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PCR in situ
PCR Hotstart
Disciplina de Biologia Molecular
Profª. Fabiana Seixas
Graduação em Biotecnologia - UFPel
Bruno Matos e Júlia Cougo
PCR in situ
- É a técnica de PCR usada diretamente numa lâmina de tecido ou células isoladas. Para essa técnica, é adicionada a Taq Polimerase diretamente na lâmina e realizada uma ciclização diferente, em termocicladores adaptados.
- A PCR in situ combina a sensibilidade da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) com a especificidade e versatilidade do imunoensaio.
São usadas técnicas de detecção do produto da PCR para análise das amplificações. Um exemplo é a PCR in situ servir para detecção da presença de cargas de DNA em tecidos ou células que se acredite estarem infectadas.
Ex: detecção de vírus por PCR in situ (amplificando o DNA do vírus) e posterior identificação do vírus. Para tanto, o DNA procurado já deve ser conhecido.
Vantagens:
- Possibilidade de identificação de patógenos desconhecidos:
Muitas doenças têm desenvolvimento de seus patógenos lento, mas apresentam sintomas. Portanto a PCR in situ é uma saída para a amplificação e identificação de DNA estranho em tecidos e células e conhecimento de que tipo de doença está ocorrendo.
- A PCR permite a correlação direta dos resultados com as características histológicas e citológicas da amostra.
- A identificação de quantidades ínfimas de DNA, bem como de células que possuam genes específicos.
Desvantagens:
- O tempo é maior que o da PCR convencional (1 ciclo leva 15 minutos, enquanto o da PCR comum leva 1 minuto).
- Não permite a análise molecular do produto da PCR, pois poderia ocorrer degradação do DNA amplificado no momento da extração das células da lâmina (por conta da fixação).
- O tempo de espera para o DNA alongar-se é maior, pois há a barreira da própria célula retendo o DNA no meio intracelular.
Etapas:
1) Preparação das lâminas
Os procedimentos de preparação do tecido ou das
células a serem submetidas à PCR in situ diferem de
acordo com a origem do tecido e seu estado após a
manipulação, mas em geral, tecidos animais passam
pelos processos normais de preparação de lâminas (em
micrótomo) e tecidos vegetais passam por processos de
secagem para irem às lâminas.
Protocolo de preparação de folhas de cana de açúcar:
- Corte as folhas em pedaços pequenos (mm máx 5x2).
- Fixação em FAA, a 4 ° C durante 24 h.
- Desidratação do tecido duas vezes, durante 30 min em 70% EtOH, seguida de 30 min de EtOH a 100%.
- Transferência para Estisol puro duas vezes durante 30 min.
- Incorporação dos tecidos em parafina ou paraplast.
- Corte de secções de 8-10 μm.
- Secagem mínima de 24 h a 40 ° C.
- Retirada da parafina em xileno (ou Histoclear) durante 5 minutos seguido por 5 min em EtOH a 100%.
- Secagem à temperatura ambiente.
2) Fixação
Substâncias que aumentam a aderência do material à lâmina.
- Fixadores:
- FAA
- Paraformaldeído
3) Degradação celular
- Pectinase (plantas)
- Pepsina (animais)
4) Adição dos componentes e da Taq Polimerase:
- Para cada lâmina, preparar 25 μl de solução:
- 2.5 μl de PCR buffer
- 4.5 μl de MgCl2 (25 mM de solução estoque)
- 4.0 μl de solução dNTP (200 mM concentração final de cada nucleotídeo)
- 1.0 μl de albumina de sorobovino 2% (BSA)
- 0.4 μl de solução dUTP digoxigenina (1 mM solução estoque)
- 1 μl de cada um dos primers: primer 1 and primer 2 (20 μM)
- 11 μl de água
- 0.5 μl de Taq polimerase
5) Termociclização e PCR em si
6) Detecção
A detecção da amplificação pode ocorrer de duas maneiras diferentes:
- Direta: marcadores (ex: Biotina) são incorporados pelo produto da PCR e na seqüência detectados por Imunohistoquímica.
- Indireta: hibridização in situ de uma sonda de DNA (radiomarcada ou não) no produto da PCR, também seguida de Imunohistoquímica.
Artigos:
PCR Hot Start
Hot Start PCR é uma forma modificada da Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR), que evita a amplificação
não específica de DNA por inativar a Taq polimerase a
baixas temperaturas, ou por utilizar uma polimerase
especifica que necessita de um meio de ativação.
Vantagens:
Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94°C.
Outro exemplo é o da AmpliTaq Gold, que é uma enzima que atinge sua forma ativa apenas se permanecer 10 minutos em temperatura de 94ºC.
Ao mesmo tempo em que as enzimas estão sendo ativadas, o DNA está sofrendo desnaturação, portanto a enzima irá trabalhar em temperatura ideal e no momento correto (aumento da especificidade).
Desvantagens:
- Como se trata de um processo manual, há risco de
contaminação mais alto.
- No caso da compra de enzimas especiais prontas,
sejam as conjugadas ou especiais, o processo
encarece.
Formas de ativação das polimerases:
1 – Cápsula de cera: quando degradada permite a ativação enzimática.
2 – Degradação do anticorpo conjugado à enzima.
3 – Adicionar a enzima em temperatura ideal (risco de contaminação e erro)
A ativação da enzima e a desnaturação do DNA ocorrem na mesma fase, levando a polimerase a trabalhar em temperatura ótima na fase seguinte.
Referências:
http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/23819/aplicacao-tecnica-rt-pcr-situ/
http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/
http://www.bi.ku.dk/staff/BoJ/insitupcr.htm
http://www.pcrlinks.com/variants/insitu_pcr.htm
http://www.pcrlinks.com/variants/hotstart.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/Hot_Start_PCR
http://www.uniscience.com/polimerases/item/1478-biotium-polimerases---pcr-hot-start
Gratos pela atenção!
PCR In Situ
e Hot Start
PCR Camila Caldeira Simões
Priscila Silveira dos Santos
Pelotas, 30 de janeiro de 2013.
Universidade Federal de Pelotas
Graduação em Biotecnologia
Disciplina: Biologia Molecular
Profª.: Fabiana Seixas
PCR
PCR In Situ
Reação da cadeia polimerase que ocorre
dentro da célula, além de poder ser
realizado na superfície da lâmina.
Variações
PCR In Situ
RT In Situ PCR
PCR Hibridização In Situ
RT- PCR In
Situ
É a combinação entre a PCR In Situ e a
transcrição reversa.
Ela difere da PCR In Situ normal em dois
passos: na digestão com DNase e na
etapa de transcrição reversa.
PCR- Hibridização In Situ
PCR In Situ –15 ciclos a 94ºC em 1 min.
PCR Hibridização In Situ –Sondas e 35
ciclos a 94ºC em 1 min.
Aplicações
Identificação de marcadores celulares;
Localização de sequências de células específicas dentro das populações de células;
Detectar RNAs que ocorrem em um número de cópias relativamente elevado;
É mais indicada para diagnóstico viral.
Protocolo
Preparação de cortes de tecidos e
amostras de células
Digestão protease
DNase Digestão (para RT-PCR In Situ)
RT
PCR
Detecção
Vantagens
Permite a localização do sinal amplificado dentro da estrutura do tecido
Detectar DNA viral, proviral, rearranjos do DNA e translocações.
Pode detectar quantidades pequenas de DNA
Desvantagens
A barreira física de uma célula fixada
aumenta o tempo de alongamento do
DNA.
Artigo Objetivo: detecção molecular de uma pandemia de gripe A (H1N1) 2009 cepas
é possível no material de arquivo, como parafinizado pulmonares.
Métodos: RT-PCR in situ.
Resultados: Detectamos 100% de transcritos de neuraminidase das amostras
diagnosticados A (H1N1)-positivas. Nenhuma expressão foi detectada em dois
paciente (H1N1)-negativas. In situ os níveis de transcrição estão relacionados
com os resultados obtidos in vitro realizados com RT-PCR. . Análise da
sequência mostrou similaridade de 98% com o vírus da gripe relatados
anteriormente em outros lugares.
Conclusões: Foi amplificado com sucesso as sequências especificas da gripe
A e Neuraminidase, usando o material das amostras. Os resultados sugerem
que esta estratégia poderia ser útil quando as amostras clínicas de RNA são
em quantidade limitada, ou quando é de má qualidade. Porque é um método
muito sensível, que detecta o RNA viral neuraminidase em amostras de
pulmão de pacientes que morreram de pneumonia causada pelo surto de
Influenza A (H1N1) na Cidade do México.
Hot-Start
PCR
Variação do PCR, onde a reação de
amplificação é iniciada à temperaturas
elevadas.
Protocolo
Aplicações
Testes genéticos;
Diagnóstico clínico;
Exames de sangue;
Forense;
Biodefesa.
Vantagens
Aumenta a especificidade, a sensibilidade
e a rentabilidade do produto;
Ideal para ensaios Quantitativos
Ensaios Multiplex
Sem Hot-start Com Hot-start
Vantagens
Desvantagens
Maior risco de contaminação
Trabalho intensivo
Artigo Objetivo: detectar a Babesia bigemina e Babesia bovis em bovinos de
Moçambique, utilizando dois métodos distintos de PCR.
Métodos: Para este estudo, amostras de sangue foram coletadas em uma fazenda. As amostras de DNA foram analisadas usando o PCR nested e o hot start PCR. Os primers foram selecionados para o hot start PCR baseado no suposto gene de uma protease aspártica, a babesipsin, presente em ambos Babesia bovis e Babesia bigemina.
Resultados: A combinação da hot start e primers longos (29-31 pb) foram determinantes neste estudo para o sucesso da amplificação e detecção, além de que sensibilidade foi aumentada. O babesipsin no hot start PCR foi mais sensível do que a PCR nested. Um total de 117 amostras de campo foram testadas, 104 foram positivas para Babesia bigemina (90%), 97 foram positivas para Babesia bovis (82%), 86 foram infecções mistas (52%) e apenas 2 foram negativas para ambas as espécies de Babesia (1,7%).
Conclusão: Os resultados confirmam que esta doença deve ser considerada como uma ameaça para o gado importado.
Bibliografia http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/
http://www.cabdirect.org/abstracts/19950101840.html
http://182.48.17.65/img/pcr/pcr_guide_gbl.pdf#page=12
http://omega.rc.unesp.br/mauricio/curso/bibliografia/8/220/PCR.pdf
http://sci.odu.edu/impa/files/hotstartPCR.pdf
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1517-83822007000300004&lang=pt
http://www.molecularstation.com/wiki/PCR
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20301005
http://www.uniscience.com.br/polimerases/phusion-hot-start-flex-dna-polymerase
http://pt.scribd.com/doc/72789166/PCR-apresentacao-e-PCR-em-tempo-real-aula
http://www.uniscience.com.br/polimerases/phusion-hot-start-flex-dna-polymerase
http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/genetics/pcr/pcr_protocol.htm
http://www.pcrstation.com/hot-start-pcr/
http://www.science-protocols.com/2007/10/in-situ-pcr_17.html
http://genome.cshlp.org/content/4/4/S151.full.pdf
http://www.readcube.com/articles/10.1186/1477-3155-1-3
Obrigada!!!