para optar el título de quÍmico farmacÉutico
TRANSCRIPT
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIacuteMICA
Escuela de Formacioacuten Profesional de
Farmacia y Bioquiacutemica
Tesis
ldquoActividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de las hojas de once
morfotipos de Bixa Orellana Lrdquo
Para optar el tiacutetulo de
QUIacuteMICO FARMACEacuteUTICO
Autores
Bach NORTHCOTE MARREROS SIUL SAMIRIA
Bach VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
Asesores
QF MARIO JAVIER DE LA CRUZ FLORES MSc
ING JORGE ISAAC VILLACREacuteS VALLEJO Mgr
Iquitos ndash Peruacute
2019
DEDICATORIA
NORTHCOTE MARREROS SIUL SAMIRIA
En primer lugar dedico esta tesis a DIOS
TODOPODEROSO por haberme dado la
vida y hacer posible que culmine con
mucho eacutexito mi formacioacuten profesional
A mi tiacuteo VICENT ROBERT CHARRUE que estuvo
conmigo en los buenos malos y peores momentos de
estaba vida universitaria por haber confiado en miacute
por su apoyo incondicional daacutendome consejos para
ser una profesional de bien
A mi esposo IGOR PRACA DE ALMEIDA
por su paciencia comprensioacuten y apoyo
durante todo este proceso
Con mucho amor y carintildeo a mi madre y abuelos
FLORA MARREROS VICTOR MARREROS Y
FLORA MALDONADO porque ellos fueron siempre
el motor y motivo para que siga adelante
demostraacutendome el apoyo incondicional con mucha
comprensioacuten y siendo tambieacuten los guiacuteas para
culminar mi carrera profesional
A mis amigos del IMET en especial a
LENER NUNtildeEZ TUESTA Y SANDRA
VASQUEZ TUESTA por su tiempo y
conocimiento invertido durante este tiempo
de trabajo
2
DEDICATORIA
VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
A DIOS por haberme permitido y dado las
fuerzas necesarias para llegar a esta etapa
de mi vida que es el inicio a la vida
profesional de cada uno
A mis padres Manuel y Rociacuteo pilares
fundamentales en mi vida Sin ellos jamaacutes
hubiese podido conseguir lo que tengo
hasta ahora Su tenacidad y lucha
insaciable han hecho de ellos el gran
ejemplo a seguir y destacar no solo para
miacute sino para mis hermanos y familia en
general
A mi esposo Gomer compantildeero
inseparable de cada jornada A ellos este
proyecto que sin ellos no hubiese podido
ser
A mis hermanos parientes y primos que me
brindaron el apoyo y respaldo en mi tomas
de decisiones
3
AGRADECIMIENTO
A la facultad de Farmacia y Bioquiacutemica ndash UNAP por habernos permitido ser
parte de ella a todos los docentes que fueron parte de nuestra formacioacuten
profesional brindaacutendonos conocimientos y apoyo para seguir adelante diacutea a
diacutea
A nuestros asesores de tesis QF Mario Javier De la Cruz Flores yIng Jorge
Isaac Villacreacutes Vallejo Mgr por habernos brindado la oportunidad de recurrir a
su capacidad y conocimiento cientiacutefico asiacute como tambieacuten habernos tenido la
paciencia del mundo para guiarnos durante todo el desarrollo de la tesis
Al proyecto de investigacioacuten Obtencioacuten de morfotipos promisorios de Bixa
OrellanaL ldquoAchioterdquo en base a estudios integrados para la produccioacuten de
colorantes y biomasa Iquitos ndash Peruacute (Resolucioacuten Rectoral Ndeg 0421-2019-
UNAP)
Y para finalizar agradecemos a todos los que fueron nuestros compantildeeros de
clase durante todos los niveles de Universidad ya que gracias al
compantildeerismo amistad y apoyo moral han aportado nuestras ganas de seguir
adelante en la carrera profesional
NORTHCOTE MARREROS SIUL SAMIRIA
VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
4
5
INDICE DEL CONTENIDO
34
Contenido Paacuteg
Portada 1
Dedicatoria 2
Agradecimiento 4
Iacutendice 5
Iacutendice de tablas 7
Iacutendice de figuras 8
Lista de anexos 9
Siglas y abreviaturas 10
Resumen 11
Abstract 12
CAPITULO I 13
11 Introduccioacuten 13
12 Objetivos 15
121 Objetivo General 15
122 Objetivos Especiacuteficos 15
CAPITULO II 16
Marco Teoacuterico 16
21 Antecedentes 16
22 Marco conceptual 19
221Inflamacioacuten 19
222Tipos de inflamacioacuten 21
223 Fases de la inflamacioacuten 22
224 Tratamiento inflamatorio 22
225 Citotoxicidad 23
226 Especie vegetal en estudio 24
23Hipoacutetesis 29
24Variables 30
241Variable independiente 30
242Variable dependiente 30
25Operacionalizacioacuten de variables 31
6
CAPITULO III
Metodologiacutea 34
31 Tipo de estudio 34
32 Disentildeo de la investigacioacuten 34
33 Poblacioacuten y Muestra
331 Poblacioacuten animal
332 Muestra animal
333 Muestra vegetal
34
34
34
35
34 Procedimiento experimental 35
341 Actividad citotoacutexica 35
342 Actividad antiinflamatoria 37
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados 39
35 Consideraciones eacuteticas 39
CAPITULO IV 40
41 Resultados 40
411 Actividad citotoacutexica 40
412 Actividad antiinflamatoria 43
42 Discusioacuten 45
43 Conclusiones 46
44 Recomendaciones 47
45 Referencias bibliograacuteficas 48
46 Anexos 53
7
IacuteNDICE DE TABLAS
Paacuteg
Tabla 1 Cantidad de nauplios inyectados 40
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana 42
en las disoluciones
Tabla 3 Calculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea 43
anaacutelisis Probit
Tabla 4 Calculo del de inhibicioacuten antiinflamatoria 43
Tabla 5 Calculo de la IC50 de los once morfotipos de Bixa orellana L y de 44
La Hidrocortisona
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
DEDICATORIA
NORTHCOTE MARREROS SIUL SAMIRIA
En primer lugar dedico esta tesis a DIOS
TODOPODEROSO por haberme dado la
vida y hacer posible que culmine con
mucho eacutexito mi formacioacuten profesional
A mi tiacuteo VICENT ROBERT CHARRUE que estuvo
conmigo en los buenos malos y peores momentos de
estaba vida universitaria por haber confiado en miacute
por su apoyo incondicional daacutendome consejos para
ser una profesional de bien
A mi esposo IGOR PRACA DE ALMEIDA
por su paciencia comprensioacuten y apoyo
durante todo este proceso
Con mucho amor y carintildeo a mi madre y abuelos
FLORA MARREROS VICTOR MARREROS Y
FLORA MALDONADO porque ellos fueron siempre
el motor y motivo para que siga adelante
demostraacutendome el apoyo incondicional con mucha
comprensioacuten y siendo tambieacuten los guiacuteas para
culminar mi carrera profesional
A mis amigos del IMET en especial a
LENER NUNtildeEZ TUESTA Y SANDRA
VASQUEZ TUESTA por su tiempo y
conocimiento invertido durante este tiempo
de trabajo
2
DEDICATORIA
VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
A DIOS por haberme permitido y dado las
fuerzas necesarias para llegar a esta etapa
de mi vida que es el inicio a la vida
profesional de cada uno
A mis padres Manuel y Rociacuteo pilares
fundamentales en mi vida Sin ellos jamaacutes
hubiese podido conseguir lo que tengo
hasta ahora Su tenacidad y lucha
insaciable han hecho de ellos el gran
ejemplo a seguir y destacar no solo para
miacute sino para mis hermanos y familia en
general
A mi esposo Gomer compantildeero
inseparable de cada jornada A ellos este
proyecto que sin ellos no hubiese podido
ser
A mis hermanos parientes y primos que me
brindaron el apoyo y respaldo en mi tomas
de decisiones
3
AGRADECIMIENTO
A la facultad de Farmacia y Bioquiacutemica ndash UNAP por habernos permitido ser
parte de ella a todos los docentes que fueron parte de nuestra formacioacuten
profesional brindaacutendonos conocimientos y apoyo para seguir adelante diacutea a
diacutea
A nuestros asesores de tesis QF Mario Javier De la Cruz Flores yIng Jorge
Isaac Villacreacutes Vallejo Mgr por habernos brindado la oportunidad de recurrir a
su capacidad y conocimiento cientiacutefico asiacute como tambieacuten habernos tenido la
paciencia del mundo para guiarnos durante todo el desarrollo de la tesis
Al proyecto de investigacioacuten Obtencioacuten de morfotipos promisorios de Bixa
OrellanaL ldquoAchioterdquo en base a estudios integrados para la produccioacuten de
colorantes y biomasa Iquitos ndash Peruacute (Resolucioacuten Rectoral Ndeg 0421-2019-
UNAP)
Y para finalizar agradecemos a todos los que fueron nuestros compantildeeros de
clase durante todos los niveles de Universidad ya que gracias al
compantildeerismo amistad y apoyo moral han aportado nuestras ganas de seguir
adelante en la carrera profesional
NORTHCOTE MARREROS SIUL SAMIRIA
VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
4
5
INDICE DEL CONTENIDO
34
Contenido Paacuteg
Portada 1
Dedicatoria 2
Agradecimiento 4
Iacutendice 5
Iacutendice de tablas 7
Iacutendice de figuras 8
Lista de anexos 9
Siglas y abreviaturas 10
Resumen 11
Abstract 12
CAPITULO I 13
11 Introduccioacuten 13
12 Objetivos 15
121 Objetivo General 15
122 Objetivos Especiacuteficos 15
CAPITULO II 16
Marco Teoacuterico 16
21 Antecedentes 16
22 Marco conceptual 19
221Inflamacioacuten 19
222Tipos de inflamacioacuten 21
223 Fases de la inflamacioacuten 22
224 Tratamiento inflamatorio 22
225 Citotoxicidad 23
226 Especie vegetal en estudio 24
23Hipoacutetesis 29
24Variables 30
241Variable independiente 30
242Variable dependiente 30
25Operacionalizacioacuten de variables 31
6
CAPITULO III
Metodologiacutea 34
31 Tipo de estudio 34
32 Disentildeo de la investigacioacuten 34
33 Poblacioacuten y Muestra
331 Poblacioacuten animal
332 Muestra animal
333 Muestra vegetal
34
34
34
35
34 Procedimiento experimental 35
341 Actividad citotoacutexica 35
342 Actividad antiinflamatoria 37
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados 39
35 Consideraciones eacuteticas 39
CAPITULO IV 40
41 Resultados 40
411 Actividad citotoacutexica 40
412 Actividad antiinflamatoria 43
42 Discusioacuten 45
43 Conclusiones 46
44 Recomendaciones 47
45 Referencias bibliograacuteficas 48
46 Anexos 53
7
IacuteNDICE DE TABLAS
Paacuteg
Tabla 1 Cantidad de nauplios inyectados 40
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana 42
en las disoluciones
Tabla 3 Calculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea 43
anaacutelisis Probit
Tabla 4 Calculo del de inhibicioacuten antiinflamatoria 43
Tabla 5 Calculo de la IC50 de los once morfotipos de Bixa orellana L y de 44
La Hidrocortisona
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
DEDICATORIA
VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
A DIOS por haberme permitido y dado las
fuerzas necesarias para llegar a esta etapa
de mi vida que es el inicio a la vida
profesional de cada uno
A mis padres Manuel y Rociacuteo pilares
fundamentales en mi vida Sin ellos jamaacutes
hubiese podido conseguir lo que tengo
hasta ahora Su tenacidad y lucha
insaciable han hecho de ellos el gran
ejemplo a seguir y destacar no solo para
miacute sino para mis hermanos y familia en
general
A mi esposo Gomer compantildeero
inseparable de cada jornada A ellos este
proyecto que sin ellos no hubiese podido
ser
A mis hermanos parientes y primos que me
brindaron el apoyo y respaldo en mi tomas
de decisiones
3
AGRADECIMIENTO
A la facultad de Farmacia y Bioquiacutemica ndash UNAP por habernos permitido ser
parte de ella a todos los docentes que fueron parte de nuestra formacioacuten
profesional brindaacutendonos conocimientos y apoyo para seguir adelante diacutea a
diacutea
A nuestros asesores de tesis QF Mario Javier De la Cruz Flores yIng Jorge
Isaac Villacreacutes Vallejo Mgr por habernos brindado la oportunidad de recurrir a
su capacidad y conocimiento cientiacutefico asiacute como tambieacuten habernos tenido la
paciencia del mundo para guiarnos durante todo el desarrollo de la tesis
Al proyecto de investigacioacuten Obtencioacuten de morfotipos promisorios de Bixa
OrellanaL ldquoAchioterdquo en base a estudios integrados para la produccioacuten de
colorantes y biomasa Iquitos ndash Peruacute (Resolucioacuten Rectoral Ndeg 0421-2019-
UNAP)
Y para finalizar agradecemos a todos los que fueron nuestros compantildeeros de
clase durante todos los niveles de Universidad ya que gracias al
compantildeerismo amistad y apoyo moral han aportado nuestras ganas de seguir
adelante en la carrera profesional
NORTHCOTE MARREROS SIUL SAMIRIA
VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
4
5
INDICE DEL CONTENIDO
34
Contenido Paacuteg
Portada 1
Dedicatoria 2
Agradecimiento 4
Iacutendice 5
Iacutendice de tablas 7
Iacutendice de figuras 8
Lista de anexos 9
Siglas y abreviaturas 10
Resumen 11
Abstract 12
CAPITULO I 13
11 Introduccioacuten 13
12 Objetivos 15
121 Objetivo General 15
122 Objetivos Especiacuteficos 15
CAPITULO II 16
Marco Teoacuterico 16
21 Antecedentes 16
22 Marco conceptual 19
221Inflamacioacuten 19
222Tipos de inflamacioacuten 21
223 Fases de la inflamacioacuten 22
224 Tratamiento inflamatorio 22
225 Citotoxicidad 23
226 Especie vegetal en estudio 24
23Hipoacutetesis 29
24Variables 30
241Variable independiente 30
242Variable dependiente 30
25Operacionalizacioacuten de variables 31
6
CAPITULO III
Metodologiacutea 34
31 Tipo de estudio 34
32 Disentildeo de la investigacioacuten 34
33 Poblacioacuten y Muestra
331 Poblacioacuten animal
332 Muestra animal
333 Muestra vegetal
34
34
34
35
34 Procedimiento experimental 35
341 Actividad citotoacutexica 35
342 Actividad antiinflamatoria 37
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados 39
35 Consideraciones eacuteticas 39
CAPITULO IV 40
41 Resultados 40
411 Actividad citotoacutexica 40
412 Actividad antiinflamatoria 43
42 Discusioacuten 45
43 Conclusiones 46
44 Recomendaciones 47
45 Referencias bibliograacuteficas 48
46 Anexos 53
7
IacuteNDICE DE TABLAS
Paacuteg
Tabla 1 Cantidad de nauplios inyectados 40
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana 42
en las disoluciones
Tabla 3 Calculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea 43
anaacutelisis Probit
Tabla 4 Calculo del de inhibicioacuten antiinflamatoria 43
Tabla 5 Calculo de la IC50 de los once morfotipos de Bixa orellana L y de 44
La Hidrocortisona
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
AGRADECIMIENTO
A la facultad de Farmacia y Bioquiacutemica ndash UNAP por habernos permitido ser
parte de ella a todos los docentes que fueron parte de nuestra formacioacuten
profesional brindaacutendonos conocimientos y apoyo para seguir adelante diacutea a
diacutea
A nuestros asesores de tesis QF Mario Javier De la Cruz Flores yIng Jorge
Isaac Villacreacutes Vallejo Mgr por habernos brindado la oportunidad de recurrir a
su capacidad y conocimiento cientiacutefico asiacute como tambieacuten habernos tenido la
paciencia del mundo para guiarnos durante todo el desarrollo de la tesis
Al proyecto de investigacioacuten Obtencioacuten de morfotipos promisorios de Bixa
OrellanaL ldquoAchioterdquo en base a estudios integrados para la produccioacuten de
colorantes y biomasa Iquitos ndash Peruacute (Resolucioacuten Rectoral Ndeg 0421-2019-
UNAP)
Y para finalizar agradecemos a todos los que fueron nuestros compantildeeros de
clase durante todos los niveles de Universidad ya que gracias al
compantildeerismo amistad y apoyo moral han aportado nuestras ganas de seguir
adelante en la carrera profesional
NORTHCOTE MARREROS SIUL SAMIRIA
VELAacuteSQUEZ RIacuteOS PRISCILA MANUELA
4
5
INDICE DEL CONTENIDO
34
Contenido Paacuteg
Portada 1
Dedicatoria 2
Agradecimiento 4
Iacutendice 5
Iacutendice de tablas 7
Iacutendice de figuras 8
Lista de anexos 9
Siglas y abreviaturas 10
Resumen 11
Abstract 12
CAPITULO I 13
11 Introduccioacuten 13
12 Objetivos 15
121 Objetivo General 15
122 Objetivos Especiacuteficos 15
CAPITULO II 16
Marco Teoacuterico 16
21 Antecedentes 16
22 Marco conceptual 19
221Inflamacioacuten 19
222Tipos de inflamacioacuten 21
223 Fases de la inflamacioacuten 22
224 Tratamiento inflamatorio 22
225 Citotoxicidad 23
226 Especie vegetal en estudio 24
23Hipoacutetesis 29
24Variables 30
241Variable independiente 30
242Variable dependiente 30
25Operacionalizacioacuten de variables 31
6
CAPITULO III
Metodologiacutea 34
31 Tipo de estudio 34
32 Disentildeo de la investigacioacuten 34
33 Poblacioacuten y Muestra
331 Poblacioacuten animal
332 Muestra animal
333 Muestra vegetal
34
34
34
35
34 Procedimiento experimental 35
341 Actividad citotoacutexica 35
342 Actividad antiinflamatoria 37
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados 39
35 Consideraciones eacuteticas 39
CAPITULO IV 40
41 Resultados 40
411 Actividad citotoacutexica 40
412 Actividad antiinflamatoria 43
42 Discusioacuten 45
43 Conclusiones 46
44 Recomendaciones 47
45 Referencias bibliograacuteficas 48
46 Anexos 53
7
IacuteNDICE DE TABLAS
Paacuteg
Tabla 1 Cantidad de nauplios inyectados 40
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana 42
en las disoluciones
Tabla 3 Calculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea 43
anaacutelisis Probit
Tabla 4 Calculo del de inhibicioacuten antiinflamatoria 43
Tabla 5 Calculo de la IC50 de los once morfotipos de Bixa orellana L y de 44
La Hidrocortisona
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
5
INDICE DEL CONTENIDO
34
Contenido Paacuteg
Portada 1
Dedicatoria 2
Agradecimiento 4
Iacutendice 5
Iacutendice de tablas 7
Iacutendice de figuras 8
Lista de anexos 9
Siglas y abreviaturas 10
Resumen 11
Abstract 12
CAPITULO I 13
11 Introduccioacuten 13
12 Objetivos 15
121 Objetivo General 15
122 Objetivos Especiacuteficos 15
CAPITULO II 16
Marco Teoacuterico 16
21 Antecedentes 16
22 Marco conceptual 19
221Inflamacioacuten 19
222Tipos de inflamacioacuten 21
223 Fases de la inflamacioacuten 22
224 Tratamiento inflamatorio 22
225 Citotoxicidad 23
226 Especie vegetal en estudio 24
23Hipoacutetesis 29
24Variables 30
241Variable independiente 30
242Variable dependiente 30
25Operacionalizacioacuten de variables 31
6
CAPITULO III
Metodologiacutea 34
31 Tipo de estudio 34
32 Disentildeo de la investigacioacuten 34
33 Poblacioacuten y Muestra
331 Poblacioacuten animal
332 Muestra animal
333 Muestra vegetal
34
34
34
35
34 Procedimiento experimental 35
341 Actividad citotoacutexica 35
342 Actividad antiinflamatoria 37
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados 39
35 Consideraciones eacuteticas 39
CAPITULO IV 40
41 Resultados 40
411 Actividad citotoacutexica 40
412 Actividad antiinflamatoria 43
42 Discusioacuten 45
43 Conclusiones 46
44 Recomendaciones 47
45 Referencias bibliograacuteficas 48
46 Anexos 53
7
IacuteNDICE DE TABLAS
Paacuteg
Tabla 1 Cantidad de nauplios inyectados 40
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana 42
en las disoluciones
Tabla 3 Calculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea 43
anaacutelisis Probit
Tabla 4 Calculo del de inhibicioacuten antiinflamatoria 43
Tabla 5 Calculo de la IC50 de los once morfotipos de Bixa orellana L y de 44
La Hidrocortisona
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
6
CAPITULO III
Metodologiacutea 34
31 Tipo de estudio 34
32 Disentildeo de la investigacioacuten 34
33 Poblacioacuten y Muestra
331 Poblacioacuten animal
332 Muestra animal
333 Muestra vegetal
34
34
34
35
34 Procedimiento experimental 35
341 Actividad citotoacutexica 35
342 Actividad antiinflamatoria 37
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados 39
35 Consideraciones eacuteticas 39
CAPITULO IV 40
41 Resultados 40
411 Actividad citotoacutexica 40
412 Actividad antiinflamatoria 43
42 Discusioacuten 45
43 Conclusiones 46
44 Recomendaciones 47
45 Referencias bibliograacuteficas 48
46 Anexos 53
7
IacuteNDICE DE TABLAS
Paacuteg
Tabla 1 Cantidad de nauplios inyectados 40
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana 42
en las disoluciones
Tabla 3 Calculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea 43
anaacutelisis Probit
Tabla 4 Calculo del de inhibicioacuten antiinflamatoria 43
Tabla 5 Calculo de la IC50 de los once morfotipos de Bixa orellana L y de 44
La Hidrocortisona
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
7
IacuteNDICE DE TABLAS
Paacuteg
Tabla 1 Cantidad de nauplios inyectados 40
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana 42
en las disoluciones
Tabla 3 Calculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea 43
anaacutelisis Probit
Tabla 4 Calculo del de inhibicioacuten antiinflamatoria 43
Tabla 5 Calculo de la IC50 de los once morfotipos de Bixa orellana L y de 44
La Hidrocortisona
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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52
28 Liang P y Macrae T The synthesis of a small heat shockalphacrystallin
protein in Artemia and its relationship to stress tolerance during
development Dev Biol (1999) 207445-56 Disponible en
httpswwwncbinlmnihgovpubmed10068475 Fecha de acceso 30 de
Abril 2018
29 Andriolli A Beraldo H Santos D Teixeira S Teixeira L y Ziolli R
Avaliaccedilatildeo do potencial citotoacutexico de 2-piridiniformamida
tiossemicarbazonas e de seus complexos de Fe (III) utilizando Artemia
franciscana Heal and Environ J (2007) 8 2-10 Disponible en
httpwwwpuc-
riobrpibicrelatorio_resumo2007resumosQUIana_claudia_andriolli_dani
elle_da_s_santos_silvio_cesar_godinho_teixeirapdf
30 Sokmen M In vitro antioxidant activity of polyphenol extracts with antiviral
properties from Geranium sanguineum L Life Sciences 76 (25) 2981-
2993 (2005)
31 CHOI CW Antioxidant activity and free radical scavenging capacity
betweenKorean medicinal plants and flavonoids by assay-guided
comparison Plant Science 163 1161-1168 (2002)
32 PYO YH TC LEE L LOGENDRA Y RT ROSEN Antioxidant activity
and phenolic compounds of Swiss chard (Beta vulgaris subspecies cycla)
extracts Food Chem 85 (19) 19-26 (2004)
33 Meyer BN Ferrigni NR Putnam JE Jacobsen LB Nichols DE Mc
Laughlin JL Brine shrimp a convenient general bioassay for active plant
constituents Planta meacutedica 4531-4 1982
53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
8
IacuteNDICE DE FIGURAS
Paacuteg
Figura 1 Inflamacioacuten 20
Figura 2 Viacutea inflamatoria geneacuterica 21
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la 22
respuesta inflamatoria
Figura 4 Faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial 23
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa 27
orellanaL
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
9
LISTA DE ANEXOS
Paacuteg
Anexo 1
Anexo 2
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos
acuoso liofilizado
Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento
de citotoxicidad
Configuracioacuten de esquema de experimento de
citotoxicidad
Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia
franciscana
Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de
Artemia franciscana
Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
53
54
55
55
56
57
58
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
10
SIGLAS Y ABREVIATURAS
ppm= partes por milloacuten
FFB= Facultad de Farmacia y Bioquiacutemica
CL50= Concentracioacuten letal media 50
IO= Instan Ocean
OMS= Organizacioacuten mundial de la Salud
IMET= Instituto de Medicina Tradicional
Ho= Hipoacutetesis nula
H1= Hipoacutetesis del investigador
K2Cr2O7= Dicromato de potasio
M1 ndash M11 = morfotipo 1 al morfotipo 11
V = vivos
M = muertos
120583g= micro gramos
mgmL= miligramos por milimitros
ACIT = actividad citotoacutexica
AAI = actividad antiinflamatoria
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
11
RESUMEN
El objetivo fue determinar actividad citotoacutexica y antiinflamatoria in vitro de hojas
de once morfotipos de Bixa Orellana L Hojas colectadas y acondicionadas
secadas en deshumecedor a 35 degC por seis diacuteas posteriormente
micropulverizadas La ACIT se determinoacute sobre nauplios de Artemia franciscana
a concentraciones de 0001 001 01 y 1 mgmL obtenieacutendose CL50 viacutea
anaacutelisis Probit La AAI fue mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos a concentraciones de 1 10 100 1000 120583gmL
midieacutendose absorbancia 540 nm para obtener porcentaje inhibicioacuten e IC50 se
determinoacute por curva dosis-respuesta Se concluyoacute que todos los morfotipos no
presentan actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscana ya
que presentan CL50 gt 1000 120583gmL y en la actividad antiinflamatoria el de mejor
actividad fue el morfotipo 9 con un IC50 = 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50 =016 mgmL morfotipo 10 con un IC50 = 018 120583gmL morfotipo 7 con un
IC50 = 043 120583gmL morfotipo 6 con un IC50 = 081 120583gmL y el morfotipo 5 con
un IC50 = 087 gmL
Palabras clavesBixa orellana L Actividad citotoacutexica Artemia franciscana
actividad antiinflamatoria
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
12
ldquoIn vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of the leaves of
eleven morphotypes of Bixa Orellana Lrdquo
ABSTRACT
The objective was to determine in vitro cytotoxic and antiinflammatory activity of
leaves of eleven morphotypes of Bixa Orellana L Sheets collected and
conditioned dried in dehumidifier at 35 degC for six days then micropulverized
ACIT was determined on nauplii of Artemia franciscana at concentrations of
0001 001 01 and 1 mgmL LC50 was obtained through probit analysis AAI
was by protecting plasma membranes in human red blood cells at
concentrations of 1 10 100 1000 120583gmL by measuring 540 nm absorbance to
obtain porcentaje inhibition and IC50 was determined by dose-response curve It
was concluded that all morphotypes have no in vitro cytotoxic activity on nauplii
of Artemia franciscana since they have CL50 gt 1000 120583gmL and in the
antiinflammatory activity the best activity was morphotype 9 with an IC50 = 014
ugmL followed by morphotype 11 IC50 = 016 mgmL morphotype 10 with an
IC50 = 018 120583gmL morphotype 7 with an IC50 = 043 120583g type 05081 120583gmL
and morphotype 5 with an IC50 = 087 120583gmL
Keywords Bixa Orellana L Cytotoxic activity Franciscan Artemia
antiinflammatory activity
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
13
CAPITULO I
11 INTRODUCCION
En las uacuteltimas deacutecadas se ha incrementado el intereacutes por los productos
naturales y sus aplicaciones dentro de la industria farmaceacuteutica en buacutesqueda
de nuevos medicamentos no solo eficaces sino que tambieacuten sean seguros (1)
Cerca al 30 de los faacutermacos empleados en los paiacuteses industrializados
proceden o son sintetizados a partir de productos vegetales puesto que los
extractos de plantas son una fuente atractiva de nuevos medicamentos (2)
Cuando el organismo o un tejido se ven injuriado por agentes bioloacutegicos
quiacutemicos o fiacutesicos se produce la respuesta inflamatoria que si bien tiene un fin
protector muchas veces puede causar dantildeo y es necesario frenarla Muchas
especies vegetales son usadas en preparados artesanales con el fin de
disminuir la respuesta inflamatoria y comercialmente los antiinflamatorios son
uno de los medicamentos maacutes vendidos (3)
El estudio en cuanto a propiedades curativas de gran diversidad de plantas
peruanas es auacuten incipiente siendo miacutenimo el de las especies vegetales con
posible actividad antineoplaacutesica (3) La actividad citotoacutexica de algunas especies
quiacutemicas es deseada para destruir ceacutelulas neoplaacutesicas contrariamente una
moleacutecula de aplicacioacuten terapeacuteutica con otro tipo de actividad no debe producir
ni inducir cambios mutageacutenicos porque seriacutea insegura (4)
Las plantas superiores han sido una fuente de mucha utilidad sin embargo es
importante descartar si los productos de origen natural mediante modelos in
vitro e in vivo no poseen actividad toxica pero si es beneficioso conocer la
actividad antitumoral inicial (4) En las uacuteltimas deacutecada se han incorporado
algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que demandan unas miacutenimas
cantidades de muestras y permiten una raacutepida evaluacioacuten de extractos crudos y
fracciones para determinar actividad toacutexica como actividad citotoacutexica ocupando
un lugar sobresaliente el bioensayo con Artemia spp(3)
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
14
Dentro de la investigacioacuten se busca determinar la actividad toacutexica que
presentan los extractos de las especies vegetales en estudio sobre los nauplios
de Artemia spp se incluyen la determinacioacuten de la concentracioacuten letal media
(CL50) a fin de conocer la concentracioacuten que produciraacute un efecto toacutexico en un
50 de la especie en experimentacioacuten y observar la relacioacuten riesgo-beneficio
que va implicar el uso de estos extractos vegetales como alternativa medicinal
(3)
Asimismo es necesario indicar que la actividad antiinflamatoria ha despertado
en los uacuteltimos antildeos un gran intereacutes cientiacutefico dentro del aacuterea farmacoloacutegica
principalmente por la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en
la evolucioacuten de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (2) dando
como resultado un aumento en el nuacutemero de personas que utilizan estos
compuestos naturales para controlar su enfermedad (5)
Es por ello que el presente trabajo de investigacioacuten planteoacutedeterminar la
actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
15
12 OBJETIVOS
121 Objetivo General
- Determinar la actividad citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana y la
actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos de las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
122 Objetivos Especiacuteficos
a) Determinar la concentracioacuten letal media 50 (CL50) de las hojas de los
once morfotipos de Bixa orellana L
b) Determinar la concentracioacuten inhibitoria media (IC50) y de inhibicioacuten
antiinflamatoria de las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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32 PYO YH TC LEE L LOGENDRA Y RT ROSEN Antioxidant activity
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33 Meyer BN Ferrigni NR Putnam JE Jacobsen LB Nichols DE Mc
Laughlin JL Brine shrimp a convenient general bioassay for active plant
constituents Planta meacutedica 4531-4 1982
53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
21 ANTECEDENTES
Aranda J et al (2017) realizaron una caracterizacioacuten fitoquiacutemica mediante
cromatografiacutea de gases y espectrometriacutea de masas El meacutetodo usado para la
toxicidad fue medida en larvas de Artemia salina la actividad antioxidante fue
medida a traveacutes de la prueba de 22-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) y la
actividad hipoglicemiante in vitro fue evaluada mediante la prueba de inhibicioacuten
de α-glucosidasa e in vivo usando ratas albinas Obtuvieron como resultado
fitoconstituyentes compuestos piranos carbohidratos y fenoles asimismo con
respecto a la letalidad encontraron una CL50 de 3108 120583gmL la actividad
antioxidante en la concentracioacuten de 20 mgmL (8668 plusmn 071) con una IC50
(308 plusmn 031 mgmL) Concluyeron que la concentracioacuten de 2000 y 1750 120583gmL
mostroacute la mejor actividad inhibitoria de la α-glucosidasa (IC50 39939 120583gmL)
observaacutendose que habiacutea diferencia significativa (6)
Sepuacutelveda C et al(2016) evaluaron el efecto del tiempo de extraccioacuten y la
relacioacuten solvente sobre el contenido de fenoles totales asiacute como el efecto del
contenido de soacutelidos y el pH de la solucioacuten sobre la actividad antioxidante del
extracto de hojas de B orellana El meacutetodo usado para el contenido total de
fenoles fue Folin-Ciocalteu y la actividad antioxidante se determinoacute por los
meacutetodos espectrofotomeacutetricos de reaccioacuten con el radical 22acute-azino-bis (3-
etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y la medida de la capacidad reductora
sobre el Fe+3 Los resultados sobre las condiciones del proceso que maacutes
favorecen la extraccioacuten de compuestos fenoacutelicos desde las hojas de Bixa
orellana L son tiempo de extraccioacuten de 60 h y relacioacuten solvente hojas (vp) de
41 el contenido maacuteximo de fenoles totales fue de 14477 plusmn 966 mgATg-1 que
al someterlo a una solucioacuten de pH de 8 y 117 degBrix presenta una actividad
antioxidante de 440683 plusmn 4330 120583mol ETg-1 por el meacutetodo de reaccioacuten con el
radical 22acute-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6- aacutecido sulfoacutenico) y 454722 plusmn 5319
120583molETg-1 por el meacutetodo de medida de la capacidad reductora sobre el Fe+3(7)
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
17
Capella SO et al(2016) evaluaron la accioacuten del extracto oleoso de urucum
en la cicatrizacioacuten de heridas cutaacuteneas abiertas en ratas Wistar las mismas
que fueron tratadas de forma diaria con extracto de urucum 01 (U 01)
extracto de urucum 001 (U 001) vaselina (V) y solucioacuten fisioloacutegica (SF)
hasta 21 diacuteas A los cuatro siete 14 y 21 diacuteas se evaluoacute cliacutenicamente la
presencia de exudado corteza y epitelizacioacuten A las 21dias las muestras de
piel fueron recolectadas para anaacutelisis tensiomeacutetrico donde cliacutenicamente todos
los grupos de tratamiento presentaron una evolucioacuten cicatricial fisioloacutegica Los
grupos U 01 y U 001 presentaron mayor presencia de epitelizacioacuten a los
siete diacuteas y mayor retraccioacuten cicatricial a los cuatro diacuteas En la histologiacutea U
01 y U 001 presentaron a los cuatro y siete diacuteas mayor cantidad de fibrina
e inflamacioacuten que V y SF y en los demaacutes momentos no hubo diferencias
entre los grupos En cuanto a la fase cicatricial a los cuatro diacuteas todos los
grupos se encontraban en la fase inflamatoria a los siete diacuteas U 01 y U
001 permaneciacutean en la fase inflamatoria difiriendo de SF y V que se
caracterizaban en la fase proliferativa A los 14 diacuteas los grupos se presentaban
en transicioacuten de fase proliferativa para maduracioacuten y a las 21 dias estaban
todos en la fase de maduracioacuten Concluyeron que el extracto oleoso de urucum
acelera el proceso cicatricial en los primeros diacuteas pero proporciona una cicatriz
de baja calidad (8)
Avalos J (2014) evaluaron y compararon la actividad toacutexica citotoacutexica y
fitoquiacutemicos presentes de los extractos etanoacutelicos y sus particiones de semilla y
hoja de Azadirachta indica (Neem) de origen Mexicano (Eacutebano SLP)
comparada con la comercializada en la India (Coimbatore Tamil Nadu) Usaron
tres liacuteneas celulares MCF7 (Caacutencer de Mama) HaCaT (Queratinocitos
Humanos) y CaLo (Caacutencer cervicouterino) Determinaron la toxicidad de los
extractos sobre Artemia salina siendo la de mayor actividad el extracto de
semilla de neem de la India con una DL50 de 476 120583gmL los extractos que
presentaron mayor actividad citotoacutexica sobre las distintas liacuteneas celulares
fueron Extracto de hoja de neem de la india con una IC50 2203 120583gmL sobre la
liacutenea MCF7 extracto de semilla de neem de la India con una IC503217 120583gmL
sobre la liacutenea CaLo y extracto de hoja de neem de Meacutexico con una IC5013576
120583gmL sobre la liacutenea HaCaT De los extractos de hoja y semilla se obtuvieron
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
18
dos particiones hexaacutenica y clorofoacutermica la mayor actividad se presentoacute en la
particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India con una IC50 2517 120583gmL sobre
la liacutenea celular MCF7 particioacuten clorofoacutermica de semilla de neem de la India con
una IC503093 120583gmL sobre la liacutenea celular CaLo y particioacuten clorofoacutermica de
hoja de neem de la India con una IC509809 120583gmL sobre la liacutenea celular
HaCaT Demostraron que los extractos etanoacutelicos de A indica originarios de la
India mostraron mayor actividad toacutexica y citotoacutexica que los extractos de origen
Meacutexico la particioacuten hexaacutenica de hoja de neem de la India fue la que presentoacute
mayor actividad citotoacutexica sobre MCF7 y es promisoria como fitofaacutermaco (9)
Huamaacuten O et al (2013) evaluaron el efecto de los extractos acuoso e
hidroetanoacutelico de hojas de Bixa orellana L (achiote) sobre los indicadores no
enzimaacuteticos de la hepatotoxicidad por paracetamol en ratas Utilizaron un
disentildeo experimental con ratas machos de 3 meses de edad Distribuyeron
aleatoriamente 35 ratas machos de 3 meses de edad en 5 grupos que
recibieron viacutea peroral por 10 diacuteas NaCl 09 por ciento los controles positivo y
negativo silimarina 300 mgkg extracto acuoso 500 mgkg y extracto
hidroetanoacutelico 500 mgkg usaron como principales medidas de resultados
Ratio hepaacutetico (peso hiacutegadopeso animal x 100) bilirrubina total (BT) directa
(BD) e indirecta (BI) hepatomegalia especies reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico
(TBARS) en hiacutegado y suero Mostraron como resultados que el tratamiento con
extracto acuoso solo disminuyoacute los indicadores BT y BI (plt001) TBARS en
suero (plt005) y hubo disminucioacuten de la masa hepaacutetica de -132 por ciento
(plt001) En el grupo que recibioacute el extracto hidroetanoacutelico se redujo la BT BI
(plt001) BD (plt005) TBARS en hiacutegado (plt001) y la masa hepaacutetica -937 por
ciento Concluyeron que los extractos acuoso e hidroetanoacutelico de hojas de Bixa
Orellana L (achiote) presentariacutean efecto hepatoprotector frente al paracetamol
a dosis toacutexica en ratas (10)
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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Beacutejar Camarena Elsa Huamaacuten Gutieacuterrez Zoraida Judith Tarazona
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33 Meyer BN Ferrigni NR Putnam JE Jacobsen LB Nichols DE Mc
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
19
22 MARCO CONCEPTUAL
221 Inflamacioacuten
La inflamacioacuten es la respuesta del sistema inmunoloacutegico de un organismo al
dantildeo causado a sus ceacutelulas y tejidos vascularizados por patoacutegenos bacterianos
y por cualquier otro agresor de naturaleza bioloacutegica quiacutemica fiacutesica o mecaacutenica
Aunque dolorosa la inflamacioacuten es normalmente una respuesta reparadora
un proceso que implica un enorme gasto de energiacutea metaboacutelica En ocasiones
transcurre hacia una situacioacuten croacutenica que suele dar lugar a una enfermedad
degenerativa como artritis arteriosclerosis o incluso caacutencer Aunque suele
acompantildearse de una respuesta generalizada laquorespuesta de fase agudaraquo
caracterizada por un cuadro cliacutenico pasajero de sensacioacuten de malestar fiebre y
modificacioacuten del perfil de las proteiacutenas y leucocitos circulantes en ocasiones la
inflamacioacuten aguda local provoca una reaccioacuten orgaacutenica generalizada laquosiacutendrome
de respuesta inflamatoria sisteacutemicaraquo que en una secuencia de reacciones a
modo de espiral sin control laquoinflamacioacuten malignaraquo conduce al fracaso funcional
de los diferentes oacuterganos y sistemas laquofracaso multiorgaacutenicoraquo y tras ello a la
muerte del individuo (16)
Desencadenante
inflamatorio Infeccioacuten Lesioacuten tisular Estreacutes o disfuncioacuten celular
INFLAMACION
Propoacutesito Defensa del organismo Respuesta de Adaptacioacuten al estreacutes y retorno
fisioloacutegico contra la infeccioacuten reparacioacuten tisular al estado homeostaacutetico
Consecuencias Autoinmunidad lesioacuten Fibrosis metaplasia yo Dishomeostasis (UPR) yo
Fisiopataloacutegicas Inflamatoacuteriatisular tumorogeacutenesis enf autoinflamatorias
Sepsis SIRS
Figura 1 Inflamacioacuten
Fuente Weiss U (2002)
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
20
En cualquier caso la respuesta inflamatoria estaacute coordinada por un copioso
dispositivo de mediadores que se organizan en complejas redes reguladoras
Para disecar tal entramado es uacutetil agrupar esas sentildeales en categoriacuteas
funcionales y distinguir entre inductores y mediadores de la respuesta
inflamatoria Los primeros son sentildeales que inician el proceso activan sensores
especializados que suscitan la produccioacuten de lotes especiacuteficos de mediadores
Estos a su vez alteran los estados funcionales de ceacutelulas tejidos y oacuterganos mdash
que son los efectores de la inflamacioacutenmdash de manera que permitan su
adaptacioacuten primero y reparacioacuten despueacutes del dantildeo infringido por el inductor(13)
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Exoacutegenos Endoacutegenos
Microbianos No microbianos Derivados Derivados Derivados Derivados
Celulares tisulares plasmaacuteticos MEC
PAMP Alergenos Macromoleacuteculas Cristales Factor XII Productos
Factores de virulencia Cuerpos extrantildeos Mole Proinflamat Degradacioacuten
Oxoliproprot Compuestos toacutexicos
Hipoperfusioacuten
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
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31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
21
Inductores Sensores Mediadores Efectores
Lipopolisacaacuteridos bacterianos
TLR4
TNF-α IL-6 PGE2
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Alergenos IgE Amina vasoactivas Endoteliocitos lisoniocitos
Cristales-urato monosoacutedico
o pirofosfato caacutelcico
deshidratado
NALP3
(inflamasona)
IL-1β
Endoteliocitos leucocitos
hepatocitos hipotalamocitos
Colaacutegeno
Factor Hageman
Bradiquina coagulacioacuten
fibrino Cacute
Endoteliocitos lisoniocitos
Figura 2 Una viacutea inflamatoria geneacuterica
Fuente Weiss U (2002)
222 Tipos de inflamacioacuten
La respuesta inflamatoria presenta dos tipos que se diferencian por su
duracioacuten
a) Inflamacioacuten aguda
Es la respuesta inicial e inmediata a la lesioacuten relacionada principalmente con
cambios hemodinaacutemicos locales que llevan a manifestaciones cliacutenicas como
rubor calor edema y dolor en la zona afectada Posteriormente hay salida de
leucocitos hacia el tejido lesionado e iniciar el proceso de degradacioacuten de los
tejidos necroacuteticos Este tipo de inflamacioacuten tiene una duracioacuten que oscila entre
minutos horas y pocos diacuteas
b) Inflamacioacuten croacutenica
Es una inflamacioacuten de larga duracioacuten (semanas meses o antildeos) en la cual la
inflamacioacuten activa la lesioacuten tisular y el proceso de reparacioacuten suceden al
mismo tiempo La inflamacioacuten croacutenica es nociva para la salud y se constituye
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
22
en el mecanismo patogeacutenico baacutesico de algunas enfermedades croacutenicas como
artritis reumatoidea aterosclerosis fibrosis pulmonar obesidad entre otras
223 Fases de la inflamacioacuten
Despueacutes de un corto periodo de vasoconstriccioacuten a nivel arterial se produce
vasodilatacioacuten y aumento de flujo sanguiacuteneo en la zona de la lesioacuten que causa
enrojecimiento y aumento de la temperatura posteriormente el flujo sanguiacuteneo
disminuye por un aumento de la permeabilidad vascular que permite la salida
de liacutequido de los vasos y aumento de la viscosidad sanguiacutenea lo que se
denomina estasis (paraacutelisis total del flujo) A medida que evoluciona la estasis
se produce la migracioacuten de los leucocitos a traveacutes del endotelio vascular
mediante un mecanismo denominado transmigracioacuten (Figura 3) el cual permite
que las ceacutelulas inflamatorias lleguen al sitio de la lesioacuten (11)
Figura 3 Migracioacuten de leucocitos al tejido lesionado durante la respuesta
inflamatoria
Fuente Weiss U (2002)
224 Tratamiento antiinflamatorio
Los tratamientos antiinflamatorios implican el uso de faacutermacos de tipo
esteroidal y no esteroidal Los glucocorticoides cuya naturaleza es esteroidal
(ej cortisol 1) inhiben la transcripcioacuten de genes proinflamatorios y suprimen la
respuesta inmune Por otro lado los agentes no esteroidales (ej Diclofenaco 2)
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
23
suprimen la actividad de la enzima ciclooxigenasa (COX) Sin embargo la
utilizacioacuten de estos agentes se ha asociado con complicaciones de tipo
gastrointestinal e insuficiencia renal (14)
La alta incidencia de enfermedades croacutenicas en las que estaacute involucrada la
inflamacioacuten y la presencia de efectos adversos en muchos de los faacutermacos
utilizados comuacutenmente ha orientado las investigaciones hacia la buacutesqueda de
nuevos principios activos con el objetivo de encontrar estructuras que brinden
mayor eficacia y seguridad para controlar los efectos nocivos de la
inflamacioacuten(14)
Figura 4 faacutermacos antiinflamatorios de uso comercial
Fuente Weiss U (2002)
225 Citotoxicidad
Citotoxicidad es la capacidad que tienen ciertas sustancias de destruir o
lesionar las ceacutelulas tisulares Todas las sustancias con efectos toacutexicos por
variados que eacutestas sean son compuestos quiacutemicos complejos que provocan
enfermedades o en casos muy graves ocasionan la muerte seguacuten la dosis
ingerida Entre las sustancias toacutexicas que contienen muchas plantas se
encuentran alcaloides glicoacutesidos cardiotoacutenicos saponinas y terpenoides(15)
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
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31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
24
226 Especie vegetal en estudio
Bixa orellana L (Nombre comuacuten Achiote)
El achiote urucuacute u onoto (Bixa orellana) es un arbusto de las regiones
intertropicales de Ameacuterica cultivado especiacuteficamente en el centro de Meacutexico y
Andes de Peruacute desde la eacutepoca precolombina
A Clasificacioacuten Taxonoacutemica
Reino Plantae
Divisioacuten Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Malvales
Familia Bixaceae
Geacutenero Bixa
Especie Bixa orellana L
B Descripcioacuten botaacutenica
La Bixa orellana L es un arbusto de las regiones intertropicales de Ameacuterica
Pertenece a la familia Bixaceae y tambieacuten se le conoce con los nombres Bixa
acuminata B americana B odorata B platycarpa B purpurea B tinctoria B
upatensis B urucurana Orellana americana O orellana Sus nombres
comunes son axiote achiote achiotec bijol urucuacute urucum rocuacute annatto
orellana changerica entre otros (16)
B orellana es un arbusto perenne de 2 a 6 m de altura copa baja y extendida
tallo pardo y ramifico a poca altura del terreno Las hojas son simples grandes
verdosas claras de maacutergenes lisos Las flores se disponen en ramilletes
blanquecinas a rosadas seguacuten las variedades El fruto es una caacutepsula roja de 2
a 6 cm de largo con pelos gruesos espinosos puede ser verdoso oscuro a
morado (seguacuten las variedades) que al madurar pasa a pardo rojizo oscuro
En cada valva hay semillas en nuacutemero variable (10-50 en relacioacuten con el
tamantildeo capsular) La semilla es comprimida de 5 mm de largo con tegumento
recubierto de una sustancia viscosa de color rojizo intenso (17)
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
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31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
25
El pigmento estaacute localizado en la superficie de la semilla como una cubierta
resinosa y aceitosa estaacute formado fundamentalmente por bixina (cis y trans)
con trazas de norbixina eacutester de dimetil bixina y otros apocarotenoides
C Informacioacuten Etnomeacutedica
Seguacuten BrackE(18) y Nalvarte W(19)encontraron que en la medicina tradicional
eacutesta planta es utilizada en
bull Fiebre Tomar la infusioacuten de las hojas
bull Inflamaciones deacutermicas y vaginales Aplicar la maceracioacuten acuosa de las
hojas
bull Inflamacioacuten ocular Instilar el muciacutelago resultante de la maceracioacuten
acuosa de la corteza
bull Cefaacutelico Aplicar la pasta de las hojas machacadas en la frente y sienes
bull Dolores renales Coccioacuten de las hojas
bull Conjuntivitis Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas o de los tallos
bull Sedante tomar el cocimiento de las hojas o de la corteza en mezcla con
hojas de toronjil rosa cisa y rosas
bull Antiemeacutetico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas
bull Antidiarreico Tomar el liacutequido de las hojas machacadas o tomar la
infusioacuten de las hojas o semillas
bull Voacutemitos En infusioacuten poner 3 hojas por cada taza tomar una taza 3
veces al diacutea
bull Toacutenico estomacal Tomar la maceracioacuten acuosa de las semillas
bull Digestivo Tomar el cocimiento de las hojas o corteza
bull Depurativo Tomar el cocimiento de la corteza de la corteza raspada
bull Hepatitis Tomar la decoccioacuten de las yemas florales
bull Malestar del hiacutegado Las semillas y el tinte tomar el cocimiento de los
cogollos
bull Malestar de la garganta afecciones respiratorias (tos bronquitis) Tomar
la infusioacuten de las hojas y semillas
bull Asma Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Expectorante Tomar la infusioacuten de las semillas
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
26
bull Amigdalitis Tomar el polvo de las semillas mezcladas con miel de
abejas
bull Acarosis (caracha) Aplicar las semillas machacadas y maceradas en
aceite de higuerillas
bull Lepra Tomar el aceite de las semillas o aplicar la pasta de las hojas con
sulfato de magnesio
bull Infecciones a la piel Emplasto de las hojas sobre la piel previa
maceracioacuten en agua Dejar de 9 a 12 hojas en un litro de agua durante
una noche y aplicar despueacutes sobre la lesioacuten
bull Antiseacuteptico vaginal Poner de 9 a 12 hojas restregadas durante una
noche en un litro de agua El liacutequido se aplica en lavados vaginales
bull Cicatrizante Aplicar la maceracioacuten acuosa de las hojas serenadas o
lavar la herida con el cocimiento de las hojas
bull Quemaduras Aplicar las semillas frescas trituradas
bull Diureacutetico Tomar el cocimiento de la raiacutez
bull Hipertensioacuten Tomar la maceracioacuten acuosa de las hojas
bull Homeostaacutetico Contra las hemorroides contra la angina contra los
abscesos
bull Cardiotoacutenico Tomar la infusioacuten de las semillas o de las hojas
bull Antiacutedoto contra el cianuro y aacutecido cianhiacutedrico (yuca amarga) Comer el
fruto o tomar la infusioacuten del fruto y semillas
bull Malaria Tomar el cocimiento de la raiacutez
D Composicioacuten Quiacutemica
La B orellana es rica en carotenoides especialmente apocarotenos como la
bixina isobixina y norbixina tambieacuten se describen el beta-caroteno
criptoxantina luteiacutena zeaxantina orellina entre otros Ademaacutes las semillas
contienen liacutepidos como el aacutecido linoleico y en menor cantidad el alfa-linoleacutenico
y oleico aminoaacutecidos como el glutamato aspartato y leucina contiene altas
concentraciones de foacutesforo y escasas de calcio y gran cantidad de hierro y zinc
(2021)
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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un sector econoacutemico con un potencial de realizacioacuten Ciefor y Universidad
Nacional Agraria la Molina Lima Peruacute 1999
21 Biltencourt C et al Characterization of thermal modifications of bixin from
Bixa orellana fruit J Agric Food Chem 200553 (16)6195-200
22 Hetzel de la C Lourido Peacuterez Gregorio Martiacutenez Saacutenchez La Bixa
orellana L en el tratamiento de afecciones estomatoloacutegicas un tema auacuten
por estudiar Revista Cubana de Farmacia Rev Cubana
Farm v44 n2 Ciudad de la Habana abr-jun 2010 Disponible en
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23 Rodriacutegues S et al Isolation and purification of RNA from tissues rich in
poliphenols polysaccharides and pigments of annatto (Bixa orellana L)
Mol Biotechnol 2007 37(3)220-4
24 Toledo de Oliveira T et al Biological properties of natural dyes Ars
Pharmaceut 200445(1)5-20
25 Journal Ethnopharmacol (2011) September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
26 Aguirre Z et al Botanica Austroecuatoriana ABYA YALA 2002
27 AYMEacute Fernaacutendez-Calienes Valdeacutes Judith Mendiola Martiacutenez Deyanira
Acuntildea Rodriacuteguez Ramoacuten Scull Lizama Yamilet GUTIEacuteRREZ GAITEacuteN
Actividad antimalaacuterica de un extracto hidroalcohoacutelico de Bixa orellana L
Rev Cubana Med Trop v63 n2 Ciudad de la Habana mayo-ago 2011
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52
28 Liang P y Macrae T The synthesis of a small heat shockalphacrystallin
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development Dev Biol (1999) 207445-56 Disponible en
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Abril 2018
29 Andriolli A Beraldo H Santos D Teixeira S Teixeira L y Ziolli R
Avaliaccedilatildeo do potencial citotoacutexico de 2-piridiniformamida
tiossemicarbazonas e de seus complexos de Fe (III) utilizando Artemia
franciscana Heal and Environ J (2007) 8 2-10 Disponible en
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riobrpibicrelatorio_resumo2007resumosQUIana_claudia_andriolli_dani
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30 Sokmen M In vitro antioxidant activity of polyphenol extracts with antiviral
properties from Geranium sanguineum L Life Sciences 76 (25) 2981-
2993 (2005)
31 CHOI CW Antioxidant activity and free radical scavenging capacity
betweenKorean medicinal plants and flavonoids by assay-guided
comparison Plant Science 163 1161-1168 (2002)
32 PYO YH TC LEE L LOGENDRA Y RT ROSEN Antioxidant activity
and phenolic compounds of Swiss chard (Beta vulgaris subspecies cycla)
extracts Food Chem 85 (19) 19-26 (2004)
33 Meyer BN Ferrigni NR Putnam JE Jacobsen LB Nichols DE Mc
Laughlin JL Brine shrimp a convenient general bioassay for active plant
constituents Planta meacutedica 4531-4 1982
53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
27
HOOC
COOCH3
CH3CH3
CH3CH3
NORBIXINA
HOOC
COOH
CH3CH3
CH3CH3
BIXINA
Figura 5 Estructura quiacutemica de los principales pigmentos de la Bixa Orellana L
Fuente De la C (2010)
Los extractos de achiote son aceites o productos alcalinos obtenidos al eliminar
la capa externa de las semillas de achiote mediante diversos procesos(24)
Estos extractos se presentan en polvo en pasta en suspensioacuten o en solucioacuten
Los extractos liposolubles de achiote se obtienen mediante la extraccioacuten de la
cubierta exterior de las semillas por medio de
a) La extraccioacuten directa con aceites o grasas comestibles
b) La incorporacioacuten en los aceites o grasas comestibles del extracto obtenido a
disolventes orgaacutenicos (acetona diclorometano etanol hexano metanol
isopropanol tricloroetileno) seguida de la eliminacioacuten del disolvente
El achiote es uno de los materiales maacutes interesantes para la extraccioacuten de
pigmentos es la posibilidad de obtener de su semilla tanto colorantes solubles
en agua (hidrosolubles) como colorantes solubles en aceite (liposolubles) con
solo variar el disolvente de extraccioacuten La bixina es el pigmento mayoritario de
la semilla del achiote y representa el 80 de todos los carotenoides presentes
A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina
(liposoluble) la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la
degradacioacuten teacutermica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable
e ideal para la coloracioacuten de las pastas La sal de norbixina se obtiene
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
28
mediante la extraccioacuten alcalina (con hidroacutexido soacutedico o potaacutesico) de los
pigmentos de la semilla del achiote Esta extraccioacuten transforma la bixina en sal
(sal de norbixina) que es soluble en soluciones acuosas alcalinas La sal de
norbixina se precipita en forma de norbixina mediante la neutralizacioacuten de la
disolucioacuten (pH= 7) que en esta forma no es soluble en agua Ademaacutes de la sal
de norbixina es posible aumentar la solubilidad en agua de la bixina y la
norbixina utilizando emulsificantes como los polisorbatos el glicol propileacutenico
entre otros
El extracto liposoluble de achiote debe contener al menos un 02 de
carotenoides expresados como bixina mientras que el extracto hidrosoluble de
bixa debe contener al menos un 02 de carotenoides expresados como
norbixina La fraccioacuten liposoluble es insoluble en agua y es poco soluble en
etanol mientras que la fraccioacuten hidrosoluble es soluble en agua y poco soluble
en etanol(23)
De las semillas bixinato de sodio aacutecido tomentoacutesico bixina beta caroteno
pectina vitamina A cryptoxantina luteiacutena metilbixina norbixina zeaxantina
De las hojas Bixahaneno ishwarano 7-bisulfato de epigenina 7-bisulfato de
luteolina 8-bisulfato de hipolaetina
Carotenoides Bixina norbixina orellina betacaroteno criptoxantina
metilbixina zeaxantina luteiacutena mono y sesquiterpenos
Flavonoides Glucoacutesido de apigenina bisulfato de apigenina bisulfato de
luteolina bisulfato de hipolaetina aacutecido tomentoacutesico vitaminas (A B y C)
proteiacutenas azuacutecares celulosa grasas caacutelcio fierro y foacutesforo(24)
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
45 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
29
23 HIPOacuteTESIS
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
H1 Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
citotoacutexica in vitro sobre Artemia franciscana
HO Los once morfotipos de Bixa orellana L no presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
H2 Los once morfotipos de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana plasmaacutetica en
gloacutebulos rojos humanos
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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Beacutejar Camarena Elsa Huamaacuten Gutieacuterrez Zoraida Judith Tarazona
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
30
24 VARIABLES
241 Variable independiente
Extractos acuosos liofilizados de las hojas de once morfotipos de Bixa
orellana L
Indicador
Nivel de Concentracioacuten
242 Variable dependiente
a) Actividad citotoacutexica
b) Actividad antiinflamatoria en las dosis ensayadas
Indicador
CL50
de inhibicioacuten antiinflamatoria IC50
Clasificacioacuten de toxicidad seguacuten CYTED (15)
GRUPO CATEGORIA ESCALA (ugmL)
I Extremadamente toacutexico 1 ndash 10
II Altamente toacutexico 10 ndash 100
III Moderadamente toacutexico 100 ndash 500
IV Ligeramente toacutexico 500 ndash 1000
V Praacutecticamente no toacutexico 1000 ndash 1500
VI Relativamente inocuo gt1500
Fuente Journal Ethnopharmacol 2011 September 1 137(1) 121ndash140
doi101016jjep201104071
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
31
25 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Extracto acuoso liofilizado de
las hojas de once morfotipos
de Bixa orellana L
Liofilizados de
especies de diversos
compuestos quiacutemicos
obtenido por coccioacuten
congelado y
conservado
Extraccioacuten por coccioacuten de la parte
vegetal con agua a 60-100ordmC
durante 72hrs Posteriormente
filtrado concentrado a 60-70ordmC
congelado (1 diacutea a -22ordmC) para
finalmente liofilizar por 72 horas
(-40oC 133x10-3 MBARR120
horas)
Dosis de extractos
10 mgmL
15 mgmL
Concentraciones
1ppm 10ppm
100ppm 1000ppm
Con
Actividad
Sin
Actividad
Con
Actividad
Sin
Actividad
Racional
Tipo
Cuantitativo
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
32
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad citotoacutexica in
vitro sobre Artemia
franciscana
Ensayo donde se
puede evaluar la
citotoxicidad de un
tratamiento en
teacuterminos de
concentraciones
letales (CL50)
Ensayos empleados para
determinar la potencial
citotoxicidad que presentan los
extractos de las especies
vegetales sobre los nauplios de
Artemiafranciscana con la
finalidad de conocer la
concentracioacuten que produciraacute un
efecto toacutexico en el 50 de la
especie en experimentacioacuten y
visualizar la relacioacuten riesgo-
beneficio que implicaraacute el uso de
estos extractos vegetales como
alternativa medicinal
Concentracioacuten letal (CL50)
Citotoacutexico
1 ndash 1000 ugmL
No citotoacutexico
gt1000 ugmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
33
VARIABLE
DEPENDIENTE
DEFINICIOacuteN
CONCEPTUAL
DEFINICIOacuteN
OPERACIONAL
INDICADOR
INDICE
ESCALA
Actividad
antiinflamatoria in vitro
mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica
en eritrocitos de seres
humanos
Ensayo donde se
puede evaluar la
actividad
antiinflamatoria de
un tratamiento en
teacuterminos de
porcentaje de
inhibicioacuten
antiinflamatoria e
IC50
Ensayos empleados para
determinar el potencial
antiinflamatorio que presentan los
extractos de las especies vegetales
de los once morfotipos de Bixa
orellana L con la finalidad de
conocer la concentracioacuten que
produciraacute un porcentaje de
inhibicioacuten antiinflamatoria
satisfactoria e IC50 y asiacute visualizar
la relacioacuten riesgo-beneficio que
implicaraacute el uso de estos extractos
vegetales como alternativa
medicinal
de inhibicioacuten
antiinflamatoria
IC50
mgmL
Racional
Tipo
Cuantitativo
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
34
CAPIacuteTULO III
METODOLOGIacuteA
31 TIPO DE ESTUDIO
bull Experimental porque se realizoacute comparaciones de la variable
dependiente entre los grupos experimentales y del control positivo
bull Analiacutetico porque presentoacute dos variables (bivariado) ademaacutes planteoacute y
puso a prueba una hipoacutetesis
32 DISENtildeO DE LA INVESTIGACIOacuteN
33 Poblacioacuten y muestra
33 POBLACIOacuteN Y MUESTRA
331 Poblacioacuten animal
Se utilizaron nauplios de Artemia franciscana
332 Muestra animal
Se utilizaron quistes de Artemia franciscana que despueacutes de un proceso
de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
Criterios de Inclusioacuten
Nauplios viables de Artemia franciscana Quistes que despueacutes de un
proceso de eclosioacuten llegaron a nauplios
Criterios de exclusioacuten
Quistes que despueacutes de un proceso de eclosioacuten no llegaron a la etapa de
nauplios
ETAPA PROCEDIMIENTO
I Etapa
II Etapa
Certificacioacuten de la especie vegetal
Preparacioacuten de la muestra
Acondicionamiento limpieza secado y molienda de hojuelas
III Etapa
IV Etapa
Preparacioacuten del extracto acuoso
Liofilizado
35
333 Muestra vegetal
B orellana L reportado del jardiacuten botaacutenico de la Facultad de Agronomiacutea-
Zungarococha UNAP que tiene como uso eacutetnico sus actividades
antiinflamatorias citotoacutexicas etc
Criterios de Inclusioacuten
bull Material vegetal identificado y georeferenciado
bull Material vegetal en buen estado de conservacioacuten Las hojas grandes y
enteras no presentaron ningun tipo de mancha ni microorganismo
34 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Certificacioacuten Taxonoacutemica de la especie vegetal Se realizoacute en el Herbarium
Amazonense de la Universidad Nacional de Amazonia Peruana ndash UNAP el
mismo que otorgoacute una constancia con su respectivo coacutedigo de identificacioacuten
341 Actividad citotoacutexica
Animales de Experimentacioacuten huevos de Artemia franciscana que luego de un
proceso de eclosioacuten se convirtieron a nauplios
A Condiciones de mantenimiento de los camarones de experimentacioacuten
En un vaso precipitado de vidrio de 600mL se preparoacute una solucioacuten de Instant
Ocean 3 disolviendo 15 gramos de sal de IO (Instant Ocean) en 500 mL de
agua destilada De esta solucioacuten preparada se extrajo 30 mL de solucioacuten IO
3 Se agregaron 01g de quistes de Artemia franciscana y se dejoacute en reposo
por un lapso de 15 minutos (proceso importante para poder descartar los quistes
inviables) Luego se agregoacute 370 mL de solucioacuten de IO para su hidratacioacuten a
temperatura 25degC por 1 hora Despueacutes se colocoacute un pelele acuario (motor que
es el encargado de dar aireacioacuten) en el vaso precipitado para la aireacioacuten
(utilizar cinta adhesiva para fijar y cubrir con un papel de aluminio el recipiente)
se colocoacute dos laacutemparas pequentildeas de 20W a menos de 5 cm de cada lado del
36
frasco para una iluminacioacuten uniforme Incubacioacuten a temperatura 25degC por 48
horas (2526)
Las condiciones ambientales para los quistes de experimentacioacuten fueron
monitoreadas mediante un medidor de temperatura en el laboratorio entre 22 y
29deg C la iluminacioacuten fue permanente con dos laacutemparas de 20W
B Tratamiento y evaluacioacuten de grupos experimentales
Apagar el pelele y una de las laacutemparas de luz de manera que los nauplios se
congregaron para el lado iluminado del vaso precipitado Despueacutes se etiquetoacute
los tubos de ensayos colocando 06 columnas de tubos de ensayos etiquetados
A B C D E y F respectivamente Cada columna tuvo tres filas de tubos Tubos
A1-A3 B1-B3 C1-C3 y D1-D3 contenieron los nauplios con el extracto a evaluar
(son los grupos experimentales) Los tubos de ensayos E1 ndash E3 fueron controles
negativos con soacutelo el nauplio y solucioacuten IO agregada los tubos de ensayos F1 ndash
F3 fueron controles positivos en el que se antildeadieron 100 ppm de K2Cr2O7Luego
se preparoacute la solucioacuten madre de extracto a evaluar en una concentracioacuten de 10
mgmL siendo un extracto esterilizado purificado se prepararaacute a partir de ella
concentraciones de 1 mgmL 01 mgmL 001 mgmL y 0001 mgmL Cada
concentracioacuten preparada fue por triplicado y depositado a cada tubo de ensayo
(6 mL) En los tubos de ensayo E1 ndash E3 se antildeadieron 5 mL de solucioacuten IO 3
para los controles negativos y en los tubos de ensayo F1 ndash F3 se antildeadieron 5
mL de solucioacuten de K2Cr2O7 en una concentracioacuten de 100ppm para los controles
positivos Para todos los tubos de ensayos se pipetearon del vaso de
precipitado 10 nauplios y se colocaron en cada tubo de ensayo posteriormente
se cubrioacute con papel de aluminio (a todos los tubos de ensayo) y se colocoacute las
laacutemparas de 20W a ambos costado durante 24 horas
C Determinacioacuten cuantitativa de supervivencia de nauplios
Estos fueron contados despueacutes de 24 horas de exposicioacuten al extracto evaluado
Se transfirioacute el contenido de todos los tubos de ensayo (de uno en uno) a un
pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos despueacutes se enjuagoacute el
tubo con una pequentildea cantidad de agua para asegurar que todos los camarones
fueron transferidos Se contoacute los nauplios bajo un equipo de video de alta
37
resolucioacuten registrando asiacute cantidades de nauplios muertos y vivos por separado
Moribundo (gravemente enfermo y a punto de morir o extremadamente letaacutergico)
todaviacutea se consideroacute vivo
Se registroacute el nuacutemero de camarones vivos y muertos en la hoja de datos y el
caacutelculo de la diferencia de la cantidad inicial de camarones antildeadido se repitioacute
este procedimiento para todos los tubos de ensayo la eliminacioacuten de los
contenidos del pozo cada vez Se enjuagoacute bien con la solucioacuten IO y despueacutes se
limpioacute con una peseta cada tubo de ensayo
D Procesamiento de la informacioacuten
Los resultados medios de la mortalidad de los nauplios de salmuera se
representaron frente a los logaritmos de las concentraciones utilizando la
herramienta de Anaacutelisis Probit del software estadiacutestico SPSS de la que la
mediana letal concentracioacuten (CL50) en intervalos de confianza del 95 (IC) se
calculoacute con el meacutetodo de Finney (1971) (2728) La actividad bioloacutegica usando el
ensayo del camaroacuten de salmuera se registroacute como la concentracioacuten cuando el
50 de los nauplios murieron dentro de las 24 h de contacto con el extracto
evaluado Los valores CL50 de 1 ndash 10 120583gmL (extremadamente toacutexico) 10 ndash 100
120583gmL (altamente toacutexico) 100 ndash 500 120583gmL (moderadamente toacutexico) 500 ndash 1000
120583gmL (ligeramente toacutexico) 1000 ndash 1500 120583gmL (praacutecticamente no toacutexico) y gt
1500 120583gmL (relativamente inocuo) seguacuten Clasificacioacuten de toxicidad CYTED
342 Actividad Antiinflamatoria
A Solucioacuten de Gloacutebulos Rojos Humanos
Se extrajo 20 mL de sangre venosa a una persona sana y que no recibioacute
tratamiento alguno con ninguacuten medicamento (por lo menos 15 diacuteas antes del
ensayo) De la sangre extraiacuteda se colocoacute 5mL en 4 tubos de ensayo y se
mezcloacute con igual volumen de solucioacuten de Alsever esteacuteril (2 dextrosa 08
citrato de sodio 005 aacutecido ciacutetrico y 042 cloruro de sodio en agua) Se
homogenizoacute por inmersioacuten La sangre se centrifugoacute a 3000 rpm por 15 minutos
Concluido este proceso se descartoacute el sobrenadante (suero) y la fibrina
(proteiacutena) El plasma obtenido se lavoacute con ClNa 09 (pH 72) y se centrifugoacute a
38
3000 rpm por 15 minutos (repetir este proceso 3 veces) Con el paquete celular
(plasma) se preparoacute una solucioacuten al 10 vv con ClNa 09 para obtener una
solucioacuten de gloacutebulos rojos y se almacenoacute a una temperatura de 2 ndash 8deg C
B Preparacioacuten del tubo de experimentacioacuten
La mezcla a ensayar ha contenido 05 mL del extracto liofilizado de hojas de
Bixa Orellana La diferentes concentraciones en varios tubos (por ejemplo 1000
100 10 1 120583gmL) con 02mL de Buffer fosfato (015 M pH 74) 38mL de
solucioacuten hiposalina (036) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos
Se utilizoacute hidrocortisona como faacutermaco de referencia 250 mgmL en la
evaluacioacuten de actividad
A otro tubo se agregoacute 43ml de solucioacuten hiposalina con 02 mL de Buffer fosfato
(015M pH 74) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el
estaacutendar
A otro tubo de ensayo se le agregoacute 4mLde solucioacuten isosalina 05 mL del
extracto liofilizado de hojas de Bixa Orellana Ly 05 mL de la suspensioacuten de
gloacutebulos rojos el cual fue el blanco
A otro tubo se le agregoacute 4mL de solucioacuten isosalina 05 mL de la muestra (sol
isosalina) y 05 mL de la suspensioacuten de gloacutebulos rojos el cual fue el blanco del
estandar
Cada concentracioacuten se repite por triplicado
Todos los tubos se incubaron a temperatura ambiente por 10 min y fueron
centrifugados a 3000 rpm por 10 minutos
La hemoglobina contenida en la solucioacuten sobrenadante fue valorada en el
espectrofotoacutemetro a 540 nm
El indicador que se evaluoacute en el ensayo seraacute el porcentaje de hemoacutelisis que se
calculoacute asumiendo que la hemoacutelisis producida por el agua destilada es 100
El porcentaje de proteccioacuten de la membrana de gloacutebulos rojos se calculoacute usando
la siguiente expresioacuten (29)
119875119903119900119905119890119888119894119900119899 () = 100 minus 119860119887119904 119898119906119890119904119905119903119886
119860119887119904 119888119900119899119905119903119900119897times 100
39
343 Preparacioacuten de los extractos acuosos liofilizados
Los extractos fueron preparados siguiendo el estudio realizado por Aranda-
Ventura 2014 ndash 2016 Se utilizoacute las hojas de once morfotipos de Bixa orellana L
las cuales fueron limpiadas cortadas y acondicionadas en el cuarto de secado a
temperatura entre 35 - 40degC y se utilizoacute un equipo deshumidificador durante 6
diacuteas Los trozos de las hojas previo molido se sometieron al proceso de coccioacuten
llevaacutendose a sequedad las frac34 partes del contenido de agua a temperatura de 60
a 70degC para su filtracioacuten y congelacioacuten posterior en el equipo Shell Frezer a
temperatura de -35degC El producto congelado se llevoacute a liofilizar a una
temperatura de -40degC con una presioacuten de 133 x 10 -3 MBARR durante 48 horas
35 CONSIDERACIONES EacuteTICAS
Los nauplios de Artemia franciscanaque fueron utilizados no causaron ninguna
alteracioacuten en su ecosistema ni en su existencia como especie ya que son de
raacutepida reproduccioacuten
La recoleccioacuten de hojas de B Orellana L no causoacute ninguacuten dantildeo en su existencia
como especie ya que solo se utilizoacute en cantidades miacutenimas (100 g) por cada
morfotipo
40
CAPITULO IV
41 RESULTADOS
411 Actividad citotoacutexica
Tabla 1Cantidad de nauplios inyectados
Muestra Extracto acuoso liofilizado de Bixa orellana L
Concentraciones 001
mgmL 01
mgmL 1
mgmL 10
mgmL IO 3
(-) K2Cr2O7
100 ppm (+)
M1
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M2
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M3
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M4
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M5
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
41
M6
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M7
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M8
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M9
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M10
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
M11
1deg reacuteplica A A1 30 B1 30 C1 30 D1 30 E1 30 F1 30
2deg reacuteplica B A2 30 B2 30 C2 30 D2 30 E2 30 F2 30
3deg reacuteplica C TOTALES
A3 30 90
B3 30 90
C3 30 90
D3 30 90
E3 30 90
F3 30 90
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 1 muestra la cantidad de nauplios de Artemia franciscana inyectados
en cada tubo de ensayo haciendo un total de 90 por cada una de las
42
concentraciones evaluadas maacutes su respectivo control negativo y control
positivo todas ellas evaluadas en un tiempo de 24 horas
Tabla 2Conteo de nauplios vivos y muertos de Artemia franciscana en las
disoluciones
Fuente Realizacioacuten propia
La tabla 2 muestra la cantidad de nauplios vivos y muertos despueacutes de 24
horas expuestas al extracto por cada una de las concentraciones evaluadas
Morfotipo Repeticiones
Total Nauplios
de Artemia
Concentraciones
0001 mgmL
001 mgmL
01 mgmL
1 mgmL
IO 3 (-)
K2Cr2
O7
(100ppm)
V M V M V M V M V M V M
M1 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 72 18 79 11 90 0 0 90
M2 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 85 5 90 0 0 90
M3 A1 A2 A3 90 90 0 84 6 80 10 30 60 90 0 0 90
M4 A1 A2 A3 90 90 0 85 5 85 5 85 5 90 0 0 90
M5 A1 A2 A3 90 90 0 89 1 90 0 59 31 90 0 0 90
M6 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 27 63 90 0 0 90
M7 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 85 5 66 24 90 0 0 90
M8 A1 A2 A3 90 90 0 90 0 89 1 83 7 90 0 0 90
M9 A1 A2 A3 90 90 0 86 4 86 4 87 3 90 0 0 90
M10 A1 A2 A3 90 90 0 88 2 81 9 53 37 90 0 0 90
M11 A1 A2 A3 90 90 0 87 3 84 6 86 4 90 0 0 90
43
Tabla 3 Caacutelculo de la CL50 a partir de la ecuacioacuten lineal obtenida viacutea anaacutelisis
Probit
Morfotipo Ecuacioacuten R2 CL50 (mgmL)
M1 y = 02264x + 01715 09295 212
M2 y = 00879x + 28421 09309 164
M3 y = 00314x + 33531 09919 281
M4 y = 0621x + 2E-15 10000 137025
M5 y = 01108x + 08305 07118 427
M6 y = 00716x + 08543 08065 794
M7 y = 01515x + 07397 07003 132
M8 y = 04045x + 06662 06719 513
M9 y = 07455x + 01270 09551 347
M10 y = 00806x + 17859 05594 759
M11 y = 05442x + 05073 08325 182
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 3 muestra el valor deCL50 de los once morfotipos de hojas de Bixa
orellanaL donde todos los valores estaacuten por encima de 1000 120583gmL
412 Actividad antiinflamatoria
Tabla 4 Caacutelculo del inhibicioacuten antiinflamatoria
Especie vegetal Bixa orellana L
Parte usada
INH ANTIINFLAMATORIA Λ 1 120583gmL 10 120583gmL 100 120583gmL 1000 120583gmL
MORFOTIPO 1 Hojas 2767 3570 4197 7070
540 nm
MORFOTIPO 2 Hojas 2401 2798 3253 6601
MORFOTIPO 3 Hojas 2653 2823 3552 7188
MORFOTIPO 4 Hojas 2299 2762 2994 6736
MORFOTIPO 5 Hojas 5342 5755 6010 7960
MORFOTIPO 6 Hojas 5568 5657 6527 8614
MORFOTIPO 7 Hojas 5598 5621 6214 7689
MORFOTIPO 8 Hojas 4740 4868 5181 5648
MORFOTIPO 9 Hojas 5371 5997 6673 6898
MORFOTIPO 10 Hojas 5359 5614 6166 6547
MORFOTIPO 11 Hojas 5391 5718 6544 6688
Hidrocortisona 5935 6141 6459 7879 Fuente Elaboracioacuten propia
44
Tabla 4 muestra el porcentaje de inhibicioacuten antiinflamatoria a las diferentes
concentraciones evaluadas
Tabla 5 Caacutelculo de la IC50de los once morfotipos de Bixa orellana L y de la
Hidrocortisona
Especie vegetal
Bixa orellana L Ecuacioacuten R2 IC50
Morfotipo 1 y = 58789ln(x) + 23704 08703 8761
Morfotipo 2 y = 56699ln(x) + 18048 07677 28016
Morfotipo 3 y = 62257ln(x) + 1904 07581 14445
Morfotipo 4 y = 58816ln(x) + 16663 07302 28946
Morfotipo 5 y = 35219ln(x) + 50503 08120 087
Morfotipo 6 y = 43471ln(x) + 50903 08327 081
Morfotipo 7 y = 29815ln(x) + 52506 08157 043
Morfotipo 8 y = 13196ln(x) + 46533 09410 1384
Morfotipo 9 y = 22834ln(x) + 54461 09632 014
Morfotipo 10 y = 17868ln(x) + 53044 09828 018
Morfotipo 11 y = 20473ln(x) + 53783 09344 016
Hidrocortisona y = 26714ln(x) + 56808 08195 008
Fuente Elaboracioacuten propia
La tabla 5 muestra los resultados de IC50 para cada una de los once morfotipos
y de la Hidrocortisona
45
42 DISCUSION
Los compuestos fenoacutelicos son importantes en los diferentes procesos de
oxidacioacuten lipiacutedica y estaacuten asociadas con la actividad antiinflamatoria
(Sokmenetal2005 Choietal 2002)3031
tambieacuten poseen efectos inhibitorios
sobre la mutageacutenesis y carcinogeacutenesis en humanos cuando son incluidos en la
dieta diaria a partir de productos naturales Los aacutecidos fenoacutelicos y flavonoides
son reconocidos como poseedores de actividad antiinflamatoria
(Pyoetal2004)32
En la evaluacioacuten de la citotoxicidad de extractos acuosos liofilizados de los
once morfotipos de Bixa orellana L sobre Artemia franciscana nuestro estudio
muestra valores por encima de 1000 120583gmL y esto concuerda con lo declarado
por Meyer et al1982 (33) ldquoun valor de CL50 mayor a 1000 120583g ml no se considera
bioactivordquo en sentido no presenta actividad bioloacutegica y no puede considerarse
como bioactiva
En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de membrana
plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad fue el morfotipo 9
con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11 IC50=016 mgmL morfotipo
10 con un IC50= 018 120583gmL morfotipo 7 con un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6
con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo 5 con un IC50= 087 120583gmL
Los morfotipos 5 y morfotipo 7 no presentaron diferencias significativas en sus
porcentajes de proteccioacuten en comparacioacuten al uso de Hidrocortisona a una
concentracioacuten de 1000 120583gmL
46
43 CONCLUSIONES
En funcioacuten al anaacutelisis efectuado se concluye que
bull Los hojas de los once morfotipos de Bixa orellana L no muestran
actividad citotoacutexica in vitro sobre nauplios de Artemia franciscanaa las
diferentes concentraciones evaluadas ya que todas ellas presentan
CL50gt 1000 120583gmL
bull De los once morfotipos de la especie en estudio los que presentaron a
la concentracioacuten de 1000 120583gmL mayor porcentaje de inhibicioacuten
antiinflamatoria fueron el morfotipo 6 con un 8614 el morfotipo 5 un
7960 y el morfotipo 7 un 7689 respectivamente
bull En la actividad antiinflamatoria in vitro mediante proteccioacuten de
membrana plasmaacutetica en gloacutebulos rojos humanos el de mejor actividad
fue el morfotipo 9 con un IC50= 014 120583gmL seguido del morfotipo 11
IC50=016 mgmL morfotipo 10 con un IC50= 018 u120583mL morfotipo 7con
un IC50= 043 120583gmL morfotipo 6con un IC50= 081 120583gmL y el morfotipo
5 con un IC50= 087 120583gmL
bull Los extractos acuosos liofilizados de Bixa orellana L presentan actividad
antiinflamatoria mediante la inhibicioacuten de la lisis de la membrana celular
en gloacutebulos rojos En el caso los morfotipos 9 10 y 11 mostraron un
desempentildeo similar al faacutermaco de referencia Hidrocortisona
47
44 RECOMENDACIONES
En relacioacuten a que seis de los once morfotipos presentan mejor actividad
antiinflamatoria es oportuno continuar su estudio de aislamiento y purificacioacuten
de cada uno de los metabolitos secundarios para poder ser formulados en un
futuro como posibles faacutermacos de actividad antiinflamatoria
Estudios de toxicidad croacutenica por administracioacuten continua a 90 diacuteas a fin de
determinar efectos carcinogeacutenicos a los morfotipo 9 morfotipo 11 morfotipo
10 morfotipo 7 morfotipo 6 y el morfotipo 5 respectivamente
De aquellos morfotipos que presentaron mejores valores en IC50 se
recomienda cuantificarlos metabolitos secundarios para asiacute correlacionar su
actividad citotoacutexica y antiinflamatoria
48
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53
46 ANEXOS
Anexo 1 Flujograma del proceso de preparacioacuten de extractos acuoso liofilizado
Certificacioacuten de la especie vegetal
Secado de las especies vegetales
Certificacioacuten del estado de las especies
vegetales despueacutes de la aclimatacioacuten
en el secado
Molienda de las hojuelas
Preparacioacuten del extracto (4
g1000ml)
Liofilizado (-40deg C -13 Pasc
48 horas)
54
Anexo 2 Flujograma del ensayo de la actividad citotoacutexica
55
Anexo 3 Esquema de dilucioacuten del extracto para el experimento de citotoxicidad
Anexo 4 Configuracioacuten de esquema de experimento de citotoxicidad
6mL 6mL 6mL 6mL
6 ml de
Extracto
IO 6mL
IO 6mL
IO 6mL
S1 S2 S3 S4 S5
IO
6mL
IO
6mL
56
Anexo 5 Hoja de trabajo_ ensayo de toxicidad por Artemia franciscana
57
Anexo 6 Hoja de trabajo_ conteo de larvas vivas muertas de Artemia franciscana
58
Anexo 7 Constancia de certificacioacuten de la especie vegetal
