par absorption biphotonique principe de la...
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La microscopie à 2 photonsYves Usson
Principe de la microscopiepar absorption biphotonique
La microscopie à 2 photonsYves Usson
L’optique non-linéaireou
1 photon + 1 photon = 1photon !
La microscopie à 2 photonsYves Usson
e1 = hν1
Orbitale basse
Orbitale haute
Principe de la fluorescence
Absorption
Noyau
e2 = hν2
e1 > e2λ1 < λ2
Emission
Noyau
La microscopie à 2 photonsYves Usson
e1 = hν1
e1 = hν1Orbitale basse
Orbitale haute
Principe de la fluorescence à 2 photonsAbsorption de 2 photons
infrarouges
Noyau
e2 = hν2
e1< e2 et e1+e1> e2λ1 > λ2
Noyau
Emission d’un photonvisible
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Fluorescence 1 photon
état de base
état excité
σa
σ1ph ~ σs
10-16cm2
section efficace
Fluorescence 2 photons
état de base
état excité
σs
σa
∆τ
∆τ, fenêtre de survie de l’état intermédiaire
σ2ph ~ σsσa∆τ
10-18cm2 10-16cm2 10-15s
La microscopie à 2 photonsYves Usson
E2ph = P2 / (t.F)Probabilité d’excitation bi-photonique :
Absorption Bi-photonique
P = puissance moyennet = durée d’impulsionF= fréquence de répétition
Condition nécessaire pour l’absorption biphotonique :
Une très haute densité en photons que ce soit
d’un point de vue spatial(concentration par focalisation, objectif à grande ouverture numérique)
oud’un point de vue temporel
(utilisation d’une source pulsée laser femto ou pico seconde)
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Lasers pulsés
temps
20 W
temps
P
Mode continu
100fs
10ns10ns
100 kW
100fs
10ns
temps
P
Mode pulsé
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Lasers accordables
Pompe miroir 99/1miroir
milieu dispersif laser
LASER USUEL
LASER ACCORDABLE (690nm à 1015nm)
Pompe miroir 99/1
miroir
milieu dispersif laserPrisme
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Lasers pulsésAspect spectral et gamme d’excitation des fluorochromes
T
E
Oscillation continue, absence de localisation temporelle
Domaine temporel Domaine spectralA
λOscillation continue, forte localisation spectrale
T
E
Oscillation pulsée, localisation temporelle des impulsions Oscillation pulsée, étalement spectral
A
λ
∆λ=5 à 8nm
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Compensateur de largeur d’impulsion
Lasers pulsés
ajustement de la largeur 80 fs150 fs
P1 P2
La microscopie à 2 photonsYves Usson
S
LASER PULSE INFRA-ROUGEACCORDABLE (690-1020 nm)
LASERDE
POMPEVERT
MAO
STATIFDE
MICROSCOPEUNITE DEBALAYAGE
ET DEDETECTION
Dispositif de microscopie bi-photonique
La microscopie à 2 photonsYves Usson
L’installation de microscopie confocale etbi-photonique du site IAB
Source laser pulsée Tsunami/MilleniaVIII Microscope confocalZeiss LSM510 NLO
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Fluorescence 1 photon
Effet biphotonique
excitation488 nm
cône d’illumination(fluorescence !)
objectif x10
solution de FITC
Fluorescence 2 photons
excitation976 nm
Spot biphotoniqueau foyer
de l’objectif
Spot biphotoniqueau foyer
de l’objectif
cône d’illumination(pas de fluorescence)
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Microscopie photonique 3DPropriétés de sectionnement optique
Tache de diffractionen microscopieconventionnelle
AX
E O
PT
IQU
E
Eliminer la lumièrehors focale
Filtrage confocal
Lumière réfléchie - fluorescenceMéthodes optiques
Solution reposant sur laformation de l’image
FluorescenceMéthodes optiques non-linéaires
Solution reposant surl’illumination
Créer de la lumièreuniquement dans
le plan focal
Absorption biphotonique
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Fluorescence 1 photon
Photodégradation
objectif
gel de FITC
excitation488 nm
émissionfluorescente
zone photodégradée
Fluorescence 2 photons
excitation976 nm
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Photodégradation
Fluorescence 2 photons GFP
section xy
section xzsection xz
Zone de photodégradationZone de photodégradation
Plan photodégradéPlan photodégradé0,6 µm
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Coupe optique d’unefibre myocardique
NADHExcitation bi-photonique
λ = 714nm
FlavoprotéinesExcitation mono-photonique
λ = 488nm
Crédits: K. Guerrero, A. Kuznetsov, Y. Usson
Absorption bi-photoniqueVisualisation de molécules métaboliques
par auto-fluorescence dans des cardio-myocytesen culture ‘in vitro’
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Absorption bi-photoniqueVisualisation de molécules métaboliques
par auto-fluorescence
NADHExcitation bi-photonique
λ = 714nmEmission 420nm
Coupe XZ
50 µm
Section optique axiale d’unefibre myocardique ‘in vitro’
La microscopie à 2 photonsYves Usson Crédits: A. Kuznetsov, Y. Usson
Absorption bi-photoniqueVisualisation de molécules métaboliques
par auto-fluorescence dans des hépatocytes enculture ‘in vitro’
NADHExcitation bi-photonique
λ = 714nm
FlavoprotéinesExcitation mono-photonique
λ = 488nm
La microscopie à 2 photonsYves Usson
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
contrôle
NADH
FLAVO
Respiration mitochondriale dans des hépatocytes en culture ‘in vitro’
contrôle
DHA
substrat DHA
DNP
découpleur complexe I
octanoate
substrat, octanoate
oléate
substrat, oléate
roténone
inhibiteur, roténone
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Fluorescence 1 photon
Application en milieu turbide
objectif
mileu diffusant
excitation488 nm
émissionfluorescente
excitation976 nm
Fluorescence 2 photons
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons
excitationexcitation
émissionémission
diffusion raman
diffusion raman
La microscopie à 2 photonsYves Usson
Résolution 1P vs 2P
0-0,5 0,5
Intensité duspot à 488 nm≅ Probabilité
d’absorption 1Pà 488 nm
Absorption à 1P : linéairementproportionnelle à la puissance
Intensité du spot à976 nm
≅ Probabilitéd’absorption 1P à
976 nmDistance de résolution à 1P :R976 nm = 2 x R488 nm Probabilité
d’absorption2P à 976 nmAbsorption à 2P :
proportionnelle au carré de la puissance
Distance de résolution :R(2P)976 nm = 1,37 x R(1P)488 nm
La microscopie à 2 photonsYves Usson
ConclusionAvantages de la microscopie à deux photons :
Source laser infrarouge : -> grand pouvoir de pénétration dans les tissusfaible diffusion et faible absorption
Absorption bi-photonique :
-> rayonnement “inoffensif” pour les cellules vivantes-> accordabilité : autorise l’ajustement de l’excitation à un grand nombre de fluorochromes-> confinement de la photodégradation auniveau du plan focal-> amélioration du rapport signal/bruit dans les coupes optiques sériées-> localisation assurée du “photobleaching” dans les expériences de FRAP et autres expérimentations reposant sur le photoblanchiment