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-‐ PCR (Reação em cadeia da Polimerase) -‐SEQUENCIAMENTO
GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Profa. Fabiana K. Seixas
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SEQUENCIAMENTO DE DNA
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" Clivagem química ou Método de Maxam-Gilbert (não é mais utilizado)
" Método de Sanger: de terminação de cadeia com didesoxirribonucleosídeo trifosfato.
" Manual
" Automatizado
SEQUENCIAMENTO DE DNA
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Método de Maxam-‐Gilbert
Clivagem de uma molécula de DNA com reagentes químicos que atuam especiOicamente em um determinado nucleotídeo
Grupo fosfato radioativo
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• Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de “Sanger”
SEQUENCIAMENTO DE DNA
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Método de Sanger
Polimerização
SEQUENCIAMENTO DE DNA
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SEQUENCIAMENTO DE DNA
Método de Sanger
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2´, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reação de polimerização da cadeia de DNA
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Seqüenciamento de nucleotídeos
pelo método do término do
crescimento da cadeia.
SEQUENCIAMENTO MANUAL
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SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO
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Anelamento do primer
Extensão do primer
Terminação da síntese: adição dos ddNTPs
Método de Sanger - Manual
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
32P
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E l e t r o f o r e s e em g e l d e po l iacr i lamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferença
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Auto-radiogramas de um gel de seqüenciamento de DNA
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Método de Sanger automatizado
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Seqüenciamento Manual X Automá3co
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Seqüenciando um Genoma
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Há duas estratégias empregadas no seqüenciamento de genomas:
1. Mapeamento prévio do genoma. Utiliza-se uma coleção de clones recombinantes contendo segmentos grandes do DNA total do organismo (fragmentados, subclonados e seqüenciados);
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Há duas estratégias empregadas no seqüenciamento de genomas:
2. DNA genômico é fragmentado em segmentos menores que são clonados e seqüenciados.
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Vídeo Seqüenciamento
www.scq.ubc.ca/.../
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Genômica -‐ Histórico
• 1977 – Técnica de seqüenciamento de DNA – Método de Sanger
• 1991 – Projeto Genoma Humano • 1995 – Primeiro genoma seqüenciado (Haemophylus in/luenzae)
• 2001 – Primeiro rascunho do Genoma Humano • 2003 – Conclusão do seqüenciamento do Genoma Humano • 2007 – Mais de 500 genomas seqüenciados
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Haemophilus influeanzae
Fleischmann et al., Science 269:496-512, 1995
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Science, July 28, 1995 v269 n5223 p496(17)
Whole-‐genome random sequencing and assembly of Haemophilus in8luenzae Rd. (8irst genome of free-‐living
organism ever completely sequenced). Robert D. Fleischmann; Mark D. Adams; Owen White; Rebecca A. Clayton; Ewen F. Kirkness; Anthony R. Kerlavage; Carol J. Bult; Jean-‐Fracois Tomb; Brian A. Dougherty; Joseph M. Merrick; Keith McKenney; Granger Sutton; Will FitzHugh; Chris Fields; Jeannine D. Gocayne; John Scott; Robert Shirley; Li-‐Ing Liu; Anna Glodek; Jenny M. Kelley; Janice F. Weidman; Cheryl A. Phillips; Tracy Spriggs; Eva Hedblom; Matthew D. Cotton; Teresa R. Utterback; Michael C. Hanna; David T. Nguyen; Deborah M. Saudek; Rhonda C. Brandon; Leah D. Fine; Janice L. Fritchman; Joyce L. Fuhrmann; N.S.M. Geoghagen; Cheryl L. Gnehm; Lisa A. McDonald; Keith V. Small; Claire M. Fraser; Hamilton O. Smith; J. Craig Venter.
ABSTRACT
An approach for genome analysis based on sequencing and assembly of unselected pieces of DNA from the whole chromosome has been applied to obtain the complete nucleotide sequence (1,830,137 base pairs) of the genome from the bacterium Haemophilus inOluenzae Rd. This approach eliminates the need for initial mapping efforts and is therefore applicable to the vast array of microbial species for which genome maps are unavailable. The H. inOluenzae Rd genome sequence (Genome Sequence DataBase accession number L42023) represents the only complete genome sequence from a freeliving organism.
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Organism Complete Draft assembly In progress total Prokaryotes 598 396 506 1500 Archaea 48 4 29 81 Bacteria 550 392 477 1419 Eukaryotes 24 125 176 325 Animals 5 53 83 141 Mammals 2 20 23 45 Birds 1 2 3 Fishes 3 6 9 Insects 2 20 17 39
Flatworms 1 3 4 Roundworms 1 3 13 17 Amphibians 2 2 Reptiles 1 1
Other animals 6 19 25 Plants 3 3 34 40
Land plants 2 2 27 31 Green Algae 1 1 7 9
Fungi 10 49 28 87 Ascomycetes 8 41 20 69 Basidiomycetes 1 6 4 11 Other fungi 1 2 4 7 Protists 6 18 27 51
Apicomplexans 1 9 6 16 Kinetoplasts 1 2 5 8 Other protists 4 7 15 26
total: 622 521 682 1825
Projetos
Genomas
Revised: Nov 17, 2007 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/gpstat.html
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Projetos
Genomas
Revised: Mar 29, 2011
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OBRIGADA PELA ATENÇÃO