pC13-35S-Intron-Sma: VEKTOR BINER FLEKSIBEL UNTUK

EKSPRESI GEN TARGET SECARA KONSTITUTIF PADA

TRANSFORMASI TANAMAN MELALUI AGROBACTERIUM

NATALIA LUSIANNGSIH SUMANTO

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul pC13-35S-Intron-

Sma: Vektor Biner Fleksibel untuk Ekspresi Gen Target Secara Konstitutif pada

Transformasi Tanaman Melalui Agrobacterium adalah benar karya saya dengan

arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada

perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya

yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam

teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Oktober 2015

Natalia Lusianingsih Sumanto

NIM P051130051

RINGKASAN

NATALIA LUSIANINGSIH SUMANTO. pC13-35S-Intron-Sma: Vektor Biner

Fleksibel untuk Ekspresi Gen Target Secara Konstitutif pada Transformasi

Tanaman Melalui Agrobacterium. Dibimbing oleh Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto,

M.Sc dan Dr. Sigit Purwantomo.

Teknik penyisipan gen target ke dalam tanaman menggunakan vektor alami

Agrobacterium telah menjadi hal rutin dalam perakitan tanaman transgenik. Bakteri

ini memiliki kemampuan dalam menyalin, memindahkan, dan menyisipkan daerah

T-DNA ke dalam kromosom tanaman yang berada pada vektor biner.

Vektor biner pC13-35S-Intron-Sma memungkinkan gen target yang

disisipkan pada situs SmaI (CCCGGG) diatur ekspresinya oleh promoter kuat 35S

dan terminator Nos untuk membentuk cassette ekspresi dengan cepat. Gen target

akan mendapat tambahan intron (cat1) di ujung 5’- dan 6 kali histidin di ujung

karboksil. Keberadaan intron untuk memastikan ekspresi gen target tidak berasal

dari Agrobacterium. Komponen 6 kali histidin dapat berfungsi sebagai penanda

untuk purifikasi dan deteksi pada tingkat protein.

Untuk mengetahui keberhasilan dari konstruksi pC13-35S-Intron-Sma

disisipkan gen enhanced green fluorescent protein (eGFP) pada situs SmaI

membentuk pC13-35S-Intron-eGFP dan ditransformasi ke padi varietas

Nipponbare menggunakan Agrobacterium EHA105. Infeksi dilakukan pada kalus

yang berumur lima hari dan ditanam pada media kultivasi. Pengamatan kalus

transforman yang berusia satu bulan setelah infeksi menunjukkan adanya sinyal

ekspresi eGFP dengan terbentuknya pendaran berwarna hijau di bawah sinar biru.

Hasil ini menunjukkan bahwa vektor biner pC13-35S-Intron-Sma dapat digunakan

untuk transformasi tanaman dengan Agrobacterium.

Kata kunci: vektor biner, eGFP, intron, Agrobacterium, transformasi tanaman

SUMMARY

NATALIA LUSIANINGSIH SUMANTO. pC13-35S-Intron-Sma: a flexible

binary vector for Agrobacterium-mediated constitutive expression of target gene in

plant. Supervised by Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc and Dr. Sigit

Purwantomo.

Insertion technique of foreign gene into plants using natural vector

Agrobacterium has become a routine practice to generate transgenic plants.

Agrobacerium has an ability to -copy, -move and -insert a DNA fragment from its

T-DNA region located in a binary vector into plant chromosome.

The binary vector pC13-35S-Intron-Sma allows a target gene to be inserted

in SmaI site (CCCGGG). The gene will be directed by a strong promoter 35S of

CaMV to create an expression cassette and get an intron (cat1) at 5’- end and a hexa

histidine at its carboxyl end. The presence of intron will assure the expression of

gene is derived from the plant but not Agrobacterium. Hexa histidine could serve

as Tag for protein purification and detection.

The enhanced green fluorescent protein (eGFP) was inserted at SmaI site of

pC13-35S-Intron-Sma to create pC13-35S-Intron-eGFP. This construct was used to

test the expression of the gene with additional intron driven by the 35S promoter.

The 5 days of early developed calli of Nipponbare rice were infected with

Agrobacterium EHA105 harboring pC13-35S-Intron-eGFP followed by 3 days co-

cultivation. Some calli in selection medium containing 50 mg L-1 hygromycin

showed eGFP expression at one month after infection. This result indicated that the

binary vector pC13-35S-Intron-Sma might be use for Agrobacterium-mediated

plant transformation.

Keywords: binary vector, eGFP, intron, Agrobacterium, plant transformation

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau

menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains

pada

Program Studi Bioteknologi

pC13-35S-Intron-Sma: VEKTOR BINER FLEKSIBEL UNTUK

EKSPRESI GEN TARGET SECARA KONSTITUTIF PADA

TRANSFORMASI TANAMAN MELALUI AGROBACTERIUM

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

NATALIA LUSIANINGSIH SUMANTO

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.si

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala

karunia-Nya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam

penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2014 hingga bulan Juli 2015

ini adalah pengembangan vektor biner pC1301 menjadi pC13-35S-Intron-Sma.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto,

M.Sc dan Bapak Dr. Sigit Purwantomo selaku pembimbing, atas segala arahan,

saran, dan solusi selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan tesis ini. Terima

kasih kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si selaku penguji luar komisi atas saran

yang diberikan pada ujian tesis. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih

kepada DIKTI atas program beasiswa unggulan tahun 2013/2014 yang telah

memberikan dana perkuliah selama studi penulis di IPB.

Terima kasih kepada Yuzer Alfico dan Anastasya Aliesa Hermoningtyas serta

rekan-rekan di laboratorium R&D PT. Wilmar Benih Indonesia atas motivasi dan

bantuan selama pelaksanaan penelitian. Terima kasih kepada teman-teman

seperjuangan Bioteknologi 2013 atas segala motivasi dan keceriaan selama masa

studi. Ungkapan terima kasih tak terhingga juga penulis sampaikan kepada Bapak,

Mama, serta seluruh keluarga, atas segala dukungan, doa, serta kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2015

Natalia Lusianingsih Sumanto

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

1 PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Tujuan Penelitian 2 Manfaat Penelitian 2 Ruang Lingkup Penelitian 2

2 TINJAUAN PUSTAKA 3

Transfer gen melalui perantaraan Agrobacterium tumefaciens 3

Sistem ekspresi vektor biner 4

Promoter 35S-Intron-Sma 4

Green fluoresence protein (eGFP) 5

3 METODE 5

Waktu dan Tempat Penelitian 5

Bahan 6

Alat 6

Amplifikasi fragmen DNA 6

Kloning frgamen DNA ke pGEM-T Easy 7

Konstruksi plasmid pC-13-35S-Intron-Sma 8

Transformasi Agrobacterium tumefaciens 8

Transformasi kalus padi Nipponbare 9

Isolasi DNA genom tanaman 9

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 10

Konstruksi vektor biner pC13-35S-Intron-Sma 10

Konstruksi pC13-35S-Intron-eGFP 11

Transformasi kalus Padi Nipponbare 12

Pembahasan 14

5 SIMPULAN DAN SARAN 17

Simpulan 17 Saran 17

DAFTAR PUSTAKA 18

RIWAYAT HIDUP 21

DAFTAR TABEL

1 Daftar primer yang digunakan dalam konstruksi vektor pC-35S-Intron-

Sma 6

DAFTAR GAMBAR

1 Struktur dasar T-DNA plasmid pCambia 1301 1 2 Struktur T-DNA plasmid biner fleksibel 2 3 Mekanisme transfer daerah T-DNA dari plasmid Ti Agrobacterium

tumefaciens ke dalam kromosom tanaman 3 4 Sistem ekspresi vektor biner 4 5 Konstruksi umum daerah T-DNA pada plasmid biner 4 6 Peta konstruksi plasmid pC13-35S-Intron-Sma 10 7 Hasil amplifikasi fragmen promoter 35S-Intron-Sma 10 8 Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pC13-35S-Intron-Sma 11 9 Hasil verifikasi koloni transforman yang membawa pGEM-eGFP 11

10 Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pC13-35S-Intron-eGFP 12 11 Hasil verifikasi koloni Agrobacterium yang membawa pC13-35S-Intron-

eGFP 12 12 Hasil pengamatan ekspresi gen eGFP 13 13 Hasil pengamataneEkspresi gen eGFP di kalus transforman 13

14 Hasil verifikasi penyisipan T-DNA pC13-35S-Intron-eGFP pada empat

galur kalus transgenik 14

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Teknik pemindahan dan penyisipan gen target ke dalam tanaman

menggunakan vektor alami Agrobacterium telah menjadi hal rutin dalam merakit

tanaman transgenik. Teknik ini merupakan teknik yang relatif ekonomis

dibandingkan dengan teknik lain seperti penembakan biolistik. Vektor biner

dibutuhkan untuk membawa cassette gen target ke inti dan menyisipkannya di

kromosom tanaman.

Salah satu vektor biner yang dapat diakses bebas adalah plasmid biner dari

Cambia yaitu pCambia 1301 (Gambar 1). Gen GUS (β-Glucuronidase) dapat

langsung digantikan oleh gen target untuk diekspresikan secara konstitutif di bawah

kendali promoter 35S, akan tetapi penggantian gen GUS mengakibatkan komponen

penting dari plasmid ini yaitu intron dan 6 kali histidin menjadi hilang.

Gambar 1 Struktur dasar T-DNA plasmid pCambia 1301

Keberadaan intron dapat digunakan untuk memastikan ekspresi gen tidak

berasal dari Agrobacterium melainkan dari tanaman. Beberapa intron yang telah

digunakan antara lain adalah intron hsp70 dari jagung (Pang et al. 1996), intron dari

gen katalase cat1 dari Ricinus communis (Ohta et al. 1990), dan intron gen ST-LS1

dari kentang (Vancanneyt et al. 1990). Intron gen katalase cat1 dipilih karena

ukurannya yang relatif kecil (190 pb) dan dapat digabungkan dengan gen penanda

GUS pada ujung 5’- (Ohta et al. 1990) atau diletakkan di tengah gen hphII (Wang

et al. 1997). Sehingga, kemungkinan besar intron ini dapat juga ditambahkan pada

ujung 5’- gen yang lain.

Keberadaan 6 kali histidin sebagai penanda penting untuk keperluan

purifikasi protein yang diekspresikan gen target. Di samping itu, keberadaan 6 kali

histidin sebagai penanda dapat digunakan untuk verifikasi ekspresi gen target pada

level protein. Pada protein dengan antibodi yang belum tersedia deteksi akan dapat

dilakukan dengan menggunakan antibodi untuk 6 kali histidin.

Gen enhanced green fluorescent protein (eGFP) digunakan untuk

memverifikasi proses intron splicing. Berbeda dengan gen GUS dan LUC

(Luciferase), GFP memiliki keunggulan yaitu tidak memerlukan substrat sehingga

deteksinya cukup menggunakan sinar biru dan tidak bersifat toksik terhadap sel

hidup serta stabil. Gen ini telah ditransformasi pada beberapa tanaman seperti padi

(Vain et al. 1997), tebu (Elliot et al. 1999), gandum (Jordan 2000) dan barley

(Holme et al. 2006).

2

Perumusan Masalah

Dalam penyisipan cassette gen target ke dalam kromoson tanaman salah

satu hal yang paling esensial adalah konstruksi plasmid yang membawa cassette

gen target tersebut. Namun, konstruksi plasmid membutuhkan waktu yang tidak

sebentar. Sehingga untuk mempermudah dan mempersingkat waktu dalam

konstruksi plasmid dibutuhkan plasmid fleksibel yang komponen-komponen pada

cassette tersebut dapat diubah-ubah secara mudah. Oleh karena itu, perlu

dikonstruksi plasmid biner fleksibel yang memiliki situs restriksi yang terbatas pada

daerah promoter, situs kloning tunggal untuk menyisipkan gen target serta

dilengkapi intron pada ujung 5’ dan 6 kali histidin pada ujung karboksil

(Gambar 2). Adanya plasmid biner fleksibel ini diharapkan dapat mempersingkat

waktu dalam mengkonstruksi plasmid dan tidak perlu mengkonstruksi plasmid baru

apabila ingin mengganti daerah promoter atau gen target.

Gambar 2 Struktur T-DNA plasmid biner fleksibel

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi plasmid biner fleksibel yang

dapat mengekspresikan gen target secara konstitutif yang dilengkapi dengan 6 kali

histidin sebagai penanda dan intron untuk memastikan bahwa ekspresi gen target

tidak berasal dari bakteri.

Manfaat Penelitian

Vektor biner fleksibel pC13-35S-Intron-Sma yang dikonstruksi dalam

penelitian ini merupakan vektor dasar yang dapat digunakan untuk

mengekspresikan gen target yang bersifat fungsional pada tanaman secara

konstitutif di bawah kendali promoter 35S atau promoter konstitutif lainnya seperti

OsAct2 dan OsGOS2 dengan menganti promoter 35S pada situs restriksi tertentu.

Ruang Lingkup Penelitian

Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi amplifikasi fragmen promoter

35S-Intron-Sma, subkloning fragmen 35S-Intron-Sma ke pGEM-T Easy (Promega),

konstruksi pC13-35S-Intron-Sma menggunakan pCambia 1301 sebagai dasar dan

verifikasi aktivitas promoter 35S dengan transformasi kalus padi Nipponbare.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA

Transfer gen melalui perantaraan Agrobacterium tumefaciens

Teknik transformasi gen ke dalam tanaman didasari oleh penemuan bakteri

tanah Agrobacterium tumefaciens yang merupakan patogen penyebab penyakit

crown gall di dalam jaringan luka pada berbagai tanaman dikotil. Bagian DNA

A. tumefaciens yang ditransfer ke dalam kromosom tanaman berupa T-DNA yang

berada dalam plasmid Ti yang berukuran besar (150-250 kb) (Rossi et al. 1998). Di

dalam nukleus T-DNA diintegrasikan ke dalam kromosom tanaman dengan cara

illegitimate recombination yaitu suatu mekanisme bergabungnya dua molekul

DNA yang tidak mempunyai homologi secara luas (Offringa et al. 1990). Pada

dasarnya A. tumefaciens memberikan respon kemotaksis terhadap senyawa fenol

yang dilepaskan oleh jaringan tanaman yang terluka dan bergerak menurut gradien

konsentrasi menuju sel yang terluka. Respon kemotaksis merupakan ekspresi

konstitutif dari gen-gen kromosomal A. tumefaciens yaitu chvA, chvB, pscA dan att

(Ziemienowicz 2000).

Kontak A. tumefaciens dengan senyawa acetosyringone yang dilepaskan

oleh tanaman yang terluka menginduksi transkripsi daerah vir pada plasmid Ti.

Acetosiryngone kemudian berinteraksi dengan virA dan menghasilkan sinyal

intraseluler oleh aktivasi virG. Gen virG yang teraktivasi kemudian mengaktifkan

gen virulen lainnya (virB, virC, virD dan virE). Induksi gen vir diikuti dengan

pengenalan sekuen pembatas 25 pb sebagai imperfect direct repeat/border

sequences yang mengapit T-DNA. Pembatas T-DNA kemudian dipotong oleh dua

protein yang dihasilkan oleh operon virD yaitu virD1 dan virD2 (Filichkin dan

Gelvin 1993), sehingga diperoleh daerah T-DNA yang akan ditransfer ke dalam

kromosom tanaman (Gambar 3).

Gambar 3 Mekanisme transfer daerah T-DNA dari plasmid Ti Agrobacterium

tumefaciens ke dalam kromosom tanaman (Filchkin dan Gelvin 1993)

4

Sistem ekspresi vektor biner

Transfer daerah T-DNA A. tumefaciens ke dalam kromosom tanaman

dilakukan dengan menggunakan vektor biner yang diperkenalkan oleh Hoekema

(1983). Gen-gen vir dan daerah T-DNA berada dalam plasmid yang berbeda

(Gambar 4). Selama kedua plasmid tersebut berada dalam Agrobacterium

tumefaciens yang sama, protein yang dihasilkan oleh gen vir dapat membantu

proses transfer daerah T-DNA ke dalam kromosom tanaman. Plasmid yang

mengandung daerah T-DNA disebut dengan vektor biner sedangkan plasmid yang

mengandung gen-gen vir disebut dengan vir helper. Pada proses transfer gen, vektor

biner lebih efisien karena memiliki ukuran yang lebih kecil, memiliki gen penanda

seleksi tanaman, situs pengenalan enzim retriksi, ori E. coli dan A. tumefaciens serta

gen resisten antibiotik (Lee et al 2007).

Gambar 4 Sistem ekspresi vektor biner. (A) Gen target berada terletak di daerah

T-DNA pada vektor biner; (B) Gen vir berada pada vir helper

(Lee et al. 2007)

Secara umum daerah T-DNA pada plasmid biner dikonstruksi sehingga

mengandung promoter yang mengendalikan ekspresi gen target di tanaman,

terminator sebagai daerah pengenalan RNA polimerase dalam menghentikan proses

transkripsi dan gen penanda seleksi tanaman (Gambar 5).

Gambar 5 Konstruksi umum daerah T-DNA pada plasmid biner

Promoter 35S-Intron-Sma

Promoter 35S merupakan promoter konstitutif yang bertanggung jawab

dalam mengendalikan transkripsi genom virus CaMV (Cauliflower Mozaic Virus)

yang menginfeksi kembang kol. Promoter 35S telah umum digunakan untuk

mengekspresikan gen target secara konstitutif pada tanaman karena tidak

dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dan jenis jaringan tanaman. Penggunaan

promoter 35S telah diaplikasikan dalam mengendalikan ekspresi gen sGFP secara

5

konstitutif pada Arabidopsis sp. (Niwa et al. 1999). Pada penelitian ini sekuen

promoter 35S didesain mengandung intron (intron cat1), situs kloning gen target

(SmaI) dan 6 kali histidin sebagai penanda.

Ciri khas struktur genom eukariotik adalah gen struktural yang tersusun dari

intron dan ekson. Ekson merupakan urutan DNA yang akan ditranskripsi menjadi

mRNA kemudian ditranslasi membentuk polipeptida sedangkan intron (intragenic

regions) merupakan urutan DNA yang tidak ikut ditranslasi dan akan dibuang pada

tahap pasca transkripsi (Bergman 2001). Walaupun intron merupakan bagian yang

tidak ditranslasi namun intron berperan dalam pengaturan sintesis protein. Intron

yang tidak terpotong pada mRNA mengakibatkan penyimpangan dalam ekspresi

gen. Setiap intron pada gen eukariotik memiliki situs pengenalan yakni kedua basa

pertama dari intron mengandung GU dan dua basa terakhir dari intron adalah AG

serta kotak TACTAAC. Keseluruhan urutan basa tersebut sangat penting sebagai

pengenalan enzim spliceosome untuk memotong intron dan menyambung ekson

secara tepat (Deutsch dan Long 1999). Penambahan intron dapat mencegah ekspresi

gen target di Agrobacterium.

Green Fluoresence Protein (GFP)

Protein GFP yang berasal dari Aequorea victoria merupakan salah satu jenis

gen reporter yang umum digunakan sebagai penanda dalam transformasi tanaman

(Cinelli et al. 2000). GFP adalah protein yang merupakan polimer dari 238 asam

amino dengan berat molekul sekitar 27 kD. GFP mengandung gugus yang disebut

chomophore yang berperan penting dalam menghasilkan pendaran hijau.

Chromophore ini adalah kelompok tiga residu asam amino di posisi 65 (Serin), 66

(Tirosin) dan 67 (Glisin). Ketika dipaparkan pada cahaya biru (395 nm) maka pada

gugus ini akan terjadi oksidasi sehingga energi yang diserap menyebabkan

elektron-elektron di dalam gugus ini tereksitasi dan menghasilkan pendaran

berwarna hijau (Heim et al. 1995). Dalam upaya meningkatkan ekspresi dari GFP

maka dilakukan mutasi pada asam amino penyusun protein tersebut. Mutasi residu

asam amino nomor 64 dari Fenilalanin menjadi Leusin dan residu asam amino

nomor 65 dari Serin menjadi Tirosin membentuk enhanced GFP (eGFP). Gen

eGFP memiliki pendaran lebih terang daripada GFP wildtype (Cormarck et al.

1996). Hal ini menyebabkan eGFP banyak digunakan sebagai gen penanda dalam

transformasi.

3 METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai September 2014 sampai Juni 2015 di

Laboratorium Biotechnology Research and Development (R&D) PT Wilmar Benih

Indonesia Cikarang, Bekasi, Jawa Barat.

6

Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media pertumbuhan

bakteri Luria Agar (tripton 1 g, ekstrak khamir 0.5 g, NaCl 1g dan agar bakteriologi

1.5 g) media Luria Bertani (tripton 1 g, yeast ekstrak 0.5 g dan NaCl 1g), agarosa

1% (Choice care), bufer TAE [Tris-Acetate-EDTA] (242 g Tris, 57.1 ml asam

asetat glasial, 100 ml EDTA 0.5 M) ethidium bromide, antibiotik ampisilin (100 mg

ml-1), kanamisin (25 mg ml-1), sefotaksim (100 mg ml-1), higromisin (15 mg ml-1),

rifampisin (15 mg ml-1), kloramfenikol (25 mg ml-1), QIAPrep Purification Plasmid

kit (Qiagen), QIAquick PCR purification gel kit (Qiagen), ddH2O, marker molekuler

1000 pb DNA ladder (Vivantis), VC 100 pb (Vivantis), 6x loading dye (Promega),

Escherichia coli TOP10 (Invitrogen), PCR Go Taq Green Master Mix (Promega),

enzim T4 ligase (New England Biolabs), bufer T4 DNA ligase 10x (New England

Biolabs), enzim restriksi (New England Biolabs), vektor kloning pGEM-T Easy

(Promega), vektor ekspresi pCambia 1301, primer, polybag, tanah berpasir, kalus

padi varietas Nipponbare, media N6D, acetosyringone (20 mg L-1),

2,4-D (2 mg L-1), etanol 70%, natrium hipoklorit dan air steril.

Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mesin thermocycler,

spektrofotometer, Geldoc UV Transilluminator (Biorad), NanoDrop 2000

(Invitrogen), sentrifus, microwave, inkubator bergoyang, autoklaf, vorteks,

waterbath, laminar air flow, oven, Genetic Analyzer ABI 3130, Tissue lyser

(Qiagen), cawan Petri, Erlenmeyer, tabung 1.5 ml, mikropipet dan tip.

Prosedur Penelitian

Amplifikasi fragmen DNA

Amplifikasi fragmen DNA menggunakan metode PCR dengan denaturasi

awal dilakukan selama 5 menit pada suhu 98oC, dilanjutkan dengan siklus PCR

yang terdiri dari denaturasi (30 detik 98oC), annealing (55oC selama 30 detik dan

pemanjangan primer (72oC dengan perhitungan 1 kb/menit) sebanyak 40 siklus).

Daftar primer yang digunakan untuk amplifikasi fragmen terlampir pada tabel 1.

Visualisasi produk PCR dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% (b/v)

dilanjutkan dengan pengamatan di bawah sinar UV.

Tabel 1 Daftar primer yang digunakan dalam konstruksi vektor pC-35S-Intron-Sma

No Primer Situs

restriksi Nama

Diamplifikasi

dari Nama plasmid

Ukuran

(pb)

1 35S-SE-EcoRI-F EcoRI 35S-Intron-Sma pC1301 pGem-35S-Intron-Sma 1020

2 Intron-extraAA-SmaI-R BstEII

3 eGFP-SmaI-EcoRV_F SmaI eGFP-SmaI pST2 pGem-eGFP 741

4 eGFP- SmaI-EcoRV _R SmaI

5 Ujung Intron_F eGFP

Verifikasi Agrobacterium transforman

yang mengandung T-DNA

pC13-35-Intron-eGFP

787 6 6xHis-TGA-BstEII-R

7

Kloning fragmen DNA ke pGEM-T Easy

Purifikasi fragmen

Fragmen DNA hasil PCR terlebih dahulu dikloning pada vektor pGEM-T

Easy (Promega). Fragmen hasil amplifikasi dipurifikasi menggunakan QIAquick

PCR purification gel kit (Qiagen). Gel agarosa yang mengandung fragmen DNA

yang diingiinkan dipotong dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan ditimbang.

Ditambahkan bufer QG sebanyak 3 kali berat gel kemudian diinkubasi 60oC, 10

menit. Sebanyak 500 µl campuran dimasukkan ke dalam spin column,

disentrifugasi 13000 rpm, 1 menit. Berturut-turut dimasukkan 750 µl bufer PE dan

500 µl bufer PB kemudian masing-masing disentrifugasi 13000 rpm, 1 menit.

Sebanyak 30 µl bufer EB ditambahkan dan disentrifugasi 13000 rpm, 1 menit.

Ligasi fragmen DNA ke pGEM-T Easy

Penyambungan fragmen menggunakan enzim ligase yang dilakukan

mengikuti Sambrook et al. (2001). Komposisi ligasi terdiri dari bufer T4 ligase,

vektor pGEM-T Easy, fragmen DNA, enzim T4 ligase dan ddH2O dengan volume

total 10 µl. Campuran diinkubasi pada suhu ruang semalaman.

Pembuatan Eschericia coli TOP10 kompeten

Pembuatan E. coli TOP10 kompeten menggunakan perlakuan CaCl2 dan

MgCl2 sesuai metode Tang et al. (1994) dengan beberapa modifikasi. Koloni

tunggal E. coli TOP10 dikultur di dalam 3 ml LB dan diinkubasi dalam inkubator

bergoyang 200 rpm, 37oC semalaman. Sebanyak 200 µl kultur dimasukkan ke

dalam 10 ml LB yang baru kemudian diinkubasi 200 rpm, 37oC sampai OD600=0.4.

Sebanyak 1.5 ml kultur dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml, disentrifugasi 5000

rpm, 4oC 1 menit dan dibuang supernatan. Pelet diresuspensi dengan 1 ml CaCl2

(20 mM CaCl2 dan 80 mM MgCl2) dan diinkubasi 20 menit dalam es. Campuran

disentrifugasi 5000 rpm, 4oC 1 menit dan dibuang supernatan. Pelet diresuspensi

kembali dengan 250 µl CaCl2 0.1 M kemudian diinkubasi 10 menit dalam es.

Sebanyak 100 µl gliserol 50% ditambahkan ke dalam campuran.

Transformasi Eschericia coli TOP10 Transformasi E. coli TOP10 kompeten menggunakan metode kejut panas

sesuai dengan Sambrook et al. (2001). Sebanyak 10 µl plasmid dimasukkan ke

dalam 100 µl sel kompeten dan diinkubasi 15 menit di dalam es. Campuran

diberikan perlakukan kejut panas 42oC 90 menit kemudian diinkubasi 15 menit di

dalam es. Media Luria Bertani (LB) 1 ml ditambahkan ke dalam campuran

kemudian diinkubasi dalam inkubator bergoyang 200 rpm, 37oC 1 jam. Campuran

disentrifugasi 13000 rpm selama 1 menit dan supernatan dibuang. Sebanyak 25 µl

campuran disebar pada media agar LB yang telah mengandung antibiotik dan

diinkubasi 37oC semalaman.

Sekuensing dan analisis hasil kloning

Fragmen DNA sisipan disekuensing menggunakan ABI 3130 Genetic

Analyzer. Siklus sequencing dilakukan menggunakan primer yang sesuai dan hasil

sequencing dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Chromas Lite.

8

Isolasi plasmid yang mengandung fragmen sisipan

Isolasi plasmid dilakukan menggunakan QIAPrep Purification Plasmid kit.

Koloni tunggal bakteri transforman ditumbuhkan dalam 10 ml LB dan diinkubasi

dalam inkubator bergoyang 200 rpm, 37oC semalaman. Sebanyak 1.5 ml kultur

dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan disentrifugasi 6000 rpm, 1 menit.

Supernatan dibuang lalu pelet diresuspensi berturut-turut dengan 250 µl bufer P1,

250 µl bufer P2 dan 300 µl bufer N3. Sebanyak 750 µl campuran dimasukkan ke

dalam spin column dan disentrifugasi 6000 rpm 1 menit. Berturut-turut dimasukkan

500 bufer PB dan 750 bufer PE kemudian masing-masing disentrifugasi 13000 rpm

1 menit. Sebanyak 30 µl bufer EB ditambahkan dan disentrifugasi 13000 rpm 1

menit.

Konstruksi plasmid pC13-35S-Intron-Sma

Konstruksi plasmid yang melibatkan pemotongan utas DNA dengan enzim

restriksi dan penyambungan utas DNA dengan enzim ligase dilakukan mengikuti

Sambrook et al. (2001). Fragmen promoter 35S-Intron-Sma diisolasi dengan

pemotongan fragmen menggunakan enzim restriksi yang sesuai. Komposisi

restriksi terdiri dari bufer enzim restriksi, plasmid rekombinan, enzim restriksi dan

H2O dengan volme total 20 µl. Campuran diinkubasi sesuai dengan suhu inkubasi

enzim yang digunakan selama 1 jam. Hasil pemotongan divisualisaasi pada gel

agarosa 1% dan dilakukan purifikasi menggunakan QIAquick PCR purification gel

kit (Qiagen).

Plasmid biner pCambia 1301 dipotong dengan EcoRI dan BstEII untuk

menghilangkan fragmen promoter 35S, GUS dan multiple cloning site (MCS).

Backbone diligasi dengan promoter 35S-Intron-Sma untuk mendapatkan plasmid

pC13-35S-Intron-Sma. Gen eGFP disisipkan pada situs SmaI yang terdapat pada

plasmid pC13-35S-Intron-Sma sebagai gen reporter untuk mengetahui aktivitas

promoter 35S.

Transformasi Agrobacterium tumefaciens

Sel kompeten A. tumefaciens EHA105 (Hood et al. 1993) dibuat dengan

perlakuan CaCl2 dan transformasi vektor biner dilakukan menggunakan metode

freeze-thaw (Weigel dan Glazebrook 2002). Koloni tunggal A. tumefaciens

EHA105 digores pada LB padat yang mengandung antibiotik rifampisin

25 mg ml-1 diinkubasi 28oC selama 3 hari. Koloni yang tumbuh discrab lalu

dimasukkan ke dalam 10 ml LB yang mengandung antibiotik dan diinkubasi dalam

inkubator bergoyang 200 rpm, 28oC semalaman. Kultur dimasukkan ke dalam

10 ml LB yang mengandung antibiotik sampai OD600=0.6. Sebanyak 1.5 ml kultur

dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml lalu disentrifugasi 4000 rpm, 4oC 10 menit.

Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 1 ml CaCl2 20 mM kemudian

disentrifugasi 4000 rpm, 4oC 1 menit. Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi

kembali dengan 200 µl CaCl2 20 mM.

Transformasi A. tumefaciens dilakukan dengan memasukkan plasmid ke

dalam sel kompeten. Campuran diinkubasi berturut-turut dalam es 15 menit,

nitrogen cair 5 menit, inkubator 37oC 2 menit dan es 5 menit. Sebanyak 1 ml LB

9

ditambahkan ke dalam campuran dan diinkubasi di inkubator bergoyang 200 rpm,

28oC 4 jam. Campuran disentrifugasi 13000 rpm 1 menit dan sebanyak 25 µl

disebar pada LB padat yang mengandung antibiotik.

Transformasi kalus padi Nipponbare

Transformasi kalus padi dilakukan menggunakan metode Toki et al. (2006).

Kulit biji padi dibuka kemudian biji padi disterilkan menggunakan air sabun sambil

digoyang 200 rpm selama 15 menit. Biji padi dibilas dengan air steril sampai busa

hilang. Sterilisaasi dilanjutkan dengan memasukkan biji padi berturut-turut ke

dalam EtOH 70% selama 1 menit dan natrium hipoklorit 4% sambil digoyang 200

rpm selama 30 menit. Biji padi dibilas menggunakan air steril sebanyak 5 kali

masing-masing selama 15 menit sambil digoyang 200 rpm. Selanjutnya biji padi

dikeringkan dengan kertas saring steril dan ditanam dalam media N6D, 32oC, 5 hari

pada kondisi terang.

Tahapan infeksi Agrobacterium dilakukan dengan memasukkan kalus yang

berusia 5 hari ke dalam kultur Agrobacterium (OD600=0.1) yang mengandung

acetosyringone lalu didiamkan 1.5 menit. Kalus dikeringkan dengan kertas saring

steril dan ditanam dalam media N6D yang mengandung acetosyringone, 20oC, 3

hari pada kondisi gelap. Kalus dibilas dengan air steril sebanyak dua kali 2 menit

digoyang. Selanjutnya kalus dibilas kembali dengan air steril yang mengandung

antibiotik sebanyak 5 kali masing-masing selama 15 menit. Kalus dikeringkan

dengan kertas saring steril dan ditanam dalam media N6D yang mengandung

antibiotik 250 mg L-1 sefotaksim dan 200 mg L-1 ampisilin, 32oC, pada kondisi

terang dan disubkultur setiap 2 minggu. Seleksi kalus putative transgenik

menggunakan media yang mengandung 50 mg L-1 higromisin, 250 mg L-1

sefotaksim dan 200 mg L-1 ampisilin dan dilakukan subkultur setiap 2 minggu.

Isolasi DNA genom tanaman

Isolasi DNA genom tanaman dilakukan DNeasy Plant Mini Kit. Kalus

transgenik dipecah dengan menggunakan Tissue lyser lalu ditambahkan 400 µl

buffer AP1 dan 4 µl larutan RNAse dan disentrifugasi 13000 rpm. Campuran

diinkubasi pada suhu 65oC, 10 menit dan ditambahkan 130 µl buffer AP2 dan AP3,

diresuspensi kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit. Campuran

disentrifugasi 13000 rpm, 5 menit dan supernatan dipindahkan ke QIAshredder

Mini spin column selanjutnya disentrifugasi 13000 rpm, 5 menit. Supernatan

dipindahkan ke dalam DNeasy Mini spin column kemudian secara berturut-turut

ditambahkan bufer AW1 sebanyak 1,5 kali volume supernatan, 500 µl Mini spin

column buffer AW2 dan 30 µl lalu disentrifugasi 13000 rpm, 2 menit. Verifikasi

kalus transgenik dilakukan dengan mengamplifikasi daerah eGFP dari T-DNA

pC13-35S-Intron-eGFP menggunakan primer eGFP.

10

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Konstruksi vektor biner pC13-35S-Intron-Sma

Langkah awal yang dilakukan untuk mengkonstruksi plasmid pC13-35S-Intron-

Sma adalah melakukan amplifikasi fragmen promoter 35S-Intron-Sma. Pada bagian N-

terminal gen target terdapat penambahan sepuluh asam amino dan diharapkan dengan

penambahan tersebut intron pada pC13-35S-Intron-Sma akan mengalami proses splicing

seperti pada pC1301. Modifikasi ini juga diharapkan tidak mengganggu fungsi gen target

yang disisipkan. Fragmen promoter 35S-Intron-Sma mengandung intron yang memiliki

masing-masing lima asam amino gen GUS dari pC1301 pada ujung 5’ dan 3’, situs

kloning gen target (SmaI), 6 kali kodon histidin dan stop kodon TGA. Pada fragmen ini

ditambahkan situs restriksi EcoRI pada ujung 5’ dan BstEII pada ujung 3’

promoter 35S (Gambar 6)

Gambar 6 Peta konstruksi plasmid pC13-35S-Intron-Sma

Fragmen promoter 35S-Intron-Sma yang diamplifikasi dengan PCR

menghasilkan pita berukuran 1020 pb pada gel agarosa (Gambar 7). Fragmen ini

dipurifikasi, diligasi ke pGEM-T Easy dan diintroduksikan pada sel kompeten E.

coli TOP10. Koloni yang membawa pGEM-35S-Intron-Sma diseleksi pada media yang

mengandung ampisilin 100 mg L-1. Verifikasi koloni yang membawa plasmid

rekombinan diverifikasi dengan PCR menggunakan primer khusus 35S-Intron-Sma_F

dan 35S-Intron-Sma_R dan verifikasi keberadaan fragmen promoter 35S-Intron-Sma

juga dilakukan dengan restriksi plasmid rekombinan menggunakan EcoRI dan BstEII.

Hasil verifikasi PCR koloni dan restriksi plasmid rekombinan menghasilkan pita

berukuran 1020 pb.

Gambar 7 Hasil amplifikasi fragmen promoter 35S-Intron-Sma

(M= penanda 100 pb)

11

Fragmen 35S-Intron-Sma dari pGemT-35S-Intron-Sma disubkloning ke

pC1301 yang telah dipotong dengan enzim restriksi EcoRI dan BstEII untuk

menghilangkan daerah MCS, promoter 35S dan gen GUS. Plasmid pC1301 yang

telah dimodifikasi disebut dengan pC13-35S-Intron-Sma. Plasmid pC13-35S-

Intron-Sma diintrodukasi pada sel kompeten E. coli TOP10. Koloni yang membawa

pC13-35S-Intron-Sma ditapiskan pada media yang mengandung kanamisin 50 mg

L-1 dan diverifikasi dengan PCR menggunakan primer khusus dan menghasilkan

pita berukuran 1020 pb (Gambar 8).

Gambar 8 Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pC13-35S-Intron-

Sma. Koloni No. 4 positif membawa plasmid pC13-35S-Intron-Sma

(M= penanda 1000 pb DNA ladder; K(-)= kontrol negatif)

Konstruksi pC13-35S-Intron-eGFP

Gen eGFP diamplifikasi dengan PCR dari plasmid pST2 dan dikloning ke

pGEM-T Easy. Plasmid pGEM-eGFP diintroduksi pada sel kompeten E. coli

TOP10. Koloni yang membawa plasmid ini ditapiskan pada media yang

mengandung ampisilin 100 mg L-1 dan diverifikasi dengan PCR menggunakan

primer eGFP_F dan eGFP_R. Hasil verifikasi PCR menghasilkan pita berukuran

741 pb (Gambar 9).

Gambar 9 Hasil verifikasi koloni transforman yang membawa pGEM-eGFP (M= penanda 100 pb)

Fragmen eGFP disubkloning ke pC13-35S-Intron-Sma pada situs SmaI

membentuk pC13-35S-Intron-eGFP. Koloni yang membawa plasmid ini ditapiskan

pada media yang mengandung kanamisin 50 mg L-1. Verifikasi dengan PCR

12

dilakukan dengan 35S-Intron-Sma_F dan eGFP_R untuk melihat orientasi dari

eGFP. Hasil verifikasi PCR menghasilkan pita berukuran 1761 pb (Gambar 10).

Gambar 10 Hasil verifikasi koloni yang membawa plasmid pC13-35S-Intron-eGFP

(M= penanda 1000 pb DNA ladder; K(-)= kontrol negatif)

Transformasi kalus padi Nipponbare

Plasmid pC13-35S-Intron-eGFP diintroduksi pada Agrobacterium

kompeten dan diseleksi pada media yang mengandung antibiotik rifampisin 25 mg

L-1, klorampenikol 35 mg L-1 dan kanamisin 200 mg L-1. Koloni Agrobacterium

yang membawa pC13-35S-Intron-eGFP diverifikasi dengan PCR menggunakan

primer ujung intron_F dan 6xHis-TGA-BstEII-R dan menghasilkan pita berukuran

787 pb (Gambar 11).

Gambar 11 Hasil verifikasi koloni Agrobacterium yang membawa pC13-35S-

Intron-eGFP. Koloni No.1 positif membawa pC13-35S-Intron-eGFP

(M= penanda 1000 pb DNA ladder; K(-)= kontrol negatif)

Sebelum dilakukan transformasi pada tanaman model, koloni

Agrobacterium yang membawa plasmid pC13-35S-Intron-eGFP diamati di bawah

sinar biru dengan panjang gelombang 395 nm. Pengamatan ini dilakukan untuk

mengetahui ekspresi eGFP di Agrobacterium. Hasil pengamatan koloni

13

Agrobacterium yang mengandung pC-35S-Intron-eGFP tidak menunjukkan

ekspresi gen eGFP (Gambar 12).

Gambar 12 Hasil pengamatan ekspresi gen eGFP di bawah sinar putih (A) dan

sinar biru (B)

Transformasi dilakukan pada kalus padi Nipponbare. Transformasi

dilakukan melalui ko-kultivasi kalus selama 3 hari. Kalus hasil ko-kultivasi

diseleksi pada media seleksi menggandung antibiotik higromisin 50 mg L-1. Hasil

transformasi menunjukkan bahwa terdapat empat galur kalus yang membawa

sisipan T-DNA plasmid pC-35S-Intron-eGFP. Hal ini diketahui dari pengamatan

ekspresi gen eGFP pada kalus di bawah sinar biru. Ekspresi eGFP diamati pada

kalus padi yang berumur empat minggu setelah infeksi (Gambar 13).

Gambar 13 Hasil pengamatan ekspresi gen eGFP di bawah sinar putih (A) dan

sinar biru (B)

Verifikasi keberadaan T-DNA pC13-35S-Intron-eGFP pada empat galur

kalus transgenik dilakukan dengan mengamplifikasi genom kalus transgenik

menggunakan primer eGFP_F dan eGFP_R menghasilkan pita berukuran 741 pb

(Gambar 14).

A

A B

14

Gambar 14 Hasil verifikasi keberadaan T-DNA pC13-35S-Intron-Sma pada empat

galur kalus transgenik (M= penanda 100 pb)

Pembahasan

Penyisipan gen ke dalam kromoson tanaman melalui perantaraan

Agrobacterium merupakan suatu metode transformasi yang telah berlangsung lama

di alam. Hal ini disebabkan karena A. tumefaciens merupakan bakteri tanah yang

secara alami mampu melakukan transfer DNA ke dalam kromoson tanaman.

Bakteri ini mampu menyisipkan daerah T-DNA yang merupakan bagian dari

Ti-plasmid. Di dalam T-DNA terdapat gen onkogenik penyandi fitohormon dan gen

penyandi opin. Secara alami gen-gen yang berada di dalam T-DNA tersebut tidak

dapat diekspresikan oleh Agrobacterium karena enzim RNA polimerase

Agrobacterium tidak mengenali daerah promoter gen-gen tersebut. Oleh karena itu,

Agrobacterium menyisipkan daerah T-DNA tersebut ke dalam kromoson tanaman

sehingga gen-gen tersebut diekspresikan oleh tanaman karena RNA polimerase

tanaman dapat mengenali daerah promoter gen-gen tersebut.

Salah satu komponen yang penting dalam transformasi tanaman adalah

vektor yang membawa daerah T-DNA yang akan disisipkan ke kromosom tanaman.

Transformasi tanaman dengan A. tumefaciens memiliki beberapa jenis sistem

vektor yaitu vektor biner dan cointegrate vector. Vektor biner merupakan sistem

yang paling banyak digunakan karena plasmid yang mengandung T-DNA menjadi

lebih kecil dan mudah dimanipulasi (Rachmawati 2006). Daerah T-DNA pada

plasmid biner dapat dimanipulasi sesuai dengan tujuan penelitian. Salah satu contoh

vektor biner adalah pCambia 1301. Plasmid pCambia 1301 memiliki daerah T-

DNA yang terdiri dari kaset gen penanda seleksi untuk tanaman transgenik dan

kaset gen reporter GUS (Jefferson 1987). Kedua gen tersebut dikendalikan secara

konstitutif oleh promoter 35S. Beberapa kekurangan pC1301 sebagai vektor biner

adalah penyisipan kaset gen target yang dilakukan pada daerah MCS karena pada

plasmid tersebut tidak disediakan situs khusus untuk penyisipan gen target.

Penyisipan gen target pada daerah gen GUS merupakan hal yang tidak efisien

karena akan menghilangkan komponen penting yaitu intron yang berada di tengah

gen GUS dan 6 kali histidin sebagai penanda. Pengembangan vektor biner yang

sederhana dan fleksibel untuk transformasi melalui Agrobacterium perlu dilakukan

agar kosntruksi kaset ekspresi dapat lebih efisien. Modifikasi pengembangan kaset

ekspresi pada T-DNA sebaiknya menyediakan situs pengenalan enzim restriksi

yang mengapit promoter, intron, situs kloning gen target dan penanda (Tag)

sehingga komponen tersebut dapat diganti sesuai dengan kebutuhan penelitian.

15

Oleh karena itu untuk mempermudah proses konstruksi daerah T-DNA tersebut

dilakukan modifikasi pada plasmid pCambia 1301.

Plasmid hasil modifikasi pCambia 1301 disebut dengan pC13-35S-Intron-

Sma. Plasmid ini didesain agar memiliki struktur yang lebih sederhana dan fleksibel

sehingga akan mempermudah proses konstruksi kaset ekspresi. Daerah T-DNA

pC13-35S-Intron-Sma tersusun dari kaset ekspresi gen target yang terdiri dari

promoter 35S yang memiliki situs restriksi yang terbatas. Situs pengenalan enzim

restriksi EcoRI dan BstXI terdapat pada daerah upstream promoter 35S serta NcoI

dan BglII pada daerah downstream promoter 35S. Selain itu, terdapat intron

pertama dari gen katalase (cat1), situs restriksi tunggal sebagai tempat penyisipan

gen target (SmaI) dan 6 kali kodon histidin sebagai penanda. Promoter 35S

merupakan promoter kuat yang dapat mengendalikan ekspresi gen target secara

konstitutif. Manipilasi promoter tersebut relatif lebih mudah karena memiliki

ukuran sekuen yang pendek (343 pb), tidak memiliki situs pengenalan enzim

restriksi dan aktif pada tanaman monokotil maupun dikotil (Benfey et al. 1989).

Promoter 35S merupakan promoter yang sangat kuat dan merupakan promoter yang

mengendalikan ekspresi gen patogen yang menyerang tanaman sehingga promoter

tersebut aktif di Agrobacterium. Vancanneyt et al. (1990) menyebutkan bahwa

beberapa promoter yang mengendalikan ekspresi gen patogen tanaman dapat

dikenali oleh sistem transkripsi Agrobacterium. Hal ini akan mengakibatkan gen

target dapat terekspresi dibawah kendali promoter 35S pada Agrobacterium

sehingga menimbulkan bias pada saat transformasi.

Subkloning gen target pada pC13-35S-Intron-Sma dilakukan dengan

metode kloning konvensional yang melibatkan PCR, enzim restriksi dan ligase.

Proses insersi pada situs SmaI yang menghasilkan ujung tumpul memang lebih sulit

dibanding dengan situs restriksi yang sticky-end dan membutuhkan verifikasi

lanjutan dengan PCR untuk mengetahui posisi orientasi gen target. Akan tetapi

teknik konvensional ini relatif feasible untuk dilakukan pada banyak laboratorium

karena hanya membutuhkan satu jenis inang E. coli seperti DH5 atau TOP10.

Teknik kloning dengan metode gateway mungkin menjadi menarik karena

verifikasi orientasi tidak perlu dilakukan seperti pada seri vektor biner pGWB

(Nakagawa et al. 2007). Menariknya, jenis vektor yang memanfaatkan intron cat1

tidak ada dalam daftar seri pGWB. Di samping itu, aplikasi metode gateway lebih

kompleks daripada teknik kloning konvensional. Walaupun demikian, ada

kemungkinan untuk mengubah pC13-35S-Intron-Sma untuk menjadi vektor

destinasi dengan sistem gateway.

Keberadaan intron pada konstruksi ini merupakan hal yang penting karena

mampu meningkatkan ekspresi gen target dan intron juga dapat digunakan untuk

memastikan bahwa ekspresi gen target tidak berasal dari Agrobacterium melainkan

dari tanaman. Pada ujung 5’ dan 3’ intron cat1 terdapat penambahan lima asam

amino yang berasal dari gen GUS pada plasmid pC1301. Penambahan ekstra asam

amino ini bertujuan untuk mempermudah proses intron splicing. Situs kloning

tunggal gen target (SmaI) merupakan keunikan lain dari pC13-35S-Intron-Sma.

Penyisipan gen target pada situs tersebut memungkin gen target akan langsung

mendapatkan promoter dan terminator. Enzim restriksi SmaI merupakan enzim

yang memotong situs pengenalan dengan ujung tumpul. Situs kloning seperti ini

memungkinkan penyisipan gen target yang memiliki situs pengenalan enzim

restriksi yang memotong tumpul pada kedua ujungnya (selain SmaI) atau

16

penyisipan gen target yang diamplifikasi dengan menggunakan enzim DNA

polimerase yang tidak menambahkan basa nitrogen A pada bagian ujung, misalnya

menggunakan DNA polimerase Pfu yang diikuti dengan seleksi bakteri transforman

yang mengandung plasmid rekombinan dengan arah orientasi gen target yang

sesuai.

Promoter 35S pada pC13-35S-Intron-Sma dapat diganti dengan promoter

konstitutif lain pada situs EcoRI dan BstXI pada ujung 5’ serta NcoI dan BglII pada

ujung 3’. Intron dapat dihilangkan dengan menyisipkan gen target pada situs NcoI

atau BglII dan SmaI. Komponen tambahan 6 kali histidin pada pC13-35S-Intron-

Sma secara langsung akan ditambahkan jika gen target disisipkan pada situs

tersebut. Komponen 6 kali histidin tidak akan diekspresikan apabila fragmen gen

target mengandung stop kodon. Vektor pC13-35S-Intron-Sma telah didesain

mengandung stop kodon TGA setelah 6 kali kodon histidin sehingga fragmen gen

target diamplifikasi tanpa mengandung stop kodon. Komponen 6 kali histidin dapat

digunakan sebagai penanda untuk purifikasi di tingkat protein serta dapat

digunakan untuk purifikasi protein yang belum memiliki antibodi. Kemungkinan

lain yang digunakan apabila tidak menginginkan penambahan intron dan 6 kali

histidin pada gen target adalah menyisipkan gen target pada situs EcoRI atau BstXI

dan BstEII.

Gen eGFP merupakan gen reporter yang digunakan untuk mengetahui

aktivitas promoter, pengaruh penambahan asam amino dan proses splicing intron

cat1 pada pC13-35S-Intron-Sma. Gen eGFP diamplifikasi dari plasmid pST2 mulai

dari start kodon tetapi tidak mengikutsertakan stop kodon dengan menambahkan

situs enzim restriksi SmaI dan EcoRV pada bagian forward dan reverse. Gen eGFP

merupakan gen repoter yang digunakan untuk seleksi positif kalus trasngenik yang

telah tersisipi gen target karena ekspresi gen eGFP tidak menyebabkan kematian

pada kalus transgenik.

Pengujian ekspresi intron-eGFP dengan transformasi kalus padi Nipponbare

melalui Agrobacterium

Transformasi plasmid pC-35S-Intron-eGFP pada kalus padi Nipponbare

dilakukan dengan menggunakan A. tumefaciens karena secara alami mampu

mentransfer T-DNA dari Ti-plasmid ke dalam genom tanaman sehingga

transformasi dengan perantara A. tumefaciens relatif lebih efisien dibandingkan

dengan metode artificial (Sahoo et al. 2011). Di samping itu, keuntungan

transformasi melalui perantaraan A. tumefaciens adalah dapat menyisipkan T-DNA

yang berukuran besar, salinan T-DNA di dalam kromoson tanaman sedikit dan

ekspresi gen target di tanaman stabil (Lopez et al. 2004). Strain A. tumefaciens yang

digunakan adalah strain EHA105 (Hood 1993) yang menghasilkan yang bersifat

supervirulensi sehingga lebih efisien dalam menginfeksi kalus padi Nipponbare.

Padi Nipponbare merupakan varietas japonica yang umum digunakan sebagai

tanaman model dalam transformasi tanaman karena memiliki masa pertumbuhan

singkat yaitu sekitar tiga bulan, mudah ditransformasi karena memiliki ukuran

genom yang relatif kecil (430 Mpb) dan genom padi ini sudah dipetakan dengan

lengkap sehingga mudah dimanipulasi (Nishimura et al. 2006).

Intron merupakan komponen yang sangat penting dalam konstruksi vektor

untuk transformasi tanaman. Keberadaan intron pada gen eGFP membantu proses

seleksi kalus transforman karena eGFP hanya akan terekspresi pada kalus. Sistem

17

intron splicing tidak terjadi pada Agrobacterium dapat meyakinkan bahwa ekspresi

yang terjadi adalah berasal dari sel tanaman. Apabila terdapat intron pada gen target

maka Agrobacterium tidak mampu melakukan intron splicing sehingga

mengakibatkan gen target tidak terekspresi pada Agrobacterium (Tanaka et al.

1990).

Proses kokultivasi kalus dan Agrobacterium yang mengandung plasmid

pC13-35S-Intron-eGFP dilakukan pada media yang mengandung Acetosyringone.

Penambahan senyawa fenolik ini bertujuan untuk meningkatkan efisiensi transfer

T-DNA oleh Agrobacterium (Amoah et al. 2001). Setelah proses kokultivasi

kemudian dilanjutkan dengan proses kultivasi yang menggunakan media dengan

penambahan antibiotik ampisilin, sefotaksim dan higromisin. Kombinasi antibiotik

ampisilin dan sefotaksim efektif untuk membunuh Agrobacterium sehingga tidak

terjadi overgrowth sedangkan higromisin digunakan untuk menyeleksi kalus yang

telah mengandung T-DNA. Jumlah kalus yang tahan dengan sistem seleksi

berjenjang ini akan terus menurun sampai pada tahap regerasi karena hanya kalus

yang benar-benar mengandung gen ketahanan terhadap higromisin yang dapat

tumbuh pada media seleksi (Chakrabarty et al. 2002).

Keberadaan plasmid biner pC13-35S-Intron-Sma diharapkan dapat

digunakan untuk mempermudah ekspresi gen secara konstitutif. Walaupun plasmid

ini tidak ditujukan untuk mengkloning promoter, plasmid ini juga memiliki

kemungkinan untuk mengubah promoter konstitutif 35S dengan promoter lain

menggunakan enzim restriksi yang tersedia.

5 SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Vektor biner pC35S-Intron-Sma yang mengandung gen eGFP intron untuk

transformasi tanaman telah berhasil dikonstruksi. Signal pada kalus padi

Nipponbare yang diamati di bawah sinar biru menunjukkan bahwa gen eGFP yang

mengandung intron terekspresi di bawah kendali promoter 35S. Ekspresi gen eGFP

tidak tampak pada A. tumefaciens yang diamati di bawah sinar biru sehingga dapat

disimpulkan gen eGFP hanya terekspresi pada kalus transgenik dan terdapat proses

intron splicing pada konstruksi gen eGFP.

Saran

Perlu dilakukan penelitian tentang optimasi promoter dari vektor biner

fleksibel pC13-35S-Intron-Sma dengan mengganti promoter 35S dengan promoter

konstitutif lain dan penyisipan gen target lain yang lebih fungsional pada tanaman.

Selain itu tanaman model yang digunakan untuk transformasi dapat divariasikan

sehingga diketahui tingkat fleksibilitas dari plasmid tersebut.

18

DAFTAR PUSTAKA

Amoah BK, Wu H, Sparks C, Jones HD. 2001. Factors influencing Agrobacterium-

mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. J. Exp.

Bot. 52:1135-1142.

Benfey PN, Ren L, Chua NH. 1989. The CaMV 35S enhancer contains at least two

domains which can confer different developmental and tissue-specific

expression patterns. EMBO J. 8(8):2195-202.

Bergman CM, Kreitman M. 2001. Analysis of conserved noncoding DNA in

drosophila reveals similar constraints in intergenic and intronic sequences

cases. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 11:1335-1344.

Chakrabarty R, Viswakarma N, Bhat SR, Kirti PB, Singh BD, Chopra VL. 2002.

Agrobacterium-mediated transformation of cauliflower: optimization of

protocol and development of Bt-transgenic cauliflower. J. Biosci. 27:495-

502.

Cormarck PB, Valdivia RH, Falkow S. 1996. FACS optimized mutants of the green

fluorescent protein (GFP). Gene. 173:33-38.

Deutsch M, Long M. 1999. Intron-exon structures of eukaryotic model organisms.

Nucleid Acids Research. 27(15):3219-3228.

Elliot AR, Campbell JA, Dugdale B, Brettell RIS, Grof CPL. 1999. Green-

fluorescent protein facilitates rapid in vivo detection of genetically

transformed plant cells. Plant Cell Rep. 18:707-714.

Filchkin SA, Gelvin SB. 1993. Formation a putative relaxation intermediate during

T-DNA processing directed by the Agrobacterium tumefaciens virD1,

virD2 endonuclease. Mol. Microbiol 8:915-926.

Heim RA, Cubitt B, Tsien RY. 1995. Improved greenfluorescence. Nature.

373:663-664.

Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA. 1983. A binary plant

vector strategy based on separation of vir- and T-region of the

Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature. 303: 179-180.

Holme IB, Pedersen HB, Lange M, Holm PB. 2006. Transformation of barley

(Hordeum vulgare L.) by Agrobacterium tumefaciens infection of in vitro

cultured ovules. Plant Cell Rep. 25:1325-1335.

Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, Hoekema A. 1993. New Agrobacterium helper

plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. 2:208-218.

Jefferson RA. 1987. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion gene.

Plant Mol Biol Rep. 4(5):387-405.

Jordan MC. 2000. Green fluorescent protein as a visual marker for wheat

transformation. Plant Cell. 19:1069-1075.

Lee LY, Kononov ME, Bassuner B, Frame BR, Wang K, Gelvin SB. 2007. Novel

plant transformation vectors containing the superpromoter. Plant Physiol

145: 1294-1300.

19

Nakagawa T, Kurose T, Hino T, Tanaka K, Kawamukai M, Niwa Y, Toyooka K,

Matsuoka K, Jinbo T, Kimura T. 2007. Development of series of gateway

binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes

for plant transformation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 1(104):

34-41.

Nishimura A, Aichi I, Matsioka M. 2006. A protocol for Agrobacterium-mediated

transformation in rice. Nature. 6(1):2796-2802.

NiwaY, Hirano T, Yoshimoto K, Shimizu M, Kobayashi H. 1999. Non-invasive

quantitative detection and application of non-toxic, S65T-type green

fluorescent protein in living plants. The Plant J. 18:455-463.

Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K. 1990. Construction and expression in

tobacco of a β-glucuronidase (GUS) reporter gene containing an intron

within the coding sequence. Plant and Cell Physiol. 31:805-813.

Offringa R, de Groot MJ, Haagsman HJ, Does MP, Van den Elzen, Hooykaas PJJ.

1990. Extrachromosomal homologous recombination and gene targetting in

plant cells after Agrobacterium mediated transformation. EMBO J 9: 3077-

3084.

Pang SZ, DeBoer DL, Wan Y, Ye G, Layton JG, Neher MK, Amstrong CL, Fry EJ,

Hinchee MAW, Fromm ME. 1996. An improved green fluorescent protein

gene as a vital marker in plants. Plant Physiol. 112:893-900.

Rachmawati S. 2006. Studi perkembangan perbaikan sifat genetik padi

menggunakan transformasi Agrobacterium. AgroBiogen. 2(1):36-44.

Rossi L, Hohn B, Tinland B. 1996. Integration of complete T-DNA units is

dependent on the activity of virE protein of Agrobacterium tumefaciens.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 126-130.

Sahoo KK, Tripathi AK, Pareek A, Sopory SK, Pareek-Singla SL. 2011. An

improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse

indica rice cultivars. Plant Methods. 49(7):1-11.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 2001. Molecular Cloning: A laboratory

Manual. Ed ke-3. New York (US): Cold Spring Harbor.

Tanaka A, Mita S, Ohta S, Kyozuka J, Shimamoto K, Nakamura K. 1990.

Enhancement of foreign gene expression by a dicot intron in rice but not in

tobacco is correlated with an increased level of mRNA and an efficient

splicing of the intron. Nuc Acids Res. 23(18):6767-6781.

Tang X, Nakata Y, Li HO, Zhang M, Gao H, Fujita A, Sakatsume O, Ohta T,

Yokoyama K. 1994. The optimization of preparations of competent cells for

transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 22(14): 2857-2858.

Toki S, Hara N, Ono K, Onodera, Tagiri, Oka S, Tanaka H. 2006. Early infection

of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation

of rice. Plant J. 47:969-976.

Vain P, Worland B, Clarke MC, Richard G, Beavis M, Liu H, Kohli A, Leech M,

Snape J, Christou, Atkinson H. 1997. Expression of an engineered cysteine

proteinase inhibitor (Oryzacystatin-│▲D86) for nematode resistance in

transgenic rice plants. Theor Appl Genet. 96:266-271.

20

Vancanneyt G, Schmidt R, Sanchez AO, Willmitzer L, Sosa MR. 1990.

Construction an intron-containing marker gene: Splicing of the intron in

transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-

mediated plant transformation. Mol Gen Genet. 220:245-250.

Wang MB, Brettell RIS, Upadhyaya NM, Waterhouse PM. 1997. Intron-mediated

improvement of a selectable marker gene for plant transformation using

Agrobacterium tumefaciens. J. Genet. Breed. 51:325-334.

Weigel D, Glazebrook J. 2002. Arabidopsis Laboratory Manual. New York (US):

Cold Spring Harbor.

Ziemienowicz A, Tinland B, Briyant J, Gloecker V, Hohn B. 2000. Plant enzymes

but not Agrobacterium VirD2 mediate T-DNA ligation in vitro. Mol. Cell.

Biol 20:6317-6322.

21

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Beringin (Kabupaten Simalungun, Sumatera Utara),

pada tanggal 17 Desember 1989 dan merupakan puteri pertama dari pasangan

Antonius Sumanto dan Prudentina Widyastuti. Penulis memperoleh gelar Sarjana

Sains (S.Si) dari Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Sumatera Utara pada tahun 2011 dan pada tahun 2013 penulis

melanjutkan pendidikan Magister Sains di Program Studi Bioteknologi, Sekolah

Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

Penelitian ini telah dikirim ke jurnal Hayati IPB dengan judul pC13-35S-

Intron-Sma: a Simple Binary Expression Vector for Rice Agrobacterium-Mediated

Transformation dan dalam tahap submit.