79

PCR và gi i trình t

Gi i trình t là gì?

DNA là c s hóa h c c a gen. Phân t DNA là m t chu i xo n kép c a hai m ch n

c c u t o t 4 lo i nucleotide khác nhau nh các base c a chúng, ó là: A (adenine),

C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này n i k t liên ti p v i nhau

theo m t th t xác nh. Gi i trình t c a gen t c là phát hi n c th t s p x p c a 4

lo i nucleotide này trên phân t DNA.

Các ph ng pháp gi i trình t gene

1. Ph ng pháp hóa h c gi i trình t DNA

Vào n m 1977, Maxam và Guilbert phát minh c m t ph ng pháp hóa h c

có th gi i trình t m t o n DNA. Nguyên t c c a ph ng pháp này là: (1) Tr c

h t là ph i ánh d u m t u c a o n DNA c n ph i gi i trình t b ng m t g c

phospho ng v phóng x (32P); (2) X lý các o n DNA ã ánh d u này v i ch t

hóa h c có th làm bi n i c hi u m t ho c hai lo i base c a nucleotide trên o n

DNA. Ví d , dimethylsulphate bi n i Guanine b ng các thêm m t g c methyl v

trí nitrogen th 7 (N7), hydrazine làm bi n i Thymine và Cytosine, hydrazine và

NaCl làm bi n i Cytosine, acid làm bi n i Guanine và Adenine, NaOH

làm bi n i Adenine và Cytosine v i Adenine u tiên h n Cytosine. Nh v y trong

giai o n này, ph i dùng ít nh t 4 ng nghi m và trong m i ng nghi m, DNA c x

lý v i m t l ng r t gi i h n c a m t trong các ch t hóa h c nêu trên m i ng

nghi m ch có ch a các o n DNA mà trên m i o n DNA này ch có m t v trí

nucleotide c hi u v i ch t hóa h c là b bi n i; (3) Các nucleotide b bi n i này

s b l y ra kh i m ch khung ng-phosphate (sugar-phosphate backbone) c a o n

DNA và nh ó tách ra c các o n m ch n có m t u ánh d u 32P và m t u

b m t phân t base vì phân t này ã b l y ra kh i m ch khung (hình 37). (4) Th c

hi n i n di m u DNA ã x lý trong 4 ng nghi m này trên 4 hàng c a m t gel

polyacrylamide bi n tính các m ch n trong m u di chuy n trong gel không b bi n

i trong quá trình i n di. Nh ó, sau khi hoàn t t i n di, các m ch n s b d ng

t i các v trí khác nhau, tùy thu c vào m ch n này dài ng n khác nhau, theo hàng d c

su t chi u dài c a gel. Áp gel ã i n di này trên m t phim nh y tia X, các v trí d ng

80

l i c a các m ch n trên gel i n di s t o thành các v ch trên phim vì các v trí này

u b ánh d u phóng x do các m ch n u có m t u c ánh d u b ng 32P.

T các v ch trên phim x ký t ghi này (autoradiography), có th c c trình t c a

các nucleotide c a o n DNA (hình 38).

Ph ng pháp hóa h c xác nh trình t DNA c a Maxam và Gilbert trên th c t

không ph i d th c hi n vì c n ph i xác nh khá nhi u thông s t i u cho thí nghi m,

trong ó khó nh t là ph i xác nh c n ng gi i h n nh t c a các ch t hóa h c sao

cho khi x lý m u DNA thì trên m i o n DNA ch có m t base b bi n i ng v i

m i v trí c a base b bi n i thì s có m t m ch n có u ánh d u 32P c tách ra.

Chính vì s ph c t p này, ph ng pháp Maxam Gilbert hi n nay ít c s d ng, mà

thay vào ó các nhà khoa h c dùng ph ng pháp enzyme v i nhi u u i m v t tr i

h n.

M ch n DNA 32P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..

32P32P32P32P32P

Các m ch DNA n có u b

ánh d u 32P

Hình 37: Các m ch n có m t u ánh d u v i 32P và m t u base Guanine b l y kh i m ch khung do bbi n i. Các m ch n này có chi u dài ng n khác nhau tùy thu c vào v trí c a Guanidine trên

o n DNA.

C

T+G

G

A>C

3� 5� G C C C A C T T C A G A A G A A A A A G G

Hình 38: Hình x ký t ghi trên phim nh y tia X m t gel polyacrylamide sau khi ã i n di. Các v ch là v trí các m ch n b d ng l i sau i n di. Các v trí này g n hay xa kh i i m là tu kích th c c a m ch ndài hay ng n khác nhau. T các v ch này, c trình t c a o n DNA trong m u.

81

2. Ph ng pháp enzyme gi i trình t DNA

Ph ng pháp enzyme c Sanger và các c ng s phát minh c ng vào n m 1977,

và ngày hôm nay ph ng pháp này càng ngày càng c hoàn thi n và th c hi n d

dàng t i các phòng thí nghi m. Nguyên t c chung c a ph ng pháp này có th tóm t t

nh sau:

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddATP

GGAATGC

CCTTACG CATACGTGG

m i GGAATGC

CCTTACG CATACGTGG

CGTAAGG*C*CdACGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA

CGTAAGGdCCGTAAGG*CdCCGTAAGG*C*C*AdC

CGTAAGG*C*C*A*CdGCGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG

CGTAAGG*C*C*A*C*GdTCGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT

CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdACGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*CdACGTAAGG*CdCCGTAAGGdC

i n di trên gel

Chi u i n di

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddCTP

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddGTP

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddTTP

Hình 39: Ph ng pháp Enzyme gi i trình t DNA. o n DNA c chèn vào m t vector t i m t v trí bi t rõ trình t , nh ó có th t ng h p c các m ch n có m t u là m i, m t u là các nucleotide t n. Trong hình các nucleotide ánh d u * là các nucleotide c dánh d u 35S, nh v y các m ch

n c ánh d u.

82

Tr c h t chèn các o n DNA c n ph i xác nh trình t vào m t vector là phage

hay plasmid t i m t v trí mà trình t chu i c a v trí này ã c xác nh rõ. Chuy n

th t c là a các vector mang o n chèn DNA này vào t bào vi khu n nhân b n

các vector này thành nhi u b n sao, sau ó tách chi t và tinh khi t các vector t vi

khu n thành các vector t do.

Dùng các o n m i b sung m t cách c hi u v i trình t c a vector t i v trí

chèn o n DNA. Thêm vào ng ph n ng men DNA polymerase và 4 lo i nucleotide

t do (g i là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và m t l ng r t gi i h n các

nucleotide t n (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, c ng nh dNTP,

có 4 lo i ddNTP t ng ng v i 4 base A, T, C và G). Ph n ng c th c hi n trong 4

ng, và m i ng cho m t lo i ddNTP khác nhau. B t u t o n m i, men DNA

polymerase s kéo các dNTP vào t ng h p m ch n b sung v i m ch DNA chèn

trên vector, và s t ng h p m ch n s b d ng

l i t i v trí mà ddNTP c kéo vào thay vì

dNTP. Lý do s t ng h p b d ng l i là vì

ddNTP có c u trúc hóa h c b m t i g c OH t i

v trí carbon th 3 c a ng deoxyribose, mà

g c OH t i v trí này chính là n i dNTP k

ti p c g n vào. Nh v y trong ng ph n ng

có các m ch n DNA có các chi u dài khác

nhau t ng ng v i các v trí trình t các

nucleotide trên o n DNA g c (hình 39).

gi i trình t , ng i ta dùng ph ng pháp

i n di trên gel polyacrylamide bi n tính. V i

ph ng pháp ánh d u m i hay các dNTP b ng

ng v phóng x 32P hay 35S thì sau khi i n di,

c ng gi ng nh ph ng pháp c a Maxam và Gilbert, ng i ta phát hi n các v ch i n

di b ng k thu t x ký t ghi, và t các v ch này gi i c trình t c a o n DNA

(hình 40).

T 3� CGCAGTCCTAGCTTAGCGG 5�

A C G T

Hình 40: Hình x ký t ghi m t k t qu gi itrình t DNA trên gel polyacrylamide. T k t qu này,

c c trình t DNA

83

3. Gi i trình t b ng máy t ng (automated sequencer)

Các phòng thí nghi m hi n nay u dùng ph n ng gi i trình t b ng ph ng pháp

enzyme, nh ng khi làm gi i trình t thì th ng dùng các máy t ng ch không dùng

k thu t x ký t ghi nh tr c ây. th c hi n c gi i trình t b ng máy t ng

thì các m ch DNA n s n sinh trong ng ph n ng gi i trình t ph i c ánh d u

hu nh quang các v ch i n di c a các m ch n này phát sáng khi i qua m t chùm

tia sáng laser. C u t o c a m t máy t ng gi i trình t g m hai ph n chính y u, ó

là: ph n i n di v i gel polyacrylamide và ph n phát hi n các v ch i n di. Ph n i n

Hình 41: S kh i m t máy t ng gi i trình t dùng b n gel polyacrylamide. Máy g m hai ph n: ph ni n di gel polyacrylamide, ph n phát hi n các v ch i n di. Các v ch i n di c các con m t c m

quang phát hi n khi i qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hi u c m t c m quang truy n vmáy tính hi n th thành các nh c ng sáng

A G C T T A C G G A C T A A T G C

Màu 1

Màu 2

Màu 3

Màu 4

Tia LASER

Máy tính

M t c m quang

A G C T T A C G G A C T A A T G C

Màu 1

Màu 2

Màu 3

Màu 4

Tia LASER

Máy tính

M t c m quang

84

di polyacrylamide có th là m t b n gel hay là m t ng mao qu n ch a gel. Ph n phát

hi n v ch i n di là nh ng con m t c m quang và m t chùm tia laser i qua tr c nó.

Nguyên t c ho t ng c a máy là trong su t quá trình i n di, m i khi có m t v ch

i n di i qua chùm tia laser thì v ch i n di s phát sáng lên và s phát sáng này s

c con m t c m quang

ghi nh n và l u l i thành

m t nh c ng sáng

trong bi u . T bi u

c a các nh c ng

sáng này, máy s so dòng

c a các nh t ng ng

v i các màu cu i cùng

phân tích thành trình t

c a o n DNA (hình 41).

V i các máy th h

m i sau này, ng i ta có

th dùng 4 màu hu nh

quang khác nhau ánh

d u 4 lo i ddNTP, nh v y

ph n ng gi i trình t có

th th c hi n c ch

trong m t ng nghi m và

khi gi i trình t ch c n i n di trên m t hàng mà không c n ph i trên 4 hàng khác nhau

nh tr c ây (hình 42). N u dùng di n di mao qu n thì tùy thu c vào s mao qu n có

th ch y m t l n mà ng i làm thí nghi m có th có s m u cho m i l n ch y nhi u

hay ít. Hình 43 là s kh i minh h a cho m t gi i trình t 8 mao qu n (CEQ8000,

hay CEQ8800). Tùy thu c vào qui mô c a phòng thí nghi m cùng v i s m u gi i

trình t mà phòng thí nghi m có th trang b gi i trình t ít hay nhi u mao qu n. Ví d

v i ABI thì có nhi u lo i: ch 1 mao qu n, 4 mao qu n, 16 mao qu n, 48 mao qu n, r i

96 mao qu n. Phòng thí nghi m R&D c a công ty Nam Khoa tr c ây nhu c u gi i

trình t không nhi u nên ch trang b CEQ8000 có 8 mao qu n (hình 44). Nh ng nay

GGAATGCCCTTACGCATACGTGG

CGTAAGGCCdACGTAAGGCdCCGTAAGGCCACdGCGTAAGGCCACGTdACGTAAGGdCCGTAAGGCCACGTA TdGCGTAAGGCCAdCCGTAAGGCCACGdTCGTAAGGCCACGTAdT

*CGTAAGGCCACGTA TdG*CGTAAGGCCACGTAdT*CGTAAGGCCACGTdA

*CGTAAGGCCACGdT*CGTAAGGCCACdG

*CGTAAGGCCAdC*CGTAAGGCCdA

*CGTAAGGCdC*CGTAAGGdC

thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP,ddGTP, ddCTP

Chi u i n di

GGAATGCCCTTACGCATACGTGG

CGTAAGGCCdACGTAAGGCdCCGTAAGGCCACdGCGTAAGGCCACGTdACGTAAGGdCCGTAAGGCCACGTA TdGCGTAAGGCCAdCCGTAAGGCCACGdTCGTAAGGCCACGTAdT

*CGTAAGGCCACGTA TdG*CGTAAGGCCACGTAdT*CGTAAGGCCACGTdA

*CGTAAGGCCACGdT*CGTAAGGCCACdG

*CGTAAGGCCAdC*CGTAAGGCCdA

*CGTAAGGCdC*CGTAAGGdC

thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP,ddGTP, ddCTP

thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP,ddGTP, ddCTP

Chi u i n di

Hình 42: V i các ddNTP ánh d u hùynh quang khác nhau, các antrình t t n cùng u 5� s c ánh d u b ng 4 màu hùynh quang khác nhau t ng ng v i nuleotide t n là A, hay T, hay C hay G. Chính nh v y không c n ph i th chi n ph n ng gi i trình t trong 4 ng ph n ng.

85

do nhu c u nghiên c u và d ch v ngày càng nhi u nên ã trang b thêm ABI 3130XL

có n 16 mao qu n (hình 44).

Các th h máy v sau ngày càng có nh ng ch ng trình i kèm ch ng nh ng

có th hi n th t ng các ký t hoá h c c a trình t DNA mà còn giúp các nhà nghiên

c u có th : (1) Phát hi n các chi ti t c n thi t trên trình t nh mã kh i u, mã k t

thúc, vùng c m (ORF: Open Reading Frame), trình t c hi u cho các enzyme c t

gi i h n (restriction enzyme), các d u n di truy n...mà các chi ti t này r t c n thi t

l p b n gen...(2) Phiên d ch trình t trong vùng c m (t c là vùng trình t có ý

ngh a) thành trình t acid amin c a m t protein, nh ó có th xác nh, ph ng oán,

hay làm c s ban u hi u c ch c n ng c a gen...(3) T ng so sánh trình t

DNA trong thí nghi m hay

m t trình t DNA n p vào

máy, hay có th trình t acid

amin c a protein, v i các

trình t khác ã có trong ngân

hàng d li u phát hi n

c s t ng ng v i trình

t ã bi t, nh ó làm c s

xác nh gen và ch c n ng

gen...

Hình 44: Máy gi i trình t CEQ8000 có 8 mao qu n c a Becman Coulter và ABI 3130XL có 16 mao qu nc a Applied Biosystem c trang b t i phòng thí nghi m R&D c a công ty Nam Khoa

C c [-] Laser

C mquang

i n th cao

Mao qu n

C c [-] Laser

C mquang

i n th cao

C c [-] Laser

C mquang

i n th cao

Mao qu n

Hình 43: S kh i m t máy di n di mao qu n dùng gi i trình t DNA

86

PCR là công c giúp hoàn thi n và m r ng ph áp d ng k thu t gi i trình t

PCR ã óng góp r t nhi u vào công ngh gi i trình t làm cho công ngh gi i trình t

ngày càng d dàng h n và thu n ti n h n. Không ch v y PCR còn làm cho gi i trình t

có nhi u ng d ng h n không ch trong nghiên c u mà c trong ch n oán n a.

Tr c khi có PCR thì ng i ta ch có th gi i trình t các o n gene c cô l p và

chèn vào plasmid vì ch có nh v y thì m i có th nhân b n c o n gene mu n gi i

trình t thành nhi u b n sao v i s l ng ch y c ph n ng gi i trình t . Ngoài

ra, enzyme polymerase c ng là lo i enzyme không ch u nhi t nên ph n ng gi i trình t

ch th c hi n 37oC, do v y mà v n t i u các thành ph n c a ph n ng r t là khó

ng th i hi u qu c a ph n ng gi i trình t c ng không cao.

T khi có s ra i c a k thu t PCR thì k thu t gi i trình t c ng có nh ng ti n b

r t v t b c. Ch c n dùng PCR là có th nhân b n o n gene mu n gi i trình t thành

hàng t b n sao hoàn toàn gi ng h t nhau và s n ph m khu ch i này có th a vào

gi i trình t tr c ti p mà không c n ph i chèn vào m t plasmid gi i trình t n a. S phát

minh ra k thu t nhân b n DNA trong ng nghi m b ng PCR c ng giúp cho vi c c i ti n

ph n ng gi i trình t kém hi u qu tr c ây tr nên hi u qu h n nh áp d ng enzyme

polymerase gi i trình t b n v i nhi t ph n ng gi i trình t c th c hi n qua các

chu k nhi t gi ng h t PCR, mà ngày nay chúng ta g i là ph n ng chu k nhi t gi i trình

t . V i ph n ng chu k nhi t gi i trình t thì hi u qu ph n ng t t h n r t nhi u, ng

th i t i u hóa các thành ph n c a ph n ng c ng d dàng h n r t nhi u. Có th nói

chính s ra i và hoàn thi n k thu t PCR ã giúp t ng t c k thu t gi i trình t không

nh ng trong v n hoàn thi n nó, mà c trong v n ph m vi áp d ng.

Gi i trình t b gene ng i

1. Làm th nào gi i trình t b gene ng i

Gi i trình t b gen ng i t c là gi i trình t toàn b th t s p x p các nucleotide

A, T, C, và G c a DNA trong 23 c p nhi m s c th t bào ng i. D án gi i trình t b

gen ng i c Ti n S James Watson, cha c a phát hi n c u trúc DNA, ra t

gi a th p niên 1980. n tháng 10 n m 1990, d án c ra i v i kinh phí 3 t M

kim do HGP (Human Genome Project) c a Vi n Qu c Gia Y T Hoa K lãnh o

cùng v i s tham gia c a nhi u trung tâm nghiên c u b gen ng i c a nhi u qu c gia

87

trên th gi i. Do tiên oán giá tr kinh t mang l i t vi c gi i mã thành công b gen

ng i s r t l n, nên ã có m t s công ty sinh h c chuyên v b gen ng i ã c

hình thành. S nh p cu c c a các công ty t nhân này ã t o nên m t b u không khí thi

ua cho vi c khai phá bí m t v b gen c a loài ng i chúng ta, càng g n n nh ng

ngày n ích càng c c k ngo n m c. Trong cu c ch y ua này, nh ã áp d ng m t

ph ng pháp c c k c áo k t h p gi a công ngh PCR, công ngh gi i trình t

DNA v i công ngh tin h c, nên ch v i kinh phí kho ng 200 tri u m kim, Ti n S

Crag Venter c a Celera Genomics tr thành ng i d n u thành công nh t trong vi c

gi i trình t c g n nh hoàn toàn b gen ng i.

Cái khó kh n c a vi c gi i trình t b gene ng i là không th nào tách t ng i

phân t DNA c a t ng nhi m s c th r i em gi i trình t i phân t DNA nguyên

v n này. Các nhà khoa h c c a HGP c ng nh các trung tâm khác trên th gi i nghiên

c u v b gen ng i th ng c t các i phân t DNA c a nhi m s c th m t cách nh

h ng theo b n di truy n, r i em gi i trình t các o n c t DNA này, và cu i cùng

tìm cách ghép n i chúng l i v i nhau cho úng v trí c a chúng trên i phân t DNA.

Ph ng pháp này òi h i ph i t n nhi u th i gian và công s c vì có nhi u khi các o n

c t DNA quá l n, r t khó gi i trình t c ng nh khó cho k t qu gi i trình t chính xác.

Do ó, v i m i m t o n DNA các nhà khoa h c ph i th c hi n gi i trình t ít nh t là

7 l n m b o l p l i. Chính vì v y, v i cách ti p c n này, nhi u v trí trên các

i phân t DNA v n không th gi i trình t c mà t ó các nhà khoa h c c a HGP

có th hoàn t t vi c x p úng v trí các o n DNA ã gi i trình t trên i phân t

DNA c a nhi m s c th .

Ti n s Crag Venter ã th c hi n m t ph ng pháp gi i trình t b gen ng i m t

cách hoàn toàn khác h n (hình 45). Tr c h t ông cho tách chi t toàn b DNA nhi m

s c th t bào ng i r i phá bung m t cách không nh h ng các i phân t DNA

thành các m nh DNA nh h n. em gi i trình t t t c các m nh DNA nh này. Cu i

cùng dùng nh ng máy i n toán c c m nh mà ông ã h p tác v i công ty ABI ch t o

ra, dò tìm các u trùng l p c a các m nh DNA nh này l p n i vào úng các v trí

c a chúng trên i phân t DNA c a nhi m s c th . Chính nh áp d ng chi n l c gi i

trình t này mà Celera Genomics ã gi i trình t r t nhanh các m nh DNA, ch c n l p

l i cho m i m nh DNA có 5 l n, và ã x p úng g n nh h u h t v trí c a các m nh

88

DNA ã gi i trình t trên i phân t DNA c a nhi m s c th . H n th n a, TS. Crag

Venter c ng tuyên b công ty ã tri n khai m t k thu t m i có th làm cho ph ng

pháp gi i trình t b gen c a công ty, v n d ã là ph ng pháp nhanh nh t r i, tr

thành nhanh h n n a. Cu i n m 2000, Celera Genomics ã hoàn thành vi c gi i trình

t b gen c a chu t v i 2.3 t �ký t hóa h c� trong ó có r t nhi u t ng ng v i b

gen ng i, nh v y s giúp các nhà khoa h c d dàng h n trong vi c truy tìm các ch c

n ng c a các gen.

2. K t qu gi i trình t b gene ng i

Sau g n 10 n m nghiên c u

th c hi n v i nh ng n m càng v

sau càng sôi ng không khí thi

ua do s nh p cu c c a các công

ty t nhân, ngày 26 tháng 6 n m

2000, t i Tòa B ch c v i s

hi n di n c a T ng Th ng Hoa

K Bill Clinton, hai khoa h c gia

M là Ti n S Crag Venter i

di n cho Celera Genomic và Ti n

S Francis Collins i di n cho

HGP (HGP: Human Genome

Project) c a NIH (NIH: National

Institute of Health) công b m t

cách long tr ng là ch ng trình

gi i trình t b gen ng i ã

hoàn t t. ây chính là m t th i

kh c l ch s c c k quan tr ng và

áng nh c a nhân lo i, ánh d u

ngày nhân lo i ã có trong tay

m t b n sinh h c c n thi t

b c vào k nguyên m i v i

nhi u h a h n các thành t u v

caggca t t t c ca gc

gg cggc g g a gca g

c g a g cg g cg g

c ca gc a g t gagg a g a c ag c

c ca gc a g t gag g a g a c a g c

c g ag cgg cgggg cggc gga g ca g

caggca t t t cca g c

c gagc g g cggc gga g ca g gca t t t cca g c a g t gag g a g a c a gct g t a c

ccgtcaaccggagtta

acgttct

DNA t mhi m s c thc phá bung thành

nhi u mãnh nh

Các mãnh DNA nhc gi i trình t

Các mãnh DNA nh c ch ng trình phân tích t ng tìm các u trùng l p, nh ó tái hi n

c trình t c a i phân t DNA

Hình 45:Ph ng pháp gi i trình t b gen ng i c a công ty Celera Genomics: tr c h t tách chi t toàn b DNA c a nhi m s cth t bào ng i, sau ó phá tung DNA thành các m nh nh ,gi i trình t t t c các m nh nh này, cu i cùng nh ch ng trình vi tính c c m nh n i k t các o n DAN nh này l iv i nhau b ng cách dò tìm các u trùng l p nh v y tái hi n

c m ch DNA nguyên th y

89

i v sinh y h c trong t ng lai. Dù thành công c a các nhà khoa h c gi i trình t

c 3.1 t các �ký t hóa h c� làm nên b gen ng i ã c ví nh s ki n l ch s

con ng i b c lên m t tr ng (ngày 26 tháng 7 n m 1969, t khoang b phi thuy n

Apollo, Neil Armstrong b c xu ng i d o trên m t tr ng và ánh d u th i i m con

ng i th c hi n c hoàn toàn c m ã t ng ao c b y lâu: kh c d u chân mình

trên b m t ch H ng), nh ng ây ch a ph i là th i i m mà con ng i ã to i nguy n

c c m hi u bi t t ng t n c b gen c a mình.

Th t s cho n th i i m ó các nhà khoa h c Công ty Celera Genomic hãy

còn ch a gi i trình t c 3% b gen ng i, t c kho ng 150 tri u, và công vi c này

òi h i ph i t 1 n 2 n m n a m i có th hoàn t t vì 3% còn l i này n m trên ph n

khó gi i trình t nh t. Còn HGP thì thành công ít h n, hãy còn nhi u o n trình t c a

b gen mà các nhà khoa h c c a HGP ch a gi i c và c ng có nhi u o n trình t ã

gi i c nh ng h v n ch a s p x p vào úng v trí. Ngoài ra, cho dù các nhà khoa

h c có gi i trình t c m t cách tr n v n b gen con ng i, thì cu n sách c a i

s ng (the book of life) này hãy còn ch a c c, nh Gerald Rubin, Phó Giám c

Nghiên C u Y Sinh H c c a Vi n Y H c Howard Hughes gi i thích: �Cu n sách c

vi t b ng m t ngo i ng r t ph c t p, c n ph i có m t th i gian dài chúng ta m i hi u

c�. Th t v y, có th t ng t ng là n u các trình t c a b gen ng i c in ra

thành sách thì s c n ph i kho ng 200 cu n và m i cu n dày ph i 500 trang. Có 3000

trang n m r i rác trong 200 cu n sách trên là có ý ngh a t c là có gen, mà cho n hi n

nay ch m i có m t s ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa h c ã c c t c là

xác nh c gen. Hãy còn vài trang (kho ng 3%) ch a vi t xong và nh ng trang này

là nh ng trang khó vi t nh t vì thu c nh ng vùng khó gi i trình t nh t trong b gen

ng i.

Cho n tháng 4 n m 2003, các trang khuy t này ã c các nhà khoa h c vi t

hoàn t t. Tuy v y, m t vi c r t l n hi n ang t ra tr c m t các nhà khoa h c ó là

ph i xác nh c các trình t nào là gen và ch c n ng c a các gen này. Ch có 3%

c a b gen ng i là mang gen t c là mang trình t có ý ngh a và hi n nay các nhà khoa

h c c ng ch a bi t chính xác là th t s có bao nhiêu gen trong b gen ng i. Câu tr

l i ph ng ch ng nh t là t 28.000 n 140.000 gen, và g n ây nh t có l là ang g n

n con s chính xác h n, ó là 30.000 gen. Trong kho ng 30.000 gen này, các nhà

90

khoa h c hi n ch bi t c ch c n ng c a kho ng 10.000 gen, hãy còn 20.000 ch a

bi t ch c n ng c a chúng. ây chính là m t cu c ua m i c ng h a h n y sôi ng

vì k t qu t ng ch ng m t c a cu c ua, t c k t qu c a vi c xác nh c chúc n ng

c a t ng gen, u h a h n nh ng áp d ng c c k ngo n m c và y tri n v ng trong

sinh h c c ng nh y h c.

3. Gi i trình t b gene ng i � cu c ua ch a k t thúc

Gen chính là trình t các nucleotide trong chu i DNA ch huy c s t ng h p

m t protein. Chính vì v y xác nh c ch c n ng c a m t gen t c là xác nh c

protein mà gen t ng h p có c u trúc nh th nào và có nhi m v gì trong c th s ng.

Sau k t qu gi i trình t b gen ng i, hi n nay các nhà khoa h c ang có nhi u chi n

l c có th nhanh chóng phát

hi n ch c n ng c a các gen trong

b gen ng i. Chúng tôi xin trình

bày ra ây ba trong s nh ng chi n

l c ó.

(1) Nh k t qu gi i trình t

b gen ng i, các nhà khoa h c s

nhanh chóng xác nh các trình t

mang gen. V i các k thu t sinh

h c phân t hi n i nh k thu t

PCR, các nhà khoa h c s d dàng

nhân b n các gen này trong ng

nghi m r i dòng hóa chúng vào các

vect sau ó nh các h t bào

bi u hi n bi u hi n các protein.

V i cách này các nhà khoa h c s

nhanh chóng thành l p c m t

th vi n các protein c a các gen có trong b gen ng i. V n ti p theo là ph i xác

nh các protein trong th vi n protein là có ch c n ng gì? bi t c ch c n ng c a

protein trong th vi n, các nhà khoa h c s th nghi m các protein này h th ng các

lo i nuôi c y t bào tìm hi u m i giao ti p gi a protein th nghi m v i t bào ích,

Dùng PCR t ng h p các gen

Clone vào các vector

a vào các h th ng t

bào bi u hi n

L p th vi nprotein

Th nghi m trên các lo i t bào ích

Hình 46: Chi n l c t o th vi n protein ò tìm ch c n ng c a gen, tóm t t là t gen t ng h p các protein, trtrong th vi n protein, r i th trên các h th ng t bào ích phát hi n ch c n ng c a protein, t ó bi t

c ch ng n ng c a gen.

91

nh ó xác nh t bào ích nào có ph n ng v i protein th nghi m, và nh v y s

bi t c ch c n ng protein bi t c ch c n ng c a gen. (hình 46).

(2) Gi i trình t b gen c a ng v t h u nh

nh dã nhân (r t gi ng b gen ng i) hay chu t,

ây là nh ng b gen c a các ng v t có nhi u

t ng ng v i b gen ng i, nh ng l i trên các

ng v t mà các nhà khoa h c r t d làm thí

nghi m. Trên b gen ng v t này, các nhà khoa

h c s d dàng phát hi n các gen, và các ch c n ng

c a gen thông qua s thay i ho c bi u hi n c a

m t tính tr ng nào ó c a ng v t thí nghi m m t

khi các nhà nghiên c u dùng các k thu t sinh h c

phân t gây t bi n hay làm knock-out ngay trên nh ng vùng mang gen c a b gen.

M t khi ã xác nh c gen và ch c n ng c a m t gen trên ng v t thí nghi m, các

nhà nghiên c u s d dàng truy t m và phát hi n gen và ch c n ng c a gen này trên b

gen ng i nh phát hi n s t ng ng v trình t trong gen ng i v i gen c a ng

v t thí nghi m.

(3) Chúng ta bi t r ng m t protein c t ng h p t gen ho t ng nh m t vai trò

c u trúc ho c vai trò ch c n ng là nh hình dáng c a nó v i các h c nh hay các n p

g p. Chính vì v y cho nên dù m t gen có c gi i mã và bi u hi n c m t protein,

thì c ng ch a th xác nh c ch c n ng c a protein này n u ch a bi t c các

hình dáng c a nó. Chính vì v y mà Vi n Qu c Gia Khoa H c Y Khoa T ng Quát t i

Hoa K ang chi m t kho ng 20 tri u ô la thành l p các trung tâm Proteomics, là

các trung tâm chuyên nghiên c u và l u tr các c u trúc và hình dáng c vi tính hóa

(hình 47) c a các protein có trong thiên nhiên. Các vi n Proteomics nh v y c ng

ang và s thành l p t i các n c khác. Các nhà khoa h c hy v ng r ng trong vòng 10

n m t i ây, các vi n proteomics s l u tr c hình dáng c a g n 10.000 protein có

trong thiên nhiên. Con s này dù hãy còn r t nh so v i m t s l ng khá l n các

protein th c s có trong thiên nhiên, nh ng các nhà khoa h c c ng hy v ng r ng th

vi n này s c bao g m t t c hình d ng c a t t c các protein có liên quan n sinh

h c và y h c, vì các protein khác không có trong danh sách c ng ch là các bi n th hay

Hình 47: Hình d ng c a phân t kháng thc vi tính hóa

92

các ng d ng v i các protein có trong danh sách mà thôi. Nh các trung tâm

proteomics và th vi n các hình d ng protein, các nhà nghiên c u ch c ch n s d dàng

h n trong xác nh các ch c n ng c a gen.

4. Vi t Nam có th tham gia vào cu c ua này không?

Hi n nay các nhà khoa h c ang c g ng nghiên c u khai phá các bí m t trong

cu n sách i s ng ghi chép y trình t b gen ng i v i nhi u tri n v ng s có

các ng d ng cách m ng trong sinh h c, y h c, c ng nh các l nh v c khoa h c khác

và s a n nhi u ti n b m i cho loài ng i trong k nguyên m i này. Các nhà y-

sinh h c c a chúng ta hoàn toàn có th tham gia trong cu c ua này, vì theo chúng tôi

thì sinh h c phân t i v i các qu c gia thu nh p th p có th coi nh là m t ngành

khoa h c ti u th công nghi p hi n i. Ti u th công nghi p vì không nh t thi t

ph i có các máy móc c c k hi n i và t n kém mà v n có th th c hi n c các k

thu t b ng các thi t b không quá t ti n. Hi n i vì nhà nghiên c u th c hi n k

thu t d a trên các ki n th c hi n i v i các k t qu hoàn toàn có th có óng góp l n

vào kho tàng ki n th c hi n i c a nhân lo i. V n chính là chúng ta ph i có chu n

b nh th nào và ph i có chi n l c tham gia vào cu c ua nh th nào.

chu n b , quan tr ng nh t là chúng ta ph i c g ng xây d ng và ào t o trong

c ng nh ngoài n c i ng các nhà nghiên c u y sinh h c có trình và b n l nh

ngang t m v i th gi i. Các nhà nghiên c u c a chúng ta không ch ph i có ki n th c

và k n ng v chuyên môn sinh-y h c mà còn ph i có kh n ng ti p c n khai thác

c kho tàng ki n th c c ng nh các d li u ngày càng c p nh t trên m ng internet.

Ngoài ra, chúng ta ph i tránh tình tr ng ào t o các nhà nghiên c u nh ng l i không

chu n b cho h các i u ki n c ng nh ph ng ti n làm vi c. Chính vì s thi u th n

i u ki n c ng nh ph ng ti n làm vi c mà các nhà nghiên c u c a chúng ta dù có

trình và b n l nh n âu c ng s thui ch t d n nhi t huy t c ng nh kh n ng theo

th i gian, và d n d n tình tr ng ch y máu ch t xám trong c ng nh ngoài n c s

không th tránh kh i.

V chi n l c, thì có l chúng ta c ng c g ng tham gia cu c ua v i nh ng ích

nh m là gi i quy t và khai thác nh ng c thù trong n c. Ch n h n khai thác nghiên

c u c ch m c sinh h c phân t tác ng c a các d c li u trong n c b ng cách

xây d ng các mô hình thí nghi m ex-vivo trên các c y t bào phát hi n s c m ng

93

bi u hi n gen khi cho các h th ng nuôi c y t bào này ti p c n v i các trích phân c a

d c li u. Phát hi n các c ch tác ng c a d c li u m c sinh h c phân t , ch c

ch n chúng ta s khai thác c các ngu n d c li u quí mà chúng ta v n có s n trong

n c. Ngoài ra, dân t c Vi t c a chúng ta là m t dân t c khá thu n nh t, bên c nh ó

chúng ta c ng có nh ng dân t c ít ng i s ng r t t p trung và ch a h b lai tr n, ây

chính là c s cho các nghiên c u v s phân b các gen c ng nh các mã di truy n

cho các nghiên c u ng d ng sau này phát hi n, ch a tr ho c phòng ng a các b nh

lý di truy n.

Nhân lo i ang b c vào thiên niên k 21 v i hành trang mang theo là các ti n b

v t b c nhi u l nh v c khoa h c khác nhau, trong ó có khoa h c Y h c và Sinh

h c. M t hành trang c n y u nh t cho m t cu c s ng d dàng h n và t t p h n là

cu n sách c a i s ng v i h u nh toàn b trình t c a b gen ng i mà các nhà khoa

h c m i v a k p hoàn t t. Vi c khai thác cu n c m nang sinh h c c n y u nh t này c a

nhân lo i òi h i m t s h p tác a ngành c ng nh chuyên ngành. Chính vì v y nên

chúng tôi cho r ng chúng ta c ng không th b qua y u t h p tác và h c h i: chúng ta

ph i h p tác và h c h i t b n bè qu c t , và quan tr ng nh t là ph i bi t h c h i và

bi t h p tác gi a chúng ta v i nhau.

ng d ng công ngh gi i trình t t i phòng thí nghi m NK-Biotek

Phòng thí nghi m NK-Biotek và n v R&D c a công ty Nam Khoa ã ng d ng khá

thành công k thu t gi i trình t vào các d ch v ch n oán và nghiên c u. D i ây xin

a ra m t s thành t u tiêu bi u.

1. ng d ng k thu t PCR và gi i trình t nh danh vi khu n

Nh phát hi n c m t c p m i mà sau ó c t tên là NK16s-F và NK16s-R

khu ch i c o n DNA dài 527 bps ch a các trình t giúp phân bi t gi ng và loài

các vi khu n, phòng thí nghi m NK-Biotek và n v R&D c a công ty Nam Khoa ã

xây d ng thành công qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình gi i trình t tr c

ti p s n ph m PCR này nh danh vi khu n. Thành công này ã giúp phòng thí

nghi m NK-Biotek và n v R&D c a Nan Khoa th c hi n c khá nhi u ng d ng

trong các xét nghi m d ch v và nghiên c u

94

a. ng d ng trong xét nghi m vi sinh lâm sàng nh danh vi khu n k khí

Vi khu n k khí là các vi khu n ch có th t ng tr ng trong i u ki n khí tr ng

không có oxygene phân t (O2). Vi khu n k khí có th là các vi khu n có l i c s

d ng trong công ngh vi sinh, tuy nhiên v m t y h c r t có nhi u loài vi khu n k khí

là các tác nhân nhi m khu n n i sinh hay ngo i sinh. B nh lý nhi m khu n k khí r t a

d ng, t các nhi m khu n t i ch k t h p v i các vi khu n không k khí, hay các nhi m

khu n h th ng, hay các nhi m khu n c hi u. Do a d ng nh v y nên vi c xác nh

m t nhi m khu n k khí v m t lâm sàng không ph i d dàng. Trong khi ó xét nghi m

vi sinh lâm sàng t i các phòng thí nghi m th ng b h n xét nghi m vi khu n k khí vì

g p ph i nhi u tr ng i v k thu t nh là: (1) Có c ph ng ti n chuyên ch b nh

ph m sao cho gi c b nh ph m luôn i u ki n k khí cho n khi n c phòng

thí nghi m. (2) T o khí tr ng k khí nuôi c y phân l p c vi khu n k khí t các

b nh ph m. (3) nh danh cho c vi khu n k khí. (4) Làm c kháng sinh vi

khu n k khí.

Trong các tr ng i trên, tr ng i khó gi i quy t nh t là v n nh danh vi khu n

k khí phân l p c t các b nh ph m. Có nhi u b th nghi m nh API 20A c a Bio-

Merieux, RapIDTM ANA II c a Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA

card (Vitek)...có s n trên th tr ng cho các phòng thí nghi m chuyên dùng cho nh

danh vi khu n k khí. Tuy nhiên các b th nghi m này khó có s n t i Vi t Nam vì nhu

c u không nhi u. H n n a các b th nghi m này c ng có nhi u h n ch nh t l nh

danh sai khá cao (19% i v i API 20A, 10% i v i RapIDTM ANA II), t l không

th nh danh n loài c ng nhi u (38% i v i RapIDTM ANA II, 29% i v i API

20A).

Chính vì v y nên có th th c hi n c xét nghi m vi sinh lâm sàng vi khu n

k khí, phòng thí nghi m NK-Biotek và n v R&D c a công ty Nam Khoa ã tri n

khai m t gi i pháp toàn di n, bao g m ch t o c môi tr ng chuyên ch CaryBac

có th gi b nh ph m i u ki n k khí trong th i gian 24 gi h n c th i gian c n

thi t chuy n m u t lâm sàng n phòng thí nghi m, s d ng n nh ph ng ti n

t o khí tr ng k khí b ng các túi Anaerocult A c a Merck, th c hi n c kháng sinh

vi khu n k khí b ng b th nghi m kháng sinh k khí do n v R&D nghiên

c u và thi t k ra. Trong nh danh vi khu n k khí, phòng thí nghi m NK-Biotek và

95

n v R&D c a công ty Nam Khoa ã a ra m t ti p c n hoàn toàn m i và hi n i,

nh ng l i ít t n kém nh t, ó là gi i pháp gi i trình t m t o n ch a trình t c hi u

gi ng và loài n m trong gene 16S c a vi khu n.

Có th tóm t t qui trình nh sau: Vi khu n m c trên h p th ch phân l p c g t

vào n c mu i sinh lý vô khu n t c 0.5 � 1 McF. Sau ó un cách th y sôi

trong 10 phút. ngu i r i ly tâm 13.000RPM trong 5�. L y 5 l d ch n i cho vào PCR

mix 45 l ch a s n các thành ph n k c c p m i NK16s-F và NK16s-R khu ch i o n

DNA dài 527 bps ch a trình t c hi u loài trên gene 16S c a vi khu n. Ch y ch ng

trình nhi t PCR g m 1 chu k 95oC/5� kích ho t enzyme hot start Taq polymerase,

r i 40 chu k 94oC/15�-60oC/30�-72oC/1�. S n ph m PCR sau ó c tinh s ch b ng

b �Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem� c a Promega. S n ph m tinh s ch c

i n di trên th ch và sau ó nh l ng b ng quang ph GenQuant c a Pharmacia, sau

ó c a vào ph n ng gi i trình t 2 chi u s d ng m i xuôi và m i ng c c a

PCR th c hi n trên b thu c th �DTCS cycle sequencing kit� c a Becman Coulter.

Ch ng trình luân nhi t c a ph n ng gi i trình t v i b thu c th trên là 30 chu k

96oC/20�-50oC/20�-60oC/4�. S n ph m c a ph n ng gi i trình t c t a b ng

ethanol, r i sau ó c ch y i n di gi i trình t trên máy gi i trình t CEQ8000. K t

qu gi i trình t c so chu i b ng ch ng trình blast search trên ngân hàng d li u

gene c a NCBI. T k t qu so chu i, chúng ta s có c k t qu nh danh vi khu n.

Sau này, v i các trang b thêm nh i n di b ng DNA chip c a Bio-analyzer và máy

gi i trình t ABI 3130XL 16 capillary, qui trình c a ph n ng gi i trình t và i n di

gi i trình t c ng ã c nghiên c u t ng thích v i các trang b này. C th là

thay vì i n di trên gel r i nh l ng b ng quang ph 260/280 thì k t h p c hai b ng

i n di và nh l ng trên Bio-analyzer DNA chip c a Agilent; thay vì dùng DTCS

là ph n ng gi i trình t thì dùng �BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit�

c a ABI v i ch ng trình luân nhi t c a ph n ng gi i trình t là tr c h t 1 chu k

96oC/1�, theo sau 25 chu k 96oC/10�-50oC/5�-60oC/4�. S n ph m c a ph n ng gi i

trình t sau khi t a b ng ethanol, c ch y i n di gi i trình t trên máy gi i trình t

ABI 3130XL v i gel POP 7 và mao qu n 50cm. Hình 48 là m t k t qu nh danh

b ng gi i trình t 16s rDNA vi khu n k khí phân l p t m u m xoang c a b nh nhân.

Phòng thí nghi m NK biotek ã áp d ng ti p c n này trong n m 2008 cho xét nghi m

96

Hình 48: K t qu gi i trình t 16s rDNA tr c khu n Gram [+] phân l p k khí t b nh ph m m xoang l y t b nh nhân cho phép k t lu n ây là Propionibacterium acnes

vi sinh lâm sàng vi khu n k khí v i các m u b nh ph m là 39 m u m xoang l y t

b nh nhân b viêm xoang m n tính. K t qu xét nghi m cho th y có 31% (18/59) c y ra

tác nhân vi khu n k khí và k t qu nh danh b ng ph ng pháp gi i trình t 16s

rDNA cho th y có 11% (2/18) Veillonella (c u khu n Gram -), 17% (3/18) Prevotella

buccae (tr c khu n Gram -), 22% (4/18) là Propionibacterium acnes, 6% (1/18) là

Streptococcus aginosus, 17% (3/18) là Streptococcus constellatus, 17% (3/18) là

Streptococcus gordonii, 6% (1/18) là Peptostreptococcus micros, và 6% (1/18) là

Peptostreptococcus stomatis. K t qu này cho th y PCR và gi i trình t 16s rDNA là

m t gi i pháp k thu t hoàn toàn có th s d ng nh danh vi khu n k khí, gi i

quy t c khâu k thu t ph c t p và khó kh n nh t trong qui trình xét nghi m vi sinh

lâm sàng vi khu n k khí.

b. Phát hi n ch t l ng các s n ph m probiotic cho ng i và cho th y s n

Probiotic chính là các vi sinh v t không gây b nh, c dùng làm s n ph m tr

sinh qua ng n hay u ng s d ng trên ng i, gia súc, hay th y s n phát huy hi u

qu ch ng l i các nhi m trùng nh các c ch nh c nh tranh ch t dinh d ng và ch

97

bám c a vi sinh v t gây b nh, ph c h i vi khu n chí bình th ng cho ru t hay cho môi

tr ng, kích thích h th ng mi n d ch không c hi u c a c th v t ch ch ng l i vi

sinh v t gây b nh, hay ti t ra các ch t có tính kháng sinh kháng c các vi sinh v t

gây b nh.

Các vi khu n th ng c dùng làm probiotic là Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophilus, Bifidobacterium...và th ng c cung c p d i d ng b t ghi hàm l ng

và các lo i vi khu n có trong s n ph m. Do các vi khu n này th ng là các vi khu n d

m c nên ch v i các ph ng ti n phòng thí nghi m và các môi tr ng nuôi c y thông

th ng là có th s n xu t c các s n ph m probiotic nên hi n nay trên th tr ng c a

chúng ta xu t hi n khá nhi u s n ph m probiotic c s n xu t t r t nhi u c s trong

và ngoài n c s d ng không ch cho gia súc, th y s n mà c cho ng i. Chính vì

tình tr ng này nên có m t v n mà nhi u ng i r t quan tâm, ó là li u ch t l ng

c a các s n ph m probiotic hi n ang có m t trong th tr ng có th t s úng nh nhà

s n xu t công b hay không, c bi t là li u các vi khu n c ghi trong nhãn hi u s n

ph m có úng là vi khu n có trong s n ph m hay không, và hàm l ng có m b o

úng nh v y hay không.

tr l i câu h i trên, trong n m 2008 phòng thí nghi m NK-Biotek và b ph n

R&D c a Nam Khoa ã h ng d n m t s tài t t nghi p lu n v n Th c S có n i

dung tìm hi u ch t l ng các s n ph m probiotic dùng cho ng i và th y s n hi n

ang l u thông trên th tr ng. ki m tra hàm l ng thì gi i pháp k thu t không

khó, ch c n th c hi n c y nh l ng b ng ph ng pháp th ch hay ph ng pháp

láng trên b m t môi tr ng dinh d ng và i u ki n thích h p là có th cho c

k t qu nh l ng chính xác hàm l ng vi khu n ích có trong m u s n ph m c n

ph i ki m tra. Tuy nhiên xác nh chính xác tên vi khu n có trong s n ph m có

úng nh tên c nêu trong nhãn s n ph m hay không l i là m t v n không n

gi n vì các vi khu n probiotic nh B. subtilis, L. acidophilus...không ph i là các vi

khu n d dàng c nh danh n loài n u ch d a vào các tính ch t sinh v t hóa h c.

Chính vì v y, chúng tôi ã gi i pháp PCR và gi i trình t gene 16s rDNA c a vi khu n

phân l p c t các s n ph m probiotic xác nh danh tính c a vi khu n. K t qu

cho th y có khá nhi u lo i s n ph m probiotic s d ng cho ng i và cho th y s n có

v n v m t ch t l ng c v hàm l ng l n v vi khu n th t s có trong s n ph m.

98

B ng 13 và 14 trình bày k t qu cho th y s khác bi t gi a vi khu n th t s có trong

s n ph m probiotic so v i k t qu c nhà s n xu t công b trên nhãn.

STT Tên s n ph m Tên vi khu n trên nhãn s n ph m K t qu PCR và gi i trình t 16sDNA

1 Biosubtyl DL Bacillus subtilis 107/gr Bacillus subtilis 106/gr

2 Bidisubtilis (gói gi y) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr

3 Bidisubtilis (gói nhôm) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 106/gr

4 Bio � Acimin Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr

5 Biosubtyl II (gói) Bacillus subtilis 107/gr Bacillus pumilus 107/gr

6 Biosubtyl II (viên) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 108/gr

7 Subtyl Bacillus subtilis 107/gr Bacillus cereus 107/gr

8 Medilac � Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus cereus 106/gr

9 Bio Baby Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr

10 Bio Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr

B ng 13: K t qu nh danh b ng k thu t PCR và gi i trình t 16s rDNA và k t qu nh l ng các vi khu nth t s có trong các probiotic s d ng trên ng i

STT Tên s n ph m Tên và l ng* vi khu ntrên nhãn s n ph m

K t qu nh danh và nh l ng* th c t

1 DT-LACTO Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus

Bacillus pumilus Không tìm th yL. acidophilus

2 Bio-DW Bacillus subtilis 109/gr Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 106/gr Không tìm th yL. acidophilus

3 Probiotex-one Bacillus subtilis B. megaterium

4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 1011/gr Bacillus subtilis 104/gr

5 Biozyme for fish Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 106/gr

6 Novazyme F Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 105/gr

7 Subtyl-LA Bacillus subtilis Bacillus pumilus

8 NPV-Prozyme 90 Bacillus subtilis 106/gr Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis Không tìm th yL. acidophilus 106/gr

9 ProKura Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 107/gr

10 Men g u vàng Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus

Bacillus cereus Không tìm th yL. acidophilus

11 Biobac Bacillus subtilis Bacillus pumilus

12 Pond clear Bacillus subtilis 1011/grLactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 105/gr Không tìm th yL. acidophilus

13 Bio Pond Bacillus subtilis 108/gr Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 105/gr Không tìm th yL. acidophilus

14 Men Bac Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus

Bacillus cereus Không tìm th yL. acidophilus

15 Microzyme Bacillus subtilis ? Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 105/gr Không tìm th yL. acidophilus

16 Zymmix Lactobacillus acidophilus Acidovorax sp.

17 Lactovet Lactobacillus acidophilus Clostridium phylofermentant

18 Zeofarm Lactobacillus acidophilus 109/gr L. acidophilus 106/gr

*Ch nêu lên l ng các vi khu n mà nh danh b ng PCR và gi i trình t cho th y k t qu không sai l ch

B ng 14: K t qu nh danh b ng k thu t PCR và gi i trình t 16s rDNA và k t qu nh l ng* các vi khu nth t s có trong các probiotic s d ng cho th y s n

99

Phân tích các d ki n trình bày trong hai b ng trên, chúng ta th y i v i các s n

ph m probiotic dùng cho ng i, s sai bi t v hàm l ng gi a k t qu ki m tra so v i

công b trên nhãn không nhi u (không quá 10 l n), nh ng có n 50% tên vi khu n

công b không úng v i k t qu nh danh. Th m chí có n 4 s n ph m l i s d ng B.

cereus, vi khu n không c phép có m t trong th c ph m vì có kh n ng gây tiêu

ch y và ói m a do có th ch a các toxin, làm vi khu n tr sinh. i v i các s n ph m

probiotic dùng cho th y s n, k t qu ki m tra cho th y i v i vi khu n B. subtilis, có

6/15 m u không ph i là B. subtilis mà là B. cereus hay B. pumilus; và ch có m t s n

ph m là có ch a L. acidophilus còn h u h t là không tìm th y vi khu n này nh công

b trên nhãn. Hình 49 minh h a m t k t qu gi i trình t gene 16s rDNA xác nh vi

khu n là B. cereus trong khi nhãn s n ph m l i là B. subtilis. Còn v m t hàm l ng thì

th t th m h i, trong các các s n ph m c ki m tra th t s có vi khu n nh công b

thì a s hàm l ng t t gi m t 104 n 105 so v i công b . K t qu c a nghiên c u là

m t ti ng chuông báo ng các nhà s n xu t c ng nh các c quan ki m tra ch t

Hình 49: M t ch ng vi khu n phân l p t m t s n ph m probiotic n u chi d a vào tính ch t khu n l c và nhu mGram thì không th bi t ây không ph i là B. subtilis, nh ng khi gi i trình t 16s rDNA thì xác nh cây là B. cereus.

100

l ng nên quan tâm n v n ch t l ng c a các s n ph m probiotic s d ng cho

ng i và th y s n hi n ang l u hành t i Vi t Nam; và ki m tra c ch t l ng

các s n ph m probiotic thì ph i s d ng PCR và gi i trình t gene 16s rDNA vì ch có

gi i pháp này m i có th nh danh chính xác vi khu n c s d ng làm probiotic,

tránh nh m l n v i các vi khu n không có tác d ng probiotic hay th m chí có th c

h i.

Hình 50: M t phi u lý l ch 16s rDNA c a m t ch ng vi khu n dùng trong ki m chu n v i các thông tin v tính ch tkhu n l c, hình nh Gram, các tính ch t sinh hóa c b n, và quan tr nh nh t là trình t gene 16s rDNA

101

c. Xây d ng lý l ch 16s rDNA c a các ch ng vi khu n dùng trong ki m chu n

Trong n i ki m hay ngo i ki m vi sinh, r t c n thi t ph i dùng các ch ng vi sinh

có lý l ch nh danh ch ng chính xác. Các phòng thí nghi m vi sinh th ng yêu c u

cung c p các ch ng qu c t v i lý l ch xu t phát t nhà cung c p ch ng. Hi n nay r t

khó có th t mua các ch ng g c qu c t vì v n nguy c kh ng b sinh h c.

Chính vì v y gi i pháp hay nh t hi n nay là s d ng các ch ng g c qu c t hi n ang

l u gi t i các phòng thí nghi m, th m chí s d ng các ch ng g c phân l p c

nh ng ph i có lý l ch d nh danh chính xác n loài. ng tr c yêu c u này, phòng thí

nghi m NK-Biotek và n v R&D c a Nam Khoa ã xây d ng lý l ch 16s rDNA c a

t t c các ch ng qu c t ATCC, c ng nh m t s ch ng phân l p c và tiêu bi u cho

các gi ng và lo i vi khu n c n cho ki m chu n. Hình 50 minh h a m t lý l ch 16s

rDNA c a 1 ch ng vi khu n c phòng thí nghi m NK-Biotek và n vi R&D c a

Nam Khoa cung c p dùng trong ki m chu n.

Hình 51: M t k t qu nh danh b ng PCR và gi i trình t 16s rDNA c a m t ch ng vi sinh công nghi p cho th y ây là Acrobacterium tumefaciens, là vi khu n r t khó nh danh b ng vi sinh kinh i n

102

d. Làm xét nghi m d ch v nh danh vi khu n

C ng v i công ngh PCR và gi i trình t 16s rDNA c a vi khu n, phòng thí

nghi m NK-Biotek và n v R&D c a Nam Khoa ã và ang th c hi n d ch v nh

danh các vi khu n c dùng trong vi sinh công nghi m c ng nh vi sinh nông nghi m

c g i n t các công ty, nhà máy, hay t các yêu c u c a các tài nghiên c u.

M u c g i n nh danh có th là các ch ng vi khu n c y trên môi tr ng nuôi

c y, hay là các d ch tách chi t DNA, hay huy n d ch vi khu n. Có th nói v i gi i pháp

k thu t PCR và gi i trình t gene 16s rDNA, các vi khu n dù l n âu, dù khó nh

danh n âu c ng u c nh danh n loài. Hình 51 là k t qu m t ch ng vi

khu n dùng trong vi sinh công nghi m c yêu c u nh danh, và k t qu nh danh

cho th y ây là vi khu n Agrobacterium tumefaciens.

2. ng d ng k thu t PCR và gi i trình t nh danh vi n m

Trong các xét nghi m vi sinh thì nh danh vi n m có l là m t tr ng i l n nh t vì

n u s d ng các ph ng pháp kinh i n thì không ch phân tích hình thái i th và vi

th , v n d ph c t p và công phu, mà còn ph i làm cho c các kh o sát sinh v t hóa

h c khác nh ng hóa ng, phân tích các ch t bi n d ng...Chính vì v y thông

th ng ít có phòng thí nghi m vi sinh làm c xét nghi m vi n m.

Nh n di n c tr ng i k thu t chính y u này, phòng thí nghi m NK-Biotek và

n v R&D công ty Nam Khoa ã c g ng tìm gi i pháp v t qua, và sau m t th i

gian nghiên c u - th nghi m, ã xây d ng c m t gi i pháp k thu t ó là s d ng

PCR và gi i trình t gene 28s rDNA. Nguyên t c c a gi i pháp này là s d ng bNKFUNGI-DNAPREP do n v R&D c a công ty Nam Khoa ch t o tách chi t

DNA toàn ph n t m u vi n m hay m u th ch a vi n m c n nh danh, sau ó s

d ng PCR v i m t c p m i c t tên là NK28s-F và NK28s-R c hi u m t o n

DNA dài kho ng 260 bps có ch a các trình t c hi u gi ng và loài c a vi n m trên

gene 26s rDNA, và sau cùng là gi i trình t tr c ti p và 2 chi u s n ph m PCR nh

danh vi n m qua blast search trên ngân hàng d li u gene c a NCBI.

ng d ng gi i pháp k thu t này, phòng thí nghi m NK-Biotek và n v R&D

c a công ty Nam khoa ang th c hi n r t thành công hai d ch v , ó là:

103

Cand id a orthopsilo sis1 (2%)

M alassezia rest ricta 2 (3%)

Rhinocladiella at rovirens3 (5%)

Penicit rium cit rinum3 (5%)

Xylar ia curta1 (2%)

zophyllum cominune1 (2%)

Pichia guilliermondii1 (2%)

Pseud allescheria b oydi4 (7%)

Asperg il lus f lavus2 (3%)

Aspergillus oryzae11 (19%)

Aspergillus fumigat us23 (40 %)

Aspergillus niger4 (7%)

Neosarto rya f ischeri 2 (3%)

Bi u 12: T ng k t các k t qu phát hi n và nh danh n m b ng k thu t PCR và gi i trình t 28s rDNA trong các m u bi n m l y t m viêm xoang trên b nh nhân

a. Phát hi n và nh danh vi n m trong các bi n m l y ra t ph u thu t b nh nhân

viêm xoang

Tr c ây, các b nh ph m bi n m (fungus ball) th ng c các bác s tai m i

h ng g i n phòng thí nghi m gi i ph u b nh và k t qu th ng c nh n v sau 1

tu n là nhìn th y vi th các s i t n m nghi Aspergillus. Hi n nay v i xét nghi m PCR

và gi i trình t c th c hi n t i phòng thí nghi m NK-biotek thì các nhà lâm sàng s

có k t qu sau 2 ngày v i nh danh vi n m n loài. Bi u 12 t ng k t các k t qu

phát hi n và nh danh vi n m trong các bi n m c b nh vi n Tai M i H ng TP.H

Chí Minh g i n trong th i gian g n ây. Có t ng c ng 58 m u c g i n làm xét

nghi m, và c 58 u phát hi n và nh danh c vi n m là tác nhân gây b nh.

b. D ch v nh danh vi n m

Trên c s c a k thu t PCR và gi i trình t gene 28s rDNA, phòng thí nghi m

NK-Biotek và n v R&D c a công ty Nam Khoa tri n khai c xét nghi m d ch v

nh danh vi n m v i các ngu n m u là t các công ty, nhà máy trong l nh v c công

nông nghi p, hay là t các phòng thí nghi m c a các tr ng i h c hay c a các trung

tâm nghiên c u. Có th nói là cho n nay, h u nh không có m u vi n m nào g i n

phòng thí nghi m NK-Biotek là không có k t qu nh danh. Hình 52 và hình 53 minh

h a hai k t qu nh danh n m trong xét nghi m d ch v nh danh vi n m c a NK-

Biotek.

104

3. ng d ng PCR và gi i trình t phát hi n, nh l ng và xác nh genotype

HCV

Phát hi n, nh l ng và xác nh genotype HCV là các thông s mà bác s c n

ph i bi t tr c khi cho ch nh i u tr c hi u b ng interferon ph i h p v i ribavirin

là phát i u tr chu n cho b nh nhân có antiHCV [+]. Phát hi n HCV-RNA xác

nh là b nh nhân ang nhi m HCV, nh l ng HCV-RNA là xác nh l ng virus

tr c khi b t u i u tr và làm c s theo dõi hi u qu i u tr , còn xác nh

genotype HCV là giúp bác s i u tr quy t nh c th i gian i u tr cho b nh

nhân. Thông th ng các phòng thí nghi m lâm sàng s ph i th c hi n các yêu c u này

riêng l , ngh a là h ph i phát hi n HCV-RNA tr c, r i m i nh l ng, và cu i cùng

Hình 52: Vi n m có hình d ng vi th hình h t men nh góc trên trái cho k t qu PCR và gi i trình t 28s rDNA nh bên d i, và t trình t này k t qu blast search trên ngân hàng gene NCBI cho k tqu nh danh Candida tropicalis v i t ng ng 99%.

Hình 53: Vi n m có hình d ng vi th hình que dài nh góc trên trái cho k t qu PCR và gi i trình t 28s rDNA nh bên d i, và t trình t này k t qu blast search trên ngân hàng gene NCBI cho k tqu nh danh Rhinocladiella atrovirens v i t ng ng 99%.

105

m i nh genotype HCV và th ng thì

do yêu c u k thu t nên các xét

nghi m này u ph i b t u t m u

huy t thanh c a b nh nhân. Công ty

Nam Khoa l i s d ng m t ti p c n

khác r t m i m , ti n l i, và ít t n kém

h n phát tri n m t gi i pháp toàn

di n th c hi n c các yêu c u này

c a bác s cùng m t lúc. ó là gi i

pháp s d ng RT real-time PCR

phát hi n và nh l ng HCV-RNA

trong m u huy t thanh b nh nhân và

sau ó gi i trình t tr c ti p s n ph m

real-time PCR xác nh genotype

HCV b ng cách so chu i trình t gi i

c v i ngân hàng d li u genotype

HCV trên th vi n NCBI và th vi n

Los Alamos.

xác nh genotype HCV, ngoài

lý do là m t m t xích c a gi i pháp

toàn di n nh ã nêu trên, công ty

Nam Khoa ch n ti p c n gi i trình t

vì còn có nhi u lý do: (1) N u s d ng

kit InoLIPA c a Siemen (Bayer) là kit

c các nhà y h c th a nh n thì s là

m t l a ch n khá t n kém vì giá thành

c a kit này khá cao, k t qu có ôi khi

không phân bi t c subtype, và v i

version c thì có s nh m l n gi a 6a và 1b; (2) N u s d ng k thu t gi i trình t

vùng 5�NC c a HCV b ng h th ng gi i trình t kín Trugene c a Siemen (Bayer) dù

r t c nhi u nhà y h c th a nh n, nh ng c ng s là m t l a ch n t n kém vì giá

Yêu c u xác nh genotype HCV

nh l ng HCV-RNA b ng xét nghi m

RT-qPCR s d ng kit NKRT-HCVqPCR

Xác nh genotype HCV: gi i trình t tr c ti p s nph m HCVqPCR (#200bp trên vùng 5�NC)

ABI 3130XL (16 capillaries)

CEQ8000 (8 capillaries)

K T QU24 gi sau khi nh n m u

nh l ng 37.017 copies/ml

Ki u gene 1c

Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR và gi i trình t vùng 5�NC phát hi n, nh l ng và nh genotype HCV

106

Bi u 13: Phân b các genotype HCV trong 2000 m uhuy t thanh b nh nhân nhi m HCV c g i

n xét nghi m t i phòng thí nghi m NK-Biotek trong n m 2008

thành c a các v t li u tiêu hao i kèm theo h th ng này r t cao; (3) S d ng ph ng

pháp real-time PCR v i các probe c hi u là m t ti p c n n gi n và r ti n nh ng

không nh y c m cho ch n oán vì vùng khu ch i không ph i là vùng 5� NC (là

vùng c công nh n là nh y c m nh t cho ch n oán), không có kh n ng phân bi t

cao các subtype th ng g p vì khó thi t k c các probe c hi u n subtype, và

nguy c phát hi n chéo không c hi u mà v n c l m t ng là có kh n ng phát

hi n ng nhi m.

Chính vì các lý do trên, Phòng thí Nghi m Y Khoa NK-BIOTEK và công ty Nam

Khoa ã nghiên c u và xây d ng c ph ng pháp xét nghi m xác nh genotype

HCV b ng k thu t gi i trình t vùng 5�NC c a HCV nh ng thay vì s d ng h th ng

gi i trình t kín c a Trugene, s d ng h th ng gi i trình t m c a ABI (máy ABI

3130XL có 16 mao qu n) hay c a Becman Coulter (máy CEQ8000 có 8 mao qu n).

Ti p c n này ã mang n cho b nh nhân và các nhà lâm sàng nhi u l i i m: (1) Nh

gi i trình t tr c ti p c s n ph m PCR t real-time PCR s d ng m i và taqman

probe c hi u vùng 5�NC nên k t qu xét nghi m xác nh genotype luôn i kèm v i

k t qu nh l ng HCV-RNA. Do v y các nhà lâm sàng tr c khi quy t nh i u tr

c hi u cho b nh nhân ch c n cho m t ch nh xét nghi m xác nh genotype HCV

là mà không c n cho thêm xét nghi m nh l ng. (2) t c nh y cho ch n

oán nh s n ph m ích gi i

trình t xác nh genotype HCV

chính là s n ph m PCR d a trên

vùng ích 5�NC là vùng duy nh t

trên genome HCV c th a

nh n là nh y c m làm ch n

oán xác nh và nh l ng

HCV. (3) t c chính xác

trong xác nh genotype HCV

không khác bi t v i h th ng gi i

trình t kín Trugene nh gi i

trình t úng ngay o n ích mà h th ng Trugene s d ng trên vùng 5�-NC c a

genome HCV. (4) Nhà lâm sàng hay nghiên c u còn c cung c p thông tin v trình

107

t vùng 5�NC ã gi i c và các thông tin này r t quí giá trong các nghiên c u v

phylogenetic góp ph n trong nghiên c u ngu n g c nhi m trùng hay nghiên c u

ng nhi m HIV/HCV.

Hình 54 tóm t t qui trình phát hi n, nh l ng và nh genotype HCV b ng k

thu t RT real-time PCR trên ích là vùng 5� NC c a b gene HCV r i sau ó gi i trình

t tr c ti p s n ph m PCR xác nh genotype HCV. Trong n m 2008, t ng k t 2000

m u xét nghi m nh genotype HCV th c hi n t i phòng thí nghi m NK-Biotek, chúng

tôi nh n th t a s genotype c a HCV nhi m trên b nh nhân là 1b (58%), k ó là 6a

(17%). Bi u 13 t ng k t s phân b các genotype HCV trong 2000 m u huy t thanh

b nh nhân nhi m HCV c g i n xét nghi m t i phòng thí nghi m NK-Biotek

trong n m 2008.

4. Áp d ng PCR và gi i trình t phát hi n t bi n kháng thu c c a HBV

Hi n nay t i Vi t Nam, nh các ti n b v k thu t sinh h c phân t nh l ng

c HBV làm c s ánh giá hi u qu i u tr ; và phát c ng nh các thu c có

kh n ng i u tr b nh viêm gan virus B m n tính luôn có s n trên th tr ng bác s

d dàng l a ch n, nên vi c i u tr c hi u cho b nh nhân viêm gan virus B m n tính

ã ph bi n h n. Tuy nhiên, i u tr c hi u b nh lý viêm gan virus B m n tính b ng

các thu c kháng virus là m t i u tr lâu dài. Chính vì v y nên HBV (virus viêm gan B,

hepatitis B virus) có c h i ti p xúc lâu dài v i các thu c kháng virus và t o c các

t bi n kháng thu c, và t y n y sinh ra yêu c u ph i có xét nghi m phát hi n các

t bi n kháng thu c c a HBV, c bi t i v i các thu c nh lamivudine, adefovir và

entecavir là các thu c th ng c s d ng hi n nay.

phát hi n y các t bi n kháng các thu c nêu trên, n u ch n ti p c n real-

time PCR hay PCR-RFLP thì ch có th phát hi n c r t ít t bi n kháng thu c c a

HBV vì có quá nhi u các bi n th c a HBV ã làm cho vi c thi t k các probe phát

hi n t bi n hay thi t k các v trí enzyme c t gi i h n nh n di n b khó kh n r t

nhi u. H n n a cho n hi n nay, y v n ch m i báo cáo có real-time PCR và PCR-

RFLP phát hi n t bi n kháng lamivudine hai v trí 180 và 204 trong khi ó còn

nhi u t bi n n a không ch t o cho virus kháng lamivudine, mà c adefovir và

entecavir n a. Ch n ti p c n nh v y ch c ch n s không áp ng c th c t .

108

Do v y phòng thí nghi m NK-

BIOTEK và công ty Nam Khoa ã

ch n m t ti p c n khác d a trên

ph ng ti n và trang thi t b hi n

i ang có công ty, ó chính là

ti p c n PCR và gi i trình t m t

o n DNA dài 550 bps trên vùng

gene preS làm xét nghi m phát

hi n các t bi n kháng

Lamivudine, Adefovir và

Entecavir. Xét nghi m d a trên ti p

c n này hi n nay ang c nhi u

nhà lâm sàng và nghiên c u y h c

tin c y nh các u i m sau: (1)

Phát hi n c h u h t các v trí

t bi n có th x y ra gây ra

kháng 3 lo i thu c trên; (2) V i

nh y c m c a thi t b gi i trình t

hi n nay (sequencer ABI 3130XL,

gi i hai chi u), không ch t t c các

i m t bi n k trên u c gi i

n, mà c tình tr ng heterozygote

c a t bi n/hoang d i v n c

phát hi n; (3) V i trình t gi i

c, k t qu xét nghi m còn cung

c p thông tin m t cách chính xác

v genotype c a HBV mà không

c n ph i có ch nh xét nghi m

này t lâm sàng. Hình 55 mô t qui trình xét nghi m PCR và gi i trình t gene preS

phát hi n các t bi n kháng thu c và xác nh genotype HBV, trong ó k t qu phát

hi n t bi n c trình bày trong m t b ng li t kê các v trí t bi n t bi n kháng

Yêu c u tìm t bi nkháng thu c c a HBV

PCR khu ch i an chi u 550bps trên vùng

gene preS c a HBV

Tìm t bi n kháng thu c: gi i trình t tr c ti p s nph m PCR 550bps t vùng gene preS

ABI 3130XL (16 capillaries)

KEÁT QUAÛ (24 giôø sau khi nhaän maãu)

Genotype Genotype CPhát hi n t bi n

TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT

Kháng Lamivudine KQ

Kháng Adefovir KQ

Kháng Entecavir KQ

I169T K L80V/I K T184G KV173L K S85A K S202I KL180M Coù V84M K M250V KA181T K A181V/T K T184S K V214A K M204I Coù Q215S K

V207M/I K N236T K Q215S K

Hình 55: Qui trình xét nghi m phát hi n t bi n kháng thu c và xác nh genotype c a HBV b ng kthu t PCR và gi i trình t m t an DNA 550 bps trên gene PreS c a HBV

109

lamivudine, adefovir và entecavir ã c các nhà nghiên c u ghi nh n và t t c các v

trí t bi n này u n m trong gi i trình

c gi i.

Trong n m 2008, phòng thí nghi m

NK-Biotek c a công ty Nam Khoa ã th c

hi n c 455 xét nghi m PCR và gi i trình

t vùng gene PreS c a HBV, k t qu cho

th y có n 69% các tr ng h p là thu c

genotype B và 31% là genotype C, không

có các genotype khác. Có 46% phát hi n có

t bi n kháng lamivudine v i 30% v trí

204, 9% hai v trí 204 và 207, 6.5% 204 và 180, và 0.5% t bi n c 204, 180 và

207. K t qu này c trình bày trong bi u 14.

5. Áp d ng PCR và gi i trình t phát hi n t bi n precore/ promoter và genotype

HBV

Trong quá trình ph n ng v i các áp ng mi n d ch t b nh nhân, HBV có th b

t bi n precore và t bi n core promoter. t bi n precore là t bi n t i v trí

nucleotide 1896 t G thành A (G1896A) làm cho codon TGG tr thành TAG là m t

stop codon. t bi n này ã làm cho HBV không th t ng h p c HBeAg. Do v y,

khi th máu b nh nhân, không phát hi n c HBeAg mà HBV-DNA v n t n l i cùng

v i HBeAb [+]. ây là m t t bi n r t quan tr ng c n ph i c phát hi n vì b nh

nhân s có nguy c cao vào x gan hay ung th gan, c bi t khi phát hi n c thêm

t bi n core promoter t i hai v trí nucleotide 1762 và 1764 (A1762T, G1764A). Khi

b nh nhân b phát hi n mang HBV có các t bi n này thì ph i c i u tr b ng

thu c kháng virus su t i. Chính vì t m quan tr ng i v i lâm sàng nh v y nên

trong th i gian qua phòng thí nghi m NK-BIOTEK & công ty Nam Khoa ã xây d ng

c k thu t PCR và gi i trình t vùng gene core làm xét nghi m phát hi n t

bi n precore và t bi n core promoter và không ch v y, còn cho bi t thêm v

genotype HBV. Hình 56 minh h a qui trình này.

Xét nghi m này hi n nay ang c nhi u nhà lâm sàng và nghiên c u y h c quan

tâm và tin c y. Trong n m 2008, phòng thí nghi m NK-Biotek và công ty Nam Khoa

29.89

8.796.59

0.45

54.28

0

10

20

30

40

50

60

204 204+207 204+180 204+180+207 Khoâng ÑB

Bi u 14:S phân b t l các v trí t bi n kháng lamivudine phát hi n c

110

ã th c hi n 134 m u xét nghi m t

bi n precore và core promoter c a

HBV trên các b nh nhân b bác s i u

tr nghi ng có t bi n precore/core

promoter. K t qu cho th y có n 73%

phát hi n t bi n v i nhi u ki u t

bi n khác nhau, có th ch t bi n

precore, có th ch t bi n core

promoter, có th t bi n c promoter

và core promoter. Các thông tin này s

r t h u d ng các nhà y h c có th

nghiên c u sâu h n v m i liên h v i

lâm sàng, b nh h c và sinh b nh h c.

Bi u 15 trình bày t l phân b các

ki u t bi n phát hi n c.

6. PCR và gi i trình t phát hi n t

bi n kháng rifampicine và INH

c a M. tuberculosis

T n m 1996, chúng tôi ã b t u

tri n khai k thu t PCR phát hi n M.

tuberculosis và cho n hi n nay xét

nghi m PCR phát hi n M. tuberculosis

do chúng tôi phát tri n này ã c các

nhà y h c trong n c ch p nh n nh

nh y c m r t cao so v i kh o sát tr c

ti p và nuôi c y. V i PCR, k t qu phát

hi n M. tuberculosis có th n tay nhà

lâm sàng ch 24 gi sau khi g i m u i

xét nghi m. Nh u i m nhanh chóng

và nh y c m nên có th nói công c

PCR ã mang n m t l i ích không

Yêu c u tìm t bi nprecore/promoter c a HBV

PCR khu ch i an chi u 250bps trên vùng

gene core c a HBV

Tìm t bi n precore/promoter: gi i trình t tr cti p s n ph m PCR 250bps t vùng gene core

ABI 3130XL (16 capillaries) hay CEQ8000 (6 capillaries)

K T QU(24 gi sau khi nh n m u)

B nh nhân có HBeAg- HBeAb+,

HBVDNA+, ALT b t th ng

Hình 56: Qui trình PCR và gi i trình t phát hi n t bi n precore/promoter

3626%

3828%

2820%

2719%

21%

96%

G1896A

A1762T, G1764A

G1896AA1762T, G1764A

Không t bi n

A1762T

G1896AA1762T

Bi u 15: T l phân b các ki u t bi nprecore/core promoter phát hi n

c trong 134 m u xét nghi m

111

ch i cãi trong l nh v c ch n oán lao, v t qua các công c vi sinh kinh i n. M t v n

hi n nay ang c các nhà y h c quan tâm là làm th nào có th có c k t qu

kháng sinh vi khu n M. tuberculosis v i th i gian ng n h n, vì v i ph ng pháp vi

sinh kinh i n thì k t qu kháng

sinh ch có th có c sau

h n 2 tháng v i 1 tháng có

c vi khu n m c c trên

môi tr ng nuôi c y và 1 tháng

có k t qu kháng sinh .

Thông tin v kháng sinh mà

bác s c n bi t nh t là li u vi

khu n phân l p trên b nh nhân

có kháng v i thu c kháng

lao rifampicin, c coi là hi u

qu nh t cho n hi n nay hay

không có th ti p t c duy trì

hay ch nh cho b nh nhân

công th c kháng lao có

rifampicine.

Tr c th c t òi h i này,

phòng thí nghi m NK-Biotek

và n v R&D công ty Nam

405 427 Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG

Pro CCG

Leu CTA

Val GTC

/..../ Dele

Leu TTG

Tyr TAC Asp GAC Gln

CAG Asn AACArg

CGC Pro

CCC

Leu TTG Gln

CAG Trp

TGG

Pro CCG

(3%) (3%) (9%) (1%) (1%) (1%)

(28%)

(52%)

Hình 57: Vùng nóng v i các t bi n trên rpoB gene và t l th ng xãy ra

Yêu c uPCR phát hi n MTB Tìm t bi n kháng Rifampicine và INH

PCR phát hi n MTB d a trên khu ch itrình t 249bp trên IS6110

PCR khu ch i trình t c hi u ch a các

t bi n trên rpoB, katG, và inhA

K t qu phát hi nMTB trong vòng 24gi

Gi i trình t phát hi n t bi nrpoB, katG và inhA

t bi n rpoBL430P S431G Q432K/L 433 ins TTC(phe : F) D435G/A/V 440 ins TCGGGGTTG H445N/D/Q/S/R/L/Y/F S450L L452P I480V

t bi n katGS315T

t bi n inhAC-15T

K t qu kháng sinh MTB 72 gi sau khi l y m u àm

Hình 58: Mô t qui trình PCR và gi i trình t phát hi n các t bi n kháng rifampicin và INH c a vi khu n M.

tuberculosis tr c ti p t m u àm mà không ph i qua nuôi c y. K t qu n tay các nhà lâm sàng ch 72 gisau khi l y m u àm

112

Khoa ã nghiên c u và th nghi m m t qui trình PCR và gi i trình t khu ch i

m t vùng nóng c a gene rpoB c a M. tuberculosis có th phát hi n c t t c các

t bi n th ng x y ra t o cho vi khu n kháng c rifampicine (hình 57).

Ngoài vùng nóng này, chúng tôi c ng ã thành công trong xây d ng m t qui trình

phát hi n kháng INH b ng k thu t PCR và gi i trình t gene katG phát hi n v

trí t bi n th ng g p là S315T và gene inhA xác nh v trí t bi n C-15T. Hi n

nay qui trình này ã c chúng tôi áp d ng phát hi n tr c ti p các t bi n kháng

thu c này t b nh ph m mà không c n thi t ph i qua nuôi c y. Hình 58 minh h a tóm

t t qui trình c phòng thí nghi m NK-Biotek th c hi n phát hi n MTB và cho

luôn k t qu kháng sinh ch 72 gi sau khi l y m u àm t b nh nhân. Hi n nay

chúng tôi ang ti p t c nghiên c u có th có thêm các k t qu kháng sinh phát

hi n các t bi n kháng các thu c kháng lao khác nh ethambutol, PAS, PZA,

Ofloxacin... có th áp ng c m t cách y các yêu c u n t các nhà lâm

sàng trong cu c chi n u ch ng l i tình hình lao a kháng ngày càng tr m tr ng hi n

nay.