participación de las bacterias la calidad...

Participación de las Bacterias Lácticas en la Salud Humana y en

la Calidad Alimentaria

5ª Reunión de la Red Temática BAL Libro de Resúmenes

Logroño, 2011

Edición: Gaspar Pérez Martínez Fernanda Ruiz Larrea

Título original: 5ª Reunión de la red temática BAL: Participación de las bacterias lácticas en la salud humana y en la calidad alimentaria. Libro de resúmenes Edición: Gaspar Pérez Martínez Fernanda Ruiz Larrea

Logroño, 2011

Financiado por la Acción Complementaria Modalidad B del Ministerio de Ciencia e Innovación AGL2009-06415-EALI

ISBN: 978-84-694-4900-4 Depósito Legal: LR-201-2011

Servicios de Publicaciones y de Comunicación de la Universidad de La Rioja

INDICE

ÍNDICE

Página I. TAXONOMÍA E IDENTIFICACIÓN. 1 1. Análisis del género Lactobacillus por MALDI-TOF MS. 1 Ruvira M.A., Arahal D.R., Clermont D., De Vos P., Schumann P. 2. Identificación y determinación de la viabilidad de Lactobacillus mediante PCR en células enteras

3

Lidia Haro Blasco, Sergi Ferrer, Isabel Pardo 3. Identificación molecular de bacterias lácticas aisladas de neonatos para su uso como probióticos en embutidos fermentado-curados

5

Raquel Rubio, Teresa Aymerich, Belén Martín, Margarita Garriga II. BACTERIAS LÁCTICAS EN ALIMENTOS 6 4. Exopolisacáridos de bacterias del ácido láctico aisladas de productos cárnicos

6

Nácher-Vázquez, M., Notararigo, S. , Mohedado, M.L., Fernández de Palencia, P., López, P., Prieto, A., Sánchez, G., and Aznar, R.

5. Diversidad de las comunidades microbianas durante la fermentación de aceituna de mesa “Manzanilla Aloreña”

7

Hikmate Abriouel, Nabil Benomar, Rosario Lucas, Magdalena Martínez Cañamero, Antonio Gálvez.

6. Microbiología de productos lácteos tradicionales: i) diversidad microbiana y ii) caracterización de bacterias ácido-lácticas

8

Ángel Alegría, Elena Fernández, Susana Delgado, Ana Belén Flórez, Alicia Noriega, Baltasar Mayo.

7. Actividades α -cetoácido descarboxilasa y a-cetoácido deshidrogenasa en una colección de cepas de Lactococcus lactis aisladas de quesos de leche cruda

9

Picón, P. Morales, P. Gaya y M. Núñez. 8. Biosíntesis de aminas biógenas en bacterias del ácido láctico aisladas de leche materna.

10

Marta P. García, Victor Ladero, Mª Cruz Martín, María Fernández y Miguel A. Álvarez.

9. Incidencia de resistencias a biocidas y antibióticos en bacterias de la cadena alimentaria

11

Miguel Ángel Fernández, Elena Ortega, Hikmate Abriouel, Rubén Pérez Pulido, Antonio Sánchez, Leire Lavilla, Antonio Gálvez.

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10. Sinergias de la enterocina AS-48 con biocidas sobre bacterias patógenas en la cadena alimentaria.

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Natacha Caballero, Hikmate Abriouel, Mª Carmen López, Mª José Grande, Rubén Pérez Pulido, Elena Ortega, Rosario Lucas, Antonio Gálvez.

11. Control de L. monocytogenes en jamón cocido loncheado mediante la aplicación combinada de enterocinas y alta presión hidrostática

13

Anna Jofré, Teresa Aymerich, Eva Valdivia y Margarita Garriga. 12. Bacterias lácticas del vino: actividades enzimáticas y producción de compuestos volátiles azufrados

14

J.J. Rodríguez-Bencomo, A. García-Ruiz, M.C. Martínez-Cuesta, E. González-Rompinelli, T. Requena, B. Bartolomé, M.V. Moreno-Arribas.

13. Biodiversidad de bacterias lácticas en vinos tintos de la D.O.Ca. Rioja.

15

Grupo de Gestión y Control Microbiológico de la Vinificación del ICVV 14. Búsqueda de bacterias lácticas con actividades enzimáticas, como herramienta biotecnológica en enología

16

Fátima Pérez Martín, Susana Seseña, Pedro Nieto Arribas, María Isabel Moreno, Pedro Miguel Izquierdo y Llanos Palop.

15. Utilidad de los genes rpoB y rpoC como marcadores de resistencia a las condiciones del vino en Oenococcus oeni

17

A. Guija, S. Ferrer e I. Pardo 16. Mecanismos de adaptación de Oenococcus oeni al estrés del vino

18

Nicolas Rozès*, Meritxell Bordas, Isabel Araque, Cristina Reguant, Albert Bordons

17. Actividad antimicrobiana de la pediocina PA-1 en condiciones anológicas frente a bacterias del vino.

19

Lorena, Diaz, Beatriz Rojo-Bezares, Myrian Zarazaga, Juan M. Rodríguez, CarmenTorres y Fernanda Ruiz-Larrea.

III. BIOTECNOLOGÍA DE BACTERIAS LÁCTICAS 20 18. Estudio de los genes de tiorredoxina / tiorredoxina-reductasa en Oenococcus oeni

20

Albert Bordons*, Karoline Wagner, Cristina Reguant 19. Estudio proteómico y trascriptómico de la respuesta de Lactobacillus plantarum WCFS1 a compuestos fenólicos

21

Inés Reverón, José Antonio Curiel, Héctor Rodríguez, Monique Zagorec, Marie Champomier-Vergès, Blanca de las Rivas, Rosario Muñoz y Félix López de Felipe.

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20. Análisis de la respuesta a bilis de Lactobacillus casei BL23 mediante análisis transcriptómico y proteómico

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Cristina Alcántara; Amalia Blasco; Manuel Zúñiga. 21. El principio y el fin de una muerte programada: el represor del ciclo lisogénico y la lisina el fago A2.

23

Juan Evaristo Suárez, Susana Escobedo y Pedro Ribelles. 22. Análisis de la fuerza de los promotores del cluster as-48 en Lactococcus lactis

24

Sonia Rodríguez-Ruano, Rubén Cebrián, Manuel Montalbán, Eva Valdivia, Manuel Martínez-Bueno, Mercedes Maqueda

23. Vectores de fusión transcripcional para regiones promotoras uni- y bidireccionales de bacterias lácticas

25

García-Cayuela T, Pérez-Gómez de Cadiñanos L, Mohedano ML, Fernández de Palencia P, Boden D, Wells J, Peláez C, López P, Requena T*

24. Eukaryotic Antimicrobial Peptide Production by Recombinant Lactic Acid Bacteria

26

Rogier Gaiser, Begoña Giménez, Pilar Fernández de Palencia, Pilar Montero, and Paloma López

25. Producción de pigmentos carotenoides por cepas de Lactobacillus plantarum

27

A. Maldonado Barragán, J. Garrido Fernández, B. Caballero Guerrero, H. Lucena Padrós, D. Hornero Méndez, J. L. Ruiz Barba.

26. Utilización y síntesis de fucosil-oligosacáridos naturales por tres a-L-fucosidasas aisladas de Lactobacillus casei

28

Jesús Rodríguez-Díaz, Vicente Monedero y María Jesús Yebra 27. Secuenciación y análisis del cluster eps de Bifidobacterium animalis subsp. lactis IPLA-R1 y estructura de su exopolisacárido de alto peso molecular

29

Claudio Hidalgo, Borja Sánchez, Shaun Leivers, Glenn Robinson, Andrew P. Laws, Abelardo Margolles y Patricia Ruas-Madiedo

28. Producción de heteropolisacáridos por cepas de Lactobacillus aisladas de sidra

30

I. Ibarburu, A. I. Puertas, A. Irastorza, S. Notararigo, P. Fernández de Palencia, P. López, A. Prieto, y M. T. Dueñas

29. Estudio genético y funcional de las enzimas implicadas en la degradación de galotaninos en Lactobacillus plantarum

31

José Antonio Curiel, Héctor Rodríguez, Gloria Fernández-Lorente, Inés Reverón, José Manuel Guisán, José Luís Ruiz-Barba, Blanca de las Rivas y Rosario Muñoz

INDICE

30. Impacto metabólico del plásmido bacteriocinogénico pBL1 en Lactococcus lactis

32

Ana B. Campelo, Paula Gaspar, Clara Roces, Ana Rodríguez, Ana Rute Neves y Beatriz Martínez.

31. El genoma de Lactobacillus casei BL23 codifica cuatro sortasas. Construcción de mutantes y caracterización

33

Diego Muñoz-Provencio, Carmen Collado y Vicente Monedero IV. INTERACCIÓN BACTERIAS LÁCTICAS/HUÉSPED 34 32. Moonlighting functions of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum.

34

Irene González, Borja Sánchez, Lorena Ruiz, Francesca Turroni, Marco Ventura, Miguel Gueimonde, and Abelardo Margolles.

33. Análisis de la mucosa intestinal en un modelo in vitro y valoración de las propiedades inmunomoduladoras de β-glucanos producidos por bacterias ácido lácticas

35

Sara Notararigo, Alicia Prieto, Angel L. Corbí, David Sancho Paloma López y Pilar Fernández de Palencia

34. Papel de los exopolisacáridos de bifidobacterias y lactobacilos en el ambiente intestinal: estudios in vitro

36

Patricia Ruas-Madiedo, Nuria Salazar, Miguel Gueimonde, Abelardo Margolles y Clara G. de los Reyes-Gavilán

35. Lactobacillus casei y Lactobacilus plantarum reducen la expresión de genes proinflamatorios en fragmentos de colon humano

37

Christine Bäuerl, Marta Llopis, María Antolín, Manuel Mata, Manuel Zuñiga, Vicente Monedero, Francisco Guarner y Gaspar Pérez Martínez*

36. Bacterias lácticas aisladas de leche humana y VIH: inhibición de la transfección dependiente de DC-SIGN de células T humanas

38

Grupo Probilac (coordinador: Rodríguez, J.M.) 37. Implicaciones de probióticos microencapsulados en el crecimiento y desarrollo de ratones con cáncer de colon.

39

Iván Benito, Francisco C. Ibáñez, María Alfaro, María Chávarri, María del Carmen Villarán, Paloma Torre, Florencio Marzo

38. Efecto de los probióticos Lactobacilus gasseri y Bifidobacterium bifidum en líneas celulares de adenocarcinoma de colon.

41

María Alfaro, Iván Benito, Francisco C. Ibáñez, Paloma Torre, Ignacio Encío, Florencio Marzo

INDICE

39. Susceptibilidad de la microbiota intestinal a extractos fenólicos comerciales obtenido del vino

42

Carolina Cueva, Begoña Bartolomé, Irene Bustos, Teresa Requena, M. Victoria Moreno-Arribas, Rosa del Campo

40. Impacto de la obesidad y sobrepeso materno en las poblaciones de bacterias lácticas y bifidobacterias presentes en la leche materna

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M.C. Collado 41. Establecimiento y desarrollo de la microbiota intestinal en niños prematuros

45

Silvia Arboleya; Ana Binetti; Nuria Salazar; Nuria Fernández; Gonzalo Solís; Ana Hernández-Barranco; Abelardo Margolles; Clara G. de los Reyes-Gavilán; Miguel Gueimonde

INDICE DE AUTORES 46

I. TAXONOMÍA E IDENTIFICACIÓN

1

1. Ánálisis del género Lactobacillus por MALDI-TOF MS

†Ruvira M.A., †Arahal D.R., *Clermont D., +De Vos P., #Schumann P.

†Departamento de Microbiología y Ecología, Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Universidad de Valencia. *Institut Pasteur, Collection de l´Institut Pasteur, Départment de Microbiologie F-750115 Paris, France.+Laboratory of Microbiology (LM-UGent), Department of Biochemistry and Microbiology, Ghent University, K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Ghent, Belgium.#Deutstche Sammlung für Mikrobiologie und Zellkultur, Brunschweig, Germany. [email protected] MALDI-TOF (Matrix-Assisted-Laser-Desortion-Ionization Time-of-Flight) es una técnica de ionización suave usada en espectrometría de masas para el análisis de biomoléculas. En taxonomía microbiana, esta técnica es aplicada a un extracto bacteriano para la determinación de proteínas que se expresan constitutivamente (principalmente proteínas ribosomales). El perfil generado permite discriminar entre especies cercanamente relacionadas, permitiendo, incluso, la clasificación en algunos géneros a nivel de subespecie. Además, algunos autores han estudiado su alta capacidad discriminatoria en comparación con el análisis de secuencia del gen 16S rRNA, sugiriendo que MALDI-TOF MS posee una mayor precisión para la identificación de determinadas especies microbianas. Por esta razón, y debido a su alta reproducibilidad, fácil manejo y bajo coste, esta técnica se convierte en una herramienta muy útil para la identificación y autentificación de cepas. La CECT, junto con otras Colecciones de Cultivo europeas, participa en un proyecto denominado “EMbaRC” (European Consortium of Microbial Resource Centers) (http://www.embarc.eu/). Una de las tareas de este proyecto, es el análisis de varios géneros mediante MALDI-TOF MS, con el fin de examinar la identidad de las cepas de las Colecciones implicadas, permitiendo comparar y armonizar los espectros generados entre los diferentes laboratorios, como control de calidad de los mismos y con el fin de generar una librería robusta. En este trabajo se han analizado 195 cepas pertenecientes a 123 especies y 15 subespecies del género Lactobacillus. La mayor parte de las cepas (concretamente 148) estaban representadas por 2, 3 o 4 subcultivos (cepas equivalentes) de la CECT, CIP, DSMZ y/o LMG lo que eleva el número de perfiles a 472 que han sido analizados con el software Biotyper 1.0 (Bruker Daltonics). The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Programme (FP7, 2007-2013), Research Infrastructures action, under the grant agreement No. FP7-228310 (EMbaRC project). Bizzini A, Jaton K, Romo D, Bille J, Prod'hom G, Greub G. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry as an


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Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains. J Clin Microbiol 2011;49:693. Murray PR. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry: usefulness for taxonomy and epidemiology. Clin Microbiol Infect 2010; 16:1626. Wunschel SC, Jarman KH, Petersen CE, Valentine NB, Wahl KL, Schauki D, et al. Bacterial analysis by MALDI-TOF mass spectrometry: an inter-laboratory comparison. J Am Soc Mass Spectrom 2005; 16:456. Palabras clave: MALDI-TOF, Lactobacillus, control de calidad, cepas equivalentes, recursos microbianos


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2. Identificación y determinación de la viabilidad de Lactobacillus mediante PCR en células enteras. Lidia Haro Blasco, Sergi Ferrer, Isabel Pardo ENOLAB - Laboratorio de Microbiología Enológica. Departamento de Microbiología, Universidad de Valencia Facultad de Biología, Edificio Investigación 3.71. C/Dr. Moliner 50 E-46100 Burjassot-València, Spain

La PCR es una de las herramientas mas usadas en el análisis microbiológico por su sensibilidad y especificidad. Desde que fue desarrollada en 1986 por Kary Mullis se han perfeccionado variantes según las necesidades del estudio como por ejemplo la PCR cuantitativa que permite determinar el número de células presentes en la muestra. Sin embargo no deja de ser una técnica basada en el DNA y por lo tanto es incapaz de discriminar por sí misma células vivas y muertas. El DNA permanece en el medio durante un tiempo incluso muerta la célula y por lo tanto es susceptible de ser detectado.

La EMA (monoazida de etidio) y la PMA (monoazida de propidio) son dos moléculas que se unen al DNA de forma covalente impidiendo que sea detectado por técnicas moleculares como PCR, hibridación de sondas, etc. La importancia de estas moléculas es que sólo son capaces de interaccionar con el DNA cuando acceden a él. Al trabajar con células, esto sólo es posible cuando la membrana está intacta. De este modo pueden discriminan células con membranas intactas (vivas) y células con membranas dañada (muertas).

El uso de estas moléculas se ha descrito anteriormente por Nocker et al (1). En este método las células enteras son tratadas con EMA y PMA, y el DNA es extraído y amplificado por PCR.

El objetivo de nuestro trabajo es la optimización de parámetros de la técnica de PCR asociada a estas moléculas para diferenciar células vivas y muertas sin la necesidad de extraer el DNA.

Trabajamos con cultivos de células de Lactobacillus amplificando mediante PCR el fragmento del gen 16S rDNA para su identificación. Tras establecer un rango de concentraciones de EMA y PMA para inhibir la amplificación a partir del DNA puro en solución, se pasó a aplicar la técnica directamente en células enteras.

Partiendo de tres suspensiones celulares de Lactobacillus plantarum (células vivas, células muertas por etanol y células muertas por calor) se trataron con EMA o PMA a distintas concentraciones. Al amplificar el fragmento del gen 16S rDNA directamente de células enteras no se obtuvo ningún resultado positivo: las moléculas de EMA y PMA libres en el medio son capaces de interferir en la reacción de PCR aún no estando unidas al DNA.

A raíz de los resultados anteriores se propuso incluir un paso nuevo de lavado tras el tratamiento con EMA y PMA. Las muestras de células vivas tratadas con EMA o PMA fueron capaces de amplificar el gen 16S rDNA mediante PCR. En las muestras de células muertas tanto por calor como por etanol solo se produjo la amplificación en las no tratadas con EMA o PMA. Al eliminar el EMA y PMA libre en el medio evitamos que interfieran en la reacción de PCR.


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Las modificaciones introducidas mejoran el método en cuanto a rapidez y sencillez, y evitan las posibles interferencias debidas al paso de extracción del DNA. Por primera vez se ha aplicado el método a células enteras sin la necesidad de extraer el DNA. Además los resultados obtenidos con el método del lavado son mejores que los obtenidos con la extracción del DNA ya que el método es eficaz a concentraciones menores de PMA.

En el presente momento estamos adaptando el sistema a otros métodos cuantitativos, como PCR cuantitativa, FISH y citometria de flujo, comparando los resultados con el sistema LIVE/DEAD, y la siembra en placa y recuento de totales. También estamos adaptando su aplicación al estudio de muestras ambientales directas.

1. Nocker, A., Cheung, C., Camper, A. 2006. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of life vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods; 67: 310-320

Palabras clave: gen 16S rDNA, EMA, PMA, viabilidad, Lactobacillus.


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3. Identificación molecular de bacterias lácticas aisladas de neonatos para su uso como probióticos en embutidos fermentado-curados. Raquel Rubio, Teresa Aymerich, Belén Martín, Margarita Garriga IRTA-Programa de Seguridad Alimentaria, Finca Camps i Armet s/n 17121Monells [email protected] A partir de 50 muestras de heces de neonatos de edades comprendidas entre menores de 1 mes y 6 meses, alimentados exclusivamente con lactancia materna, lactancia fórmula o lactancia mixta se aislaron un número representativo de colonias para proceder a su caracterización e identificación.

Mediante RAPD-PCR y con los cebadores KS y M13R2 se caracterizaron los diferentes aislados y se identificaron 69 cepas con perfiles diferentes. A nivel de especie se identificaron, mediante la secuenciación parcial del ADN, un total de 106 aislados, correspondientes a un número significativo de las 69 cepas discriminadas por perfiles RAPD. Las dianas establecidas fueron la región V1-V3 del gen 16S del ARNr y el gen cpn60 para el estudio de los géneros Enterococcus, Lactobacillus y Weissella y el gen SodA correspondiente a la enzima superóxido dismutasa para el género Streptococcus.

El género predominante fue Enterococcus (46%), seguido por Lactobacillus (39,8%), Weissella (8%) y Streptococcus (7%). Cabe destacar que en neonatos alimentados con leche materna se observó un equilibrio entre enterococos y lactobacilos, sin embargo, en los alimentados con fórmula o mixta los lactobacilos fueron predominantes (ca. 80%). Con respecto a la edad, se observó que la población de enterococos fue dominante únicamente en neonatos de entre 1 y 2 meses. La especie mayoritaria fue E. faecalis (ca. 40%). En los neonatos alimentados con leche materna E. faecalis representó el 42% de los aislados, seguida por L. gasseri (19%), mientras que en los alimentados a base de lactancia mixta y lactancia fórmula destacó mayoritariamente la presencia de L. fermentum (46% y 40%, respectivamente).

Palabras clave: Enterococcus, Lactobacillus, probióticos, RAPD-PCR, embutidos

II. BACTERIAS LÁCTICAS EN ALIMENTOS

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4. Exopolisacáridos de bacterias del ácido láctico aisladas de productos cárnicos. Nácher-Vázquez, M.3, Notararigo, S. 1, Mohedado, M.L. 1, Fernández de Palencia, P.1, López, P.1, Prieto, A.4, Sánchez, G.3, and Aznar, R.2,3 1Departamento de Microbiología Molecular y de Biología de las Infecciones, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid. 2Departamento de Microbiología y Ecología, Universitat de València, Burjassot, Valencia. 3Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Burjassot, Valencia. 4Departamento de Biología Medioambiental, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid. [email protected] Las bacterias del ácido láctico (BAL) producen una gran variedad de exopolisacáridos (EPS) de interés industrial diferentes en cuanto a su composición química, tamaño, estructura, organización molecular y mecanismo de síntesis. Son polímeros de cadena larga de alto peso molecular cuya cantidad y tipo depende de cepa y de las condiciones de crecimiento. El objetivo de este trabajo ha sido el estudio de la producción de dextrano por BAL aisladas de productos cárnicos, así como la identificación y caracterización de los genes implicados en su biosíntesis. Las cepas seleccionadas pertenecen a tres especies: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei y Leuconostoc mesenteroides. Las bacterias fueron cultivadas en medio definido incluyendo diferentes carbohidratos como fuente de carbono. La máxima producción se obtuvo en presencia de sacarosa, llegándose a alcanzar niveles superiores a 1 g/L. Los EPS producidos fueron aislados y caracterizados mediante métodos fisico-químicos. Su estructura, composición y configuración anomérica indican que se trata de dextranos, ya que están constituidos por D-glucopiranosa con enlaces α(1→6) y poseen un bajo porcentaje de ramificación α(1→3). Los EPS fueron purificados mediante cromatografía de exclusión molecular para realizar estudios inmunológicos. Para determinar los genes implicados en la biosíntesis de dichos EPS se diseñaron oligonucleótidos degenerados, basados en la secuencia codificante del centro activo de dextransacarasas, que se utilizaron para amplificación por PCR. Seguidamente mediante hibridación de los amplicones por "Southern", se observa que los genes dsr están localizados en plásmidos de elevado peso molecular y son diferentes en L. sakei (15 kb), L. plantarum (19,4 kb), y L. mesenteroides (22 kb). La secuenciación de los amplicones reveló que las proteínas codificadas por los genes dsr pertenecen a la familia de las glicosil hidrolasas GH70 y que existe una divergencia próxima al 50% entre la secuencia de aminoácidos de la proteína de L. sakei respecto a sus homónimas en L. plantarum y L. mesenteroides. Palabras clave: exopolisacárido, bacteria ácido láctica, dextrano, glucansacarasa


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5. Diversidad de las comunidades microbianas durante la fermentación de aceituna de mesa “Manzanilla Aloreña” Hikmate Abriouel, Nabil Benomar, Rosario Lucas, Magdalena Martínez Cañamero, Antonio Gálvez. Centro, Institución, dirección. Área de Microbiología, Dpto. Ciencias de la Salud, Fac CC. Experimentales, Campus Las Lagunillas s/n. 23071-Jaén [email protected] La aceituna de mesa Manzanilla Aloreña es un producto típico de la región de Guadalhorce (Málaga) con denominación de origen (DO). Esta variedad de aceitunas tiene unas características peculiares. Su bajo contenido en oleuropeína (glucósido amargo principal de aceitunas) permiten que se pueda prescindir de la etapa de endulzado por NaOH, bastando con el lavado con agua para eliminar el amargor. Las pequeñas y medianas empresas de la región elaboran tres tipos de aceitunas: cámara (almacenadas bajo refrigeración), patio (cubas) y fermentador (tª ambiente). La diversidad microbiana (bacterias, arqueas, levaduras y mohos) de las aceitunas fermentadas en distintas condiciones fue determinada mediante métodos independientes de cultivo usando la técnica de PCR-DGGE. Los resultados obtenidos demostraron que las poblaciones microbianas de las aceitunas fermentadas en frío estaban compuestas principalmente de Gordonia sp./Pseudomonas sp. y Sphingomonas sp./Sphingobium sp./Sphingopyxis sp. junto con arqueas halófilas (principalmente haloarchaeon/Halosarcina pallida y uncultured archaeon/uncultured haloarchaeon/Halorubrum orientalis) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae y Candida cf. apicola). Las aceitunas fermentadas en cubas a temperatura ambiente mostraron una gran diversidad microbiana: Gordonia sp./Pseudomonas sp., Sphingomonas sp./Sphingobium sp./Sphingopyxis sp. y Thalassomonas agarivorans junto con arqueas halófilas y levaduras (principalmente S. cerevisiae y C. cf. apicola, y también Pichia sp., y Pichia manshurica/Pichia galeiformis). Al final de la fermentación se detectaron algunas BAL, como Lactobacillus pentosus/Lactobacillus plantarum y Lactobacillus vaccinostercus/Lactobacillus suebicus. La presencia y predominancia de las BAL fue mucho más patente en las aceitunas elaboradas en fermentador (Lactobacillus sp., Lactobacillus paracollinoides, y Pediococcus sp.) junto con algunas arqueas halófilas y algunas levaduras (P. manshurica/P. galeiformis) en menor proporción. Palabras clave: Aceituna de mesa, fermentación, diversidad microbiana.


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6. Microbiología de productos lácteos tradicionales: i) diversidad microbiana y ii) caracterización de bacterias ácido-lácticas. Ángel Alegría, Elena Fernández, Susana Delgado, Ana Belén Flórez, Alicia Noriega, Baltasar Mayo. Departamento de Microbiología y Bioquímica, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA), CSIC, Carretera de Infiesto, s/n, 33300-Villaviciosa, Asturias *[email protected]

Las propiedades sensoriales de los productos lácteos dependen de una larga serie de factores entre los que podemos destacar la alimentación de los animales, las prácticas y tecnologías de elaboración y la composición cualitativa y cuantitativa de los microorganismos responsables de los procesos de acidificación y maduración. Este último factor, la evolución y actividad de las poblaciones microbianas, juega un papel importante también en las cualidades higiénicas y de conservación de estos productos.

España cuenta con gran número de productos lácteos tradicionales de reputada fama, de los que muchos están siendo protegidos con marcas de calidad como Denominaciones de Origen Protegidas (DOPs) o Indicaciones Geográficas Protegidas (IGPs) (http://www.mapa.es/es/alimentacion/pags/Denominacion/resultado1.asp). Una gran mayoría de ellos se elabora aún con leche cruda, lo que asegura una extraordinaria diversidad microbiológica a lo largo de elaboración y maduración. Estos microorganismos constituyen una fuente inagotable de variabilidad fenotípica y genética que es necesario caracterizar y preservar, puesto que cepas bien caracterizadas de estas poblaciones pueden utilizarse para diseñar fermentos específicos, complementar y mejorar los fermentos comerciales o para el desarrollo de nuevos procesos y/o productos.

En los últimos años, nuestro grupo ha participado en la caracterización de un buen número de productos lácteos tradicionales españoles y extranjeros (en su mayoría quesos), utilizando técnicas clásicas de cultivo y técnicas microbiológicas cultivo-independientes. Entre los productos estudiados podemos citar el queso Casín, con DOP desde el año 2008, una leche fermentada tradicional, el queso polaco Oscypek y los quesos iraníes Lighvan y Koozeh. Además de las bacterias del ácido láctico (BAL) convencionales (Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, etc.), en algunos de estos tipos se han detectado poblaciones importantes de Lactococcus garvieae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y/o Streptococcus thermophilus. Representantes de estas poblaciones se han sometido a una exhaustiva caracterización fenotípica, genética y, en muchos casos, tecnológica, lo que nos ha permitido seleccionar cepas de BAL con buenas aptitudes que carecen de propiedades indeseables. Algunas de las cepas se han transferido a empresas nacionales o internacionales de fermentos; otras, por su importancia biológica y su valor evolutivo, están siendo estudiadas en mayor profundidad antes de su transferencia. Palabras clave: productos lácteos tradicionales, quesos tradicionales, cultivos iniciadores, cultivos adjuntos, fermentos, bacterias del ácido láctico.


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7. Actividades α-cetoácido descarboxilasa y α-cetoácido deshidrogenasa en una colección de cepas de Lactococcus lactis aisladas de quesos de leche cruda. Picón, P. Morales, P. Gaya y M. Núñez. INIA, Departamento de Tecnología de Alimentos, Carretera de La Coruña Km 7, 28040 Madrid [email protected] Los α-cetoácidos son compuestos clave en el metabolismo de muchos aminoácidos y en la generación de compuestos relevantes para el sabor del queso. En este estudio se emplearon 32 cepas de Lactococcus lactis aisladas de quesos de leche cruda por Gaya y col. (1999), y 6 cepas de referencia ampliamente utilizadas en la bibliografía. Los compuestos volátiles producidos por estas cepas en queso fresco fueron estudiados por Morales y col. (2003). Un análisis de grupos jerárquicos basado en la abundancia relativa de los compuestos volátiles producidos por estas cepas las agrupó en 2 ramas. Mientras que todas las cepas de referencia se encontraban localizadas en la rama A, la mayoría de las cepas de la colección INIA estaban situadas en la rama B. A pesar de que ninguna cepa de referencia presentó actividad α-cetoácido descarboxilasa, 29 de las 32 cepas de la colección INIA sí que presentaron esta actividad sobre α-cetoisocaproato. Se obtuvieron valores comprendidos entre 0,10 y 0,89 nmol de 3-metilbutanal / mg de proteína / h para la mayoría de ellas, pero seis de las cepas de la colección INIA obtuvieron valores comprendidos entre 2,56 y 5,57 nmol de 3-metilbutanal / mg de proteína / h. Cinco de las seis cepas con elevada actividad α-cetoácido descarboxilasa poseían los dos genes (kivd y kdcA) cuyos productos son responsables de esta actividad. Casi todas las cepas con esta actividad se encontraban localizadas en la rama B. Actualmente estamos determinando la actividad α-cetoácido deshidrogenasa en extractos celulares de estas cepas. Palabras clave: Lactococcus lactis, queso, metabolismo de α-cetoisocaproato


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8. Biosíntesis de aminas biógenas en bacterias del ácido láctico aisladas de leche materna. Marta P. García, Victor Ladero, Mª Cruz Martín, María Fernández y Miguel A. Álvarez. Grupo de Microbiología Molecular. Instituto de Productos Lácteos de Asturias, IPLA- CSIC. Carretera de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, España [email protected]

La leche materna proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo adecuado del recién nacido, así como toda una serie de compuestos con actividades biológicas esenciales. Entre estos compuestos se encuentran la espermidina y la espermina, que son moléculas orgánicas nitrogenadas, pertenecientes al grupo de las aminas biógenas, y conocidas como poliaminas. La espermidina y la espermina se sintetizan a partir de otra poliamina, la putrescina, tras sucesivas reacciones de condensación con un grupo aminopropilo.

A las poliaminas se les han atribuido distintas funciones fisiológicas, entre las que cabe destacar su papel en la maduración intestinal del recién nacido. La concentración de poliaminas en fórmulas infantiles comerciales es unas 10 veces menor que en la leche materna, lo que ha impulsado su enriquecimiento en estos compuestos con el fin de emular la composición natural de la leche materna.

Aunque las células de la glándula mamaria son las principales responsables de la biosíntesis de poliaminas durante la lactancia, la microbiota de la leche también podría participar en el aporte de estas sustancias. Durante los últimos años se han realizado avances muy importantes en la caracterización de la microbiota de la leche materna (Martin et al., 2007) y no se puede descartar la posibilidad de que las BAL de dicha microbiota influyan en la concentración de las aminas biógenas presentes en la leche. Aunque el aporte de poliaminas podría ser beneficioso, la biosíntesis de otras aminas biógenas como la histamina o la tiramina, con conocidos efectos tóxicos, sería indeseable.

El objetivo de este trabajo es conocer la capacidad de biosíntesis de aminas biógenas y poliaminas de las BAL predominantes en la leche materna, con la doble finalidad de conocer las que son potencialmente peligrosas y las que son capaces de sintetizar espermina y espermidina. Estas últimas abrirían una nueva alternativa en la obtención de estos compuestos para el enriquecimiento artificial de fórmulas infantiles o incluso para su uso como probióticos.

El estudio de la capacidad de estas bacterias para sintetizar aminas biógenas y poliaminas se ha abordado desde un punto de vista genético, detectando mediante técnicas de PCR los genes que codifican las enzimas implicadas en las rutas de biosíntesis; y fenotípico, cultivándolas y cuantificando, mediante técnicas cromatográficas, la presencia de aminas biógenas y poliaminas en los medios de cultivo. Martín R, Heilig HG, Zoetendal EG, Jiménez E, Fernández L, Smidt H, Rodríguez JM. 2007. Cultivation-independent assessment of the bacterial diversity of breast milk among healthy women. Res. Microbiol.158:31-37. Palabras clave: BAL, aminas biógenas, poliaminas, leche materna.


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9. Incidencia de resistencias a biocidas y antibióticos en bacterias de la cadena alimentaria. Miguel Ángel Fernández, Elena Ortega, Hikmate Abriouel, Rubén Pérez Pulido, Antonio Sánchez, Leire Lavilla, Antonio Gálvez. Centro, Institución, dirección. Área de Microbiología, Dpto. Ciencias de la Salud, Fac CC. Experimentales, Campus Las Lagunillas s/n. 23071-Jaén [email protected] El empleo intensivo de biocidas en la industria alimentaria, en ambientes clínicos y en el ámbito doméstico, genera múltiples oportunidades para la aparición de cepas adaptadas a diferentes tipos de agentes antimicrobianos. El tratamiento repetido con biocidas en la industria alimentaria puede seleccionar la implantación de cepas tolerantes a los mismos así como a otros tratamientos físicos y químicos, como se ha demostrado para Listeria monocytogenes o Escherichia coli. Más preocupante aún es la aparición de cepas con una resistencia incrementada no solo a los propios biocidas, sino también a antibióticos de uso clínico como ciprofloxacina, cloranfenicol, tetraciclina, ampicilina y otros, como consecuencia del empleo de mecanismos comunes de resistencia frente a ambos tipos de compuestos. Todo ello genera la necesidad de analizar las consecuencias del uso indiscriminado de biocidas sobre el incremento de resistencias múltiples a agentes antimicrobianos de uso común en clínica. Si bien aún se desconoce qué tipo de alimentos pueden representar un mayor riesgo, los alimentos ecológicos presentan un especial interés no sólo por su valor añadido sino también por sus diferencias en los métodos de producción con el resto de alimentos. En los estudios realizados por nuestro grupo sobre microorganismos procedentes de diferentes tipos de alimentos se han aislado cepas bacterianas resistentes a biocidas como cetrimida, cloruro de hexadecil-piridinio y hexachlorofeno, aunque con una baja incidencia. Sin embargo, muchas de las cepas resistentes a biocidas lo fueron también a antibióticos de uso clínico como cefuroxime, amoxicilina y eritromicina. Estos resultados sugieren que el empleo de biocidas podría facilitar la persistencia de cepas bacterianas resistentes a antibióticos en la cadena alimentaria. Palabras clave: Biocidas, antibióticos, cadena alimentaria Agradecimientos Trabajo financiado por el proyecto P08-AGR-4295 (Junta de Andalucía, FEDER)


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10. Sinergias de la enterocina AS-48 con biocidas sobre bacterias patógenas en la cadena alimentaria.

Natacha Caballero, Hikmate Abriouel, Mª Carmen López, Mª José Grande, Rubén Pérez Pulido, Elena Ortega, Rosario Lucas, Antonio Gálvez Centro, Institución, dirección. Área de Microbiología, Dpto. Ciencias de la Salud, Fac CC. Experimentales, Campus Las Lagunillas s/n. 23071-Jaén [email protected] La enterocina AS-48 es un péptido cíclico producido por Enterococcus faecalis. Su actividad biológica, mecanismo de acción, estructura molecular y determinantes genéticos han sido estudiados en gran detalle en estudios previos. AS-48 muestra actividad bactericida frente a bacterias patógenas en sistemas alimentarios (cárnicos, lácteos, vegetales) sola y/o en combinación con otros antimicrobianos como ácidos orgánicos, agentes quelantes, aceites esenciales o compuestos fenólicos. Además de sus posibles aplicaciones como biocoservante alimentario, AS-48 podría ofrecer otras posibles aplicaciones como por ejemplo en la desinfección de superficies. Por ello, hemos estudiado los efectos sinérgicos de esta bacteriocina frente a bacterias patógenas o productoras de toxinas (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, E. coli, Salmonella enterica) en combinación con diversos tipos de biocidas (agentes oxidantes, derivados de amonio cuaternario, bis-fenoles, biguaninas y poliguaninas), tanto frente a células planctónicas como a poblaciones de biofilms. En el caso de bacterias Gram-positivas, se han detectado efectos sinérgicos en combinación con la mayoría de los biocidas ensayados. Las células formando biofilms muestran una mayor resistencia a los biocidas así como a la bacteriocina. Sin embargo, en los tratamientos combinados se observa siempre una mayor efectividad. Los resultados obtenidos indican que es posible emplear combinaciones biocida/enterocina a concentraciones inferiores a los compuestos por separado a la vez que incrementa la eficacia de los tratamientos. Para bacterias Gram-negativas, los efectos sinérgicos observados han sido más limitados, aunque se han obtenido buenos resultados para determinadas combinaciones biocida/bacteriocina tanto en el caso de E. coli como S. enterica en estado planctónico y en biofilms. Palabras clave: Bacteriocina, biocidas, patógenos alimentarios, biofilms. Agradecimientos Trabajo financiado por el proyecto AGL2008-01553/ALI (MICINN, FEDER)


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11. Control de L. monocytogenes en jamón cocido loncheado mediante la aplicación combinada de enterocinas y alta presión hidrostática. Anna Jofré1, Teresa Aymerich1, Eva Valdivia2 y Margarita Garriga1 1IRTA-Programa de Seguridad Alimentaria, Finca Camps i Armet, 17121 Monells 2Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Campus de Fuentenueva s/n, 18071 Granada, Spain. [email protected] La aplicación de bacteriocinas puede contribuir a extender la vida útil de los alimentos, minimizando la adición de conservantes químicos o la aplicación de tratamientos térmicos intensos, especialmente si se combina con otro tipo de tratamientos físicos como el procesado por alta presión (AP). El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto combinado de las enterocinas A&B o AS48 y la AP (600 MPa) en jamón cocido loncheado inoculado con 2.5 log ufc/g de L. monocytogenes después del loncheado, simulando una contaminación cruzada. La aplicación de A&B y AS48 en las lonchas de jamón cocido produjo una reducción de los recuentos de L. monocytogenes de 1.5 y 0.4 log ufc/g, respectivamente en 18h. El tratamiento por AP disminuyó de forma inmediata los recuentos del patógeno por debajo del límite de detección (presencia en 25g) tanto en el lote control como en los lotes que contenían las enterocinas A&B o AS48. Durante el almacenaje en refrigeración de las muestras no presurizadas, los recuentos de L. monocytogenes aumentaron progresivamente en el lote control hasta situarse a 7.5 log ufc/g después de 35 días. En el lote A&B los recuentos aumentaron pero se mantuvieron durante todo el período de almacenaje unos 2 log ufc/g inferiores al lote control mientras que en el lote AS48 los recuentos no aumentaron con respecto al inoculo inicial. Todas las muestras presurizadas, en cambio, registraron ausencia de L. monocytogenes durante los primeros 14 días a 4ºC, posteriormente, los lotes con enterocinas registraron un mayor número de muestras con ausencia del patógeno que el lote control. La aplicación de las enterocinas A&B y AS48 retrasó e inhibió, respectivamente, el crecimiento de L. monocytogenes en lonchas de jamón cocido. Sin embargo, la eliminación del patógeno durante el almacenaje sólo se consiguió mediante la aplicación de un tratamiento de AP, y especialmente cuando este se combino con la aplicación de las enterocinas A&B o AS48. Palabras clave: Alta presión hidrostática, enterocinas, jamón cocido loncheado, L. monocytogenes


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12. Bacterias lácticas del vino: actividades enzimáticas y producción de compuestos volátiles azufrados. J.J. Rodríguez-Bencomo, A. García-Ruiz, M.C. Martínez-Cuesta, E. González-Rompinelli, T. Requena, B. Bartolomé, M.V. Moreno-Arribas. Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL) (CSIC-UAM). C/Nicolás Cabrera 9, Campus Cantoblanco, 28049, Madrid. [email protected] La investigación se ha centrado en el estudio de la incidencia en estirpes silvestres de bacterias lácticas (BAL) de las principales actividades enzimáticas con un posible impacto en el aroma de los vinos. De esta manera se ha realizado un screening de: i) actividades esterasa, que modifican el perfil de ésteres responsables en gran medida del aroma afrutado de los vinos; ii) actividades β-glucosidasa, responsables de la formación de compuestos aromáticos a partir de sus precursores glicosilados; y iii) actividades C-S liasa implicadas en la producción de compuestos volátiles azufrados (VSCs) y que confieren al vino sus características notas aromáticas.Asimismo, la capacidad de producir VSCs a partir de L-metionina también ha sido evaluada mediante la determinación de la formación de metanotiol (MTL), dimetildisulfuro (DMDS) y dimetiltrisulfuro (DMTS) por microextracción en fase sólida del espacio de cabeza acoplada a cromatografía de gases-espectrometría de masas (SPME-GC-MS). Los resultados obtenidos han mostrado una gran diversidad en las capacidades enzimáticas así como una alta variabilidad inter- e intra- especie entre las cepas de BAL estudiadas. El conocimiento del potencial enzimático de las BAL asociadas al vino, ofrece nuevas posibilidades para la selección de cultivos iniciadores con las características organolépticas deseadas, a la vez que constituye una eficaz herramienta para mejorar el aroma del vino. Palabras clave: Bacterias lácticas, vino, actividades enzimáticas, compuestos volátiles azufrados, aroma


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13. Biodiversidad de bacterias lácticas en vinos tintos de la D.O.Ca. Rioja. Grupo de Gestión y Control Microbiológico de la Vinificación del ICVV. Servicio de Investigación y Desarrollo Tecnológico Agroalimentario (Centro asociado al Instituto de las Ciencias de la Vid y el Vino. ICVV). Sección de Viticultura y Enología. Consejería de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural del Gobierno de La Rioja. Ctra. Mendavia-Logroño NA 134 – km. 88, 26071-Logroño (La Rioja). [email protected] El estudio de la ecología bacteriana a lo largo del proceso de vinificación es de crucial importancia para la obtención de un vino de calidad, evitando problemas en la etapa de fermentación alcohólica (FA), controlando posteriormente la fermentación maloláctica (FML), la estabilización y la crianza del vino. Conocer la diversidad de bacterias lácticas (BL) presentes en los vinos de la D.O.Ca. Rioja elaborados según distintos métodos de vinificación constituye también el punto de partida para la selección de BL autóctonas y su posterior comercialización, contribuyendo al mantenimiento de la biodiversidad y tipicidad de los vinos de esta región. Con el objetivo de abordar esta línea de investigación, se han realizado muestreos en bodegas representativas de toda la denominación, teniendo en cuenta las instalaciones, el ambiente y las distintas etapas del proceso de elaboración. Se han puesto a punto técnicas de Biología Molecular aplicadas a la detección e identificación de la microbiota del vino. De esta manera, el estudio de ecología de BL se está llevando a cabo mediante la combinación de varias metodologías que, en función de la técnica empleada, nos permiten estudiar las BL totales, las viables, las viables no cultivables y las no viables. Estos estudios se han realizado directamente sobre una muestra de vino sin la siembra previa de la muestra en medios de cultivo, y a partir del crecimiento bacteriano obtenido en medios de cultivo selectivos utilizando técnicas de microbiología clásica (siembra, aislamiento e identificación). Por ambos métodos se ha detectado una gran variedad de especies de BL desde el mosto hasta las etapas previas a la FML, momento a partir del cual la especie mayoritaria ha sido Oenococcus oeni. El estudio mediante electroforesis en gradiente de desnaturalización (DGGE) ha permitido la detección de una mayor diversidad de especies en comparación con el uso de técnicas tradicionales, diferenciando hasta veinte especies de BL distintas. El estudio de selección de BL se está llevando a cabo con las cepas aisladas en FML. Una vez identificadas, están siendo caracterizadas y seleccionadas en base a criterios básicos y específicos, como por ejemplo, la baja producción o incluso la metabolización de aminas biógenas y la resistencia a la lisozima, que nos permitan reducir los niveles de sulfuroso y elaborar vinos más saludables. Palabras clave: bacterias lácticas, ecología, Oenococcus oeni, vino.


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14. Búsqueda de bacterias lácticas con actividades enzimáticas, como herramienta biotecnológica en enología. Fátima Pérez Martín1, Susana Seseña1, Pedro Nieto Arribas1, María Isabel Moreno1, Pedro Miguel Izquierdo2,3 y Llanos Palop1. 1 Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos, Facultad de Ciencias del Medio Ambiente, Universidad de Castilla-La Mancha, Toledo. 2 Instituto de la Vid y el Vino de Castilla-La Mancha (IVICAM). Crta.Toledo-Albacete s/n. 13700, Tomelloso (Ciudad Real), 3 Parque Científico y Tecnológico de Albacete, Paseo de la Innovación, 1, 02006 Albacete. Spain. [email protected]

El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de una colección de aislados de bacterias lácticas obtenidos de muestras de vino tinto de distintas variedades de uva, de berenjenas de Almagro y de queso Manchego, para producir enzimas con potencial biotecnológico como las α y β-D-glucosidasa, s, la β-D-xilopiranosidasa, la α-L-ramnopiranosidasa y la α-L-arabinofuranosidasa. Estas enzimas juegan un papel muy importante en la calidad sensorial del vino al actuar sobre compuestos responsables del aroma y, por consiguiente, la utilización de cepas que produjeran alguna/s de estas enzimas en la FML, podría reportar importantes beneficios.

Para ello, en primer lugar, se realizó una caracterización genética de los aislados utilizando la técnica RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR) lo que permitió agrupar aislados idénticos, seleccionándose representantes de todos los genotipos identificados para el estudio de las actividades enzimáticas. Paralelamente se procedió a la identificación de las cepas mediante la técnica 16S-ARDRA.

Se determinó la actividad β-D-glucosidasa usando como sustrato el p-nitro-fenil β-D-glucopiranósido y aquellas cepas que mostraron resultados positivos para esta actividad se ensayaron para el resto de glicosidasas, utilizando los sustratos correspondientes: p-nitro-fenil α-D-glucopiranósido, p-nitro-fenil β-D-xilopiranósido, p-nitro-fenil α-L-ramnopiranósido y p-nitro-fenil α-L-arabinofuranósido.

Con las cepas que presentaron mayor actividad, se llevó a cabo un estudio para conocer la influencia de factores tales como la temperatura y el pH, en los rangos encontrados durante la vinificación, o de la presencia de algunos componentes del vino, como los azúcares y el etanol en distintas concentraciones, sobre la actividad enzimática. Asimismo, se realizó un estudio para conocer la localización celular de las enzimas.

En un futuro próximo está previsto completar este estudio con el análisis de la capacidad de producción de esterasas, enzimas que tienen también una gran importancia en el proceso de vinificación y en las características sensoriales de los vinos.

Palabras clave: glicosidasa, bacterias lácticas, fermentación maloláctica, aroma del vino.


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15. Utilidad de los genes rpoB y rpoC como marcadores de resistencia a las condiciones del vino en Oenococcus oeni A. Guija, S. Ferrer e I. Pardo Laboratorio de Microbiología Enológica ENOLAB. Dpto. Microbiología y Ecología. Universidad de Valencia. [email protected] Oenococcus oeni es una especie cuya importancia reside en su capacidad para realizar la fermentación maloláctica (FM). La FM consiste en la degradación del ácido málico para producir ácido láctico. Este proceso supone una reducción de la acidez y una mejora organoléptica de los vinos. Oenococcus oeni, además de degradar el ácido málico también es capaz de metabolizar otros compuestos presentes en el vino dando lugar a compuestos beneficiosos, como el diacetilo, perjudiciales, como el ácido acético, o tóxicos, como las aminas biógenas. No todas las cepas presentan las mismas capacidades metabólicas y, por ello, es importante seleccionar una cepa adecuada para llevar a cabo la FM. Además, la cepa escogida debe de ser capaz de resistir las condiciones existentes en el vino. Muchos investigadores han abordado proyectos para seleccionar cepas destinadas a realizar la FM. Sin embargo, esta tarea consume mucho tiempo y recursos. Algunos autores han descrito que existen diferencias genéticas entre cepas más o menos resistentes a las condiciones del vino.

El objetivo de este trabajo es comprobar la existencia de diferencias de secuencia en los genes rpoB y rpoC entre cepas de O. oeni de la colección ENOLAB con distintas capacidades metabólicas y fisiológicas. La capacidad de adaptación al vino se comprueba mediante el análisis de la capacidad de fermentar carbohidratos, la actividad frente a los ácidos orgánicos del vino, la capacidad para crecer a distintos valores de etanol, pH y anhídrido sulfurosos (SO2). La importancia del trabajo consiste en que, de establecerse la correlación entre diferencias a nivel génico y resistencia de las cepas a las condiciones del vino, se facilitaría la selección de cepas capaces de llevar a cabo la fermentación maloláctica en condiciones adversas.

La realización de este trabajo ha sido posible gracias a la financiación obtenida del proyecto RM2010-00001-00-00. Palabras clave: Oenococcus oeni, fermentación maloláctica, rpoC y rpoB.


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16. Mecanismos de adaptación de Oenococcus oeni al estrés del vino. Nicolas Rozès*, Meritxell Bordas, Isabel Araque, Cristina Reguant, Albert Bordons Departament de Bioquímica i Biotecnologia, Facultat d’Enologia, Universitat Rovira i Virgili. C/ Marcel·lí Domingo 1, Campus Sescelades N4, 43007 Tarragona [email protected] Aquí se presenta parte del trabajo con las bacterias lácticas del vino en la parte troncal del proyecto Cénit-Deméter, financiado por el CDTI en el programa Ingenio 2010. Este proyecto está dedicado al estudio de los efectos del cambio climático sobre la viticultura y la enología. Entre estos efectos, cabe destacar el aumento del contenido de etanol, que puede afectar a Oenococcus oeni, la principal especie de bacteria láctica asociada a la fermentación maloláctica (FML) del vino.

Para poder sobrevivir en estas condiciones, O. oeni utiliza diferentes mecanismos moleculares que están asociados con la respuesta a estrés y adaptación. Los objetivos principales de nuestro proyecto son estudiar las diferencias entre cepas más tolerantes y menos tolerantes a nivel de expresión de genes clave, y a nivel de composición de ácidos grasos de membrana.

Para ello se efectuó previamente una seleccción de cepas más tolerantes al etanol aisladas a partir de FML de vinos de Tarragona con alto contenido alcohólico. Las cepas fueron identificadas como O. oeni y tipificadas.

Los estudios se han llevado a cabo en primer lugar en vino simulado a pH 3.4 y a 20ºC, con dos de estas cepas seleccionadas, y comparado con la cepa tipo, como cepa menos tolerante. Para el análisis de la expresión, tras estudios previos, se escogieron 5 genes clave: hsp18 (chaperona), clpp (proteasa), mleA (enzima maloláctico), gsh (glutatión-reductasa) y citE (citrato-liasa). Se ha observado una clara relación de una mayor expresión relativa de algunos genes, como hsp18 y citE, en las cepas más tolerantes a etanol con respecto a la menos tolerante.

También se han efectuado los estudios en vinos reales de Tempranillo de Penedès y de Rioja, realizando FML con las cepas seleccionadas, y estudiando la expresión gènica y la composición de àcidos grasos. Se han observado diferencias en la cinética de FML y en la composición de los vinos en función de su origen, y se ha visto la influencia de la cepa inoculada en estas diferencias.

Estos conocimientos podrán ser aplicados en la preadaptación de cepas para su uso como inóculos, así como criterios adicionales en la selección de cepas, como características marcadoras de las cepas con un mayor potencial de tolerancia al etanol.

Palabras clave: Oenococcus, maloláctica, estrés, etanol, expresión


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17. Actividad antimicrobiana de la pediocina PA-1 en condiciones enológicas frente a bacterias del vino. Lorena Díez1, Beatriz Rojo-Bezares2, Myriam Zarazaga3, Juan M. Rodríguez4, Carmen Torres2,3 y *Fernanda Ruiz-Larrea1 1Universidad de La Rioja, ICVV (CSIC-UR-GR), Departamento de Agricultura y Alimentación. Av. Madre de Dios 51, 26006 Logroño. 2 Area de Microbiología Molecular, Centro de Investigación Biomédica de La Rioja, Logroño. 3Universidad de La Rioja. Departamento de Agricultura y Alimentación. 4Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Universidad Complutense de Madrid, 28010 Madrid. *e.mail: [email protected]

La pediocina PA-1 es una bacteriocina con un amplio campo de aplicación en el sector alimentario como bioconservante, y es producida principalmente por cepas de Pediococcus de diversos orígenes. El metabisulfito potásico (MBS) es un agente antimicrobiano que se usa desde los primeros estadíos de la vinificación para controlar el crecimiento de bacterias alterantes del vino. Los objetivos de este trabajo han sido por un lado, estudiar la posibilidad de controlar el crecimiento bacteriano durante la elaboración y conservación del vino mediante el uso de fermentados de características enológicas que contengan pediocina PA-1 producida por una cepa Pediococcus acidilactici; por otro lado, evaluar el efecto del etanol y del mosto de uva sobre la producción de pediocina PA-1 por la cepa productora P. acidilactici J347-29.

Para este estudio se emplearon 53 cepas de bacterias lácticas (BAL), 18 de bacterias acéticas y 16 de levaduras. Se determinaron las concentraciones inhibitorias de la pediocina PA-1 (Sigma-Aldrich), del MBS y del etanol, solos y en combinaciones binarias. La actividad antimicrobiana de P. acidilactici J347-29 se estudió en condiciones de cultivo con presencia de etanol (0, 2, 4, y 8 %) y de mosto (0, 20, 40, 80 y 100%). Los resultados obtenidos mostraron que la pediocina PA-1 es un inhibidor eficaz de las BAL, siendo la especie Oenococcus oeni más sensible que el resto de BAL. El efecto de la pediocina fue bacteriostático y no bactericida en el rango de concentraciones estudiado (625-0.33 ng/ml). Asimismo, se demostró que en presencia de una concentración subinhibitoria de pediocina (10 ng/ml para O. oeni y 156 ng/ml para el resto del BAL) aumenta la eficacia del MBS, 2 veces en el caso de O. oeni y 4 veces para el resto del BAL. Además se comprobó que la cepa productora de pediocina P. acidilactici J347-29 fue capaz de crecer en presencia de etanol y mosto; la máxima producción de pediocina se obtuvo cuando el medio de cultivo contenía 20 % mosto y 2-4 % etanol, o bien 40-60 % mosto y 2 % etanol. Todos estos resultados sugieren que fermentados de composición enológica y que contengan pediocina PA-1 pueden proporcionar una actividad antibacteriana eficaz, y que la cepa productora natural de pediocina, P. acidilactici J347-29, podría constituir un agente biológico para el control microbiológico de los vinos.

Agradecimientos: Este trabajo ha sido realizado con la ayuda de los proyectos AGL2007-60504 y AGL2010-15466 del MICINN y FEDER.

Palabras clave: pediocina PA-1; Oenococcus oeni; antibacterianos, vino.

III. BIOTECNOLOGÍA DE BACTERIAS LÁCTICAS

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18. Estudio de los genes de tiorredoxina / tiorredoxina-reductasa en Oenococcus oeni Albert Bordons*, Karoline Wagner, Cristina Reguant Departament de Bioquímica i Biotecnologia, Facultat d’Enologia, Universitat Rovira i Virgili. C/ Marcel·lí Domingo 1, Campus Sescelades N4, 43007 Tarragona. [email protected] Oenococcus oeni es la principal especie responsable de la fermentación maloláctica (FML) del vino. Durante la FML, O. oeni está expuesto a varios tipos de estrés. Algunos de los mecanismos de respuesta al estrés ya han sido estudiados en O. oeni, pero se sabe poco acerca de otros sistemas de protección, tales como el par tiorredoxina / tiorredoxina-reductasa. Este sistema está involucrado en la protección contra el estrés oxidativo y podría desempeñar un papel en la respuesta a la oxidación de componentes celulares causada por el etanol del vino. En este trabajo se evaluó, en 25 cepas de O. oeni aisladas de vino, la presencia de los diferentes genes de tiorredoxina (trxA) y tiorredoxina-reductasa (trxB) descritos en los genomas ya publicados de esta especie. También se estudió la expresión relativa de estos genes por medio de PCR en tiempo real, para comprender el papel de los diferentes loci que supuestamente codifican para la misma función. Nuestros resultados mostraron la presencia de dos trxA (trxA_1625, trxA_1702) y dos genes trxB (trxB_0566, trxB_0163) en las cepas analizadas. No había diferencias intraespecíficas en la composición de los genes trx y todas las cepas analizadas contenían los genes trxA y trxB. En cuanto a la expresión relativa de los genes trx, mostraron un nivel diferente de expresión durante el crecimiento. Esto sugiere que algunos genes trx serían más importantes para el mantenimiento del equilibrio redox que otros. Por otra parte, también se observaron diferencias entre cepas, lo que sugiere que algunas cepas pueden tener un sistema de trx más activo para mantener el equilibrio redox. Palabras clave: Oenococcus, vino, estrés, maloláctica, tiorredoxina, tiorredoxina-reductasa.


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19. Estudio proteómico y trascriptómico de la respuesta de Lactobacillus plantarum WCFS1 a compuestos fenólicos. Inés Reverón1, José Antonio Curiel1, Héctor Rodríguez1, Monique Zagorec2, Marie Champomier-Vergès2, Blanca de las Rivas1, Rosario Muñoz1 y Félix López de Felipe1 1Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición, ICTAN-CSIC, Madrid. 2INRA MICALIS, UMR1319, FLEC, Jouy en Josas, France. [email protected] Los compuestos fenólicos son un grupo de metabolitos que han atraído una considerable atención debido a su influencia en las características sensoriales de los alimentos y en la salud animal y humana. Como modelo para el estudio de la interacción entre compuestos fenólicos y bacterias lácticas se ha elegido Lactobacillus plantarum, cultivo iniciador predominante en diversas fermentaciones vegetales y presente en el tracto gastrointestinal, dos nichos en los que abundan los compuestos fenólicos. Para estudiar la respuesta de Lactobacillus plantarum a los diferentes compuestos fenólicos hemos estudiado los perfiles de expresión global mediante un análisis proteómico y transcriptómico. Se ha estudiado la respuesta y adaptación de L. plantarum WCFS1 a ácido tánico mediante el estudio del perfil proteómico por electroforesis bidimensional. Se consideró una respuesta diferente cuando la diferencia entre la intensidad de las proteínas fue igual o mayor a dos. Se observó que en presencia de 1 mM de ácido tánico se alteró significativamente el perfil de 22 proteínas sobre un total de 350 proteínas aproximadamente. Las proteínas se identificaron mediante espectrofotometría de masas y se agruparon en tres categorías principales: biosíntesis de pared celular, estrés oxidativo y procesos de transcripción/traducción. Para el análisis de transcripción global en respuesta a la presencia de compuestos fenólicos se han utilizado micromatrices de DNA diseñadas por nuestro grupo y que incluyen 15.741 sondas específicas y controles de referencia. Se consideró que un gen se expresaba diferencialmente frente al compuesto utilizado cuando el cambio en la intensidad de la señal fue igual o mayor a 2. Se analizaron los genes que se expresaban diferencialmente en respuesta a la presencia de 1.5 mM de los ácidos gálico y p-cumárico. En respuesta a ácido gálico mediante este análisis se detectaron 14 genes que se expresaban diferencialmente, de los cuales 10 estaban inducidos y 4 reprimidos. En el caso del estudio en presencia del ácido p-cumárico se observa una alteración mayor en el perfil de expresión génica, identificándose 280 genes que se expresan diferencialmente (144 inducidos y 136 reprimidos) los cuales están incluidos en 15 categorías funcionales. Palabras clave: L. plantarum; proteómica; ácido tánico; transcriptómica; ácido gálico; ácido cumárico


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20. Análisis de la respuesta a bilis de Lactobacillus casei BL23 mediante análisis transcriptómico y proteómico. Cristina Alcántara; Amalia Blasco; Manuel Zúñiga. Laboratorio de Bacterias Lácticas y Probióticos (IATA, CSIC) Avda Agustín Escardino 7, 46980 Paterna (Valencia). [email protected] La capacidad de resistir la acción de las sales biliares es un carácter crucial para la supervivencia en el tracto gastrointestinal. Lactobacillus casei es un componente de la microbiota intestinal de los seres humanos y algunas cepas de esta especie han sido descritas como probióticos. Con el objeto de estudiar el proceso de adaptación de Lb. casei al habitat intestinal, se ha estudiado la respuesta de Lb. casei BL23 ante la exposición a sales biliares en medio sintético mediante análisis transcriptómico y proteómico. Para el análisis transcriptómico se utilizó una macromatriz en la que están representadas 2390 ORFs. Los resultados obtenidos se verificaron mediante ensayo de diez genes por RT-qPCR. El análisis proteómico se realizó mediante electroforesis bidimensional de las fracciones soluble y de membrana de extractos libres de células. Las proteínas con expresión significativamente diferente fueron identificadas mediante huella peptídica. El análisis transcriptómico permitió detectar 27 genes inducidos y 40 reprimidos en presencia de bilis. Por su parte, el análisis proteómico permitió detectar 54 proteínas en la fracción de membrana y 27 en la fracción soluble con diferencias significativas. Los resultados obtenidos mostraron que la exposición a bilis provoca cambios importantes en la fisiología de Lb. casei. Entre los genes o proteínas detectados se encontraron genes implicados en procesos de transporte, respuesta a estrés, metabolismo de lípidos, producción de energía, metabolismo de nucleótidos, división celular, etc. Los cambios observados afectaron especialmente al repertorio de transportadores de Lb. casei: 13 genes reprimidos y 7 inducidos en el análisis transcriptómico y 3 y 7 en el proteómico. Otros cambios notables observados fue la inhibición de los genes implicados en la biosíntesis de ácidos grasos y la acumulación en la fracción de membrana de la subunidad delta de la ATPasa F0F1. Palabras clave: Lactobacillus casei, bilis, respuesta a estrés, proteómica, transcriptómica


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21. El principio y el fin de una muerte programada: el represor del ciclo lisogénico y la lisina el fago A2. Juan Evaristo Suárez, Susana Escobedo y Pedro Ribelles. Área de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, c/Julián Clavería 6, 33006 Oviedo. E-mail: [email protected] Los bacteriófagos que atacan a las cepas iniciadoras son la principal causa de fallos en las fermentaciones lácteas. Por ello, los fagos que infectan a las bacterias del ácido láctico son probablemente los mejor conocidos de cuantos atacan a bacterias Gram positivas. En nuestro grupo hemos dedicado una especial atención al fago A2, que infecta cepas de Lactobacillus casei y L. paracasei. A2 pertenece a la familia Siphoviridae (cápsida isodiamétrica y cola larga no contráctil) es atemperado y presenta un genoma de ADN en doble cadena con 43.411 nucleótidos, en el que se han identificado 61 orfs. En dicho genoma el gen cro codifica para una proteína de 81 aminoácidos que se une al promotor del gen cI e impide su transcripción. Como consecuencia, CI no puede reprimir la expresión viral y el fago entra en un ciclo lítico. Además del polipéptido canónico, cro da lugar a un segundo producto que carece de los 12 aminoácidos últimos, que se origina por desplazamiento de parte de los ribosomas a la pauta -1, durante la traducción del correspondiente RNAm. Para determinar cuál podría ser efecto fenotípico de este polipéptido construimos una cepa de L. casei lisogénica para un fago mutante, que sintetiza solo la forma canónica de Cro. Dicha cepa genera progenies mayores y más rápidamente de lo que lo hace la que alberga al fago silvestre, indicando que la forma truncada de Cro compite con la canónica y dificulta la represión del promotor de cI de modo que, en su ausencia, aumenta la proporción de células que siguen el ciclo lítico y disminuye el periodo de latencia. Al final del ciclo lítico viral se generan dos proteínas, la holina y la lisina, destinadas a provocar la ruptura de la célula hospedadora y la liberación de la progenie fágica. La holina forma poros en la membrana celular, a través de los que la lisina alcanza la pared e hidroliza el peptidoglicano. La lisina del fago A2 es una endopeptidasa que rompe el enlace entre cadenas adyacentes de peptidoglicano, concretamente a nivel de un residuo de ácido aspártico que liga el aminoácido lisina de uno de los tetrapéptidos con la D-alanina del otro. Dicho ácido aspártico parece ser esencial para el reconocimiento del sustrato, de manera que el enzima solo se une (y lisa) a células que presentan este tipo de peptidoglicano. Esto incluye a Lactococcus lactis, a todos los lactobacilos excepto L. plantarum y a Pediococcus spp, pero no a Leuconostoc, Streptococcus y otras bacterias Gram positivas. Durante la exposición se discutirán algunas aplicaciones potenciales de la lisina de A2.


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22. Análisis de la fuerza de los promotores del cluster as-48 en Lactococcus lactis. Sonia Rodríguez-Ruano, Rubén Cebrián, Manuel Montalbán, Eva Valdivia, Manuel Martínez-Bueno, Mercedes Maqueda* Dpto de Microbiología, Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. C/ Fuentenueva s/n 18071-Granada. * [email protected] Resumen El objetivo de este trabajo ha sido evaluar la fuerza de los promotores del cluster as-48 en Lactococcus lactis, empleando el vector promoterless pNZ272 de amplio rango de hospedador, con un sitio de clonación múltiple que permite la fusión con el gen gusA. La valoración de la expresión de la actividad glucuronidasa en las diferentes construcciones, nos permitirá comprobar si la ausencia de expresión de AS-48 observada en lactococos es debida a la falta de reconocimiento de los promotores (Fernández et al., 2007). Además se comprobará la ausencia de promotores en la región intergénica as-48A/as-48BC propuesta por Fernández et al. (2008), así como la influencia de la inserción XhoI en dicha región. Metodología a) La amplificación de los fragmentos conteniendo los promotores PA, P2 y P3 se ha realizado mediante PCR, usando cebadores específicos que hibridan parcialmente con el ADN molde y que incluyen en sus extremos sitios de restricción adecuados. Como molde se empleó el plásmido pAM401-81. Para la construcción con P32 usada como control, se empleó el vector pMG36e (van de Guchte et al., 1989).

b) Para verificar la ausencia de promotores en la región intergénica entre los genes as-48A y as-48BC se han realizado cuatro fusiones traduccionales que arrancaban desde el propio promotor PA (construcciones L) o desde la mitad del gen as-48A (construcciones S), que se denominaron respectivamente 81 ó X, en función de que contuvieran o no el sitio XhoI en la región intergénica. En ambos casos las diferentes construcciones clonadas en vector pNZ272 han sido transferidas a las cepas JH2-2 y LM2301, libres de plásmidos, con el fin de valorar la fuerza de los diferentes promotores clonados mediante un ensayo colorimétrico de actividad β glucuronidasa, empleando como referencia la actividad del promotor P32 Resultados

Los resultados obtenidos demuestran la expresión de todos los promotores ensayados en lactococos, así como la importancia de la inserción del sitio Soy. Confirman así mismo, la ausencia de promotores en a región intergénica as-48A/as-48BC de acuerdo con los valor


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23. Vectores de fusión transcripcional para regiones promotoras uni- y bidireccionales de bacterias lácticas García-Cayuela T1, Pérez-Gómez de Cadiñanos L1, Mohedano ML2, Fernández de Palencia P2, Boden D3, Wells J4, Peláez C1, López P2, Requena T1* 1Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL, CSIC-UAM). Nicolás Cabrera, 9. 28049 Madrid. 2Centro de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC). Ramiro de Maetzu 9. 28040 Madrid. 3Janssen Pharmaceutica Turnhoutseweg 30 / B108, 2340 Beerse, Belgium 4Host-Microbe Interactomics, Wageningen University, P.O. box 338, 6700 AH Wageningen, The Netherland. *[email protected] Los genes que codifican proteínas fluorescentes son ideales para ser empleados como marcadores en la evaluación de expresión génica y para un amplio rango de procedimientos de biología molecular. En este estudio se han construido vectores con dos genes que codifican proteínas autofluorescentes como marcadores para el análisis de expresión y regulación de regiones promotoras divergentes en bacterias lácticas (BAL). Para la construcción de los vectores se han clonado, en orientación divergente, el gen sintético mrfp que codifica una proteína fluorescente monomérica, que ha sido optimizado en codones para la expresión en bacterias lácticas, y el gen gfp que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) mejorada procedente de pGreenTIR. Los plásmidos tienen un amplio espectro de huésped ya que contienen los orígenes de replicación procedentes de los plásmidos pA15 y pCT1138 y pueden replicarse tanto en BAL como en Escherichia coli. La utilidad de los vectores de fusión transcripcional se ha demostrado mediante la clonación de regiones promotoras uni- y bi-direccionales y la determinación de fluorescencia durante el crecimiento de Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis y E. coli. Los clones se detectaron fácilmente por la coloración roja, verde y marrón adquirida por las colonias en las placas de agar en función de la expresión de mrfp, gfp y de ambos genes, respectivamente. La producción in vivo de mRFP y GFP durante el crecimiento bacteriano se midió por espectrofluorimetría y densidad óptica. Mediante microscopía de fluorescencia se pudieron detectar las bacterias que expresaban los marcadores fluorescentes tanto en cultivos mixtos como mediante estudios de interacción de las bacterias con cultivos de líneas celulares humanas. La ventaja del uso de los vectores desarrollados en este estudio es que se puede evaluar la actividad de regiones reguladoras divergentes mediante medida de fluorescencia simultáneamente de dos proteínas fluorescentes y durante el crecimiento celular. Este trabajo es el primer estudio de vectores que contienen mRFP y GFP como marcadores divergentes y que son funcionales en BAL. Palabras clave: mRFP, GFP, vector de fusión transcripcional, región promotora divergente, bacterias lácticas.


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24. Eukaryotic Antimicrobial Peptide Production by Recombinant Lactic Acid Bacteria. Rogier Gaiser1, Begoña Giménez2, Pilar Fernández de Palencia1, Pilar Montero2, and Paloma López1

1Centro de Investigaciones Biológicas (CIB). Ramiro de Maeztu nº 9, 28040 Madrid 2Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTIAN). José Antonio Novais, 10 28040 Madrid. e.mail [email protected] Eukaryotic antimicrobial peptides (EAP) play a major role as the first chemical barrier against invading pathogens, providing primary immune protection to the host. Broad-spectrum activity, constitutive expression or fast induction and absence of immunological memory are their characteristic features. Generally the peptides are amphipathic, contain 13-45 amino acid residues and have a net positive charge; while they are structurally very heterogenous. Disruption and permeabilization of the target plasma membrane is believed to be essential in EAP activity. Our group, in collaboration with the group of Dr. Pilar Montero (ICTIAN), is exploring the use of lactic acid bacteria (LAB) for delivery of functional EAPs to the human digestive tract. On one hand, we set out to optimize the production and secretion of EAP by Lactococcus lactis as a biofactory. Expression of Histatin-5, a histidine-rich human EAP from saliva, which possesses strong antifungal activities has been analyzed. A synthetic gene containing optimized codons for L. lactis in multicopy state is being used. To induce expression of the gene, the NICE system was employed. To drive peptide secretion, the hst5 sequence was fused to the coding sequence of the lactococcal usp-45 signal peptide. Western blot analysis on both whole cell lysates and culture supernatants was performed to detect the histatin. We also undertook the development of probiotic LAB with increased resistance to selected EAPs, To this end, we are using the bacterial strains Lactobacillus acidophilus LA-5 and Bifidobacterium lactis BB12, both with GRAS-status, and the human antimicrobial peptide cathelicidin (LL-37), a positively charged peptide containing 37 amino acid residues and having potent activity against E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, amongst others. By culturing the bacteria in the presence of increasing concentrations of the EAP, we aim to select for more resistant mutants. We propose that LAB with increased resistance to EAPS will enhance their survival and their ability to compete with pathogens in the human digestive tract. Administration of LAB with improved gut colonization and capability to secrete human antimicrobial peptides, may be a therapeutic application for patients with faulty EAP production. Palabras clave: Eukaryotic antimicrobial peptides, probiotics, Lactobacillus acidophilus, histatin 5, LL-37


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25. Producción de pigmentos carotenoides por cepas de Lactobacillus plantarum. A. Maldonado Barragán, J. Garrido Fernández, B. Caballero Guerrero, H. Lucena Padrós, D. Hornero Méndez, J. L. Ruiz Barba. Instituto de la Gracas-CSIC; Avda Padre García Tejero, 4; 41012 Sevilla [email protected] Hemos encontrado que un cierto número de cepas de la especie Lactobacillus plantarum de diversos orígenes son capaces de producir de forma natural pigmentos carotenoides. Mediante análisis cromatográfico y espectrometría de masas, el carotenoide detectado mayoritariamente es el 4.4'-diaponeurosporeno, de coloración amarilla y perteneciente a la ruta C30 de síntesis de estos compuestos. Se detectaron también los carotenoides precursores de esta ruta biosintética 4-4'-diapo-zeta-caroteno y 4-4'-diapofitoflueno. La producción de diaponeurosporeno dependió de la cepa productora y estuvo comprendida entre 1.8 y 54 mg por kg de peso seco. Estos carotenoides son de carácter hidrofóbico y se hallan alojados en la membrana plasmática de las células productoras, por lo que hay que extraerlos de pellets celulares mediante disolventes orgánicos como N-N-dimetilformamida por un protocolo que se ha optimizado para este fin. Estudios por PCR utilizando primers diseñados a partir de la secuencia del genoma completo de L. plantarum WCFS1 mostraron que todas las cepas productoras contenían el operón crtNM, descrito anteriormente en Staphylococcus aureus. En esta especie, los genes crtM y crtN codifican, respectivamente, diapofitoeno sintasa y diapofitoeno desaturasa que son enzimas intermedios en la ruta de biosíntesis de estafiloxantina, el pigmento carotenoide "dorado" característico de esta especie. En S. aureus se ha demostrado que la biosíntesis de carotenoides aumenta la resistencia a una serie de condiciones de estrés, especialmente el oxidativo, así como al ataque de neutrófilos. El reconocido carácter antioxidante de los pigmentos carotenoides podría representar una ventaja selectiva para aquellas cepas de BAL que se prevean utilizar como agentes probióticos o bien como inóculos en fermentaciones de alimentos. A fin de testar esta hipótesis, hemos construido vectores suicidas adecuados para integrarse específicamente en cada uno de los genes de producción de carotenoides detectados en L. plantarum y generar los mutantes KO correspondientes. Posteriormente se compararán los fenotipos de parejas de cepas parental/mutante y se evaluará el papel que la producción de carotenoides pueda tener en la supervivencia de cepas de BAL usadas como probióticos o como cultivos iniciadores. Palabras clave: Lactobacillus plantarum, pigmentos, carotenoides, antioxidante, probiótico, mutagénesis, cultivos iniciadores.


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26. Utilización y síntesis de fucosil-oligosacáridos naturales por tres α -L-fucosidasas aisladas de Lactobacillus casei. Jesús Rodríguez-Díaz, Vicente Monedero y María Jesús Yebra Centro, Institución, dirección: Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Av. Agustín Escardino 7, 46980 Paterna [email protected] La L-fucosa es uno de los monosacáridos más comunes presente en el extremo no reductor de los grupos glicosídicos de las superficies celulares en mamíferos, mucina intestinal, antígenos sanguíneos y oligosacáridos de leche humana. Los fucosil-oligosacáridos (FUCOS) están implicados en una gran variedad de procesos biológicos, tales como la adhesión celular, la colonización de la microbiota simbiótica del tracto gastrointestinal, y son receptores para la unión de algunas bacterias patógenas y virus. Debido a ello, las α-L-fucosidasas, que son exo-glicosidasas que hidrolizan los residuos de L-fucosa presentes en los FUCOS, podrían desempeñar funciones importantes, desde la degradación de oligosacáridos como fuente de energía y carbono hasta la modificación de los glicoconjugados en las superficies celulares. Se han clonado tres genes, alfA, alfB y alfC, presentes en el genoma de Lactobacillus casei BL23, que codifican para tres α-L-fucosidasas diferentes. Estas han sido purificadas y han mostrado actividad sobre p-nitrofenil-α-L-fucopiranosido (pNP-fuc). Los enzimas han sido caracterizados y han presentado actividades diferentes que dependen del tipo del enlace y de la longitud del oligosacárido. AlfA hidroliza únicamente 6’-fucosil-GlcNAc, con una actividad específica baja comparada con su Vmax cuando se utiliza como substrato el pNP-fuc. AlfB fue capaz de hidrolizar el disacárido del antígeno H, el trisacárido tipo II del antigeno H, 3’-fucosil-GlcNAc, 4’-fucosil-GlcNAc y el oligosacárido de leche humana 2’-fucosil-Lactosa. AlfC hidroliza 6’-fucosil-GlcNAc con una actividad específica que fue varias órdenes de magnitud más alta que para otros enlaces, incluyendo el disacárido del antigeno H, 3’-fucosil-GlcNAc y 4’-fucosil-GlcNAc. La síntesis de FUCOS utilizando la capacidad de transfucosilación de las α-L-fucosidasas de L. casei también se ha ensayado. AlfB y AlfC han sido capaces de catalizar la síntesis de cantidades altas de 3’-fucosil-GlcNAc y 6’-fucosil-GlcNAc, respectivamente, por transferencia de un residuo fucosil desde el pNP-fuc a la GlcNAc. Palabras clave: oligosacáridos, fucosidasas, Lactobacillus


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27. Secuenciación y análisis del cluster eps de Bifidobacterium animalis subsp. lactis IPLA-R1 y estructura de su exopolisacárido de alto peso molecular. Claudio Hidalgoa, Borja Sáncheza, Shaun Leiversb, Glenn Robinsonb, Andrew P. Lawsb, Abelardo Margollesa y Patricia Ruas-Madiedoa

a Departamento de Microbiología y Bioquímica, Instituto de Productos Lácteos de Asturias - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IPLA-CSIC), Carretera de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, España b Departamento de Químicas y Ciencias Biológicas, Universidad de Huddersfield, Reino Unido [email protected]

Los exopolisacáridos (EPS) sintetizados por bifidobacterias en el tracto gastrointestinal humano parecen tener un efecto protector para la bacteria productora dado que, en algunos casos, la producción de EPS es inducible ante la presencia de bilis. Además, los EPS de bifidobacterias son capaces de modular la microbiota intestinal humana, pudiendo ejercer efectos beneficiosos para la salud del hospedador. Hemos llevado a cabo un análisis in silico de los 15 genomas disponibles de bifidobacterias en el momento del estudio. Comprobamos que la presencia de clusters eps, implicados en la síntesis de heteropolisacáridos, podría ser un carácter ubicuo en el género Bifidobacterium, ya que están presentes en todas las especies analizadas (B. adolescentis, B. animalis subp. lactis, B. dentium, B. longum subsp. longum y B. longum subsp. infantis) con la excepción de B. bifidum. Posteriormente, secuenciamos y analizamos el cluster eps de la cepa B. animalis subsp. lactis IPLA-R1 (54.259 pb) destacando la presencia de varios genes implicados en la síntesis de ramnosa. Procedimos a la caracterización físico-química del EPS producido por esta cepa, detectándose la presencia de dos fracciones de distinto peso molecular. El polímero de alto peso molecular (HMW-EPS) se compone de residuos L-ramnopiranosil, D-glucopiranosil, D-galactopiranosil y D-galactofuranosil en un ratio 3:1:1:1 y la unidad de repetición es un hexasacárido.

Palabras clave: Bifidobacterium, exopolisacáridos (EPS), cluster eps, glicosiltransferasa, NMR-estructura EPS.


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28. Producción de heteropolisacáridos por cepas de Lactobacillus aisladas de sidra. Ibarburu1, A. I. Puertas1, A. Irastorza1, S. Notararigo2, P. Fernández de Palencia2, P. López2, A. Prieto2, y M. T. Dueñas 1

1Departamento de Química Aplicada, Facultad de Ciencias Químicas. Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Paseo Manuel de Lardizabal, 3, San Sebastián, España. 2Departamento de Microbiología Molecular y Biología de las Infecciones. Centro de Investigaciones Biológicas, C.S.I.C., Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid, España. [email protected] Nuestro grupo ha estudiado en los últimos años la producción de exopolisacáridos (EPS) por bacterias lácticas aisladas de sidras ahiladas. Hemos encontrado que todas las cepas pertenecientes a la especie Pediococcus parvulus sintetizan 2-ramificado-(1®3)-β-D-glucanos idénticos al que es sintetizado por P. parvulus 2.6 (Dueñas et al. 1997), y poseen el gen gtf implicado en la síntesis de este homopolisacárido. Sin embargo, Lactobacillus diolivorans G-77 y Oenococcus oeni I4 producen además de este β -glucano un (1®6)-α-D-glucano y dos heteropolisacáridos (HePS), respectivamente. Este trabajo tiene como objetivo detectar cepas productoras de heteropolisacáridos, examinar su producción y analizar algunas características fisicoquímicas de estos polímeros. Todos los aislados HePS+ pertenecen al género Lactobacillus. Algunas estirpes de la especie L. suebicus sintetizan heteropolisacáridos y el β -glucano. Además, hemos aislado cepas de las especies L. suebicus, L. paracollinoides/collinoides y L. vini que carecen del gen gtf y producen heteropolisacáridos. Hemos determinado los monosacáridos que constituyen los EPSs de las cepas L. suebicus CUPV226 y L. suebicus CUPV225 mediante GLC-MS de los metil glucósidos trimetilsililderivados. Ambos HePSs están constituidos por galactosa, glucosa, N-acetilglucosamina y ácido fosfórico en distintas proporciones. El análisis mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HP-SEC) mostró que estas cepas sintetizan exopolisacáridos de elevada masa molecular, del orden de 106 Da. Así mismo, examinamos la influencia del pH inicial y del tipo de carbohidrato (glucosa, L-arabinosa, ribosa, xilosa y maltosa) sobre el crecimiento y la producción de EPS, y se obtuvo el mejor rendimiento con xilosa. Palabras clave: Lactobacillus, exopolisacáridos, heteropolisacáridos


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29. Estudio genético y funcional de las enzimas implicadas en la degradación de galotaninos en Lactobacillus plantarum. José Antonio Curiel1, Héctor Rodríguez1, Gloria Fernández-Lorente2, Inés Reverón1, José Manuel Guisán2, José Luís Ruiz-Barba3, Blanca de las Rivas1 y Rosario Muñoz1

1Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos y Nutrición, CSIC, Madrid. 2Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, Madrid. 3Instituto de la Grasa, CSIC, Sevilla [email protected] Lactobacillus plantarum es la principal especie de bacteria láctica utilizada en la elaboración de alimentos fermentados de origen vegetal, los cuales presentan un elevado contenido en compuestos fenólicos. Durante los últimos años nuestro grupo se ha dedicado al estudio del metabolismo de compuestos fenólicos utilizando como modelo la especie L. plantarum debido a su capacidad para degradar galotaninos. El metabolismo de galotaninos en L. plantarum implica la acción consecutiva de dos actividades enzimáticas. La enzima tanasa (esterasa de ácido gálico) convierte los galotaninos en ácido gálico, el cual por la acción posterior de una enzima con actividad galato descarboxilasa, se convierte en pirogalol, producto final de la degradación de galotaninos en L. plantarum. En nuestro grupo hemos caracterizado genética y funcionalmente ambas enzimas. Mediante la interrupción del gen que codifica la enzima tanasa, se ha demostrado que L. plantarum WCFS1 posee una única enzima con esta actividad. La enzima tanasa se ha hiperproducido, purificado con alto rendimiento, caracterizado bioquímicamente y determinado su especificidad sobre ésteres de los ácidos gálico y protocatéquico. La disponibilidad de un método adecuado de producción e inmovilización de esta enzima ha permitido la mejora de su estabilidad y de sus características bioquímicas haciéndola más adecuada para su uso industrial. También se ha identificado la segunda enzima implicada en la degradación de galotaninos, la enzima galato descarboxilasa. Esta enzima cataliza también la descarboxilación del ácido protocatéquico a catecol. Se ha realizado un análisis transcripcional de los genes que codifican ambas enzimas en respuesta a la presencia de diversos substratos relacionados con la degradación de galotaninos. Al contrario de lo que ocurre con la enzima tanasa, presencte únicamente en L. plantarum, la enzima galato descarboxilasa se encuentra en otras especies de bacterias lácticas. Palabras clave: L. plantarum; taninos; tanasa; galato descarboxilasa; ácido gálico; compuestos fenólicos.


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30. Impacto metabólico del plásmido bacteriocinogénico pBL1 en Lactococcus lactis. Ana B. Campelo1, Paula Gaspar2, Clara Roces1, Ana Rodríguez1, Ana Rute Neves2 y Beatriz Martínez1. 1 Grupo DairySafe, IPLA-CSIC. 33300 Villaviciosa-Asturias. 2 ITQB-UNL, Oeiras, Portugal. [email protected] pBL1 es un plásmido tipo theta de 10.9 kpb que codifica toda la información necesaria para la síntesis de la bacteriocina Lcn972. En pBL1 se distinguen dos dominios claramente diferenciados y limitados por secuencias de inserción. Uno de ellos es responsable de las funciones de replicación y mantenimiento plasmídico y el otro de la producción de Lcn972. La región bacteriocinogénica está compuesta por orf4 que codifica una proteína de función desconocida y el operón lcn972 constituido por el gen estructural y orfB y orfC que, presumiblemente, codifican un transportador ABC implicado en la imunidad a Lcn972. pBL1 se ha transformado en L. lactis MG1363 utilizando como selección la propia bacteriocina. De hecho, los transformantes son capaces de producir Lcn972 y son immunes a la misma. Salvo esta propiedad, no se observó ningún otro fenotipo atribuible a pBL1. Sin embargo, estudios transcripcionales revelaron cambios de expresión génica como respuesta a la presencia de pBL1. Entre los genes inducidos se detectó el sistema de transporte de oligopéptidos opp y entre los reprimidos el componente IIC del sistema PTS de celobiosa celB. La represión de celB se ha relacionado directamente con la presencia de pBL1. La tasa de crecimiento de L. lactis en CDM-celobiosa es menor en presencia de pBL1 y similar a la que se observa con un mutante Δ celB. Además, los cultivos con pBL1 presentan un perfil de fermentación mixta más acusado y se detectó por NMR acumulación de intermediarios glucolíticos. Todos estos datos demuestran un impedimento en la incorporación de celobiosa. También se ha observado que, en presencia de pBL1, disminuye el pool de azúcares activados y se acumulan precursores de la síntesis de pared celular indicando un posible direccionamiento del metabolismo hacia la síntesis de polímeros estructurales o de almacenamiento. De hecho, los cultivos con una menor tasa de crecimiento en celobiosa son más resistentes a Lcn972. Por esta razón, postulamos que la represión de celB podría actuar como señal para activar un mecanismo de defensa frente a la actividad antimicrobiana de Lcn972. Palabras clave: bacteriocinas, Lcn972, metabolismo, NMR, transcriptómica.


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31. El genoma de Lactobacillus casei BL23 codifica cuatro sortasas. Construcción de mutantes y caracterización. Diego Muñoz-Provencio, Carmen Collado y Vicente Monedero Laboratorio de Bacterias Lácticas y Probióticos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos. IATA-CSIC, Paterna, Valencia. [email protected] El genoma de Lactobacillus casei BL23 contiene dos genes que codifican sortasas de tipo A (srtA1 y srtA2) y dos de tipo C (srtC1 y srtC2), estos dos últimos asociados con los genes de sus sustratos potenciales. Se han identificado un total de 23 posibles substratos de estas sortasas que poseen una secuencia de anclaje a la pared celular que no se desvía sustancialmente del consenso LPXTG. En su mayoría se trata de proteínas con posible actividad enzimática o con un probable papel en la interacción con la mucosa del huésped. Entre ellas cabe destacar proteínas constituyentes de pili específicos para la unión de mucus descritos en L. rhamnosus GG, que son ensamblados por sortasas de tipo C. El análisis por Southern blot y de secuencias de genomas en bases de datos indica que srtA1, srtC1 y srtC2 son comunes a multitud de cepas de L. casei-L. rhamnosus, mientras que srtA2 sólo está presente como un pseudogen en L. casei ATCC334 y en localización plasmídica en L. rhamnosus Lc705. Se han construido mutantes simples en las cuatro sortasas y un doble mutante srtA1/srtA2. La mutación en srtA1 produce una drástica reducción de la hidrofobicidad de la superficie celular. Los ensayos de actividad N-acetilglucosaminidasa y proteinasa de pared (dos proteínas con secuencia de anclaje por sortasa) y de la presencia en superficie de una fusión NucA-M6 muestran que la mutación en srtA1 causa una disminución de la cantidad de estas proteínas en superficie. Esta disminución es más acusada en el doble mutante srtA1/srtA2. De igual manera, el mutante srtA1/srtA2 muestra el efecto más acusado en la unión a las líneas epiteliales intestinales Caco-2 y HT-29. Sin embargo, el mutante srtA1/srtA2 no presenta cambios sustanciales en el perfil de proteínas de superficie determinado por electroforesis bidimensional. Los resultados sugieren que SrtA1 es la sortasa principal encargada del anclaje en superficie de la mayoría de las proteínas con secuencia LPXTG. SrtA2 jugaría un papel redundante o complementario que sólo se evidencia tras la mutación en srtA1. Palabras clave: Sortasa, motivo LPXTG, adhesión

IV. INTERACCIÓN BACTERIAS LÁCTICAS/HUÉSPED

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32. Moonlighting functions of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum. Irene González1, Borja Sánchez1, Lorena Ruiz1, Francesca Turroni2, Marco Ventura2, Miguel Gueimonde1, and Abelardo Margolles1.

1. Grupo de Probióticos, Prebióticos y Exopolisacáridos. Instituto de Productos Lácteos de Asturias, Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Ctra Infiesto s/n, 33300, Villaviciosa, Asturias. 2. Laboratory of Probiogenomics. Department of Genetics, Biology of Microorganisms, Anthropology and Evolution, University of Parma. [email protected] En el presente estudio se caracterizaron genotípica y fenotípicamente 13 cepas de la especie Bifidobacterium bifidum. Así mismo, se determinó su capacidad de adhesión a la línea celular intestinal HT29 y el fenotipo de autoagregación. Se seleccionaron 4 cepas de las que se obtuvieron las proteínas asociadas a la superficie celular y se realizaron experimentos de unión de dichas proteínas a mucina, comprobando que una de ellas, identificada como transaldolasa, presentaba un alto grado de afinidad por la mucina. Se clonó el gen de la transaldolasa, de la cepa B. bifidum A8, en Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000, usando dos vectores diferentes: pNZ8110, que contiene la secuencia del péptido señal de la proteína USP45, obteniendo el clon L. lactis NZ9000 SecTal+ y pNZ8048, en el que se introdujo el gen de la transaldolasa con una cola de histidina, obteniendo el clon L. lactis NZ9000 TalH+. Se determinó la unión de la cepa L. lactis NZ9000 SecTal+ a mucina, observándose una mayor capacidad de adherencia que la cepa control. Se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo frente a la transaldolasa y mediante inmunomarcaje se determinó que una fracción de la transaldolasa se localiza en la superficie de la cepa A8. Palabras clave: Bifidobacterium bifidum, transaldolasa, adhesión, agregación.


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33. Análisis de la mucosa intestinal en un modelo in vitro y valoración de las propiedades inmunomoduladoras de β-glucanos producidos por bacterias ácido lácticas.

Sara Notararigo11, Alicia Prieto1, Angel L. Corbí1, David Sancho2 Paloma López1 y Pilar Fernández de Palencia1

1 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Melchor Fernández Almagro 3, 28029 Madrid [email protected] Los exopolisacáridos (EPS) sintetizados por bacterias poseen diversas funciones que incluyen reconocimiento e interacción celular, adherencia a superficies y formación de biofilms. Los beneficios de los EPS producidos por bacterias ácido lácticas (LAB) en el sabor/textura de alimentos fermentados son bien conocidos, siendo los efectos el reflejo de sus estructuras químicas, ya que en la naturaleza existen EPS lineales, ramificados y cíclicos. Con anterioridad hemos mostrado que el gen gtf de Pediococcus parvulus 2.6 codifica la glicosiltransferasa GTF responsable de la síntesis de (1→3)-β-glucano con ramificaciones 1→2 (1). Asimismo, hemos demostrado que dos estirpes de Pedioccocus productoras de dicho biopolímero son capaces de inmunomodular macrófagos humanos (2,3) y que la presencia de sus EPS potencia la habilidad de las bacterias para unirse a células epiteliales del intestino humano (2,3). Sin embargo, todavía no hay evidencias concluyentes de que estas biomoléculas tengan propiedades prebióticas y/o inmunomoduladoras. En este trabajo hemos purificado los EPS producidos por estirpes silvestres y recombinantes portadoras del gen gtf con el objetivo de caracterizar su potencial inmunomodulador y sus propiedades anti-inflamatorias. Los EPS fueron obtenidos a partir de sobrenadantes de cultivos bacterianos por precipitación con etanol, y purificados por cromatografía de exclusión molecular (SEC) usando Sepharose CL6B equilibrada con NaOH 0,3 M. Los EPS eluyeron como un pico único, y fueron retenidos en la columna sólo parcialmente, indicando una masa molecular superior a 1000 kDa. El análisis de contaminantes en las preparaciones de EPS reveló la ausencia de RNA, DNA o proteínas. La determinación de la reducción extracelular del XTT a formazán por NADH producido en la mitocondria por la vía de transporte de electrones trans-membrana plasmática y por un mediador de electrones, reveló que el EPS no tiene efectos tóxicos sobre células epiteliales intestinales humanas. El análisis de la influencia del β -glucano en la producción de citoquinas por macrófagos humanos mostró un aumento de la proporción IL-10/TNF-α, indicando un efecto anti-inflamatorio. Finalmente, utilizando la línea celular B3Z transfectada establemente con la construcción quimérica Dectin 1-CD3zeta, se comprobó que el receptor Dectin-1 específico de β-glucanos no está implicado en el reconocimiento de este (1→3)-β-glucano ramificado. Referencias: (1) Werning et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:5259-5262, (2) Fernández de Palencia et al. 2009. Appl. Environ. Microbiol. 75:4887-4891; (3) Garai-Ibabe et. al. 2010. Bioresource Technol. 101:9254–9263. Palabras clave: exopolisacáridos, β-glucanos, inmunomodulación


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34. Papel de los exopolisacáridos de bifidobacterias y lactobacilos en el ambiente intestinal: estudios in vitro. Patricia Ruas-Madiedo, Nuria Salazar, Miguel Gueimonde, Abelardo Margolles y Clara G. de los Reyes-Gavilán Instituto de Productos Lácteos de Asturias - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IPLA-CSIC), Departamento de Microbiología y Bioquímica, Carretera de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, España. [email protected]

Los exopolisacáridos (EPS) de bacterias lácticas (BAL) y bifidobacterias son polímeros de carbohidratos que se localizan en la superficie extracelular a la que están unidos de forma más o menos estable. Las BAL productoras de EPS de origen alimentario han sido ampliamente estudiadas debido a la relevancia tecnológica de sus polímeros. En nuestro grupo hemos aislado lactobacilos y bifidobacterias productoras de EPS del ecosistema intestinal, por lo que suponemos que la síntesis de estos polímeros podría conferir una ventaja selectiva para la bacteria productora en este nicho ecológico.

i) Los EPS estarían implicados en la supervivencia a las condiciones adversas de tracto gastrointestinal (TGI) superior (pH ácido y sales biliares). Utilizando un modelo simulado del tránsito TGI, empleando jugo gástrico e intestinal humano, hemos constatado que las cepas de bifidobacterias productoras de EPS son capaces de sobrevivir en mayor porcentaje. Además, la bilis induce la síntesis de EPS en Bifidobacterium animalis subsp. lactis, al igual que se ha descrito para otras bacteria Gram-negativas y Gram-positivas.

ii) Los EPS estarían involucrados en la colonización del TGI inferior. Algunas cepas de bifidobacterias productoras de EPS muestran alta adherencia a modelos in vitro de células del epitelio intestinal humano, mientras que, en otros casos, la presencia de polímeros purificados tanto de bifidobacterias como lactobacilos dificulta a adhesión a mucus intestinal humano. Esto sugiere que en el escenario de interacción entre las bacterias productoras de EPS y el hospedador, las características físico-químicas del polímero y superficiales de la bacteria productora serían determinantes a la hora de interaccionar con la mucosa intestinal.

iii) Los EPS modularían la microbiota intestinal. Los EPS, tipo heteropolisacárido, aislados de bifidobacterias y lactobacilos intestinales son capaces de modificar la dinámica de la microbiota intestinal humana al ser empleados como sustratos fermentables por la misma ejerciendo, además, un efecto bifidogénico. Finalmente, algunos de estos EPS son capaces de contrarrestar el efecto citotóxico de toxinas bacterianas sobre células intestinales Caco2, probablemente mediante el bloqueo de sus receptores en la célula eucariota o actuando como agentes secuestradores de la toxina.

El siguiente reto será demostrar estas hipótesis y si se produce síntesis de EPS in vivo.

Palabras clave: Exopolisacáridos (EPS), tracto gastro-intestinal, líneas celulares intestinales


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35. Lactobacillus casei y Lactobacilus plantarum reducen la expresión de genes proinflamatorios en fragmentos de colon humano. Christine Bäuerl1, Marta Llopis2, María Antolín2, Manuel Mata3, Vicente Monedero1, Francisco Guarner2 y Gaspar Pérez Martínez1* Dep. Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Paterna, Valencia, 2) Dep. de Gastroenterología, Hospital Vall d’Hebron, Barcelona, y 3)Fundación Hospital General Universitario, Valencia. [email protected] A determinados lactobacilos se les atribuyen efecto antiinflamatorio o de inducción de la respuesta inmune, sin embargo se desconocen los procesos moleculares implicados. En este trabajo se ha utilizado un sistema de co-cultivo ex vivo de fragmentos de colon humano con lactobacilos probióticos para determinar cambios en la expresión génica mediante Microarrays de DNA humano. El análisis de los datos mostró que aunque durante el tratamiento experimental se inician procesos de muerte celular, éstos no afectan al patrón de expresión de genes relacionados con procesos inflamatorios. También se ha podido demostrar que probióticos como Lactobacillus casei BL23 y Lactobacillus plantarum 299v, son capaces de contrarrestar de forma global el estímulo proinflamatorio inducido por PMA/IO, restaurando la homeostasis, y de reducir significativamente los niveles de expresión de importantes citoquinas y quimioquinas (IL-2, IFN-γ, IL-17A, CXCL9, CXCL11) y otros mediadores proinflamatorios (TNFRSF4, TNFRSF9, IRF1, GZMB). Esto se puede deber a la represión primaria de IFN-g y de la señalización vía JAK/STAT. La disminución de expresión de IL-2 y IL-2RA sugiere que los lactobacilos probablemente reducen significativamente el número de linfocitos T activados. Se han podido detectar diferencias entre distintas cepas de lactobacilos, aunque estas no afectan a moléculas efectoras de inflamación. Palabras clave: Lactobacillus, explantes intestinales, microarrays, inflamacíon


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36. Bacterias lácticas aisladas de leche humana y VIH: inhibición de la transfección dependiente de DC-SIGN de células T humanas. Grupo Probilac (coordinador: Rodríguez, J.M.) Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. Avda. Puerta de Hierro, s/n. 28040 Madrid En la reunión anterior, se presentaron los resultados obtenidos tras analizar la actividad anti-VIH de 38 cepas bacterianas aisladas de leche humana. Entre las cepas que mostraron mayor actividad frente a aislados primarios de VIH-1 con tropismo por los co-receptores CXCR4 (HC4) y R5/X4 (C7/86) destacaron Lactobacillus salivarius VM5, Lactococcus lactis VM17 y Streptococcus salivarius VM18.

S. salivarius VM18 destacaba por su capacidad para producir un exopolisacárido (EPS). Dado que el EPS podría permitir a esta bacteria competir con el VIH por los mismos receptores de las células dendríticas, los objetivos de este trabajo fueron la caracterización parcial del EPS producidos por S. salivarius VM18 y la evaluación de su potencial para inhibir la transfección de células T humanas mediante DC-SIGN. Se obtuvieron dos preparaciones de EPS a partir de S. salivarius VM18, una tras su fermentación en caldo BHI (EPS) y la segunda en caldo BHI complementado con sacarosa (Sac-EPS). Tanto EPS como SacEPS inhibieron la unión del VIH-1 a DC-SIGN pero la inhibición mostrada por EPS fue notablemente más eficiente ya que los valores de IC50 fueron de 0,01799 y 2,684 mg/mL para EPS y SacEPS, respectivamente. En conclusión, el EPS de S. salivarius VM18 parece tener un gran potencial para inhibir la infectividad del VIH-1. No obstante, existen todavía algunas incertidumbres sobre su composición, aspecto en el que se está trabajando actualmente en colaboración con la Dra. Patricia Ruas Madiedo (IPLA).

Por otra parte, se intentó valorar el posible papel de la nisina Z producida por L. lactis VM17 empleando el mismo tipo de ensayo pero los resultados no fueron concluyentes por una falta de reproducibilidad. Finalmente, se están estudiando los fenómenos de mimetismo molecular que podrían mediar la actividad anti-VIH de Lactobacillus salivarius VM5.


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37. Implicaciones de probióticos microencapsulados en el crecimiento y desarrollo de ratones con cáncer de colon. Iván Benito1, Francisco C. Ibáñez1, María Alfaro1, María Chávarri2, María del Carmen Villarán2, Paloma Torre1, Florencio Marzo1 1Laboratorio de Fisiología Animal y Nutrición. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. Universidad Pública de Navarra. Campus Arrosadia, 31006, Pamplona (Navarra). 2 Bioprocesses and Preservation Area, Tecnalia Research & Innovation, Parque Tecnológico de Álava, c/Leonardo Da Vinci nº11, 01510 Miñano (Álava). [email protected] El cáncer colorrectal es el tercer tipo de cáncer con mayor prevalencia en hombres y el segundo en mujeres, siendo el cuarto tipo de tumor que más muertes provoca. La modulación de la microbiota intestinal mediante probióticos puede ser una aplicación de interés en la prevención y tratamiento del cáncer de colon. El objetivo del trabajo es estudiar el efecto de una alimentación suplementada con probióticos microencapsulados sobre el crecimiento y desarrollo de ratones con cáncer de colon (ApcMin/+), en especial sobre algunos signos asociados al desarrollo de la enfermedad, como son peso corporal, alteración de órganos y sangrado intestinal. La administración de los probióticos en forma de microcápsulas añadidas a la dieta tiene como fin proteger a las bacterias durante su transito gastrointestinal y aumentar la supervivencia de las mismas. Se usaron 36 ratones, distribuidos en tres grupos: C1, ratones C57BL6/J alimentados con dieta estándar como grupo control salvaje; C2, ratones C57BL6/J ApcMin alimentados con dieta estándar; y E1, ratones C57BL6/J ApcMin alimentados con dieta estándar suplementada con microcápsulas de Lactobacillus gasseri y Bifidobacterium bifidum a concentración 107 ufc/100g de dieta. El período experimental fue de 10 semanas. Se registró la ingesta diariamente y el peso corporal semanalmente. Se analizó la presencia de sangre oculta en heces en la 1ª y 9ª semana mediante el test Hemoccult® Sensa® (Beckman). Al finalizar el experimento, se sacrificaron los animales y se obtuvieron diferentes órganos (timo, hígado, bazo, testículos, colon, yeyuno, tejidos grasos y músculo gastrocnemio) que se congelaron para posteriores análisis. El grupo C2 presentó un peso corporal menor a lo largo del experimento, que fue significativo (p≤0,05) respecto del grupo C1 al final del mismo. El grupo E1 tuvo un peso corporal similar, aunque menor, al grupo C1 durante todo el período, sin diferencias significativas respecto a C1 ni a C2. El alimento ingerido a lo largo del período experimental fue similar en todos los grupos experimentales. Esto pone de manifiesto que la velocidad de crecimiento no se relaciona con una disminución de la ingesta, y más bien podría estar relacionada con alteraciones de la absorción intestinal o incrementos del gasto energético. El peso del hígado y del bazo se incrementa significativamente (p≤0,05) en los grupos C2 y E1 respecto del grupo C1. Se observó una reducción significativa en los depósitos grasos de los grupos C2 y E1, en comparación del grupo C1, la reducción fue mayor en el grupo C2. No se observó sangre oculta en las heces del grupo C1. Por el contrario, se detectó sangre en las heces de todos los animales ApcMin/+, esto pone de manifiesto el desarrollo de la neoplasia en los mismos. A lo largo del período experimental, se


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incrementa la cantidad de sangre en heces en los grupos C2 y E1, siendo mayor en el grupo C2. Palabras clave: Lactobacillus, Bifidobacterium, cáncer, colon, ratón, APC, microencapsulado


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38. Efecto de los probióticos Lactobacilus gasseri y Bifidobacterium bifidum en líneas celulares de adenocarcinoma de colon. María Alfaro1, Iván Benito1, Francisco C. Ibáñez1, Paloma Torre1, Ignacio Encío2, Florencio Marzo1 1Laboratorio de Fisiología Animal y Nutrición. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. 2Departamento de Ciencias de la Salud. Universidad Pública de Navarra. Escuela Universitaria de Ciencias de la Salud. Universidad Pública de Navarra. Campus Arrosadia, 31006, Pamplona (Navarra). [email protected] El cáncer colorrectal es el tercer tipo de cáncer con mayor prevalencia en hombres y el segundo en mujeres, siendo el cuarto tipo de tumor que más muertes provoca. Existen evidencias de los efectos beneficiosos que tiene la administración de probióticos sobre el intestino y su microflora, evitando la colonización por bacterias patógenas y protegiendo frente a lesiones preneoplásicas y procesos inflamatorios. En el presente trabajo se ha estudiado el efecto de dos cepas probióticas (Lactobacillus gasseri y Bifidobacterium bifidum) sobre la proliferación celular, apoptosis, y diferentes fases del ciclo celular utilizando las líneas celulares HT-29 y Caco-2 de adenocarcinoma de colon humano. La línea HT-29 son células derivadas de un tumor primario de cáncer de colon de grado II, y la Caco-2 son células derivadas de un tumor primario de cáncer de colon de grado I. El estudio de proliferación celular se ha realizado mediante el ensayo del MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol), que permite determinar la funcionalidad mitocondrial y viabilidad de las células. Las líneas celulares se expusieron a diferentes concentraciones (106, 5x106, 107, 5x107, 108 ufc/ml) de nuestras cepas probióticas L. gasseri y B. bifidum durante diferentes tiempos de exposición (24 y 72 horas). La apoptosis y del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo por el método TUNEL. Estos análisis se realizaron en la línea celular HT-29 expuesta a cada una de las cepas probióticas durante un periodo de 24 horas. Los resultados obtenidos demuestran que tras la exposición de las líneas celulares a las diferentes concentraciones de cada uno de los probióticos y durante 24 y 72 horas, no presentan efectos citotóxicos. Esto supone la supervivencia de la mayoría de las células. Por otra parte, la línea celular HT-29 tratada con diferentes concentraciones de probióticos durante 24 horas no presentó ninguna modificación significativa en los niveles de apoptosis, ni en las fases de su ciclo celular. Palabras clave: Lactobacillus, Bifidobacterium, HT-29, Caco-2, cáncer, colon


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39. Susceptibilidad de la microbiota intestinal a extractos fenólicos comerciales obtenido del vino. Carolina Cueva1, Begoña Bartolomé1, Irene Bustos1, Teresa Requena1, M.Victoria Moreno-Arribas1, Rosa del Campo2 1Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CSIC-UAM), Campus de la Universidad Autónoma de Madrid. C/Nicolás Cabrera 9, Madrid, 28049. 2Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y Cajal e IRYCIS. Ctra.Colmenar km 9.1, Madrid, 28034 [email protected] Introducción y Objetivo. En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos estudios para conocer el papel de la microbiota intestinal sobre la salud del hospedador y las interacciones entre ambos. Entre las funciones de dicha microbiota, destacan la de nutrición, modulación del sistema inmune, resistencia a la colonización de patógenos, desarrollo del epitelio intestinal y recuperación de energía metabólica. Uno de los factores que más influyen en la composición y variabilidad de la microbiota intestinal es la dieta, y por tanto, es importante conocer si la ingesta de determinados alimentos podría modificar la composición de dicha microbiota. El objetivo planteado en este trabajo fue evaluar la susceptibilidad y/o tolerancia de la microbiota intestinal humana frente a dos extractos fenólicos comerciales obtenidos a partir de vino. Material y Métodos. Se utilizaron dos extractos fenólicos comerciales, uno procedente de pepita de uva y otro de vino tinto y 36 heces de voluntarios gastrointestinalmente sanos. Para determinar el efecto de los extractos sobre la microbiota intestinal, se procedió de la siguiente manera: 1 g de cada muestra se solubilizó en 10 ml de solución salina y se recogieron tres alícuotas de 2700 µl en tubos estériles. Cada una de las alícuotas se puso en contacto con 300 µl de extracto de fenólico de vino (10 mg/ml), 300 µl extracto fenólico de pepita de uva (10 mg/ml) y 300 µl agua estéril (control). Todos los tubos se incubaron durante 3 horas a 37ºC y después se sembraron alícuotas de 100 µl en medios de cultivo selectivos (MRS, Manitol Salt, Mac Conckey y M-Enterococcus) e inespecíficos (Sangre de Carnero, TSA) suplementados con 1 mg/ml de los extractos fenólicos. Tras la siembra, las placas se incubaron a 37ºC durante 18 horas, y transcurrido este tiempo se realizó un recuento de colonias y se procedió al aislado de aquellas bacterias sensibles/resistentes a los extractos. La identificación de dichas bacterias a nivel de especie se realizó mediante espectofotometría de masas (MALDI-TOF) con el aparato MALDI Biotyper (Fco. Soria Melguizo, Madrid), y cuando fue necesario, se confirmó la identificación de la bacteria mediante secuenciación del gen 16S rADN.

Posteriormente se analizó la susceptibilidad de todos los aislados obtenidos, tanto en presencia como en ausencia de polifenoles, a los extractos comerciales mediante la técnica de dilución en agar, conociendo de este modo la concentración mínima inhibitoria (CMI) para cada aislado. Resultados. Cada uno de los dos extractos fenólicos estudiados difiere en su modo de actuación sobre los diferentes grupos bacterianos de la microbiota intestinal. Así, el extracto de pepita de uva, a la concentración estudiada (1 mg/ml), presenta un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de las enterobacterias, bacterias lácticas, enterococos y estafilococos. Por el contrario, el extracto de vino tinto a la misma concentración, estimula el crecimiento de los enterococos y de las bacterias lácticas, mostrando a su vez una clara inhibición de las bacterias gram-negativas y los estafilococos.

Mediante dilución en agar se ha estudiado la susceptibilidad de 145 aislados gram-negativos (132 E. coli, 2 Enterobacter, 4 Klebsiella, 1 Raoultella ornithinolytica, 1 Shigella, 2 Weissella, 3 Citrobacter) y 118 gram-positivos (3 Anaerococcus, 13 E.


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faecalis, 79 E. faecium, 7 Enterococcus spp, 1 Lactobacillus sakei, 2 Lactobacillus garviae, 1 Leuconostoc, 2 Micrococcus luteus, 9 Staphylococcus, 1 Streptococcus). Los resultados indican una mayor susceptibilidad en los aislados gram-positivos (CMI50=1-4 mg/ml) que en los gran-negativos (CMI50=8-≥10 mg/ml) para ambos extractos, siendo más activo el extracto fenólico obtenido a partir de pepitas de uva. Conclusiones. Se ha evidenciado un comportamiento diferente de las bacterias gram-positivas con respecto a las gram-negativas frente a los extractos fenólicos obtenidos a partir del vino. Estos son los primeros datos que existen sobre la modulación de la microbiota intestinal por el vino, demostrando el potencial efecto modulador sobre la microbiota intestinal. Palabras clave: Polifenoles, vino, microbiota intestinal, susceptibilidad y/o tolerancia.


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40. Impacto de la obesidad y sobrepeso materno en las poblaciones de bacterias lácticas y bifidobacterias presentes en la leche materna. M.C. Collado IATA-CSIC, Grupo de Bacterias Lácticas y Probióticos, Av. Agustin Escardino 7, 46980 Paterna, Valencia, España [email protected] La prevención de la obesidad y sobrepeso infantil es una prioridad actual debido al increíble aumento de esta epidemia, además del riesgo de que persista en la edad adulta. Recientes estudios sugieren que alteraciones en la microbiota desde muy temprana edad podrían contribuir, como un efecto más, junto con otros factores geneticos y/o ambientales, en el desarrollo de la obesidad y en otras enfermedades. La microbiota neonatal es un complejo ecosistema bacteriano con actividades relacionadas con la nutrición, metabolismo y estimulación del sistema inmune que afectan al desarrollo infantil, y está influenciada por diversos factores tales como la microbiota materna, tipo de parto, tipo de lactancia y los niveles de higiene. Alteraciones en la microbiota materna asociados al peso y a la ganancia de peso durante el embarazo podrían ser transferidas al neonato mediante el parto y/o a través de la lactancia, favoreciendo el desarrollo de microbiota alteradas en el neonato y su consecuente efecto en su salud a corto y largo plazo. Además, la leche materna contiene componentes inmunológicos y factores pre- y probióticos que influyen en el desarrollo de la microbiota y en la maduración del sistema inmune de los neonatos favoreciendo la prevención de infecciones gastrointestinales y otros desordenes incluida la obesidad. Todo ello, hace necesario la investigación sobre el impacto de microbiota presente en la leche materna durante la lactancia en el desarrollo de la microbiota neonatal y su papel en la obesidad y sobrepeso. Para ello, hemos caracterizamos la composición de la microbiota mediante técnicas moleculares como PCR cuantitativa presentes en las muestras de leche materna durante distintas etapas en la lactancia y además, en función del índice de masa corporal (IMC) y peso materno. Palabras clave obesidad, bifidobacterias, bacterias lácticas, lactancia


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41. Establecimiento y desarrollo de la microbiota intestinal en niños prematuros. Silvia Arboleya; Ana Binetti; Nuria Salazar; Nuria Fernández; Gonzalo Solís; Ana Hernández-Barranco; Abelardo Margolles; Clara G. de los Reyes-Gavilán; Miguel Gueimonde. Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA). Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Ctra. Infiesto, s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias. [email protected] El perfil de la microbiota intestinal de los niños alimentados con leche materna, es considerado el estándar de una microbiota intestinal beneficiosa y una referencia para el desarrollo de fórmulas infantiles. La colonización microbiana del tracto gastrointestinal del recién nacido constituye un proceso clave para la futura salud del individuo. El establecimiento de esta microbiota proporciona señales para el adecuado desarrollo del intestino y la maduración del sistema inmune, contribuyendo a la correcta función barrera frente a microorganismos patógenos y sustancias tóxicas presentes en la dieta. En niños prematuros, debido al uso frecuente de antibióticos y a las largas estancias en el hospital, este proceso está alterado. Para ayudar a un adecuado desarrollo de la microbiota intestinal en estos niños es necesario un buen conocimiento del proceso de colonización y establecimiento de la microbiota así como de las diferencias con los niños nacidos a término. Se estudió el establecimiento de la microbiota intestinal en niños prematuros (n=21) durante los tres primeros meses de vida y se comparó con la de niños nacidos a término, por parto natural y alimentados exclusivamente con leche materna (n=20) usando métodos cuantitativos y cualitativos independientes de cultivo (qPCR, PCR-DGGE). Se observaron importantes diferencias en la composición de la microbiota intestinal entre ambos grupos. Los niños prematuros mostraron elevados niveles de microorganismos facultativos, niveles reducidos de anaerobios, como Bifidobacterium y Bacteroides, y niveles más elevados de microorganismos patógenos en comparación con los niños nacidos a término. La diversidad microbiana y la concentración de AGCC analizados en heces mediante CG fueron menores en los niños prematuros durante los primeros días de vida. Nuestros resultados pusieron de manifiesto profundas alteraciones en el proceso de establecimiento de la microbiota intestinal en niños prematuros, lo cual apoya la necesidad de implementar estrategias de intervención dietética dirigidas a corregir dichas alteraciones. Palabras clave: Microbiota intestinal; niños prematuros; lactantes.

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ÍNDICE DE AUTORES Autores Resumen nº

Abriouel, H 5,9,10 Alcántara, C 20 Alegría, A 6 Alfaro, M 37,38 Álvarez, MA 8 Antolín, M 35 Arahal D.R. 1 Araque, I 16 Arboleya, S 41 Aymerich, T 3,11 Aznar, R 4 Bartolomé, B 12,39 Bäuerl, C 35 Benito, I 37,38 Benomar, N 5 Binetti, A 41 Blasco, A 20 Boden D, 23 Bordas, M 16 Bordons, A 16,18 Bustos, I 39 Caballero Guerrero, B 25 Caballero, N 10 Campelo, AB 30 Cebrián, R 22 Champomier-Vergès, M 19 Chávarri, M 37 Clermont D. 1 Collado, MC 40 Collado, C 31 Corbí, AL 33 Cueva, C 39 Curiel, JA 19,29 de las Rivas, B 19,29 de los Reyes-Gavilán, C G 34,41 De Vos P. 1 del Campo, R 39 Delgado, S 6 Diez, L 17 Dueñas, MT 28 Encío, I 38 Escobedo, S 21 Fernández de Palencia, P 4,23,24,28,33 Fernández-Lorente, G 29 Fernández, E 6 Fernández, M 8 Fernández, MA 9 Fernández, N 41 Ferrer, S 2,15

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Flórez, AB 6 Gaiser, R 24 Gálvez, A 5,9,10 García-Cayuela T 23 García-Ruiz, A 12 García, MP 8 Garrido Fernández, J 25 Garriga, G. 3 Garriga, M 11 Gaspar, P 30 Gaya, P 7 Giménez, B 24 González-Rompinelli, E 12 González, I 32 Grande, MJ 10 Guarner, F 35 Gueimonde, M 32 Gueimonde, M 34, 41 Guija, A 15 Guisán, JM 29 Haro Blasco, Lidia 2 Hernández-Barranco, A 41 Hidalgo, C 27 Hornero Méndez, D 25 Ibáñez, FC 37,38 Ibarburu, I 28 Irastorza, A 28 Izquierdo PM 14 Jofré, A 11 Ladero, V 8 Lavilla, L 9 Laws, AP 27 Leivers, S 27 Llopis, M 35 López de Felipe, F 19 López, MC 10 López, P 4, 23,24,28,33 Lucas, R 5,10 Lucena Padrós, H 25 Maldonado Barragán, A 25 Maqueda, M 22 Margolles, A 27,32,34,41 Martín, B. 3 Martín, MC 8 Martínez Cañamero, M 5 Martínez-Bueno, M 22 Martínez-Cuesta, MC 12 Martínez, B 30 Marzo, F 37,38 Mata, M 35 Mayo, B 6

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Mohedano ML, 4,23 Monedero, V 26,31,35 Montalbán, M 22 Morales, P 7,24 Moreno-Arribas, MV 12,39 Moreno, MI 14 Muñoz-Provencio, D 31 Muñoz, R 19,29 Nácher-Vázquez, M 4 Nieto Arribas, P 14 Noriega, A 6 Notararigo, S 4,28,33 Núñez, M 7 Ortega, E 9,10 Palop, Ll 14 Pardo, I 2,15 Peláez C, 23 Pérez Martín, F 14 Pérez Martínez, G 35 Pérez Pulido, R 9,10 Pérez-Gómez de Cadiñanos L, 23 Picón, P 7 Prieto, A 4,28,33 Puertas, AI 28 Reguant, C 16,18 Requena, T 12,39,23 Reverón, I 19,29 Ribelles, P 21 Robinson, G 27 Roces, C 30 Rodríguez-Bencomo, JJ 12 Rodríguez-Díaz, J 26 Rodríguez-Ruano, S 22 Rodríguez, A 30 Rodríguez, H 19,29 Rodríguez, JM 17 Rojo-Bezares, B 17 Rozès , N 16 Ruas-Madiedo, P 27,34 Rubio, R. 3 Ruiz-Barba, JL 25,29 Ruiz-Larrea, F 17 Ruiz, L 32 Rute Neves, A 30 Ruvira M.A. 1 Salazar, N 34,41 Sánchez, A 9 Sánchez, B 27,32 Sánchez, G 4 Sancho, D 33 Schumann P. 1

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Seseña, S 14 Solís, G 41 Suárez, JE 21 Torre, P 37 Torre, P 38 Torres, C 17 Turroni, F 32 Valdivia, E 11,22 Ventura, M 32 Villarán, MC 37 Wagner, K 18 Wells J, 23 Yebra, MJ 26 Zagorec, M 19 Zarazaga, M 17 Zúñiga, M 20,35

participación de las bacterias la calidad...

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