pcr para o diagnóstico da mastite bovina
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Aline LemesFernanda Aquino
Marília GomesViviane Pessin
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Inflamação das glândulas mamárias Prejuízos econômicos:1. Queda na produção2. Queda na qualidade3. Perda de teto4. Descarte de animais5. custos com drogas, veterinário e mão de obra
Perda mundial 35 bilhões $/ano Atividade leiteira
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Multifatorial1. Trauma2. Irritação química3. Infecção microbiana
Predomínio de Staphilococcus e Streptococcus
Tipos: sub clínica ou clínica
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Clínica Sub clínica
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IRRITAÇÃOPERSISTENTE
III
PERDA DO EPITÉLIO
SECRETOR
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Patógenos contagiosos:1. Contaminam os quartos – ordenha2. S. agalacteae, S. aureus, Corynebacterium
bovis
Patógenos ambientais:1. Fezes, cama, solo, represas...2. E. coli, S. dysgalacteae, S. uberis
S. aureus, S. agalacteae, S. dysgalacteae, S. uberis90 – 95% dos casos
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Etiológico é fundamental1. Rápido2. Barato3. Eficiente
Análise fenotípica:Expressão de fatores biológicos celulares – produção
de enzima, utilização de nutrientes, metabolismo, susceptibilidade aos agentes químicos
Análise genotípicaDetectam variações no DNA, normalmente estáveis e
pouco afetadas pelas condições ambientais – identifica espécie, virulência, transmissão e fonte de infecção
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Bacteriológico1. Caro2. Ineficiente3. Baixa sensibilidade4. Cultura bacteriológica lenta5. Isolamento e identificação6. Técnicas bioquímicas
Vacas sub clinicamente infectadas podem eliminar intermitentemente o patógeno
Cultura negativa por resíduos de antibióticos
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ETIOLÓGICOBacteriológico
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus resistente à
meticilinaStreptococcus
MOLECULAR PCR Multiplex PCR Ribotipagem Detecção de microrganismos no leite
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Local: EV – DMP – UFMG
Doações da Embrapa Gado de Leite, Universidade Federal de Lavras e Hospital das Clínicas da UFMG
As amostras foram mantidas em caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth Acumedia Manufacters) com 50% de glicerol a -20ºC até o momento do uso.
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Plano de execução do experimento
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PCR – Primer – amplifica segmentos específicos
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Extração de DNA1. Preparação da amostra: retira cálcio, principal
inibidor da PCR no leite
2. Extração: retira o DNA
3. Purificação do DNA: retira proteínas e debris celulares através do protocolo de Fenol-Clorofórmio
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Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura
Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em leite artificialmente contaminadas
Extração de DNA a partir de amostras de leite de tanque de expansão
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Padronização das PCRs Individual
Multiplex
Ambas com DNA obtido a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura
PCR Multiplex para detecção de microrganismos a partir das amostras de leite de tanque de expansão
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Avaliação da especificidade verificada:
Utilizando Streptococcus bovis, Staphylococcus intermedius e S. epidermidis, comumente encontradas no leite
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Especificidade dos Primers
Bandas de DNA esperadas para cada microorganismo
Exceto, S.aureus em que se observou 3 bandas com predomínio de 900pb na maioria
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Figura 1: Fragmentos de DNA amplificados por PCR a partir de culturas puras de S. aureus e Streptococcus spp.
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Sensibilidade do PCR a partir de culturas puras
PCR Individual 10pg de DNA
PCR multiplex 500pg de DNA
S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. aureus
MRSA 250pg de DNA
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Sensibilidade da PCR a partir de amostras do leite
PCR individual 10²UFC/mL
PCR multiples 10³UFC/mL
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Figura 2. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. agalactiae (270 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
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Figura 3. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. dysgalactiae (264 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
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Figura 4. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. uberis (330 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
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Figura 5. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. aureus (900 pb, 420 pb, 200 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
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Figura 6. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de MRSA (533 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
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Testes em amostras de leite de tanque de expansão
Nas figuras e na tabela a seguir se encontram os resultados obtidos das 30 amostras de tanque de expansão.
Não foi observada interferência do azidiol presente na amostra.
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Figura 7. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
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Figura 8. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
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Figura 9. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
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Tabela 1. Utilização da PCR multiplex para detecção de microrganismos em leite bovino com diferentes contagens bacterianas totais e contagens de células somáticas, diretamente do tanque de expansão.
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Teste diagnóstico
Controlar e erradicar doenças
OBJETIVO
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Para garantia de sucesso, temos como característica impressindível a Sensibilidade
Desenvolvimento de métodos rápidos e sensíveis para a diferenciação de microorganismos
Com isso, metódos genotípicos substituem métodos fenotípicos
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Métodos fenotípicos Métodos genotípicos
Falso negativo Rápida e acurada identificação
Valores ambientais interferem
Não tem interferência do meio (genoma)
Baixa reprodutibilidade Vantagem da reprodutibilidade
Baseia em características instáveis dos microorganismos
Rapidez Sensibilidade Reprodutibilidade
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A caseína é um dos principais inibidores presentes no leite, em associção com cálcio forma micelos
Adição de solução com alta concentração de EDTA quelam (eliminam os metais tóxicos) o cálcio dissolvendo os micelos de caseína
No experimento usou-se o tampão NET (alta [EDTA])
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No trabalho realizado utilizou-se bactérias Gram-positivas
parece celular mais resistenteparece celular mais resistente
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O método de extração para DNA dessas bactérias na amostra apresentada mostrou-se:
Eficiente Fácil realização Reagentes econômicos Equipamentos sofisticados não foram requeridos Pouca manipulação da amostra Tempo de análise de processo
aproximadamente 8 horas
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![Page 44: Pcr para o diagnóstico da mastite bovina](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081517/58747a551a28ab4a758b7bc5/html5/thumbnails/44.jpg)
Pré dipping e pós dipping
Terapia da vaca seca
Tratamento eficaz e eficiente
Descarte de animais crônicos
Manutenção regular da ordenhadeira mecânica
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Marisa Araújo Silva. Utilização de PCR multiplex para o diagnóstico etiológico da mastite bovina. Dissertação de mestrado UFMG. 2008.