pcr enrique arce sophie ouabbou mónica penón celina vargas
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PCR• Enrique Arce• Sophie Ouabbou• Mónica Penón• Celina Vargas
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Generalidades
• PCR: Reacción de la cadena de polimerasa
• Descrita en 1985 por Kary B. Mullis• Objetivo: obtener mediante amplificación in
vitro, cantidades “masivas” de ADN a partir de muestras de ADN
• Cuantitativo o cualitativo
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PCR cuantitativo
• Apoyo pronóstico
• Cuantificar cargas virales: control terapéutico de virosis crónicas y pacientes inmunosuprimidos
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PCR cualitativo
• Genotipaje
• Apoyo diagnóstico
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¿Qué caracteriza al PCR y lo diferencia de otras técnicas
moleculares?
1. Específico
2. Sensible
3. Exacto
4. Preciso
5. Resultados relativamente rápidos
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PROCEDIMIENTO
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Materiales y reactivos
• Desoxinucleotidos trifosfato ( dNTPs).• Primers , cada uno complementario a una de
las dos hebras de ADN.• Iones divalentes y monovalentes (cofactores
de la polimerasa).• Solución buffer (mantiene pH adecuado).• ADN molde.• ADN polimerasa.• Termociclador.
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Pasos a seguir
• Paso 1: Desnaturalización por calor (>90°C). Se parte la doble cadena de ADN para que nucleótidos queden expuestos a la polimeraza.
• Paso 2:
Hibridación del Primer (unión a su secuencia complementaria en el ADN molde) (40°C-65°C).
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• Paso 3:
Extensión con la DNA polimerasa (72 °C).
Actúa tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del Primer como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.
** Siempre se debe utilizar doble cadena de ADN, por lo tanto para virus hay que hacer primero un proceso de transcripción.
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• Los Primers los hacen casas comerciales que estudian zonas muy bien conservadas de los virus.
• La prueba debe estandarizarse: buscar la cantidad exacta de reactivos para obtener el producto exacto.
• Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis.
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TÉCNICAS DE PCR
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• Retrotranscriptasa PCR (RT-PCR)• In situ PCR• Real time PCR• PCR anidada• Multiplex PCR• End-point quantitative PCR• Rapid cycle PCR
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Según el objetivo del examen, la prueba puede ser:
• Cualitativa
• Cuantitativa
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VIH: RT-PCR
Pasos
• Retrotranscripción
• Amplificación
La técnica de PCR se usa más para pronóstico de VIH que para diagnóstico.
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LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEL HOSPITAL
SAN JUAN DE DIOS
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• Referencia a nivel regional (Centroamérica) para pruebas diagnósticas de VIH.
• En Costa Rica, es el único laboratorio haciendo cargas virales con propósito diagnóstico, el tratamiento y monitoreo de pacientes.
• Tienen la capacidad de analizar citomegalovirus, herpes, VIH, genotipos, entre otros.
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El laboratorio
1. Extracción (el material genético de lasmuestras)
2. Amplificación (donde se lleva a cabo la PCR)
3. Detección (con secuenciador)
Para evitar la contaminación del material genéticodebenhaber al menos 2 áreas de trabajo, sin embargo el hospital cuenta con tres:
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Separar el AND o ARN de la célula de donde reside. Se pueden utIlizar muchas técnicas diferentes para este paso.
1. Área de extracción
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2. Amplificación
Ciclador automatizado que repite numerosas veces los cambios de temperatura para amplificar la carga viral de la muestra.
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3. DetecciónSecuenciador y detector.
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GRACIAS