BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Pengertian

Fluoresensi adalah emisi cahaya setelah penyerapan sinar ultraviolet (UV)atau

cahaya tampak oleh molekul fluoresensi atau substruktur disebut

fluorophore .Dengan demikian, fluorophore menyerap energi dalam bentuk

cahaya pada panjang gelombang spesifik dan membebaskan energi dalam bentuk

cahaya yang dipancarkan pada panjang gelombang yang lebih tinggi.

Fluoresensi adalah proses pemancaran radiasi cahaya oleh suatu materi setelah

tereksitasi oleh berkas cahaya berenergi tinggi. Emisi cahaya terjadi karena proses

absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan keadaan atom tereksitasi.

Keadaan atom yang tereksitasi akan kembali ke keadaan semula dengan

melepaskan energi yang berupa cahaya (deeksitasi). Fluoresensi merupakan

proses perpindahan tingkat energi dari keadaan atom tereksitasi (S1 atau S2)

menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses fluoresensi berlangsung kurang

lebih 1 nano detik sedangkan proses fosforesensi berlangung lebih lama, sekitar 1

sampai dengan 1000 mili detik.

Gambar Spektrofotometri AFS

Fluoresensi spektroskopi menggunakan foton energi yang lebih tinggi

untuk merangsang sampel, yang kemudian akan memancarkan foton energi yang lebih

rendah. Teknik ini telah menjadi populer untuk biokimia dan aplikasi medis, dan

dapat digunakan untuk mikroskopi confocal, fluoresensi mentransfer resonansi

energi,dan pencitraan fluoresensi seumur hidup.

Spektroskopi Fluoresensi Atom. Pada metode ini seperti pada spektroskopi

absorpsi atom untuk membentuk partikel-partikel atom diperlukan nyala api.

Energi radiasi yang diserap oleh partikel atom akan dipancarkan kembali ke

segala arah sebagai radiasi fluoresensi dengan panjang gelombang yang

karakteristik. Sumber radiasi ditempatkan tegak lurus terhadap nyala api sehingga

hanya radiasi fluoresensi yang dideteksi oleh detektor setelah melalui

monokromator. Intensitas radiasi fluoresensi ini berbanding lurus dengan

konsentrasi unsur.

2.2 Alat Yang Digunakan

Dalam metode spektroskopi Fluoresensi ini, alat yang digunakan disebut

dengan Spektrofotometer Fluoresensi. Komponen-komponen yang penting dari

suatu instrumen untuk pengukuran flourosensi ditunjukan dalam gambar di bawah

ini,perhatikan bahwa komponen (sumber, monokromator, dan sebagainya) yang

sama terdapat juga dalam spektrofotometer.Berikut adalah instrumennya. Dasar

set-up untuk sebuah alat untuk mengukur kondisi mapan fluoresense ditampilkan

pada Gambar 7.6.

Terdiri dari sumber cahaya (biasanya xenon atau lampu merkuri), sebuah

monokromator / atau filter untuk memilih panjang gelombang eksitasi; tempat

sampel; detektor, yang mengubah cahaya yang dipancarkan ke listrik sinyal, dan

unit untuk pembacaan data dan analisis.

2.3 Prinsip Spektroskopi Fluoresensi

Prinsip-prinsip umum dapat diilustrasikan dengan diagram Jablonski

(Veberg,2006),seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.1.Menurut diagram

Jablonski (Gambar 7.1), energi emisi lebih rendah dibandingkan dengan eksitasi.

Ini berarti bahwa emisi fluoresensi yang lebih tinggi terjadi pada panjang

gelombang dari penyerapan (eksitasi). Perbedaan antara eksitasi dan panjang

gelombang emisi dikenal sebagai pergeseran Stoke.

Langkah pertama (i) adalah eksitasi, di mana cahaya diserap oleh

molekul,yang ditransfer ke keadaan tereksitasi secara elektronik yang berarti

bahwa sebuah elektron bergerak dari keadaan dasar singlet, S0 , ke keadaan singlet

tereksitasi S’1. I n i diikuti dengan relaksasi getaran atau konversi internal (ii),

dimana molekul ini mengalami transisi dari elektronik atas ke yang lebih rendah

S’1, tanpa radiasi apapun. Akhirnya, emisi terjadi (iii), biasanya 10 - 8 detik

setelah eksitasi, ketika kembali elektron kekeadaan dasar lebih stabil, S0,

memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang sesuai dengan perbedaan energi

antara kedua elektronik.Dalam molekul, masing-masing kondisi elektronik

memiliki beberapa kondisi bagian getaran terkait. Dalam keadaan dasar, hampir

semua molekul menempati tingkat vibrasi terendah. Dengan eksitasi dengan sinar

UV atau terlihat, adalah mungkin untuk mempromosikan molekul yang tertarik ke

salah satu tingkat getaran beberapa tingkat tereksitasi secara elektronik yang

diberikan. Ini berarti bahwa emisi fluoresensi tidak hanya terjadi pada satu

panjang gelombang tunggal, melainkan melalui distribusi panjang gelombang

yang sesuai untuk transisi vibrasi beberapa sebagai komponen dari transisi

elektronik tunggal. Inilah sebabnya mengapa eksitasi dan spektrum emisi

diperoleh untuk menggambarkan secara rinci karakteristik molekul fluoresensi.

2.4 Instrumentasi untuk Pengukuran Fluoresensi

Komponen-komponen yang penting sekali dari suatu instrument untuk

pengukuran fluoresensi ditunjukan dalam Gambar 15.3. Perhatikan bahwa

komponen (sumber, monokromator, dan sebagainya) yang sama terdapat juga

dalam spektrofotometer (Gambar 14.8), namun perhatikan bahwa ada dua

monokromator dan bahwa pancaran sampe dimonitor oleh detector dengan arah

900 terhadap berkas pengeksitasi. (Instrumen yang sebenarnya dapat memiliki

bentuk luar yang agak berbeda aripada bentuk bagian dalam Gambar 15.3, lewat

penggunaan cermin-cermin untuk mengirim berkas-berkas ke arah yang

menghemat ruang, namun konfigurasi tegak lurus itu dipertahankan pada sel

sampel). Alat bantu seperti lensa-lensa untuk meneruskan radiasi pengeksitasi dan

radiasi terpancar agar efisien lewat system, tidaklah ditunjukkan pada gambar itu,

dan mungkin ada segi-sei yang lain seperti motor pengerak monokromator

penyusur yang juga dihilangkan.

Sumber

Sumber berguna yang terbaik adalah lampu busur xenon.

Pemilihan Panjang Gelombang

Instrument yang tersedia sangat beranekaragam ditilik dari harga dan

kecangihannya.

Instrument Monokrom

Instrument ini lebih baik, dilengkapi dengan susunan automatis baik dari

panjang gelombang eksitasi maupun panjang gelombang pancaran, dengan

perekaman grafis dari isyarat detector.

Deteksi radiasi

Instrument penelitian telah dirancang meskipun beum muncul secara

komersial, yang dalam waktu sekejap enghasilkan perangkat data tiga dimensi:

Keluaran menunjukan suatu permukaan intensitas pendaran yang dibangun atas

dasar panjang gelombang eksitasi dan panjang gelombang pancaran.

2.5 Penerapan dari Spektroskopi Fluoresensi

Hanya sedikit ion anorganik yang berpendar, yang paling dikenal adalah

ion uranil, UO22+. Umumnya analisis fluorometrik melibatkan molekul organik;

beberapa contoh adalah (pirena, β-Naftilamina, fenol, β-Naftol, aluminium 8-

hidroksikuinolat, piridoksina, asam salisilat, aspirin, anfetamina, barbiturat,

kuinina, tirosina, dan triptofan). Ada beberapa senyawa kelat logam yang berpendar yang

memberikan metode yang peka untuk beberapa ion logam. Seringkali kelat logam

diekstraksi dari dalam larutan berair menjadi suatu pelarut organik sebelum

pengukuran, suatu proses yang sekaligus memisahkannya dari ion-ion

pengganggu dan mengkonsentrasikan spesies yang berpendar. Misalnya, banyak

terdapat reagensia flourometrik untuk aluminium dan berilium. Logam-logam

yang lebih berat seperti Fe3+, CO2+, Ni2+dan Cu2+ sebaliknya cenderung mematikan

flourosens yang diperagakan oleh banyak zat pengkelat itu sendiri, hadirnya

logam itu dalam kompleks mendorong dibuangnya energi yang diserap secara tak

radiantif. Kadang suatu analit yang tidak berpendar dapat diubah menjadi suatu

molekul yang berpendar kuat, dengan suatu reaksi yang cepat dan kuantitatif, yang dengan

mudah digabungkan ke dalam suatu prosedur analitik keseluruhan.

Misalnya,hormon epinefrin (adrenalin) mudah diubah menjadi adrenolutin. Dalam

larutan basa,anion fenolat dari adrenolutin berpendar dengan kuat (eksitasi 360

nm; pancaran 530nm). Pasien dengan tumor tertentu pada kelenjar adrenalin dan

juga beberapa penderita tekanan darah tinggi menunjukkan kadar epinefrina yang

meningkat dalam air seninya. Hormon yang terdapat pada kadar yang sangat rendah dapat

dipekatkan dari dalam volume besar air seni dengan suatu prosedur pertukaran ion

pada suatu pH dimana nitrogen amino diprotonkan untuk membentuk suatu kation

R-NH2-CH3,dielusi dalam sedikit volume dengan ditukar-ganti dengan H+ dan

diolah seperti diatas untuk membentuk flourofor itu. Beberapa vitamin dapat

ditetapkan secara fluorometrik. Oksidasi lembut tiamina (vitamin B1) oleh

Fe(CN)63-, misalnya akan menghasilkan suatu produk yang disebut tiokrom yang

memperagakan fluoresens biru pada kondisi yang tepat. Jika pancaran pendaran

itu diukur terhadap dua porsi sampel, satu diolah dengan ferisianida dan yang lain

tidak, orang dapat mengurangi kontribusi pengganggu non-tiamina yang

berpendar untuk meningkatkan selektivitas. Riboflavin (vitamin B2) dan

piridoksin (B6) merupakan dua vitamin lain yang dapat ditetapkan oleh

fluoresensi. Meskipun kebanyakan asam amino tidak berpendar, tetapi mudah

bereaksi dengan reagen fluoresamina untuk membentuk senyawa yang sangat berpendar yang

telah digunakan dalam biokimia untuk mendeteksi kuantitas. Metode fluoresensi

sangat baik untuk menetapkan beberapa hidrokarbon aromatik polisiklik yang

telah dikelompokkan sebagai “polutan prioritas” oleh Jawatan Perlindungan

Lingkungan Amerika Serikat (EPA), yang mengatakan bahwa fluoresens memberi

deteksi yang sangat peka terhadap komponen-komponen sampel tertentu dalam

kromatografi cairan.

Misalnya pada produk Susu :Produk-produk susu mengandung beberapa

fluorophores intrinsik. Misalnya asam amino aromatik dan asam nukleat,

triptofan, tirosin dan fenilalanin dalam protein,vitamin A dan B2,Nikotinamida

adenin dinukleotida (NADH) dan klorofil, dan berbagai senyawa lainnya yang dapat

ditemukan pada konsentrasi rendah atau sangat rendah di produk makanan.

2.6 Kelebihan dan Kekurangan

Kelebihan :

Karakteristik flouresensi spektrometri adalah sensitivitas yang tinggi.Fluorometri

dapat menerima limit deteksi dengan kekuatan sinyal lebih rendah dari teknik lain.

Limit deteksi sekitar 10-10 M atau lebih rendah bisa saja diukur dari sebuah

molekul. Langkah pertama pada pengukuran flouresensi adalah eksitasi elektronik

dari sebuah molekul analit yang mengabsorbsi foton. Di flouresensi, spin pada

keadaan dasar dan tereksitasi adalah sama. Pada banyak molekul organic,kedaan dasar

adalah singlet state (semua spin berpasangan). Flouresensi terjadi ketika sebuah

molekul dipromosikan ke keadaan tereksitasi dengan absorpsi, dan kemudian

kembali pada keadaan dasar dengan emisi. Batas deteksi flouresensi sering kali berorde

10-9 M dan dengan tehnik deteksiyang istimewa hampir 10-12M. Sebagai

pedoman, flouresensi lazim seribu kali lebih peka daripada spektrofotometri,

meskipun nilai-nilai yang sebenarnya bergantung pada senyawa-senyawa yang

dilibatkan dan instrumen mana yang tersedia.Fakta bahwa fluoresensi ditandai

dengan dua parameter panjang gelombang yang signifikan meningkatkan

spesifikasi dari metode ini, dibandingkan dengan teknik spektroskopi hanya

didasarkan pada penyerapan. Suatu sifat yang menonjol dari analisis flourosensi

adalah tingginya kepekaan dibandingkan dengan tehnik lazim lainnya, misalnya

spektrofotometri. Sudah menjadi sifat lebih baik untuk mengukur sedikit cahaya

lawan tak ada cahaya ketimbang mengukur pengurangan kecil dalam suatu berkas yang

terang. Daya pancaran berpendar, PEm dapat diukur tak bergantung pada daya cahaya

masuk, Po. Pancaran dapat ditingkatan baik dengan baik dengan meningkatkan Po

maupun dengan menggandakan isyarat detektor.

Kekurangan :

Beberapa kondisi fisis yang mempengaruhi fluoresensi pada molekul antara lain

polaritas, ion-ion, potensial listrik, suhu, tekanan, derajat keasaman (pH), jenis

ikatan hidrogen,viskositas dan quencher (penghambat de-eksitasi). Kondisi-

kondisi fisis tersebut mempengaruhi proses absorbsi energi cahaya eksitasi. Hal

ini berpengaruh pada proses de-eksitasi molekul sehingga menghasilkan

karakteristik intensitas dan spektrum emisi fluoresensi yang berbeda- beda.Bila

suhu makin tinggi maka efisiensi kuantum fluoresensi makin berkurang.Hal ini

disebabkan pada suhu yang lebih tinggi tabrakan-tabrakan antar molekul atau

tabrakan antar molekul dengan pelarut menjadi lebih sering yang mana peristiwa

tabrakan kelebihan energi molekul tereksitasi dilepaskan ke molekul pelarut.

DAFTAR PUSTAKA

Ed. Da Wen Sun. 2008. Modern Technic for Food Autentication. Elsevier: New York.

Ghalib, ibnu. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar: Yogyakarta.

R.A. Day, JR & AL,Underwood.2006. Analisis Kimia

Kuantitatif.Jakarta:Erlangga