de reacción que contenía:12,5 µL de TaqMan® Universal PCR Master Mix (AppliedBiosystems), 1,25 µL de Assay-on-Demmand 20x, 6,23µL de agua libre de ARNasas DEPC 0,1% y 5 µL decADN, fueron analizadas bajo las siguientes condicio-nes: Un primer paso de 2 min. a 50ºC, un segundo pasode 10 min. a 95ºC y 40 ciclos de 15 seg. a 95ºC y 1min. a 60ºC, en un detector de PCR tiempo real ABIPRISMTM 7700 Sequence Detector System (AppliedBiosystems). Como control interno del ensayo 33,3 ngde cADN fueron amplificados para determinar la ex-presión de mARN de gliceraldehido-3-fosfato deshi-drogenasa (GAPDH) utilizando un kit TaqMan® Pre-Developed Assay Reagent Human GAPDH (AppliedBiosystems) en las mismas diluciones y condicionesque RANKL.

Obtención de leucocitos infiltrantes gingivales

La obtención de los leucocitos infiltrantes gingivalestotales y su inmunotificación y cuantificación median-te citometría de flujo fue realizado como ha sido pre-viamente publicado26. Brevemente, La biopsia gingi-val fue pesada en balanza analítica y seccionada enfragmentos de aproximadamente 1 mm3. Los fragmen-tos se incubaron durante 90 min. en baño termorregu-

lado a 37°C sometido a agitación constante, en mediode digestión que contenía: RPMI 1640 suplementa-do con 50 UI/mL de penicilina, 50 µg/mL de estrep-tomicina, L-glutamina 200 mM y 200 UI/mL de cola-genasa clostridial tipo IV (Gibco Invitrogen Corp.,Grand Island, NY, USA.), en una relación de 1 mL desolución de digestión por cada 50 mg de tejido. Lareacción se inactivó suspendiendo la población ce-lular obtenida en medio de cultivo completo suple-mentado con 10% de suero bovino fetal (SBF) (GibcoInvitrogen Corp.). Se realizó contabilización celularen cámara de Neubahuer mediante microscopio decontraste de fase (Axiovert 100, Zeiss Co., Germany).La viabilidad celular se evaluó por exclusión delcolorante azul de Trypan y fue igual o superior a90%.

Análisis mediante citometría de flujo

Para la inmunotipificación y cuantificación de los leu-cocitos infiltrantes gingivales, suspensiones de200.000 células totales gingivales en 50 µL de PBS fue-ron incubadas separadamente con 10 µL de anticuer-pos monoclonales (mAc) de ratón antihumano (BectonDickinson Immunocytometry Systems, San José, CA,USA.) anti-CD4 (linfocitos T CD4+), anti-CD8 (linfoci-tos T CD8+), anti-CD14 (monocitos), anti-CD19 (linfo-citos B), anti-CD16 y anti-CD56 (células natural killer),anti-62L (neutrófilos) y anti-CD83 (células dendríti-cas), conjugados con ficoeritrina (PE) y/o fluoresceí-na isotiociarato (FITC), durante 30 min. a 4ºC en laoscuridad. Para determinar las células infiltrantes gin-givales responsables de la síntesis de RANKL, un aná-lisis de doble marcaje mediante citometría de flujofue realizado como ha sido previamente publicado27.Brevemente, posterior al marcaje específico para cadatipo celular, un mAc de conejo anti-RANKL humanofue incubado en una concentración de 20 µg/mL a4ºC durante toda la noche en cámara de humedad(R&D Systems Inc., MI, USA). Luego, un mAc de háms-ter anticonejo FITC-conjugado fue incubado en unadilución 1:64 durante 1 hora a temperatura ambien-te (R&D Systems Inc.). Previo lavado en PBS, las célu-las resuspendidas en 300 µL de PBS fueron analiza-das en citómetro de flujo FACSort (Becton DickinsonImmunocytometry System). LeucoGATE (CD45 FITC/CD14 PE) fue utilizado para determinar la poblaciónleucocitaria total, y TriTEST CD4 FITC/CD8 PE/CD3PerCP, para la cuantificación de la razón CD4/CD8(Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Con-troles de isotipo para FITC y PE fueron utilizados concontrol.



Análisis de los datos

Los datos se analizaron utilizando el software estadís-tico Stata® versión 7.0 (Statistics/Data Analysis Stata,Stata Co., Tx, USA). El test Shapiro-Wilk fue utilizadopara determinar distribución normal de lo datos. Losparámetros clínicos edad, profundidad de sondaje ynivel de inserción clínico, y los datos experimentalesCt, ∆Ct y porcentaje de leucocitos infiltrantes gingiva-les entre grupo control y experimental se analizaronutilizando la prueba estadística t de Student no parea-da de 2 colas. El test ANOVA no pareado de 2 colas seutilizó para analizar los parámetros clínicos género,placa bacteriana y sangramiento al sondaje, y las dife-rencias en porcentaje de las poblaciones leucocitariasdentro del grupo control y el experimental. El tipocelular predominante en cada grupo se determinó conel test de Tukey. Un p<0,05 fue considerado como di-ferencia significativa.

Los datos obtenidos por citometría de flujo fueron gra-ficados como LeucoGATE dotplot y TriTEST CD4/CD8/CD3 contourplot e histogramas para cada tipo celular,utilizando en software WinMDI versión 2.8.

Los datos obtenidos de la técnica de detección de mARNde RANKL y GAPDH mediante PCR en tiempo real fue-ron analizadas mediante el software ABI PRISMTM

Sequence Detector Systems versión 1.7a (AppliedBiosystems). Los datos fueron graficados como la señalde fluorescencia ∆Rn versus el número de ciclo de am-plificación, utilizando la ecuación ∆Rn = Rn+ – Rn–, don-de Rn+ es la señal de fluorescencia del producto en unmomento dado y Rn– es la señal de fluorescencia du-rante la emisión background durante los ciclos 3 a 15.Un límite umbral arbitrario fue establecido mediante elmétodo de los replicados. El valor Ct fue definido comoel número de ciclo en el cual ∆Rn cruza el límite umbralestablecido. La relación entre RANKL y GAPDH en cadaindividuo fue definida como ∆Ct, donde ∆Ct = CtRANKL –CtGAPDH. Los valores Ct y ∆Ct de RANKL y GAPDH sonexpresados como promedio ± desviación estándar yrango de datos, la prueba estadística t-test de Studentno pareada fue utilizada para analizar las diferencias.La eficiencia de amplificación entre GAPDH y RANKLfue evaluada analizando la variación de ∆Ct en dilu-ciones seriadas en un rango de 1000 en 3 pacientescon periodontitis. Un gráfico de ∆Ct versus el logarit-mo en base 10 de la dilución de cADN fue realizado ylos datos fueron fijados utilizando análisis de regre-sión lineal. El número de veces de expresión de mARNde RANKL relativas al control interno mARN de GAPDHfue determinado utilizando el método 2-∆∆Ct 28.

RESULTADOS

Características clínicas

Las características clínicas de los pacientes con perio-dontitis y de los individuos control sano incluidos eneste estudio se muestran en la Tabla 1. En el grupo conperiodontitis fueron estudiados 8 hombres y 25 muje-res, con un rango de edad de 35–65 años (46,8±7,33),y 5 hombres y 15 mujeres, con un rango de edad de35–57 (43,0±5,50), fueron estudiados en el grupo con-trol. No se observaron diferencias significativas en laedad y el género, expresado como porcentaje de mu-jeres, entre ambos grupos en estudio. Los pacientescon periodontitis mostraron significativamente mayorporcentaje de sitios con presencia de placa bacteria-na (74,0 vs. 42,1) y de sitios con sangramiento al sonda-je periodontal (59,8 vs. 3,2), y mayor profundidad desondaje y nivel de inserción clínico perdido (3,2±0,32vs. 2,1±0,33 y 3,4±0,37 vs. 1,3±0,49, respectivamente)en comparación a los sujetos controles sanos.

Identificación de mARN de RANKL mediante RT-PCR tiempo real en biopsias de encía

Todos los pacientes con periodontitis mostraron nive-les detectables de mARN de RANKL, mientras un 75%

TABLA 1.- CARACTERÍSTICAS CLÍNICASDE LOS INDIVIDUOS ESTUDIADOS

(Media ± desviación estándar)

Característica Periodontitis Controlclínica N=33 N=20

Edad (años) 46,8±7,33 43,0±5,50Género (% de mujeres) 75,8 75,0PS (mm) 3,2±0,32* 2,1±0,33*

NIC (mm) 3,4±0,37† 1,3±0,49†

PB (% de sitios) 74,0‡ 42,1‡

SANG (% de sitios) 59,8§ 3,2§

* PS (profundidad de sondaje): Periodontitis versus control: p<0,0001.

† NIC (nivel de inserción clínico): Periodontitis versus control:p<0,0001.

‡ PB (placa bacteriana supragingival): Periodontitis versuscontrol: p<0,0001.

§ SANG (sangramiento al sondaje): Periodontitis versus con-trol: p<0,0001.



tenían niveles detectables en el grupo de individuoscontroles sanos. Los valores medios y el rango de losdatos Ct para RANKL y GAPDH se muestran en la Ta-bla 2. Los gráficos de amplificación de RANKL del me-nor de cada duplicado para ambos grupos se mues-tran en la Figura 1. El Ct de GAPDH fue similar entreambos grupos (21,678±1,62 vs. 21,505±0,86), pero elCt de RANKL fue significativamente más bajo en elgrupo de individuos con periodontitis en compara-ción a los sujetos sanos (28,791±3,27 vs. 36,514±2,67).El ∆Ct de RANKL y GAPDH se muestra en la Tabla 3.El ∆Ct fue significativamente más bajo en el grupode individuos con periodontitis en comparación a lossujetos sanos (7,113±3,00 vs. 15,009±2,80). La gráficade eficiencia de amplificación de GAPDH y RANKLmuestra una pendiente de 0,0752 (Figura 2), así, la efi-ciencia de amplificación de ambos amplicones es si-milar y la cuantificación relativa de RANKL con rela-ción a GAPDH puede ser determinada por el método2-∆∆C. Utilizando este método se determinó que, en in-dividuos con periodontitis, la expresión de RANKL seincrementó en 238,3 veces con relación a los sujetos con-trol sanos, con un rango de error estimado de 29,8–1.903,4 (Tabla 3).

Inmunotipificación y cuantificación de losleucocitos infiltrantes obtenidos de biopsiasgingivales

Las células totales obtenidas por digestión enzimáticade biopsias gingivales de pacientes con periodontitis

TABLA 2.- Ct DE GAPDH Y RANKL DELOS INDIVIDUOS ESTUDIADOS,OBTENIDOS MEDIANTE RT-PCR

CUANTITATIVA(Media ± desviación estándar

y rango de datos)

Periodontitis ControlN=33 N=20

Ct GAPDH 21,678±1,62 21,505±0,8619,026–24,072 20,845–23,117

Ct RANKL 28,791±3,27* 36,514±2,67*

24,189–35,644 36,426–40,000

Ct: Ciclo umbral (Número de ciclo).* Ct RANKL: Periodontitis versus control: P<0,0001.

TABLA 3.- ∆∆∆∆∆Ct DE RANKL AJUSTADO AGAPDH (media ± desviación estándar) Y

CUANTIFICACIÓN RELATIVA DERANKL EN PERIODONTITIS EN

COMPARACIÓN A CONTROLES SANOS(unidades de veces y error estimado),

OBTENIDOS MEDIANTE RT-PCRCUANTITATIVA

Periodontitis ControlN=33 N=20

∆Ct 7,113±3,00† 15,009±2,80†

2-∆∆Ct 238,3 (29,8–1903,4) 1,0 (0,1–7,0)

∆Ct: CTRANKL – CtGAPDH

2-∆∆Ct: Cuantificación relativa de la expresión de RANKL.† ∆Ct: Periodontitis versus control: p<0,0001.

Fig. 1: Gráfico de amplificación de RANKL mediante PCR tiemporeal. El dato menor de cada duplicado de cada individuo fue graficadocomo la señal de fluorescencia DRn versus el número de ciclo, usan-do la ecuación ∆Rn = Rn+ - Rn-. El límite umbral fue establecidomediante el método de los replicados. El valor Ct se define como elnúmero de ciclo de amplificación en el cual ∆Rn cruza este umbral.



e individuos controles sanos fueron inmunotipificadasmediante citometría de flujo (Tabla 4). Se observa sig-nificativamente mayor porcentaje de linfocitos T CD4+

y CD8+ (28,1±7,09 vs. 4,4±1,46 y 15,4±3,80 vs. 3,2±0,95,respectivamente) en pacientes con periodontitis en

comparación a individuos sanos. Por otro lado, se ob-serva mayor porcentaje de neutrófilos en individuoscontroles sanos (44,8±7,29 vs. 26,9±7,29). El tipo celu-lar predominante en el grupo de pacientes con perio-dontitis son los linfocitos T CD4+ y en el grupo controllos polimorfonucleares neutrófilos. No se observa di-ferencia en el porcentaje de monocitos, natural killer,células dendríticas, linfocitos B, ni en la razón linfoci-tos T CD4/CD8.

Doble marcaje mediante citometría de flujo

Un porcentaje de 19,4±2,81 del total de leucocitos in-filtrantes gingivales aislados expresaron RANKL en lasmuestras de pacientes con periodontitis crónica. Deestas células totales un 17,1±2,54 correspondían a lin-focitos T CD4+, 1,7±1,05 a células dendríticas y 0,6±0,63a monocitos (Tabla 5).

DISCUSIÓN

Aunque la periodontitis es una de las enfermedadeshumanas asociadas a la pérdida de hueso más preva-lentes, el mecanismo de formación de osteoclastos yla destrucción de hueso durante esta enfermedad aún

TABLA 4.- LEUCOCITOS INFILTRANTES GINGIVALES OBTENIDOS PORDIGESTIÓN ENZIMÁTICA DE BIOPSIAS GINGIVALES DE LOS INDIVIDUOS

ESTUDIADOS Y ANALIZADOS MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO(Media ± desviación estándar)

Leucocito Marcador Periodontitis Controlinfiltrante gingival celular N=33 N=20

Linfocitos T CD4+ CD4 28,1±7,09* 4,4±1,46*

Linfocitos T CD8+ CD8 15,4±3,80† 3,2±0,95†

Razón CD4/CD8 CD4/CD8 1,9±0,50 1,6±0,61Linfocitos B CD19 6,0±2,00 4,5±1,38NK citotóxicos CD16 3,3±0,49 2,0±1,20NK secretores CD56 4,8±1,02 4,6±2,35Monocitos CD14 6,6±3,86 9,1±1,84Células Dendríticas CD83 2,7±0,55 3,5±1,10Neutrófilos CD62L 26,9±7,28‡ 44,8±7,29‡

NK: Células Natural Killer.* Linfocitos T CD4+: Periodontitis versus control: p<0,0001.† Linfocitos T CD8+: Periodontitis versus control: p<0,0001.‡ Neutrófilos: Periodontitis versus control: p<0,0001.

Fig. 2: Eficiencia de amplificación de GAPDH y RANKL. Dilucionesseriadas de cADN fueron amplificadas y el ∆Ct fue calculado paracada una (n=3). La pendiente fue 0,0752, así, la eficiencia de ampli-ficación fue similar y la cuantificación relativa de RANKL puede serdeterminada mediante el método 2-∆∆Ct.



son escasamente comprendidos. Mientras, es amplia-mente aceptado y corroborado en la literatura cientí-fica que citoquinas proinflamatorias que estimulan lareabsorción de hueso, tal como IL-1β, TNFα , PGE2, INFγe IL-6, están presentes en los tejidos periodontales enla periodontitis29-31, el rol de los mediadores claves dela diferenciación y activación de osteoclastos, RANKL,RANK y OPG, aún no ha sido completamente determi-nado.

La citoquina RANKL estimula directamente la diferen-ciación y activación de osteoclastos, a través de la inte-racción con su receptor específico RANK en la superfi-cie de las células progenitoras del linaje osteoclásticoy en los osteoclastos maduros5-7. La unión de RANKL aOPG bloquea su acción en el receptor RANK5, provo-cando efectos opuestos a los de RANKL en el metabo-lismo óseo4,5.

En el presente estudio demostramos que significati-vamente mayores niveles de RANKL son expresadosen pacientes adultos afectados por periodontitis cró-nica en comparación con individuos controles sanos.Dado que, RANKL es la señal molecular final comúnrequerida para la completa diferenciación de los pre-cursores celulares hematopoyéticos totipotenciales enosteoclastos multinucleados y la activación de elloscomo células osteodestructivas15,16,32, y a que ha sidodemostrado que TNFα, IL-1β, IL-6 y PGE2 aumentan losniveles de RANKL a nivel proteína y mARN33, podríacorrelacionarse la presencia de mayores niveles de

esta citoquina osteoclastogénica en los tejidos afecta-dos por periodontitis con la destrucción ósea alveo-lar, y así dar una explicación biológica comprensiblea la pérdida de dientes consecutiva a la periodontitis.

Nuestros actuales resultados son concordantes conhallazgos previos de nuestro grupo de investigación ycon resultados descritos por Mogi y colaboradores,que establecen mayores niveles de RANKL en el fluidogingival crevicular (FGC) de individuos con periodon-titis, con niveles de severidad de enfermedad leve,moderada y avanzada, en comparación con sujetos sinenfermedad periodontal34,35. En nuestros datos, no en-contramos asociación significativa entre los niveles deRANKL y los parámetros clínicos de diagnóstico y se-veridad de la enfermedad. Aunque en una periodon-titis de mayor severidad los parámetros clínicos deprofundidad de sondaje y nivel de inserción clínicoson más elevados, esto asociado a una mayor historiade pérdida de hueso alveolar acumulada, no necesa-riamente significa que un individuo con periodontitissevera este siendo afectado por un proceso de des-trucción ósea más activa, en comparación a uno conseveridad de enfermedad menor, y en un momentodeterminado. Uno de los modelos clínicos actualmen-te más aceptado que explica la historia natural de laperiodontitis la define como una enfermedad sitio-es-pecífica de progresión episódica. Esto es, la pérdidade hueso alveolar asociada a la infección no sigue uncurso lineal de destrucción, sino que responde a unproceso cíclico de episodios cortos, únicos o múltiples,de activa destrucción del tejido periodontal, seguidode largos períodos de latencia en los que no hay evi-dencia de destrucción e incluso puede existir regene-ración de los tejidos perdidos18,36-38. Así, habría quedefinir longitudinalmente la actividad de la periodon-titis, en el individuo en general y en el sitio periodon-tal en estudio en particular, para definir que la mues-tra analizada corresponde a un sitio periodontal conactiva destrucción de tejido periodontal. Por otro lado,ha sido probado que la edad del individuo no es unfactor de riesgo de la enfermedad y que la mayor pre-valencia de periodontitis y de destrucción ósea alveo-lar en individuos adultos y adultos mayores no se aso-cia a la edad per se, sino que a una acumulación deldaño a través del tiempo39,40. Debido a estas razonesera de esperar no encontrar asociación entre los pará-metros clínicos de la enfermedad y los niveles deRANKL.

En este estudio examinamos los niveles de mARN deRANKL en los tejidos gingivales mediante RT-PCR entiempo real. Nuestros datos demuestran que todos los

TABLA 5.- EXPRESIÓN DE RANKL PORLOS LEUCOCITOS INFILTRANTESGINGIVALES DE PACIENTES CON

PERIODONTITIS, EVALUADOSMEDIANTE DOBLE TINCIÓN POR

CITOMETRÍA DE FLUJO(Media ± desviación estándar)

Leucocito Marcador Porcentajeinfiltrante gingival celular

Células RANKL+ totales RANKL+ 19,4±2,81Linfocitos T CD4+ CD4+ RANKL+ 17,1±2,54*†

Monocitos CD14+ RANKL+ 0,6±0,63*

Células dendríticas CD83+ RANKL+ 1,7±1,05†

* RANKL+: Linfocitos T CD4+ versus Monocitos: p<0,00001.† RANKL+: Linfocitos CD4+ versus Células Dendríticas:p<0,00001.



pacientes con periodontitis mostraron niveles detec-tables de mARN de RANKL y estos fueron significati-vamente mayores que los encontrados en sujetos con-troles sanos.

Nosotros demostramos que el Ct y el ∆Ct de RANKLfueron menores en pacientes con periodontitis en com-paración a individuos controles sanos. Dado que el Ctes inversamente proporcional a la cantidad de mARNpresente41, los niveles de mARN de RANKL fueron ma-yores en el grupo de individuos con periodontitis enrelación al grupo control. Al igual que en los hallazgosmediante análisis por RT-PCR semicuantitativo reali-zados por Liu y colaboradores42, todos los pacientescon periodontitis estudiados mostraron niveles detec-tables de mARN de RANKL mediante RT-PCR en tiem-po real. En nuestro estudio por RT-PCR cuantitativo,todos los sujetos con periodontitis mostraron un Ct demARN de RANKL más bajo que la Ct media del grupocontrol (36,514 ± 2,67), excepto un caso, con un Ct de35,644 (Tabla 2). Nuevamente esto puede ser explica-do porque nuestro estudio definió el grupo experimen-tal con sólo una evaluación clínica, sin determinar pro-gresión longitudinal de la destrucción periodontal.

Nosotros estudiamos los niveles de mARN de RANKLen los tejidos periodontales mediante RT-PCR en tiem-po real porque esta técnica ha sido calificada como elmétodo de elección para cuantificar citoquinas queexpresan bajos niveles de mARN41. Además, la expre-sión de mARN de RANKL normalizado a GAPDH per-mite la cuantificación relativa de la expresión de RANKLen los tejidos periodontales28,41. GAPDH fue seleccio-nado como control interno de la técnica debido a quees un gen housekeeping, sintetizado en niveles muypoco fluctuantes en todos los tipos celulares nuclea-dos del organismo, dado que codifica para una enzi-ma de la vía metabólica glicolítica, indispensable parala sobrevivencia celular43. Numerosos estudios hanmostrado que los genes housekeeping podrían expre-sarse en niveles variables en determinados estadosmetabólicos de las células. Nuestros resultados indi-can que no existen diferencias significativas en el ni-vel de expresión del gen GAPDH entre los individuosdel grupo experimental y control, y de esta forma eneste estudio GAPDH puede ser utilizado como están-dar interno sin problemas metodológicos.

Utilizando el método 2-∆∆Ct, que permite normalizar laexpresión del gen blanco a la del housekeeping, dán-dole un valor uno en el grupo control, y posibilita lacuantificación en forma relativa a este referente, estoes las veces que este gen blanco está sobreexpresado

en el grupo experimental28, nuestros datos muestranque en los individuos con periodontitis crónica la ex-presión de RANKL se encuentra incrementada en238,3 veces en comparación a los sujetos sanos, indi-cando una sobreexpresión del gen RANKL en los teji-dos periodontales asociados con destrucción ósea al-veolar.

Biopsias de tejidos gingivales fueron sometidas a di-gestión enzimática tisular para el aislamiento de leu-cocitos infiltrantes gingivales totales. Mediante citome-tría de flujo se determinó que los pacientes conperiodontitis crónica mostraron un infiltrado de linfo-citos T CD4+ y CD8+ significativamente mayor que enindividuos controles sanos. Estudios clásicos han esta-blecido un predominio de infiltrado linfocitario en es-pécimenes gingivales humanos sometidos a lesiónperiodontal experimental a partir de una a dos sema-nas de interrumpida la higiene oral44,45. Seymour y co-laboradores establecieron mediante inmunohistoquí-mica de muestras gingivales de estudiantes deodontología sometidos a lesiones periodontales expe-rimentales que un predominio de linfocitos en el infil-trado inflamatorio se establecía al día 21 del períodoexperimental22, observando que en todas las lesionesestudiadas alrededor del 70% correspondía al subti-po T23. En concordancia con esos trabajos, nuestro es-tudio estableció que en los individuos con periodonti-tis crónica los linfocitos son el tipo celularpredominante del foco inflamatorio establecido, conun predominio de los linfocitos T CD4+ sobre los CD8+

22-24. Los individuos controles sanos mostraron nivelesmás bajos de células de naturaleza inflamatoria, consignificativamente menores niveles de linfocitos y unpredominio de neutrófilos. Los individuos controles seestablecieron sobre la base de los parámetros clíni-cos establecidos en los criterios de inclusión del estu-dio. La presencia de células de naturaleza inflamato-ria, como los polimorfonucleares neutrófilos, seconsideran normales en tejidos gingivales clínicamen-te sanos, ya que participan en la homeostasis de lostejidos, infiltrando el tejido conectivo gingival desdelos plexos capilares fenestrados subepiteliales y mi-grando al surco gingivodentario a través del epiteliode unión, en donde conforman la primera barrera de-fensiva del organismo ante la injuria bacteriana20,46,47.Por otro lado, signos histológicos de inflamación pue-den aparecer en respuesta a acumulación de placabacteriana clínicamente no visible, sin manifestar sig-nos clínicos de inflamación45,48.

Para evaluar el tipo celular infiltrante gingival respon-sable de la síntesis de RANKL en los tejidos periodon-



tales afectados, se realizó una evaluación de los distin-tos tipos celulares y la expresión de RANKL mediantedoble tinción usando la técnica de citometría de flujo.Nuestros datos demostraron que los linfocitos T CD4+

fueron el principal tipo celular que sintetizaba RANKLen los tejidos gingivales de pacientes afectados porperiodontitis crónica. En un significativamente menornivel, la expresión de RANKL fue también detectadaen macrófagos y células dendríticas. Datos similaresde expresión de RANKL en superficie celular han sidodescritos por nuestro grupo de investigación en granu-lomas periapicales consecutivos a lesiones pulparesirreversibles25, en donde fue establecido que el tipocelular principal responsable de la síntesis de RANKLfueron del linaje monocito/macrófago.

Sobre la base de nuestros resultados, claramente con-cluimos que los linfocitos T CD4+ infiltrantes de los te-jidos periodontales de pacientes con periodontitis cró-nica expresan en superficie RANKL unido a membrana,y como ha sido anteriormente propuesto, contribuiríanal desbalance en los procesos celulares acoplados dela remodelación ósea a través de una pérdida de losniveles fisiológicos locales de RANKL, lo que provoca-ría una alteración en el número y actividad de los os-teoclastos y resultaría en una inapropiada alta tasa dereabsorción ósea que excede la capacidad compen-satoria de los osteoblastos4,10,13.

Un rol fundamental de los linfocitos T CD4+ en la pato-genia de la enfermedad periodontal ha sido reciente-mente establecida por Baker y colaboradores49. En unmodelo de ratas knockout para la actividad de célulasT CD4+ mediante la deleción del complejo mayor dehistocompatibilidad MHC tipo II, estableció en un 70%menos pérdida de hueso alveolar en respuesta a la in-fección oral por P. gingivalis, en comparación a ratasinmunocompetentes. Las células T no son requeridaspara la normal homeostasis ósea, dado que ratas defi-cientes en células T tienen estructura ósea normal ynormal proceso de erupción dentaria12, pero en esta-dos patológicos como la periodontitis crónica la acti-vidad de los linfocitos T puede promover la reabsor-ción de hueso.

Tomados en conjunto nuestros datos nos permiten es-tablecer que mayores niveles de RANKL se encuen-tran asociados a individuos afectados por periodonti-tis crónica en comparación a sujetos control sanos, yque en ellos los linfocitos T CD4+ juegan un rol funda-mental en el desbalance del eje RANKL-RANK-OPG.Aunque algunos estudios no descartan que otros tiposcelulares, tal como osteoblastos, macrófagos, fibroblas-

tos y células tumorales, expresen RANKL en condicio-nes patológicas50-53, estudios adicionales son necesa-rios para resolver la real participación de ellos en laenfermedad. El mayor predominio de los linfocitos TCD4+ en los sitios periodontales afectados por destruc-ción ósea y su actividad mediante la secreción de ci-toquinas proinflamatorias y proosteodestructivas, talcomo RANKL, nos permite explicar, al menos en parte,los fenómenos etiopatogénicos que llevan a la destruc-ción de hueso alveolar y la consecutiva perdida dedientes observada en la periodontitis.

ABSTRACT

Background: Chronic periodontitis is an infectiousdisease, characterized by alveolar bone destructionand teeth loss. Receptor activator of nuclear factor κB -ligand (RANKL) is an osteoclastogenic cytokine, cen-tral regulatory factor in the osteoclasts life-span andphysiological and pathological bone resorption. Gin-gival T cells synthesize RANKL contributing to mole-cular local unbalance that entail to the alveolar boneresorption seen in periodontitis. Our study was aimedat associating the levels of RANKL with the CD4+ T cellactivity present in gingival tissues of chronic periodon-titis patients.

Methods: Gingival biopsies were obtained from 33chronic periodontitis patients and 20 healthy controls.Specimens were either formalin fixed and paraffinembedded for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and histologicalanalysis, or tissue digestion processed for cell cultureand flow cytometry analysis. RANKL mRNA and proteinlevels were determined by quantitative RT-PCR andenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in gin-gival cells culture supernatants. Gingival leukocyteswere quantified by flow cytometry. RANKL and CD4immunoreactivity was analyzed by flow cytometry andconfocal microscopy.

Results: RANKL mRNA levels were higher in periodon-titis than in healthy subjects and spontaneous and LPS-and PHA-stimulated RANKL synthesis were higher alsoin patients than controls. CD4+ T lymphocytes were thepredominant infiltrate cell subset present in gingivaltissues of periodontitis patients. Furthermore, anassociation between RANKL and CD4+ T cells wasdetermined by double-staining flow cytometry andconfocal microscopy.

Conclusion: Taken together, these data demonstrate thatgingival CD4+ T cells are the main cells responsible



for the higher levels of RANKL observed in chronicperiodontitis human patients.

KEY WORDS

Periodontitis, RANKL, lymphocytes, CD4.

RÉSUMÉ

But: La parodontite chronique est une maladie de natureinflammatoire et étiologie infectieuse, caractérisée parla destruction de l’appareil d’insertion de la dent,ciment radiculaire, ligaments parodontaux et osalvéolaire, et qui cause la perte des dents. Pendant sondéveloppement, un dense infiltré inflammatoirecellulaire est établie, constitué principalement par deslymphocytes T, avec la capacité de sécréter une sériede cytokines impliquées dans les événements patho-géniques de la maladie, en régulant l’inflammation destissus parodontaux et la destruction de l’os alvéolaire.La cytokine récemment identifiée dans l’arthriterhumatoïde RANKL (ligand du récepteur activeur dufacteur de transcription nucléaire κB) est exprimé parles lymphocytes T CD4+, et est directement impliquédans les processus de stimulation de la différenciationdes ostéoclastes, leur activation, et la destructionosseuse de l’articulation. L’objectif de la présenteétude est de déterminer une possible association en-tre des niveaux élevés de RANKL et la parodontitechronique, et établir si les lymphocytes T CD4+ recrutésdans les emplacements avec parodontite chroniqueson les cellules qui sécrètent cette cytokine.

Matériel et méthodes: Dans 33 patients ages de 35années diagnostiqués de parodontite chronique et 20individus contrôles sains, les niveaux de d’acideribonucléique messager (ARNm) spécifique pourRANKL ont été déterminés sûr des biopsies de gencivepar RT-PCR en temps réel. À partir de les mêmesbiopsies, des cellules gingivales totales ont été isoléespour typifier et quantifier les leucocytes infiltrant dela gencive et identifier les cellules responsables del’expression de RANKL par cytométrie de flux dedouble couleur.

Résultats: Les patients diagnostiqués de parodontite ontdes niveaux plus élevés de ARNm de RANKL encomparaison à des individus sains (238 fois), et despourcentages de lymphocytes T CD4+ (7 fois) et CD8+

(5 fois) supérieurs à des individus sains. Uneassociation entre les taux d’expression de RANKL et le

pourcentage de lymphocytes T CD4+ a été déterminéepar cytométrie de flux.

Conclusion: Ces données démontrent que de plusgrands niveaux de RANKL, que peuvent être expliquésen partie à l’activité des lymphocytes T CD4+ dansl’emplacement de l’infection, sont associés à la paro-dontite. La détermination de l’association entre laparodontite chronique et la synthèse de RANKLconstitue un mécanisme moléculaire intéressant quicontribue à expliquer en partie la destruction tissulaireassociée et permet de projeter de nouvelles stratégiesimmunotherapéutiques qui aideraient à contrôler laperte de tissu caractéristique de la parodontite chro-nique.

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CORRESPONDENCIA

Rolando Vernal AstudilloFacultad de OdontologíaUniversidad de ChileDepartamento de Odontología ConservadoraOlivos 943 IndependenciaSantiago- ChileTelf.: +56 2 978 18 33Fax: +56 2 978 18 15E-mail: [email protected]

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