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(12) PEDIDO INTERNACIONAL PUBLICADO SOB O TRATADO DE COOPERAÇÃO EM MATÉRIA DE PATENTES(PCT)
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) Número de Publicação Internacional(43) Data de Publicação Internacional ' ' WO 2013/082682 Al13 de Junho de 2013 (13.06.2013) W P O I P C T
(51) Classificação Internacional de Patentes : Geraldo - Caixa Postal 6. 13 1, CEP: 13083-970 Campinas -C12P 7/06 (2006.01) C12P 7/00 (2006.01) SP (BR).B01D 11/04 (2006.01)
(81) Estados Designados (sem indicação contrária, para todos(21) Número do Pedido Internacional os tipos de proteção nacional existentes) : AE, AG, AL,
PCT/BR20 12/000470 AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW,BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK,
(22) Data do Depósito Internacional : DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM,23 de Novembro de 2012 (23.1 1.2012) GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN,
(25) Língua de Depósito Internacional : Português KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD,ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI,
(26) Língua de Publicação : Português NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU,
(30) Dados Relativos à Prioridade : RW, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ,
PI1 105 142-6 TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA,
7 de Dezembro de 201 1 (07. 12.201 1) BR ZM, ZW.
(71) Requerente : UNIVERSIDADE ESTADUAL DE (84) Estados Designados (sem indicação contrária, para todos
CAMPINAS - UNICAMP [BR/BR]; Rua Roxo Moreira os tipos de proteção regional existentes) : ARIPO (BW,
1831 - Distrito de Barão, Geraldo - Caixa Postal 6.13 1, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, SZ,
CEP: 13083-970 Campinas - SP (BR). TZ, UG, ZM, ZW), Eurasiático (AM, AZ, BY, KG, KZ,RU, TJ, TM), Europeu (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ,
(72) Inventores : MAUGERI FILHO, Francisco; Rua DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, ΓΓ, LT,Monteiro Lobato, 80, CEP: 13083-862 Campinas - SP LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI,(BR). ZAUSTEN, Remigius Reinerus Maria; Rua SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, GN,Monteiro Lobato, 80, CEP: 13083-862 Campinas - SP GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).(BR). VAZ-ROSSELL, Carlos Eduardo; Rua GiuseppeMáximo Scolfaro, 10.000, CEP: 13083-970 Campinas - SP Publicado:
(BR). — com relatório de pesquisa internacional (Art. 21(3))
(74) Mandatário : LAVRAS COSTALLAT SILVADO,Fernanda; Rua Roxo Moreira 183 1 - Distrito de Barão,
(54) Title : PROCESS OF EXTRACTIVE FERMENTATION AND USE THEREOF
(54) Título : PROCESSO DE FERMENTAÇÃO EXTRATIVA E USO DO MESMO
f AAD
A
fermentação C evaporaçãoB BB *"
_ _ meio EEdestilação e
.C C J )retificação
DD centrifugação
Figura 1
(57) Abstract : The present invention relates to a process of extractive fermentation. More specifically, the present invention relates∞ to a process of extractive fermentation that uses only one solvent capable of removing products and inhibitors simultaneously, andalso of cooling down the médium. In addition, the present invention relates to the use of said process. The present invention relates
0 specifically to the use of biodiesel, such as biodiesel from soybean oil, corn oil, castor oil, palm oil or macaúba palm oil, inter alia,o0 as a biocompatible extracting agent for the in situ extraction of fermentation inhibiting components and/or product, specifically the
fermentation product and inhibiting compounds present in musts from hydrolytic processes that use lignocellulosic raw material,starchy raw material, directly extractable carbohydrates, highly exhausted molasses with a high content of inhibitors, such as biotin,inter alia, or similar musts rich in carbohydrates, as well as for cooling down the fermentation médium by means of the actualsolvent.
(57) Resumo :(Continua na página seguinte)
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A presente invenção se refere a um processo de fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente invenção se refere a umprocesso de fermentação extrativa que emprega um único solvente capaz de remover produtos e inibidores simultaneamente, alémde resfriar o meio. Além disso, a presente invenção se refere ao uso do processo. Especificamente, a presente invenção se refere aouso do biodiesel, tais como biodiesel de óleo de soja, de milho, de mamona, de dendezeiro, de macaúba, entre outros, como agenteextrator biocompativel para a extração in-situ de produto e/ou componentes inibidores da fermentação, especificamente o produtoda fermentação e compostos inibidores presentes nos mostos provenientes de processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica, amilácea, carboidratos diretamente extraiveis, melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores como,entre outros, biotina, ou mostos similares ricos em carboidratos, como também para o resfriamento do meio da fermentação pelopróprio solvente.
PROCESSO DE FERMENTAÇÃO EXTRATIVA E USO DO MESMO
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um processo de
fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente
invenção se refere a um processo de fermentação extrativa
que emprega um único solvente capaz de remover produtos e
inibidores simultaneamente, e/ou resfriar o meio. Além
disso, a presente invenção se refere ao uso do processo,
por exemplo, para obtenção de etanol.
Antecedentes da Invenção
É fato conhecido que a obtenção de produtos de
fermentação, como ácidos orgânicos, solventes e álcoois, a
partir de carboidratos depende muito dos custos de matéria-
prima e custos de capital e energia, tornando outros
fatores de importância secundária. Desenvolvimento de
tecnologia de produção de combustíveis, alcoóis, solventes
ou ácidos orgânicos de segunda geração tem como princípio a
conversão de biomassa, geralmente ligno-celulósica,
amilácea e similares, ou carboidratos diretamente
extraíveis, transformando-as em produtos de interesse
económico de maior valor agregado.
Na fermentação alcoólica convencional e principalmente
na fermentação alcoólica de segunda geração, a
produtividade da mesma é limitada por efeitos de inibição,
seja pelo produto da fermentação ou por inibidores
introduzidos na extração dos carboidratos da matéria-prima
ou inibidores provenientes da hidrólise de biomassa ligno-
celulósica. O mesmo problema surge também na fermentação
para a produção de outros produtos como, por exemplo,
acetona, butanol, e produtos do tipo ácido orgânico como
ácido acético, ácido propiônico, ácido láctico, ácido
succinico, ácido butanóico, entre outros ou qualquer
combinação destes. Tecnologias desenvolvidas e atualmente
usadas na indústria pretendem diminuir este efeito de
inibição por detoxif icação do meio antes da fermentação
e/ou remoção do produto após a fermentação.
Para evitar a introdução de inibidores durante o
processo de extração de carboidratos da matéria-prima, por
exemplo cana de açúcar ou beterraba, a temperatura
empregada nesta etapa deve ser mantido baixa, em detrimento
de maiores rendimentos de extração destes carboidratos que
podiam ser obtidos para temperaturas maiores.
Para fermentações de biomassa hidrolisado, pesquisas
têm sido realizadas para desenvolver meios de remoção de
componentes inibidores do caldo hidrolitico antes da
introdução do mesmo no estágio de fermentação.
Um método convencionalmente aplicado é o tratamento
alcalino do caldo, por exemplo, a caleação: aumento de pH a
9-10 com hidróxido de cálcio. Além da neutralização do
caldo e sedimentação de sais com ácido sulfúrico na forma
de gipsita, compostos como furfural e HMF são quimicamente
alterados, diminuindo a toxicidade destes inibidores, o
qual foi descrito por Martinez e colaboradores, no trabalho
intitulado "Detoxification of dilute acid hydrolysates of
lignocellulose with lime" publicado na Biotechnology
Progress 17; 287-293 em 2001. Porém, o método tem a
desvantagem de reduzir a qualidade e a quantidade de
açúcar .
Para tratamentos baseados em adsorção de inibidores,
como a adsorção por carvão ativo ou troca iônica, uma
excelente adsorção dos compostos pode dificultar a
regeneração do carvão ou resina, de forma que sua
utilização se torna inviável, o qual foi comprovado por
Sainio e colaboradores no trabalho intitulado "Adsorptive
removal of fermentation inhibitors from concentrated
hydrolyzates of lignocellulosic biomass" publicado na
Bioresource Technology 102; 6048-6057 em 2011.
A aplicação de todos estes métodos possue efeitos
positivos na fermentação, mas a instalação e uso de um
estágio separado de tratamento do mosto antes da
fermentação encarece o processo, exceto para tratamentos
in-situ, como a detoxif icação microbiológica in-situ ou
extração liquido-líquido utilizando um solvente
biocompatível .
O mais simples tratamento microbiológico in-situ
emprega a própria levedura de fermento, eventualmente em
elevada concentração, para diminuir a toxicidade do meio,
ou pela imobilização, reciclo de células ou alimentação
controlada na fermentação batelada-alimentada, conforme
descreveu Talebnia e Taherzadeh, no trabalho intitulado "In
situ detoxif ication and continuous cultivation of dilute-
acid hydrolyzate to ethanol by encapsulated S . cerevisiae"
publicado no Journal of Biotechnology 125, 377-384, em
2006.
Porém, a desvantagem destes métodos é a limitada taxa
de detoxif icação pela levedura, prejudicando o crescimento
e produtividade e aumentando o tempo do processo
fermentativo, além do acúmulo de inibidores que não podem
ser convertidos como vários ânions de ácidos orgânicos
conforme comprovou Almeida e colaboradores no trabalho
intitulado: "Increased tolerance and conversion of
inhibitors in lignocellulosic hydrolysates by Saccharomyces
cerevisiae" publicado no Journal of Chemical Technology and
Biotechnology, 82 (2007) 340-349 em 2007.
O regime de fermentação extrativa contínua a vácuo foi
estudado por Átala em sua tese de doutorado intitulada
"Montagem, instrumentação controle e desenvolvimento
experimental de um processo fermentativo extrativo de
produção de etanol", FEA/UNICAMP em 2004 para remover o
etanol do meio durante a fermentação com um evaporador a
vácuo do tipo flash. O sistema, diminui a concentração de
etanol no meio até em torno de 5 °GL, ou seja, abaixo do
nível de inibição. Em consequência, a fermentação,
alimentada com fluxo com alto teor de açúcar (até em torno
de 500g/L) , mostrou menor inibição pelo etanol produzido,
alta viabilidade e produtividade volumétrica. Além disso, a
concentração de etanol no fluxo de vapor proveniente do
evaporador pode reduzir custos na recuperação do produto
conforme descreveu Junqueira e colaboradores no trabalho
intitulado "Simulation and optimization of the continuous
vacuum extractive fermentation for bioethanol production
and evaluation of the influence on distillation process"
publicado no Computer Aided Chemical Engineering 26; 827-
832 em 2009. A alta concentração de substrato resulta em
menor quantidade de água utilizado no processo integral de
produção de etanol, implicando menor gasto energético, e
flegmassa e vinhaça mais concentrados. O último resulta em
menor custo de secagem e transporte de vinhaça para os
campos de cana para fertilização dos mesmos. Também foi
previsto um resfriamento eficiente da dorna, pelo próprio
sistema a vácuo.
Neste sistema, ainda não foi estudado o uso de caldo
hidrolitico como substrato, a economia do uso de membrana
para reciclo de células e o evaporador flash na escala
industrial em combinação com a taxa elevada do reciclo pelo
sistema. O evaporador a vácuo pode provavelmente diminuir
as concentrações de inibidores voláteis como furfural e
ácido acético, enquanto outros inibidores como baunilha e
4-hidroxibenzaldeído podem acumular caso a massa celular
não seja bastante elevada para conversão efetiva dos
mesmos. Também, o estresse elevado do fermento, gerado pela
alta taxa de reciclo de levedura pode influenciar
negativamente a viabilidade da mesma em sistema de escala
industrial, embora este efeito não tenha sido observado na
escala de bancada. No entanto, é possível que a baixa
concentração de etanol seja de importância maior para
manter alta viabilidade. Neste contexto, é importante
lembrar que o fator de estresse devido à presença do
produto e de inibidores no caldo hidrolitico pode se somar
ao estresse que ocorre na membrana celular através do
sistema de reciclo de células. Por exemplo, os inibidores
fenólicos justamente perturbam a integridade da membrana
celular e outros inibidores provocam desvio de ATP para
reparos intracelulares, em detrimento de manutenção da
integridade da membrana celular.
A fermentação extrativa liquido-liquido envolve a
utilização de um solvente biocompativel durante a
fermentação alcoólica para remover o produto da fermentação
pelo solvente e , sobretudo, diferente de tecnologias
semelhantes propostos anteriormente por outros autores, os
inibidores no meio provenientes do processo de extração de
carboidratos da matéria-prima e/ou de caldo hidrolitico,
além de extração de calor deste meio de fermentação.
Há alguns exemplos no estado da técnica onde o
solvente empregado não é biocompativel, necessitando a
separação da levedura do meio ou vinho antes da extração ou
utilização de uma membrana para evitar contato direto entre
o fermento e o solvente, como por exemplo, decanol (Minier
., Goma G., 1998, Eckert e Schugerl, 1987, Kapucu e
colaboradores, 1999) , isso-octano, octano, gasolina,
querosene e diesel (Rahman e colaboradores, 2007) , fluidos
supercriticos, como gases comprimidos CO2, etano e propano
(Bothun e colaboradores, 2003) para remoção de etanol, ou
éter etílico ou acetato de etila (Cruz e colaboradores,
1999) . Nestes casos é impossível também a aplicação do
solvente como agente de refrigeração in-situ.
Por outro lado, existem ainda exemplos de utilização
de um solvente biocompativel. Kollerup e Daugulis, no
trabalho intitulado "Ethanol production by extractive
fermentation - solvent identif ication and prototype
development" publicado no The Canadian Journal of Chemical
Engineering, 64, 598 - 606 em 1986, fizeram uma avaliação
teórica de 1361 possíveis solventes para extração de etanol
através de propriedades como coeficientes de partição,
biocompatibilidade, disponibilidade e custo. Para a
biocompatibilidade foi observado que solventes com uma
cadeia de carbono com número de átomos de carbonos menor do
que 12 têm efeitos tóxicos ou inibidores no crescimento da
levedura (Minier e Goma, 1982) . Exemplos destes e outros
solventes descritos no estado da técnica são uso de óleo
oléico (Daugulis e colaboradores, 1987, Roffler e
colaboradores, 1987, Weilnhammer e Blass, 1994), dodecanol
(Gyamerah e Glover, 1996, Minier e Coma, 1981) e ácido
oléico para remoção de etanol (Jassal e colaboradores,
1994) ou para produção simultânea de biodiesel (Oliveira e
colaboradores, 1998, Csányi e colaboradores, 2004) , ácido
ricinoleico ou outros ácidos graxos (Waibel e
colaboradores, 2010, Boudreau e Hill, 2006) .
O uso de biodiesel, ésteres metílicos de ácidos graxos
de óleos vegetais, para remoção de etanol, butanol ou
acetona também foram avaliados e descritos no estado da
técnica (Waibel colaboradores, 2010, Grobben colaboradores,
1993, Ishizaki colaboradores, 1999) , mas não para remoção
de inibidores provenientes do processo de extração dos
carboidratos da matéria-prima, inibidores provenientes do
caldo hidrolitico e muito menos a utilização do solvente
para agente refrigerante do meio de fermentação. Utilizando
álcool oléico em um processo de sacarificação e fermentação
extrativa com celulase, Moritz e Duff (1996) chegaram perto
de realizar a extração simultânea de produto e inibidores
do caldo hidrolitico, mas sua literatura não mostra esta
compreensão .
Outros estudos mostram resultados positivos utilizando
polímeros para extração de etanol (Seiler e colaboradores,
2003, Offeman e colaboradores, 2008) e , para extração de
compostos fenólicos do caldo hidrolitico, polímeros cuja
separação do meio é induzida por um aumento da temperatura
(Hasmann e colaboradores, 2008) . A utilização de variações
de polietilenoglicol foi revisado por Banik e colaboradores
(2003) . A remoção de etanol por adsorventes, em combinação
de levedura imobilizada foi estudada por Cartón e
colaboradores (1998) .
Somente para a remoção in-situ de etanol (sem remoção
de demais inibidores ou refrigeração do meio) , com solvente
biocompatível, o processo foi testado na escala de bancada
e modelado, mostrando retornos de custos de investimento
para usinas existentes e novos usinas (Daugulis e
colaboradores, 1991, 1994) . O processo propiciou a
utilização de elevadas concentrações de açúcar, menor
inibição de etanol durante a fermentação e menor requisito
de energia.
A patente norte-americana US 4,865,973, depositada em
13 de agosto de 1986 em nome de UNIV KINGSTON e intitulada:
"Process for extractive fermentation" descreve um processo
para a produção de etanol por fermentação acoplado a uma
unidade de extração do produto formado, citando o ácido
ricinoléico e outros ácidos graxos como opções de solvente.
É descrito também que a extração é in situ e listadas como
vantagens: diminuição dos custos devido ao tamanho do
fermentador, redução dos custos de recuperação do produto
devido a maiores concentrações finais e redução do pré-
tratamento e custo de tratamento de resíduos, devido ao
menor fluxo aquoso. Além disso, o agente extratante pode
ser recirculado. A fermentação descrita no referido
documento ocorre de 20 a 80°C.
Empregar um solvente com características iguais ou
semelhantes ao biodiesel pode ter um efeito semelhante para
a remoção de inibidores desde que todas as demais condições
do processo também sejam iguais. Porém, a extração dos
inibidores não é apenas um efeito colateral, mas uma
tecnologia de pré-tratamento em si, reconhecendo o fato que
a remoção deve ser tal que a concentração final dos
inibidores no meio de fermentação deve ser igual ou menor à
concentração máxima que ainda permite um desempenho
satisfatório do micro-organismo . Sabendo que os inibidores
mostram efeitos de inibição sinérgicos, agravado por certas
faixas de pH e temperatura, o nível da remoção desejável de
inibidores se torna um complexo cálculo, envolvendo
coeficientes de partição de cada inibidor e a dependência
destes coeficientes ao temperatura, pH, concentração de
etanol e sais no sistema bifásico. Por isto, o nível de
remoção colateral de inibidores empregando o solvente no
primeiro lugar apenas para remoção do produto como sugerido
pelos outros autores do estado da técnica, dificilmente é
satisfatório no uso de caldo hidrolítico como matéria-
prima, ainda mais porque a concentração natural dos
inibidores dependa muito de modo de preparo desta matéria-
prima, seja por hidrólise ácida ou hidrólise enzimática. O
último também vale para inibidores em mostos obtidos por
extração de carboidratos da matéria-prima, como cana-de-
açúcar ou beterraba, cujas concentrações dependem
principalmente da temperatura empregada neste processo de
extração .
Nestes casos, será necessário empregar uma etapa de
pré-tratamento do mosto em um estágio anterior da
fermentação, enquanto que a tecnologia proposta pela
presente invenção pretende, justamente, entre outros,
tornar tal etapa obsoleta.
Contudo, a remoção simultânea e satisfatória de
inibidores empregando um solvente para remoção in situ de
produto da fermentação, não é óbvia e não foi descrito e
muito menos sugerido no estado da técnica. A remoção dos
inibidores pode acontecer, mas a remoção suficiente para um
bom desempenho do processo fermentativo depende, entre
outros, da taxa de vazão do solvente, temperatura, pH,
concentração de compostos polares, como também o produto da
fermentação, concentrações de outros componentes como sais,
que podem promover ou limitar a remoção dos inibidores além
de contribuir à inibição total, mesmo que a remoção do
produto seja satisfatória para os processos de extração
liquido-liquido do produto como sugerido no estado da
técnica .
Observa-se que a utilização do solvente como agente de
refrigeração do meio, não é descrito por outros autores. O
resfriamento convencional, por reciclo externo do meio da
fermentação através de trocadores de calor ou serpentinas
de resfriamento na dorna, é desvantajoso por formação de
incrustações a partir do próprio meio, entre ouros. Estas
incrustações dificultam o transporte de calor, aumentam o
risco de contaminação, promovem formação de biofilmes e
complicam a troca de calor pela baixa condução térmica e a
limitação dos gradientes de temperatura disponíveis. Outras
desvantagens de tais equipamentos de refrigeração são
choque térmico para a levedura; estresse físico para
levedura causado pelo fluxo alto do meio na tubulação e a
ainda a necessidade de equipamento de resfriamento externo.
Para que um agente possa funcionar como agente de
refrigeração, a entalpia específica do solvente no momento
de introdução do mesmo no meio da fermentação, a taxa de
vazão do solvente, e a integral da capacidade de calor do
solvente sobre a faixa de temperatura entre a temperatura
do solvente e a temperatura final do meio, são fatores
determinantes na capacidade de resfriamento pelo solvente.
De fato, o solvente só funciona como agente de refrigeração
quando o mesmo é introduzido com temperatura abaixa da
temperatura do meio de fermentação.
O que é revelado na presente invenção é a refrigeração
completa do meio pelo solvente, tornando obsoleto um
sistema secundário de refrigeração convencional. Para este
objetivo, a temperatura e taxa de vazão do solvente
precisam ser calculados com precisão, prevendo a geração de
calor por atividade metabólica e agitação do meio. Afinal,
a temperatura do meio não pode ser muito baixa, nem muito
alta, para garantir um bom desempenho da fermentação. Esta
requisição torna o usufruto do solvente como agente de
refrigeração, permitindo resfriamento por contato direto,
dispensando superfícies de troca térmica. Sendo assim, o
uso do solvente para fins de refrigeração do meio não foi
previsto, descrito ou muito menos sugerido em nenhum
documento do estado da técnica.
O pedido de patente internacional WO 2009/042950,
depositado em 26 de setembro de 2008, em nome de LS9 INC e
outros e intitulado: "Reductíon of the toxic effect of
impurities from raw materiais by extractive fermentation"
descreve a produção de etanol e butanol por fermentação
seguida da extração in situ e o agente também é reciclado.
Contudo, no referido documento o solvente utilizado não é
definido .
O pedido de patente internacional WO 2010/100642,
depositado em 02 de março de 2010 em nome de EYAL RES
CONSULTANTS LTD e EYAL AHARON e intitulado: "Fermentation
processes" descreve um método de produção de pelo menos um
produto de fermentação e um derivado do mesmo,
compreendendo entre as etapas, a de fornecer uma solução
aquosa fermentável compreendendo um composto fermentável .
No referido documento ocorre remoção de inibidores com
octanol, e sugestões de tratamento com carvão ativo,
adsorção, tratamento com calor, base, trocador de íons e
separação utilizando membrana. Uma desvantagem do referido
documento está na remoção de inibidores fora da dorna, a
qual necessita o impedimento da geração de inibidores no
processo de extração de carboidratos da matéria-prima
usando temperaturas baixas, e/ou uma etapa de pré-
tratamento do mosto a base de ligno-celulose, que requer
maior investimento em equipamento e menor eficiência do
processo em geral.
O artigo de Grobben N . e colaboradores, intitulado
"Production of acetone, butanol and ethanol (ABE) from
potato wastes : fermentation with integrated membrane
extraction" publicado no Applied Microbal Biotechnology 39,
494-498, em 1993 descreve a produção de butanol, acetona e
etanol (ABE) a partir de resíduos de batata através de
fermentação com extração de membrana integrada. O referido
artigo menciona somente a aplicação de biodiesel como
solvente extratante. Além disso, o referido artigo não
menciona e nem sugere o uso in-situ do solvente.
O artigo de Boudreau T . M., e colaboradores,
intitulado "Improved ethanol-water separation using fatty
acids", publicado na Process Biochemistry 41, 980-983 em
2006, descreve uma separação aperfeiçoada de etanol-agua
usando ácidos graxos. O artigo descreve a extração de
somente o produto e sem a utilização do solvente como
agente de refrigeração.
Neste caso, será necessário empregar uma etapa de pré-
tratamento do caldo em um estágio anterior da fermentação
para fermentação de mosto a base de caldo hidrolítico,
enquanto que a tecnologia proposta pela presente invenção
pretende, entre outros, justamente tornar tal etapa
obsoleta .
Como pode ser observado, nenhum documento do estado da
técnica descreve ou muito menos sugere abordagens de
combinar o pré-tratamento do mosto com a remoção de produto
inibidor do meio de fermentação por extração liquido-
liquido. Portanto, esta lacuna é a matéria principal da
presente invenção. Além disso, não há exemplos no estado da
técnica de refrigeração do meio de fermentação pelo
solvente, muito menos em combinação com extração simultânea
de produto e/ou inibidores. A extração líquido-líquido pode
tornar a fermentação um processo mais eficiente, causando
menos estresse à levedura e resultando em menor custo
energético .
Sumário da Invenção
Para solucionar os problemas acima mencionados, a
presente invenção, baseada em fermentação extrativa,
propiciará vantagens significativas em relação aos
processos fermentativos convencionais, possibilitando um
aumento do seu desempenho e apresentando uma relação
custo/beneficio mais favorável.
A presente invenção se refere a um processo
fermentativo extrativo para mostos provenientes de
processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica,
amilácea, carboidratos diretamente extraíveis, melaços
fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores como,
entre outros, biotina, ou mostos similares, ricos em
carboidratos e com objetivos de fermentação.
Especificamente, a presente invenção se refere ao uso de um
solvente biocompativel, tais como biodiesel de óleo de
soja, de milho, de mamona, de palmeira-de-óleo-af ricana
(dendezeiro) , de macaúba, entre outros, como agente
extrator para a extração in-situ e simultânea de produto
e/ou componentes inibidores da fermentação, especificamente
o produto da fermentação e compostos inibidores presentes
no mosto, e/ou como agente refrigerante do meio da
fermentação, sendo o último em combinação ou não com as
finalidades de extração de produto e/ou inibidores.
A produtividade da fermentação em termos de produtos
como etanol, butanol, propanodiol, 2-3 butanodiol, acetona,
enzima, aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e
glutamato monossódico, ácidos orgânicos como ácido acético,
ácido propiônico, ácido láctico, ácido succinico, ácido
butanóico, matéria-prima para bioplásticos e outros
produtos, é limitada pela concentração do próprio produto,
ou seja, existe um efeito de inibição pelo produto. Além
disto, fermentação de biomassa de ligno-celulose ou outro
tipo de biomassa, é limitada pela inibição química do
processo devido a inibidores presentes nesta matéria-prima.
Estes inibidores, sendo os principais furfural, HMF,
compostos fenólicos e ácidos carboxílicos, inibem a
fermentação em termos de crescimento microbiano e taxa de
produção. Mesmo efeito ocorre causado por inibidores
presentes em outros tipos de mosto como mostos preparados
com açúcares diretamente extraíveis da matéria-prima, como
cana-de-açúcar ou beterraba, quando a temperatura do
processo de extração dos carboidratos desta matéria-prima é
mais elevada, muitas vezes resultando em maiores
rendimentos de extração.
O mosto final pode também conter componentes orgânicos
como, por exemplo, a biotina, que inibem fermentações mais
específicas como a biosíntese de aminoácidos, como o ácido
glutâmico, lisina e glutamato monossódico.
A presente invenção possibilita a remoção de todos
estes compostos do meio de fermentação, acelerando o
processo. Assim, a tecnologia proposta pela presente
invenção efetivamente viabilizará a produção de
biocombustiveis a partir de biomassa, ou seja, combustíveis
de segunda geração, assim como outros produtos a partir de
biomassa hidrolisada, possibilita o uso de maiores
temperaturas nos processos de extração de carboidratos de
matérias primas como cana-de-açúcar e beterraba, resultando
em maiores rendimentos deste processo, e possibilitará e
promoverá o uso de mostos em qeral que contêm compostos com
efeitos inibidores extraíveis pelo solvente.
Na presente invenção, a etapa de pré-tratamento do
mosto e a da remoção do produto são integradas. Desta
forma, a remoção in-situ de produto e demais inibidores do
meio de fermentação com solvente biocompatível, sem ou com
utilização do solvente como agente refrigerante, de fato
elimina a necessidade de uma unidade extra de tratamento do
meio e pode aumentar o retorno sobre o investimento total
do processo de produção, tanto por aumento da produtividade
e do rendimento, quanto por diminuição de custos
energéticos e de água utilizada no processo integral.
O próprio solvente pode também ser utilizado para o
resfriamento do processo fermentativo. A fermentação é um
processo exotérmico, ou seja, calor está sendo gerado
durante a conversão do substrato. Este calor pode ser
efetivamente retirado do meio de fermentação utilizando o
próprio solvente em sistema continuo, sendo que o solvente
pode ser introduzido na dorna com baixa energia interna
após resfriamento prévio e eventual estocagem do mesmo.
Desta forma, a temperatura da fermentação pode ser mantida
em torno da ótima, devido a grande superfície de troca de
calor, resultado da propriedade de liquidez do solvente e
rapidez de se misturar com o meio, resultando em menores
gradientes de temperatura na dorna e , consequentemente,
elevando a eficiência em geral, tanto em termos de custos
energéticos, como em termos de custos de equipamento de
refrigeração e manutenção.
Breve Descrição das Figuras
A estrutura e operação da presente invenção,
juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais
bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e
a seguinte descrição:
A Figura 1 mostra o processo da presente invenção de
forma simplificada, onde (A) é a entrada de mosto
(substrato) ; (B) é uma opcional entrada do micro-organismo
reciclado; (C) é a entrada de solvente; (D) é a saída de
solvente e produto; (E) é a saída de vinho com fermento;
(F) é a saída de mistura de produto e água; (G) é a saída
de vinho clarificado; (H) é a saída do produto purificado e
(I) é a saída de resíduos e sub-produtos .
A Figura 2 mostra o diagrama de blocos de um processo
com a tecnologia proposta pela presente invenção.
A Figura 3 mostra a biocompatibilidade do biodiesel
(4A) e óleo de mamona (4B) e produção de dióxido de carbono
durante a fermentação sem fase orgânica (linha pontilhada) ,
com biodiesel (círculo preto) e com óleo de mamona
(triângulo branco) .
A Figura 4 mostra um desenho esquemático explicando
como o solvente tem a capacidade de absorção de certa
quantidade de água, ocorre concentração de açúcar durante a
extração, levando a fermentação a um rendimento maior
A Figura 5 mostra um gráfico de barras com a absorção
de água e etanol em oléo de mamona e biodiesel para várias
concentrações de etanol na fase aquosa.
As Figuras 6 , 7 e 8 mostram os resultados para a
fermentação A , B e C , onde (A) é a fermentação sem
inibidores, sem solvente; (B) é a fermentação com
inibidores, sem solvente; e (C) é a fermentação com
inibidores, com solvente.
As Figuras 9 e 10 mostram os perfis de concentração de
furfural, furfuril-álcool, baunilha e álcool baunílico
durante a fermentação sem solvente e com solvente,
respectivamente .
A Figura 11 mostra um gráfico de comparação de
viscosidade entre óleo de mamona e biodiesel para várias
temperaturas .
A Figura 12 mostra um fluxograma de uma planta de
fermentação extrativa conforme a presente invenção.
A Figura 13 mostra um fluxograma de uma planta de
fermentação extrativa com uma dorna, conforme uma primeira
modalidade da presente invenção.
A Figura 14 mostra um fluxograma de uma planta de
fermentação extrativa com três dornas, apenas a primeira
dorna mantendo uma camada orgânica conforme uma segunda
modalidade da presente invenção.
A Figura 15 mostra um fluxograma de uma planta de
fermentação extrativa para fermentação em regime de
batelada ou batelada alimentada, com uma dorna conforme uma
terceira modalidade da presente invenção.
A Figura 16 mostra um fluxograma de uma planta de
fermentação extrativa para fermentação continua com
resfriamento e remoção de inibidores em todas as dornas,
conforme uma quarta modalidade da presente invenção.
A Figura 17 mostra uma modalidade da presente invenção
de um processo esquemático com fluidos e unidades de
processamento de um sistema de fermentação extrativa. Os
estágios do processo na linha pontilhada foram modelados.
Descrição Detalhada da Invenção
Embora a presente invenção possa ser suscetivel a
diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na
seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com
o entendimento de que a presente modalidade deve ser
considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e
não pretende limitar a presente invenção ao que foi
ilustrado e descrito aqui.
A presente invenção se refere a um processo de
fermentação extrativa. Mais especificamente, a presente
invenção se refere a um processo de fermentação extrativa
que emprega um único solvente capaz de remover produtos e
inibidores simultaneamente, além de resfriar o meio. Além
disso, a presente invenção se refere ao uso do processo.
A presente invenção revela um processo de fermentação
extrativa com alta produtividade, que será capaz de tornar
máxima e rápida a conversão de carboidratos fermentescíveis
obtidos por extração ou hidrólise química em produtos.
0 que ocorre é que alguns compostos contidos nos
hidrolisados puros, sendo os principais furfural, HMF,
compostos fenólicos e ácidos carboxílicos, inibem a
fermentação em termos de crescimento e taxa de produção.
A tecnologia proposta pela presente invenção
possibilita a remoção in-situ destes componentes por meio
de um agente extrator biocompativel . Este procedimento de
eliminação do efeito inibidor destes componentes resultará
em um incremento da produtividade do micro-organismo,
viabilidade, eficiência da fermentação, e elevado
estabilidade do processo, assim como favorecendo uma
fermentação rápida e com alta taxa de conversão do
substrato. No caso dos produtos extracelulares, além dos
inibidores presentes no mosto o próprio produto da
fermentação, que inibe o processo a partir de certa
concentração, também será removido pelo solvente. Para
produtos intracelulares, como por exemplo, lipídeos,
polihidroxialcanoatos e várias enzimas, a presente invenção
aplica-se a remoção dos inibidores provenientes do mosto
e/ou ao resfriamento do meio de fermentação.
Matérias-primas e insumos
A matéria-prima preferencial vislumbrada para a
aplicação da tecnologia envolve hidrolisados de material
sólido ligno-celulósicos, amiláceos, como bagaço de cana-
de-açúcar, hidrolisado de amido de milho ou mandioca. Podem
também envolver o uso de carboidratos diretamente
extraíveis, como carboidratos convencionalmente usadas na
fermentação: melaço, caldo de cana, extrato de beterraba e
melaços fortemente esgotados com alto conteúdo de
inibidores, como biotina, além de mostos similares, ricos
em carboidratos e com objetivos de fermentação ou ainda
qualquer combinação ou derivado dos mesmos, daqui em diante
denominado como 'mosto' . Sendo carboidratos a denominação
geral de substratos para fermentação como sacarose,
glicose, frutose, xilose, arabinose, entre outros.
Para certas fermentações, a escolha da matéria-prima
do mosto ou a concentração dos carboidratos no mosto é
limitada pela presença de inibidores naturais como a
biotina.
Uma das principais vantagens da tecnologia proposta
pela presente invenção é justamente a remoção de inibidores
presentes no mosto, provenientes do caldo de extrato da
matéria-prima, do licor hidrolisado, ou de outra fonte,
como ácidos carboxilicos, como ácido acético, derivados de
furano, como furfural e hidroxi-metil furfural, e compostos
fenólicos, como a baunilha, álcool coniferilico, catechol,
entre outros. Compostos naturais no mosto que exibem
propriedades inibidoras, como biotina, também podem ser
removidos pela tecnologia proposta.
A presente invenção é baseada no uso de um agente
extrator biocompatível, aqui em diante denominado como
'solvente' , durante a fermentação. O solvente utilizado
como fase orgânica, especificamente parte da especificidade
da presente invenção envolve um biodiesel selecionado do
grupo que compreende óleos vegetais tais como óleo de soja,
óleo de milho, óleo de mamona, biodiesel de dendezeiro e
biodiesel de macaúba . Outros líquidos biocompativeis também
podem ser utilizados, como álcoois com cadeia longa (álcool
oléico, fitol, isofitol, álcool estearílico, álcool
cetíloco, octildodecanol) , ácidos graxos (ácido
ricinoléico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido
linolênico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido
palmitoléico, ácido esteárico) , etanoatos (dodecil acetato,
butil dodecanoato) , ou outros substâncias de cadeia longa
como dibutilsebacate, di (2-etilhexil) sebacato,
dibutiladipato, d (2-etilhexil) adipato, di(2-
etilhexil) ftalato, di (3, 5 ,5-trimetilhexil )phthalato,
glicerol tridecanoato, 2-dodecanone e dodecanal .
Preferencialmente é empregado um éster metílico ou éster
etílico de um ácido graxo, como o ácido ricinoléico.
0 ácido ricinoléico (ácido cis-12-hidroxioctadeca-9-
enoico) é uma molécula de cadeia longa, tendo um grupo
hidroxila na posição C-12. Este grupo hidroxila aumenta a
polaridade da molécula, favorecendo coeficientes de
partição de inibidores e produtos de fermentação com
características polares. A dupla ligação em posição C-9
favorece menor viscosidade. A fonte do ácido graxo pode ser
um produto agrícola como óleo de mamona que possui uma
porcentagem de 85 a 90% de ésteres de ácido ricinoléico.
O solvente tem um ponto de ebulição maior do que o
produto e os inibidores voláteis, e seu tamanho é tal que
limita a difusão e integração com a parede celular do
micro-organismo, o que prejudicaria a viabilidade e o
crescimento do mesmo.
Mais especificamente, o solvente tem as seguintes
propriedades essenciais e favoráveis:
• Coeficientes de partição favoráveis aos componentes a
ser extraídos (inibidores e/ou produto) ;
• Seletividade alta para os componentes de interesse
(produto e inibidores) em comparação com outros componentes
(substrato e minerais) ;
• Imiscível em água e com solubilidade desprezível na
fase aquosa;
• Capacidade de absorção de certa quantidade de água,
elevada pela fração de etanol no solvente, que efetivamente
concentra o substrato na fase aquosa diminuindo a perda do
mesmo e assim aumentando o rendimento do produto;
· Baixa toxicidade (fato positivo para o elemento humano
- operadores da empresa, para o ambiente e para o organismo
empregado na fermentação (bio-compatibilidade) ;
• Possibilidade de recuperação do produto do solvente e
sua regeneração;
• Não formação de emulsões (estáveis) durante a
fermentação e o processamento down-stream' em condições de
baixa turbulência do meio;
· Separação rápida de fases orgânica e aquosa;
• Alta estabilidade química, independente de utilização
de altas temperaturas na recuperação ou outros componentes
como ácidos presentes no processo;
• Baixo ponto de fusão e viscosidade na faixa de
temperatura utilizada, e ponto de ebulição acima da faixa
da temperatura utilizada;
• Baixo custo e possibilidade de produção do mesmo no
local ;
Possibilidade de ser utilizado como combustível,
biodiesel, após vários ciclos de uso como solvente do
processo .
O solvente pode ser injetado a baixas temperaturas, de
forma a atuar no resfriamento do meio fermentado, para
manter a temperatura desejada. O produto de fermentação é
extraído pelo solvente, que é retirado do biorreator, sendo
em seguida retificado com retirada de produto e
contaminantes inibidores, e reciclado continuamente, livre
de produtos e inibidores . O diagrama apresentado na Figura
1 ilustra o processo de forma simplificada.
O processo da presente invenção propicia a utilização
de elevadas concentrações de carboidratos, menor inibição
pelos inibidores provenientes do mosto e pelo produto
inibidor (etanol, butanol, acetona, propanodiol, 2-3
butanodiol, ácidos orgânicos, solventes, enzimas,
aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e glutamato
monossódico, terpenos, matéria-prima para bioplásticos,
entre outros) durante a fermentação e menor requisito de
energia .
Produtos
A presente invenção revela um processo de fermentação
extrativa com alta produtividade, que será capaz de tornar
máxima e rápida a conversão de carboidratos fermentescíveis
obtidos por extração ou hidrólise química em produtos como:
butanol, acetona, propanodiol, 2-3 butanodiol, xilitol,
ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiônico,
ácido láctico, ácido succínico, ácido butanóico, ácido
cítrico, enzimas, aminoácidos como o ácido glutâmico,
lisina e glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima
para bioplásticos, lipídeos, polihidroxialcanoatos, o
próprio fermento, ou outros produtos orgânicos ou qualquer
combinação destes, aqui em diante denominado como
^produto' .
O foco da presente invenção é etanol, mas as
características dos sistemas bifásicos envolvendo a
distribuição de um componente com polaridades menores do
que a polaridade de etanol, que é o caso para, por exemplo,
butanol, acetona e a maioria dos aminoácidos e outros
produtos mencionados acima, inevitavelmente mostrarão um
bom desempenho em termos de extração, melhor até do que o
próprio etanol. Isto porque, comparando com o etanol, os
coeficientes de partição de componentes com menor
polaridade são maiores, e como a seletividade para estes
componentes são maiores, então a extração para a fase
orgânica será favorecida.
Nota se que vários produtos mencionados podem ser
produzidos como produtos intracelulares, produtos
extracelulares , ou uma combinação disso, dependendo do(s)
micro-organismo (s) empregado (s) e a sua capacidade de
transporte do produto pela parede celular.
Para produção de biomassa ou produtos intracelulares
como, por exemplo, em muitos casos lipídeos,
polihidroxialcanoatos, várias enzimas e aminoácidos, a
presente invenção aplica-se apenas à remoção de inibidores
provenientes do mosto e/ou ao resfriamento do meio de
fermentação .
O que ocorre é que alguns compostos contidos nos
hidrolisados puros, sendo os principais furfural, HMF,
compostos fenólicos e ácidos carboxilicos, inibem a
fermentação em termos de crescimento e taxa de produção.
Efeitos similares de inibição ocorrem para mostos
preparados por extração de carboidratos da matéria-prima,
por exemplo, da cana-de-açúcar ou beterraba, processo em
que altas temperaturas promovem altos rendimentos de
extração, porém provocam a geração de tais inibidores.
Equipamentos
A fermentação extrativa pode ser executada de forma
continua, batelada ou batelada alimentada e com preferência
de forma continua. A dorna de fermentação, necessária para
a execução do processo fermentativo, deve ter uma entrada
para o solvente, com preferência na parte inferior da
mesma, possivelmente integrada no agitador ou nos
defletores, contando com uma pressão bastante alta para
superar o peso da coluna das fases aquosa e orgânica do
conteúdo da dorna.
O volume da dorna deve ser maior do que a soma da fase
aquosa e a fase orgânica empregada, sendo que a razão do
volume destas fases pode ser ajustada para qualquer razão
entre 1:0.01 á 1:20.
Demais equipamentos necessários para a produção e
recuperação do produto e a reciclagem do solvente podem
ser: misturador de meio, coluna de absorção, decantador,
cascata de destiladores, destilador, retificador,
centrífuga, válvula ou equipamento para sangramento de uma
fração de células do fermento, equipamento para reativação
celular de eventual fermento reciclado, trocadores de
calor, e outros
A Figura 2 representa o diagrama de blocos de um
processo com a tecnologia proposta pela presente invenção.
Processo biológico
O processo biológico para conversão de substrato para
produto envolve uma fermentação empregando um micro¬
organismo como, mas não limitado a , levedura, como
Saccharomyces cerevisia ou bactéria, como Zymomonas
mobilis , geneticamente modificado ou não, entre outros ou
em quaisquer combinações destes, aqui em diante denominado
como fermento' . O fermento consome fontes de carbono como
sacarose, glicose, frutose e/ou xilose, arabinose ou
quaisquer combinação destes, e converte-os em produtos tais
como etanol, butanol, acetona, propanodiol, 2-3 butanodiol,
xilitol, ácidos orgânicos como ácido acético, ácido
propiônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido
butanóico, ácido cítrico, enzimas, aminoácidos como o ácido
glutâmico, lisina e glutamato monossódico, terpenos,
matéria-prima para bioplásticos, lipídeos,
polihidroxialcanoatos, o próprio fermento ou outros
produtos orgânicos ou qualquer combinação destes. O
processo pode ser executado em condições anaeróbicas ou
empregando aeração, dependendo das necessidades
microbiológicas do fermento empregado para produção do
produto desejado. Eventuais inibidores presentes no meio de
fermentação são removidos do meio pelo solvente,
completamente ou parcialmente. Produtos extracelulares,
muitas vezes um fator inibidor a partir de certas
concentrações como no caso de etanol para Saccharomyces
cerevisiae, também são parcialmente removidos do meio pelo
solvente. Desta maneira, o desempenho do micro-organismo em
termos de taxa de crescimento, viabilidade, produtividade
volumétrica e especifica e rendimento pode ser otimizado,
assim como o uso de energia do processo total de produção
incluindo a recuperação e purificação do produto e o
reciclo do solvente.
A fermentação é um processo exotérmico, ou seja, calor
está sendo gerado durante a conversão do substrato. Este
calor pode ser efetivamente retirado do meio de fermentação
utilizando o próprio fluxo de solvente em sistema continuo,
sendo que o solvente pode ser introduzido na dorna com
baixa energia interna após resfriamento prévio e eventual
estocagem do mesmo. Desta forma, a temperatura da
fermentação pode ser mantida em torno da ótíma, com menores
gradientes de temperatura na dorna e com mais eficiência em
geral, tanto em termos de custos energéticos quanto em
termos de custos de equipamento e manutenção.
O processo de fermentação extrativa de acordo com a
presente invenção compreende as seguintes etapas:
a ) Entrada de um mosto rico em carboidratos no
biorreator;
b ) Entrada de um inoculo no biorreator;
c ) Injeção do solvente no biorreator;
d ) Remoção do solvente do biorreator;
e ) Recuperação do solvente;
f ) Purificação da fase vapor;
g ) Remoção da fase aquosa do biorreator;
h ) Recuperação do micro-organismo .
Na presente invenção, a etapa de detoxif icação do
mosto, previstas em casos como descritos acima, e de
remoção do produto do meio de fermentação, são integrados.
Desta forma, a remoção in-situ de produto e demais
inibidores do meio de fermentação com solvente
biocompativel de fato facilita a concentração do produto,
elimina uma unidade extra de tratamento do mosto e diminui
o custo total de produção de etanol, tanto em termos de
aumento de produtividade quanto em termos de minimizar
custos energéticos e de água utilizada no processo
integral .
A etapa (a) é de alimentação do biorreator com mosto
proveniente de processos hidroliticos de matéria-prima
ligno-celulósica, amilácea, carboidratos diretamente
extraiveis, melaços fortemente esgotados com alto conteúdo
de inibidores, como biotina, entre outros ou mostos
similares ricos em carboidratos, onde o conteúdo do
fermentador é composto por uma fase aquosa e outra
orgânica.
A etapa (b) é de entrada de um inoculo no biorreator,
por reciclagem, onde uma pequena fração do micro-organismo
é adicionada, ou por reativação, empregando tratamento
aeróbico, tratamento ácido e/ou alimentação de nutrientes.
Esta etapa pode ou não ser opcional, e esta escolha depende
do tipo de produto, sendo indicada na produção de produtos
extracelulares e não aplicada para a produção de produtos
intracelulares, onde a parede celular do fermento será
perfurada ou destruída para obtenção de produtos como
lipídios, enzimas, polihidroxialcanoatos, entre outros.
A etapa (c) é de injeção do solvente no biorreator,
que ocorre pelo fundo do biorreator ou através de furos nos
propulsores e/ou defletores. 0 solvente é injetado no
fermentados a baixas temperaturas, variando entre -10 e 25
°C . O solvente pode conter oxigénio estéril para auxiliar
nos mecanismos de manutenção do micro-organismo . A
densidade do solvente é relativamente baixa, o que faz com
que este flua naturalmente para a parte superior do
biorreator, onde se forma uma camada orgânica, sendo que
outra fração permanece parcialmente dispersa na fase
aquosa. Por outro lado, a agitação do meio pode resultar em
maior mistura do solvente no meio de fermentação,
aumentando a superfície de troca de calor e o tempo em que
esta superfície está exposta ao meio. O solvente funciona,
portanto, como um extrator ΐ η-situ do produto, inibidores
e/ou calor do meio de fermentação.
Na etapa (d) , o solvente é removido do biorreator, com
agitação limitada do meio, preferencialmente da parte
superior, onde o mesmo é consequentemente mais rico em
produto, por decantação ou centrifugação, após ou durante a
fermentação .
Na etapa seguinte (e) o solvente é enviado para uma
unidade de recuperação do mesmo. Como o solvente tem uma
volatilidade menor que a água e o produto, os últimos podem
então ser recuperados pelo aquecimento e evaporação a vácuo
e pode ser reintroduzido no biorreator.
Inibidores voláteis podem ser removidos também nesta
etapa. Para produtos sensíveis a altas temperaturas, como
no caso de várias enzimas, ou produtos de baixa
volatilidade, como no caso de aminoácidos, esta etapa pode
ser modificada para prevenir o prejuízo à estrutura
molecular do mesmo ou possibilitar a sua purificação. Neste
caso podem ser aplicados outros métodos de separação como a
utilização de um segundo solvente com maior volatilidade,
ultraf iltração, aplicação de campos eletromagnéticos,
diminuição da solibilidade do produto, por exemplo, por
aplicação de baixa temperatura ou modificação da polaridade
do solvente, entre outros.
A fase vapor, composta por produto da fermentação e
água, é enviada para setores de purificação, como colunas
de separação ou destilação e retificação (etapa (f )).
A camada aquosa é bombeada do biorreator como vinho
(etapa (g) ) e , opcionalmente, o micro-organismo pode ser
recuperado por centrifugação, ultraf iltração, separação por
membrana ou qualquer método de separação e concentração de
células, na etapa (h) .
Como mencionado anteriormente, para produtos
intracelulares, a etapa (h) pode ser utilizada para a
concentração das células. Já para produtos extracelulares,
como por exemplo no caso de etanol produzido por levedura,
a maior parte do inoculo pode ser re-utilizada, enquanto
que a fase leve é enviada para o setor de tratamento final
como vinho clarificado, podendo ser as colunas de
destilação ou separação e retificação. O setor de
tratamento final gera o produto e resíduos ou subprodutos,
como vinhaça, flegmassa e óleo-fúsel, por exemplo.
Podem-se citar os seguintes benefícios da tecnologia
proposta pela presente invenção:
• Reduzir o custo energético do processo integral de
fermentação e recuperação do produto;
• Controle da inibição causada pelo produto da
fermentação e/ou pelos produtos secundários originados do
mosto, resultando em maior eficiência de fermentação e
maior produtividade volumétrica e estabilidade de processo;
• Maior viabilidade dos micro-organismos, elevada
estabilidade microbiana geral e menores riscos de aplicação
de micro-organismos geneticamente modificados;
• Uso de maiores concentrações de açúcar, implicando
menor necessidade de água, energia e menos resíduos no
final do processo (por exemplo, para a vinhaça do processo
de produção de etanol que é atualmente de 11 a 13 L/L EtOH,
pode passar a 3-5 L/L EtOH) ;
• Aplicação em processo contínuo ou batelada alimentada.
Durante fermentação contínua, uma vantagem adicional é a
redução da perda de substrato: a taxa de escoamento de
solvente pode ser utilizada como um fator extra de controle
para eliminar comportamento oscilatório no bioprocesso;
• Resfriamento implícito do meio de fermentação pelo
solvente, introduzindo-o na dorna com baixa energia
interna, eliminando a necessidade de dispendiosa
instrumentação externa de refrigeração, que introduz um
fator de stress desnecessário ao micro-organismo;
• Utilização do solvente pode também resultar em menores
concenrações de impurezas na vinhaça, promovendo a opção de
reciclo da vinhaça no processo, resultando em menores
quantidades de água utilizado no processo e menos energia
necessária para tratamento da vinhaça;
• O solvente agirá como tampão de inibidores,
assegurando por muito tempo certa quantidade limitada de
inibidores também na fase aquosa, que pode atuar como anti¬
biótica natural, porque organismos contaminantes como vírus
e bactérias são expostos a efeitos inibidores similares aos
efeitos para o micro-organismo produtor (ex. levedura);
• Assegurar por muito tempo certa quantidade limitada de
inibidores na fase aquosa pode aumentar o rendimento da
fermentação porque para certas concentrações de furfural o
rendimento de etanol sobre glicose pode ser mais elevado
devido à balança na via metabólica de NADA(P) e inibição
expressão reprimida ou induzida de enzimas chaves.
• Utilização de um solvente renovável com base
biológica, como o biodiesel sugerido nesta invenção, pode
diminuir o custo do extrator, por ser produzido em ampla
escala e opção de produção no local pela própria usina e ,
após de várias reciclagens no processo fermentativo, pode
ser re-utilizado como combustível.
Como exemplo, a presente invenção pode ser aplicada na
fermentação alcoólica convencional e , mais
preferencialmente, na fermentação alcoólica de segunda
geração. Porém, a tecnologia proposta pela presente
invenção pode ser aplicada também na fermentação para a
produção de outros produtos com propriedades adequadas para
extração pelo solvente, sendo, por exemplo, acetona,
butanol, propanodiol, 2-3 butanodiol, ácido acético, ácido
lático, ácido propiônico, ácido butanóico, ácido succínico,
enzimas, aminoácidos, como o ácido glutâmico, lisina e
glutamato monossódico, terpenos, matéria-prima para
bioplásticos, entre outros ou qualquer combinação destes. O
processo da presente invenção também possibilita a
recuperação de sub-produtos provenientes do caldo
hidrolisado como furfural e compostos fenólicos, que tem
valor económico. Na produção de hidrogénio especificamente,
a composição de cerca 35-50% de etanol-água no fluxo de
solvente proveniente do fermentador é ideal na reformação a
vapor de etanol por catálise, eliminando uma etapa de
destilação neste processo.
Como pode ser observado, o diferencial do processo da
presente invenção está no uso do biodiesel, como agente
extrator biocompativel para a extração ί η-situ e simultânea
de produto e componentes inibidores da fermentação,
especificamente o produto da fermentação e compostos
inibidores presentes no mosto, sendo provenientes do
hidrolisado da biomassa, do processo de extração de
carboidratos da matéria-prima, ou diretamente provenientes
da matéria-prima. Outro diferencial é o uso do solvente
como agente refrigerante no processo fermentativo, em
combinação ou não com o uso como agente de extração de
componentes inibidores.
Outros agentes extratores, tóxicos ou biocompativeis,
foram explorados no estado da técnica, in-situ, ou fora da
dorna, mas não o biodiesel proposto pela presente invenção,
muito menos para o combinatório dos objetivos de extração
de componentes inibidores e/ou refrigeração.
O diferencial de uso do preferido solvente, biodiesel,
no processo da presente invenção é grande, sendo que ele é
renovável e sua produção sustentável. Além de ser um agente
extrator adequado em termos de biocompatibilidade,
propriedades extrativas e propriedades físicas, tal como
baixa viscosidade.
O preferido solvente tem vantagens implícitas como
produção no local a partir de óleo vegetal e re-utilização
como combustível após várias reciclagens, como proposto no
processo da presente invenção.
EXEMPLO I
Comparação de óleo vegetal e biodiesel com base em óleo
vegetal como solvente orgânico para extração de inibidores
de fermentação in-situ em bagaço hidrolisado.
O óleo de mamona e seu etilester, de agora em diante
indicado como "biodiesel", são comparados em termos de
biocompatibilidade, coeficientes de partição para vários
inibidores, substratos e etanol, viscosidade e absorção de
água. A absorção de água pode ser significante por
concentrar o substrato na fase aquosa, por um lado, mas
diluir o produto de fermentação na fase orgânica, por outro
lado. As fermentações de licor hidrolítico sintético
também são realizadas para verificar o esperado aumento do
desempenho de etanol solvente-mediado .
Biocompatibilidade
A biocompatibilidade dos solventes (óleo de mamona e
biodiesel com base neste óleo) foi determinada utilizando
quatro frascos Erlenmeyer (125mL) , equipados com pescoço de
cisne para saída de dióxido de carbono. O pescoço de cisne
continha aproximadamente 2 L de ácido sulfúrico para
secagem do gás de exaustão. O meio de fermentação foi
composto de 10 g/L peptona, 10 g/L extrato de levedura, 2,5
g/L K2HP0 e 60 g/L glicose e foi autoclavado a 121 °C por
15 min. O meio do inoculo foi similar e utilizou-se uma
cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae (Santa Adélia) ,
previamente repicada em placas de petri com agar-agar da
mesma composição. Após 12 horas de incubação, 50 mL do
inoculo foi adicionado a cada frasco. A dois frascos também
se adicionaram 10 L de um dos solventes. O peso de cada
frasco foi monitorado durante a fermentação, utilizando uma
balança analítica (Scientech SA210) , indicando a perda de
dióxido de carbono. A variação dos pesos dos frascos com e
sem solvente orgânico foram comparados para verificar a
biocompatibilidade dos solventes. A Figura 3 mostra o
perfil de peso para a fermentação com e sem solvente. Pode-
se ver que não há, praticamente, diferença entre os dois
processos, provando a biocompatibilidade de ambos os
solventes.
No fim da fermentação, todos os frascos com solventes
extrativos tiveram uma perda de 3% dióxido de carbono a
menos por litro do que os frascos sem solvente, mas como
houve retardo consistente no perfil de perda de peso dos
frascos com solvente orgânico, isso pode ser indicador de
que houve acúmulo de dióxido de carbono na camada orgânica,
ao invés da falta de biocompatibilidade .
Absorção de água e etanol
O solvente tem a capacidade de absorção de certa
quantidade de água, que se eleva na medida em que se eleva
a fração de etanol no solvente, o que efetivamente
concentra o substrato na fase aquosa como ilustrado na
figura 4 . Visto que o micro-organismo empregado na
fermentação converte o substrato até que este atinja uma
determinada concentração no final da fermentação ou na
saída de uma fermentação contínua, a perda total do
substrato, em termos da quantia absoluta, diminui, ou seja,
o rendimento da fermentação aumenta.
A absorção de água no solvente foi determinada para
várias concentrações de etanol na fase aquosa (0 a 200
g/L) . Para ambos os solventes, biodiesel e óleo de mamona,
foi construído um sistema bifásico a partir de 5 gramas de
água Milli-Q, 5 gramas de solvente orgânico e uma quantia
de etanol.
O sistema foi mantido em banho-maria a 34 °C sem
agitação por 48 horas para que se estabelecesse um completo
equilíbrio. Depois deste período amostras da fase orgânica
foram transferidas para um balão de evaporador rotativo,
com um peso conhecido, e mantido sob baixa pressão (0.5
bar) a 35°C em evaporador rotativo (Marconi MA120) .
Determinou-se o peso do balão com balança analítica em
intervalos de 5 minutos até o peso estabilizar,
significando a completa remoção do etanol e água
previamente presentes na fase orgânica. Uma amostra da fase
aquosa foi retirada, filtrada com um exemplar de filtron
0.22 (Millipore) , e a concentração de etanol foi analisada
com HPLC, equipado com um auto-sampler (Varian 90 95) , um
detector de UV (Varian 9095) , um detector de índice
refrativo (Varian RI-4) , uma bomba binária (Varian 9010) e
usando uma coluna de separação Aminex HPX-87H (Bio-Rad,
7.8*300 mm), com um Biorad micro-guard Cation-H125-0129
pre-coluna, a 25° C , e 5 mM H SO como a fase móvel a
0.7ml/min. As concentrações de etanol e água na fase
orgânica foram calculadas a partir do balanço de massa do
sistema bifásico, utilizando a conhecida massa total de
água e etanol presentes no sistema e a concentração de
etanol na fase aquosa.
Como resultado, foi observado que o biodiesel absorveu
quantidades significantes de água e em média duas vezes
mais água do que etanol. Não há relação constante de água
absorvida e etanol absorvido, como sugerido por Malinowski
et al. (1993) para álcool oleico. Na Figura 5 pode-se
observar que com o aumento das concentrações de etanol na
fase aquosa, ambos os solventes orgânicos absorveram mais
etanol e água e a razão entre água e etanol absorvida
diminui. O biodiesel absorveu 2.4 a 6.8 vezes mais água do
que o óleo de mamona, enquanto a absorção de etanol foi
aproximadamente a mesma para ambos os solventes orgânicos.
Embora uma relação clara da razão água-etanol na fase
orgânica com a concentração de etanol na fase aquosa não
pudesse ser concluída pelos dados experimentais, um aumento
na proporção de absorção etanol/água pode ser vista como
aumento de concentração de etanol, especialmente para
biodiesel .
Isto significa que com uma concentração mais alta de
etanol na fase aquosa, o etanol é relativamente mais
absorvido. Isso é muito mais significativo no caso de
biodiesel, onde ambas frações de água e etanol absorvidas
são maior com aumento da concentração de etanol. Enquanto
que a diferença em absorção de água é considerável entre
biodiesel e óleo de mamona, a diferença em absorção de
etanol reside mais dentro dos padrões de desvio dos
experimentos .
Frise-se que, com outro produto, por exemplo butanol,
outras quantidades podem ser esperadas.
No todo, o biodiesel apresenta uma vantagem sobre o
óleo de mamona quanto à maior absorção de água e pode assim
como efeito concentrar substratos na fase aquosa durante a
fermentação, o que leva a uma redução na perda de
substratos em fermentações continuas ou aumento na produção
e rendimento para fermentação em regime batelada e batelada
alimentada .
Coeficientes de partição
Os coeficientes de partição (ver equação abaixo) foram
determinados para subprodutos de hidrólise: furfural, 5-
hidroximetil-f urfural, baunilha, seringaldeido, aldeído
coniferílico e ácido acético. Também foram determinados os
coeficientes de partição para a glicose, sacarose, frutose,
xilose e para glicerol e etanol.
W— —
P (coeficiente de partição)org
onde: mp é o coeficiente de partição (-) ,
w rg : a fração mássica do componente na fase orgânica (-) ,
waq : a fração mássica do componente na fase aquosa.
Todos os coeficientes foram determinados para seis
diferentes concentrações de etanol na fase aquosa na faixa
de 0 a 200 g/L. Para cada um destes componentes e para cada
concentração de etanol, foi estabelecido o sistema bifásico
em um tubo Eppendorf contendo 1 grama de uma solução de
lg/L do componente, exceto para etanol, em água Milli-Q
como a fase aquosa e 1 grama de biodiesel como a fase
orgânica. O sistema bifásico foi mantido fechado e não
agitado por 48 horas em um banho-maria a 34°C antes de
centrifugar por 5 minutos a 2000 RPM. Uma amostra de cerca
de 500 mg da fase orgânica foi adicionada a 700 mg água
Milli-Q, formando um segundo sistema bifásico de extração
reversa do componente. Este sistema bifásico reverso também
foi mantido sem agitação por 48 horas a 34 °C. As fases
aquosas dos sistemas bifásicos originais e bifásicos
reversos foram analisadas em um equipamento HPLC . As
medições de HPLC para glicose, xilose, glicerol e etanol
foram feitas usando uma coluna de intercâmbio de ion (Bio-
Rad, Aminex HPX-87H 7.8* 300mm) , a 25°C e 5 mMH 2S0 como
fase móvel a 0.7ml/min; a deteção foi feita por um detector
de índice de refração (Varian RI-4) . Ácido acético e ácido
láctico foram separadas com a mesma coluna, mas
quantificadas com um detector UV (Varian 9095) a 210nm.
Furfural, furfural 5-hydroxymetilo, baunilha, syringaldeído
e conif erylaldeído, foram retidos usando uma coluna C-18
(pBondapak, 10 µιη, 3.9*300nm) e quantificados com detecção
UV (Varian 9095) em extensão de ondas que eram mais
apropriadas para cada composto individualmente. Uma solução
de acetonitrila em água foi usada como eluente (lml/min) .
Os eluentes foram preparados com água Milli-Q, filtrada com
0.45 filtro µ (Millipore) .
A partir do balanço de massa sobre o sistema bifásico
original e reverso, foram determinados os coeficientes de
partição para cada componente e para cada concentração de
etanol na fase aquosa. Todas as medidas foram executadas em
duplicatas ou triplicatas e os resultados resumidos na
tabela 1.
Os coeficientes de partição dependem muito da
quantidade de etanol presente no sistema bifásico.
Coeficientes de partição para HMF e furfural aumentam com o
aumento da concentração de etanol. Por entanto, para
baunilha, seringaldeido e aldeído coniferilico os
coeficientes de partição tendem a diminuir com maior
concentração de etanol no sistema.
Pode ser visto também que para estes componentes
existem coeficientes de partição máximas para concentrações
de etanol dentro da faixa escolhida de 0 a 200 g/L e , mais
especifico, para concentrações abaixo de 80 g/L.
Coincidentemente, este valor é em torno da concentração de
etanol que é visto como a concentração a partir da qual a
inibição por etanol é significativa, em temperaturas
padrões de fermentação de acordo com o trabalho de Rivera e
colaboradores, de 2006 e incorporado aqui por referência em
sua totalidade. Durante a fermentação etanólica, os maiores
coeficientes de partição de biodiesel podem então ser
explorados sem prejuízo de inibição por etanol.
Para os substratos sacarose, glicose, frutose e
xilose, os coeficientes de partição são relativamente
pequenos, até desprezíveis, com valores de 0,04 para
glicose e frutose até 1,2· IO 3 para xilose. A seletividade
para açúcares é baixa e os coeficientes de partição para os
substratos estudados são desprezíveis e ainda diminuem para
maiores quantidades de etanol no sistema.
Coeficientes de partição de glicerol, ácido acético e
ácido láctico são relativamente baixos e não maiores do que
0,3. Para a extração destes componentes, biodiesel não tem
um desempenho ideal. Contudo, a concentração ótima de
etanol na fase aquosa para exploração máxima de
coeficientes de partição de glicerol, ácido acético e ácido
láctico encontra-se abaixo de 80 g/L.
O mesmo experimento foi feito, sendo que foi
substituído o biodiesel por óleo de mamona. Do balanço de
massa sobre os sistemas bifásicos, sendo o sistema original
e o sistema secundário como acima descrito para biodiesel,
os coeficientes de partição foram determinados para cada
componente e para cada concentração de etanol na fase
aquosa .
Os coeficientes de partição medidos são representados
na Tabela 1 . Até as concentrações de etanol de 100g/L na
fase aquosa, o biodiesel supera o desempenho do óleo de
mamona como agente extrator para todos os componentes
inibidores de fermentação medidos, sendo HMF, furfural,
baunilha, siringaldeido e coniferil aldeído ácido acético e
ácido lático. Aparentemente, todos esses compostos têm mais
afinidade com biodiesel do que o óleo de mamona.
Entretanto, essa afinidade depende fortemente da quantia de
etanol presente no sistema de duas fases. Os coeficientes
de partição para HMF e furfural aumentam com a crescente
concentração de etanol, pelo menos até 100g/L de etanol na
fase aquosa.
Este também é o caso para coeficientes de partição de
baunilha, siringaldeido e coniferilaldeído no caso do óleo
de mamona como solvente orgânico, mas no caso do biodiesel,
cada coeficiente de partição, tende a diminuir mais rápido
com a quantia crescente de etanol no sistema. Também pode
ser visto que os valores máximos dos coeficientes de
partição desses compostos são atingidos para concentrações
de etanol dentro da faixa de concentração de etanol
escolhida de 0 a 200g/L, mas que as concentrações de etanol
para atingir estes valores máximos, não são os mesmos para
biodiesel e óleo de mamona. Para o biodiesel como solvente
orgânico, as coeficientes de partição máximas podem ser
encontradas para concentrações de etanol mais baixas de do
que para o óleo de mamona. Coincidentemente, para o
biodiesel, essas máximas são encontradas no etanol abaixo
de 80 g/L, concentração na qual o etanol se torna um
inibidor para a fermentação, na maioria das temperaturas
padrão de fermentação (Rivera et al., 2006). Durante a
fermentação de etanol, as propriedades extrativas de
biodiesel podem assim serem exploradas ao máximo enquanto a
inibição pelo etanol ainda pode ser mantido baixa.
Para os substratos sacarose, glicose, frutose e
xilose, nenhuma diferença significante pode ser vista entre
as coeficientes de partição para biodiesel e óleo de
mamona, mas em todos os casos os coeficientes de partição
são relativamente pequenos, com valores medidos variando
entre 0.04 para glicose e abaixo de 1.2 Ί 0 3 para xilose.
Além disso, coeficientes de partição para os substratos
estudados diminuem frente a uma quantidade aumentada de
etanol no sistema, para ambos, biodiesel e óleo de mamona.
Assim, como desejado, a seletividade para o açúcar é
desprezível em ambos os casos, biodiesel e óleo de mamona
como solvente orgânico. O uso de qualquer desses solventes
durante a fermentação consequentemente não conduzirá a
nenhuma diminuição significante em concentrações de açúcar
na fase aquosa.
No geral, a ótima concentração de etanol na fase
aquosa para máxima exploração dos coeficientes de partição
para glicerol, o ácido acético e ácido lático podem ser
encontrados abaixo de 80 g/L.
Tabela 1 : Coeficiente de partição de vários compostos para
biodiese (BD) e Óleo de Mamona (CO) na presença de
concentrações diferentes de etanol. na fase aquosa
CO < 0,01 0,37 1,1 0,5 2,5 0,025 0,040 0,040 0,0026 0,044 0,006 0,0019
37 BD 0,26 2,1 3,7 1,8 28 0,018 0,033 0,034 0,0018 0,068 0,127 0,096 0,12
CO < 0,01 0,45 1,0 0,4 2,6 0,0092 0,027 0,027 0,0032 0,023 0,048 0,0024 0,09
74 BD 0,17 2,3 2,8 1,4 29 0,0073 0,022 0,022 0,0012 0,084 0,2 5 8 0,070 0,12
CO 0,012 0,85 1,5 0,6 3,8 0,011 0,024 0,024 0,0038 0,021 0,068 0,0042 0,11
110 BD 0,40 2,4 1,8 0,97 22 0,0046 0,020 0,023 0,0014 0,041 0,304 0 , 0 6 5 0,12
CO < 0,01 1,5 5,4 1,98 16 0,0061 0,019 0,019 0,0034 0,018 0,076 0,0084 0,12
149 BD 0,49 2,5 1,5 0,86 18 0,0093 0,020 0,021 0,0014 0,054 0,337 0,071 0,15
CO 0,15 1,4 4,5 1,84 13 0,0075 0,022 0,019 0,0022 0,018 0,104 0,013 0,14
183 BD 0,61 2,5 1,4 0,81 15 0,0022 0,014 0,014 0,0016 0,038 0,346 0,068 0.15
CO 0,19 1,4 4,1 1,72 9,7 0,0058 0,017 0,018 0,0018 0,016 0,102 0,013 0,17
Fermentações
Foram executadas fermentações para ilustrar a
viabilidade técnica da presente invenção. Como inibidores
foram escolhidos furfural, ácido acético e baunilha,
representando os grupos principais de inibidores: furanos,
ácidos carboxílicos e compostos fenólicos.
Estes inibidores, foram introduzidos no pré-inoculo, no
inoculo e nas fermentações finais na razão furfural :ácido
acético :baunilha de 1:2.2:0.6 g/L, que é uma razão
representativa para caldo hidrolitico. Além destes
inibidores, os meios foram preparados com 10 g/L de
peptona, 10 g/L extrato de levedura, 2.5 g/L de K2HPO 4 e
110 g/L de glicose, esterilizados em autoclave a 121°C por
15 minutos. A incubação do inoculo foi feita em Erlenmeyer,
utilizando um agitador (Tecnallab TE420) a 34°C e 150rpm e
monitorando a densidade ótica a cada 12 horas, usando um
espectrof otômetro (Beckman Coulter DU 640) a 600nm.
A biomassa das fermentações finais foi determinada pela
massa seca de cada amostra, tendo cada uma sido lavada duas
vezes com água milliQ. Estas fermentações finais,
executadas empregando uma cepa de Saccharomyces cerevisiae
industrial (Usina Santa Adélia) em faixas de temperatura
entre 30 e 37 °C e pH entre 4.0 e 4.5, foram distintas de
seguinte forma:
A . Fermentação sem inibidores, sem solvente
B . Fermentação com inibidores, sem solvente
C . Fermentação com inibidores, com solvente
Os volumes das fermentações A e B foram de 1L de meio.
Para a fermentação C , um total de 400mL do solvente foi
adicionado a 800mL de meio. Antes da fermentação, o
solvente foi lavado 4 vezes em bateladas de cada 500mL cada
com 2500mL de água destilada a 25°C, utilizando
borbulhamento de ar comprimido com fluxo de 0.2 L-min -
durante 2 horas. Com este método, bolhas de ar levam uma
micro-camada de água limpa para a fase orgânica, na parte
de superior do sistema bifásico. Na superfície desta fase a
bolha quebra, espalhando a água na superfície da camada de
biodiesel e submerge em seguida, levando impurezas até a
fase aquosa inferior. Entre cada ciclo de lavagem, o
solvente foi deixado por duas horas antes da drenagem da
camada aquosa. Amostras desta fase aquosa foram analisadas
com HPLC para garantir a remoção completa de traços de
glicerol, etanol e outras impurezas. Depois de repetir o
processo da lavagem, o solvente foi transvazado, secado e
clarificado em evaporador rotativo (Marconi MA 120) a 55 °C
e 0.5 bar .
Massa seca do fermento e concentrações de substrato,
inibidores e produto (etanol) foram determinados através de
amostras obtidas durante as fermentações. As Figuras 6 , 7 e
8 mostram os resultados para a fermentação A , B e C .
As Figuras 9 e 10 mostram os perfis de concentração de
furfural, furfuril-álcool, baunilha e álcool baunílico
durante a fermentação sem solvente (Figura 9 ) e com
solvente (Figura 10) . O resultado destas fermentações
mostra a viabilidade do invento processo, que pode ser
resumido de seguinte forma: comparando-se a fermentação sem
inibidores (A) , que demorou 24 horas, com a fermentação com
inibidores e sem solvente (B) , que demorou 90 horas para
ser concluída, verifica-se que houve um aumento de quase 4
vezes no tempo de fermentação.
Assim, a introdução de solvente no fermentador com
inibidores, reduziu o tempo total de fermentação, que
voltou a ser de 24 horas, ou seja, quatro vezes menor,
aproximadamente. Corrigindo o volume aquoso para 20% menos,
estas quantias correspondem a uma redução de tempo de
fermentação de 67%.
Além da desintoxicação do meio pelo solvente, ocorre a
desintoxicação natural por via metabólica do fermento.
Quanto ao furfural e a baunilha, o mecanismo de
desintoxicação microbiológica funciona com a redução de
furfural a álcool furfurílico e baunilha à álcool
baunílico. A princípio, o furfural é reduzido com uma taxa
que decresce quando a concentração de furfural torna-se
menor. A redução de baunilha, ao contrário, é mais vagarosa
ou negligente inicialmente, e depois a completa conversão
de furfural, suas taxas aumentam até toda a baunilha tenha
sido reduzida.
A fermentação com inibidores, mas sem solvente (Figura
9 ) permanece em fase lag até furfural e baunilha serem
convertidos a níveis menos tóxicos, no o caso a partir de
60 horas. A partir deste momento, a fermentação continua de
maneira convencional durante as mesmas 24 horas, como visto
para fermentação sem inibidores (A) .
Na presença do solvente (Figura 10) , a fermentação
alcoólica começa logo após de introdução de levedura ao
meio, Neste caso, os inibidores são distribuídos entre a
fase aquosa e a fase orgânica. A concentração dos
inibidores na fase aquosa é consequentemente menor do que
na fermentação B , e a levedura que está somente susceptível
aos inibidores nesta fase aquosa, tem u a necessidade menor
de desintoxicar o meio para manter um desempenho
fermentativo viável.
Na presença do biodiesel, o mesmo padrão de redução
pode ser visto como foi o caso para a fermentação sem
solvente, com exceção de duas observações principais.
Primeiramente, há uma fase de retardo de 5 horas antes do
furfural começar a ser reduzido significantemente, enquanto
que a redução dos inibidores na fermentação B começa
diretamente depois da introdução do inoculo no meio. Embora
que o inoculo cresceu sob condições inibidoras iguais para
ambas as fermentações, a levedura tinha que induzir
novamente sua capacidade metabólica para reduzir o
furfural, mas foi acionada a fazer isso mais tarde em
fermentação C e em uma menor extensão. As concentrações
mais baixas de furfural, baunilha e ácido acético na fase
aquosa podem ter reduzido a necessidade de uma reação
imediata à presença desses compostos tóxicos. Em segundo
lugar, a taxa máxima de redução especifica de furfural,
calculada a partir da somma da redução na fase aquosa e na
fase orgânica, é maior no sistema bifásico (0.27 g-g - )
do que na fermentação sem solvente (0.05 g-g^-h ). Para
baunilha, uma diferença semelhante é vista: 0.20 g g 'h ~1
redução especifica versus 0.03 g g h- ; . Aparentemente, o
mais baixo nivel de inibição sinérgica na presença de uma
fase orgânica permite uma redução de furfural e baunilha
mais efetiva. Assim, enquanto na presença de uma fase
orgânica a concentração de furfural à qual a levedura é
exposta (0.9 g-l - na fase aquosa) é mais baixa do que na
fermentação sem a fase orgânica (2 g l~ ) a taxa de redução
especifica é de cinco para seis vezes mais alta.
Portanto, para fermentação de licor hidrolisado,
manter a concentração dos inibidores limitada é importante
tanto para a taxa de crescimento da levedura quanto para a
redução mais rápida dos inibidores e , assim, para a
produtividade do processo fermentativo em geral.
A alta taxa de redução de furfural resultou na redução
total do furfural em 13 horas, bem antes do fim da
fermentação. Isto tem implicações para o rendimento de
etanol comparado com glicerol, que é maior enquanto
furfural está presente no meio em baixas concentrações. Por
outro lado, a taxa de crescimento especifica e taxa de
produção especifica de etanol sofrem na presença de
inibidores .
As concentrações de ácido acético não são mostradas,
mas aumentaram levemente durante as fermentações. A tabela
2 resume diversos parâmetros de fermentações para cada lote
de fermentação.
Tabela 2 : Concentrações iniciais de inibidores e parâmetros
de fermentação na seguinte ordem: máximo crescimento
especifico, redução de furfural e baunilha e taxas de
etanol , etanol, glicerol e produção de biomassa .
furfural vanillin acetic acid biodiesel
g - g r 1 g r 1 % g g - g g - g g h-1 g g - - g g- g g- g-9"
0 0 0 0 0,47 - - 1,7 3,4 0.46 0.040 0.043
2 1,2 4,4 0 0,09 0,05 0,03 1,2 3,0 0.41 0.014 0.018
2 1,2 4,4 33,3 0,13 0,27 0,20 1,3 4,1 0.45 >0.026 0.045
Em contraste, foi mostrado no estado da técnica que a
redução das taxas de furfural aumentou com concentrações
mais altas de furfural até 4 g 1 do furfural. Para
concentrações ainda maiores, as taxas de redução diminuíram
conforme apresentado no trabalho de Palmqvist et al ., em
1999 e incorporado aqui em sua totalidade por referência.
Provavelmente, o efeito da toxicidade sinérgica da
baunilha e ácido acético em combinação com o furfural
diminui a concentração de furfural, para a qual a taxa de
redução do mesmo é máximo. Uma implicação importante desta
observação é que para fermentações executadas em regime
batelada alimentada, com mosto contendo inibidores como
furfural, independente da aplicação de uma fase orgânica,
as taxas de conversão de furfural e baunilha podem ser mais
favoráveis do que para a fermentação em regime batalada,
sendo que a alimentação regulada no regime de batelada
alimentada permite manter as concentrações dos inibidoras
constantes, mas baixas. Entretanto para a viabilidade de
uma fermentação continua, a inibição do crescimento pode
ser o real fator limitador ao invés da taxa máxima
conversão dos inibidores, mesmo sendo que a taxa de
conversão será menor do que para fermentações em regime
batelada ou batelada alimentada como se nota também por
Horvath et al., 2001, incorporado aqui em sua totalidade
por referência.
Ainda por cima, antes de chegar às condições de
^washout' da biomassa na fermentações em regime continuo,
os baixos níveis de conversão do substrato causarão a perda
do mesmo e baixos níveis da taxa de produção de etanol.
Assim especialmente para fermentações contínuas, o sistema
proposto de duas fases é uma opção prometedora para a
produtividade e rendimento aumentado com menor dependência
de taxas de redução dos inibidores pelo próprio fermento.
Portanto, o processo de fermentação da presente
invenção pode ser otimizado para a obtenção de máximo
rendimento, otimizando-se a vazão de substrato alimentado e
vazão da fase orgânica pelo sistema, e no caso de
fermentação em batelada ou batelada alimentada, mantendo-se
em nível ótimizado a concentração de inibidores presentes
no meio, até o final da fermentação.
Viscosidade
Para ambos os solventes, biodiesel e óleo de mamona,
foram feitas medidas de viscosidade usando um reômetro
Physica MCR301 (Anton Paar GMbh, Graz, Áustria), equipado
com placa paralela de aço (75mm de diâmetro, abertura de
0.5mm) . As medidas para montagem da curva de fluxo foram
realizadas em triplicatas com a taxa de cisalhamento
variando de 0 a 300s -1 . Um programa de passos sobe-desce-
sobe (up-down-up) foi realizado a fim de avaliar a
tixotropia do produto avaliado.
O comportamento do fluxo do biodiesel e do óleo de
mamona foi modelado a fim de obter parâmetros reológicos
(tensão de cisalhamento (σ0), índice de consistência (K) e
índice de comportamento do fluido (n) ), de acordo com o
modelo Herschel-Bulkley e incorporado aqui por referência
em sua totalidade, das quais foi determinada a viscosidade.
O efeito de temperatura sobre a viscosidade do
biodiesel e óleo de mamona foi estudado dentro da faixa de
5 a 40 °C, usando um intervalo de temperatura de 5°C entre
cada medida. Os resultados desse efeito da temperatura na
viscosidade foram avaliados de acordo com a equação de
Arrhenius, e incorporado aqui por referência em sua
totalidade .
σ - σ ο+ (modelo Herschel-Bulkley)
ÍEA 1ln( ) = ln(77 ) +
(equação de Arrhenius)
Onde η : viscosidade (Pa s ), Ea : energia de ativação para
fluido viscoso (Jmol^K -1), T : temperatura (K) .
Para ambos, biodiesel e óleo de mamona, a tensão de
cisalhamento demonstrou uma forte relação linear com a taxa
de cisalhamento com intercessão a zero nos dois eixos e uma
regressão média de 0.9999 para todas as temperaturas.
Consequentemente não há tensão de cisalhamento (σο) e a
índice de comportamento de fluxo (n) é igual a 1 ,
conduzindo a um comportamento Newtoniano com um índice de
consistência (K) igual à viscosidade (η) na mesma
temperatura .
A Figura 11 mostra o efeito da temperatura sobre a
viscosidade do biodiesel e óleo de mamona. Grafiçando o
logaritmo natural da viscosidade contra o inverso da
temperatura em Kelvin observa-se uma relação claramente
linear para ambos os solventes, com regressões de 0.999.
Para os dois, biodiesel e óleo de mamona, o aumento de
temperaturas resultou em viscosidades decrescentes.
Entretanto, o biodiesel, consistentemente teve uma
viscosidade mais baixa que o óleo de mamona, para todas as
temperaturas, o que era esperado já que o biodiesel foi
originalmente desenvolvido para ser combustível substituto
de petróleo com baixa viscosidade. Para o biodiesel e óleo
mamona, l"|o é encontrado 3 .126 10 8 e 5.751 '11
respectivamente; ηο de biodiesel é portanto mais alto que o
de óleo de mamona, mas ambos são relativamente pequenos. E
foi encontrado 33556 para biodiesel e 57431 para óleo de
mamona, o que significa que a energia de ativação
necessária para iniciar o fluxo é consideravelmente mais
baixa para biodiesel, e pode ser entendida, que a
temperatura necessária para baixa viscosidade é muito mais
alta para o óleo de mamona.
Escolha do agente extrator preferido
Ambos, biodiesel e óleo de mamona, demonstram ótima
biocompatibilidade com levedura industrial. Porém, conforme
demonstrado nos itens acima, o biodiesel em base de óleo de
mamona, solvente sugerido na presente invenção, tem
diversas características que o tornam uma escolha
interessante como agente de extração para fermentação
extrativa in-situ de inibidores como provenientes da
biomassa ligno-celulósica hidrolisada ou outros mostos e
matérias-primas definidos acima com fins de fermentação. É
relativamente barato e um bioproduto renovável que pode ser
produzido localmente. É biodegradável e um produto que,
depois de diversos ciclos de utilização como agente
extrator e/ou agente refrigerante, pode ainda ser vendido
ou usado com biocombustível para a própria frota da usina
ou subsidiários.
Mais específico, o biodiesel tem a menor densidade em
comparação com o óleo de mamona, favorecendo sua separação
do caldo de fermentação.
Outra vantagem do biodiesel é que absorve mais água e
etanol do que o óleo de mamona, o que, de fato, concentra
substrato na fase aquosa. Para uma fermentação em regime
batelada ou batelada alimentada, isso significa que o
açúcar é mais concentrado no final da fermentação,
promovendo a produtividade máxima neste estágio da
fermentação, e aumenta o rendimento de fermentação em
regime continuo.
Os coeficientes de partição para os principais
inibidores de fermentação são mais altos para biodiesel,
resultando na remoção desses inibidores do caldo de
fermentação em favor do processo de fermentação como um
todo .
Para uma fermentação em regime batelada ou batelada
alimentada, a produção de etanol começa mais cedo e as
taxas de produção serão mais altas do que sem um solvente
extrativo. Para uma otimização do uso das capacidades
extrativas do biodiesel, a concentração de etanol na fase
aquosa deveria ser ligeiramente mais abaixa que 50-80 g/l,
coincidentemente a concentração em que o etanol se torna
inibidor.
A comparação de uma fermentação convencional sem
inibidores, uma fermentação com inibidores e uma
fermentação com inibidores e biodiesel, confirmam o efeito
positivo do uso de biodiesel para uma série de fermentação
com furfural, baunilha e ácido acético em termos de tempo
de fermentação total, taxas de crescimento e taxas de
produção de etanol .
Operações Unitárias envolvidas e Fluxograma de modalidades
do Processo da Presente Invenção
A Figura 12 mostra um exemplo de um possível
fluxograma de uma planta de produção de etanol por
fermentação extrativa, baseada na tecnologia proposta pela
presente invenção. Segundo o diagrama, o meio é preparado
no misturador. Após o preparo e um procedimento de
tratamento térmico, o meio é resfriado por um trocador de
calor e introduzido no fermentador, onde o substrato será
convertido em produto (seja etanol, butanol, acetona,
enzima, aminoácido, entre outros) por um micro-organismo
(seja Saccharomyces cerevisia, Zymomonas mobilis, entre
outros, geneticamente modificado ou não) . A mistura de
vinho e solvente orgânico na saída do fermentador é enviada
para um decantador, aonde o solvente será separado por
diferença de densidade, eventual aplicação de calor, outro
método de separação ou qualquer combinação destes .
Em seguida, como em processo de produção convencional,
o vinho é clarificado em unidades de centrifugação e , via
outro trocador de calor, introduzido no sistema de
destilação. No caso de produto extracelular, o micro
organismo pode ser reciclado e introduzido numa unidade
onde se pode ocorrer eventual sangria de células, seguido
por uma unidade para reativação das células por tratamento
ácido, aeróbico, com nutrientes ou demais métodos com fins
de reativação.
Um produto volátil como o etanol, butanol ou acetona,
parcialmente presente no gás de saida do fermentador, é
recuperado pela coluna de absorção do produto. O solvente
orgânico, que foi separado no decantador, absorve calor via
trocadores de calor, antes de entrar num sistema, por
exemplo, uma cascata de destiladores, com o fim de
recuperação do solvente, o produto e água, de preferência
usando apenas vapor de baixa pressão. Antes de ser re¬
introduzido no fermentador, o solvente é resfriado a uma
temperatura abaixa da temperatura de fermentação pelo
trocador de calor e um sistema de resfriamento sob baixa
pressão. Produto e água recuperados do solvente são
introduzidos diretamente no sistema de purificação, como,
por exemplo, um retificador.
Outras configurações possíveis são mostradas nas
Figuras 13 e 14.
A Figura 13 mostra a remoção de inibidores e produto
com refrigeração simultânea, com recuperação do produto,
solvente, água e inibidores em sistema com apenas um
biorreator.
A Figura 14 mostra o uso de mais biorreatores em
série, neste caso três dornas de fermentação. Nesta
configuração, a primeira dorna é responsável pela
fermentação da maior parte do substrato alimentado,
enquanto a segunda e terceira dorna são responsáveis pela
fermentação do restante do substrato. Apenas na primeira
dorna é necessário a remoção de inibidores e produto pelo
solvente o suficiente para obter concentrações bastante
baixas de pelo menos a maioria dos inibidores na saída da
primeira dorna, assim garantindo uma mínima inibição
sinérgica e a fermentação efetiva tanto nesta dorna como
nas dornas conectadas em serie.
A Figura 15 mostra um fluxograma de uma planta de
fermentação extrativa para fermentação em batelada ou
batelada alimentada com uma dorna conforme uma terceira
modalidade da presente invenção. Durante a fermentação, o
solvente está sendo reciclado pelo sistema, aumentando a
produtividade da fermentação por meio de extração contínua
dos inibidores, do produto e por estar mantendo o meio de
fermentação na temperatura ótima. Após a fermentação, a
fase aquosa retirada da dorna é centrifugada e o resto do
produto presente nesta fase é recuperado e purificado pela
etapa de destilação e retificação.
A Figura 16 mostra um fluxograma de uma planta de
fermentação extrativa para fermentação contínua com
resfriamento e remoção de inibidores em várias dornas,
conforme uma quarta modalidade da presente invenção, onde o
solvente é enviado por todas as dornas em sentido
contracorrente ao meio fermentado. Assim, as concentrações
de todos os inibidores e o produto são minimizadas na
última dorna, garantindo uma produtividade e um rendimento
máximo no processo integral.
Modalidade Preferencial da Presente Invenção
MODELAGEM DE FERMENTAÇÃO DE ETANOL EXTRATIVO EM COMBINAÇÃO
COM RECUPERAÇÃO DE PRODUTO IN-SITU, MÉDIA DESINTOXICAÇÃO E
RESFRIAMENTO.
Um processo de fermentação continuo foi modelado com
uma série de três fermentadores , representando uma armação
industrial realística.
A Figura 17 mostra uma visão esquemática do processo.
Em um primeiro estágio, o mosto, composto de suco
clarificado e caldo hidrolisado, é misturado, concentrado
por evaporação, resfriado e alimentado ao primeiro
fermentador como fluxo (B) . A água evaporada (A) pode ser
usado para limpeza do solvente depois da remoção do etanol
na unidade de recuperação de etanol, mas isso não é
considerado no modelo. O primeiro fermentador é o maior em
volume, contém uma fase orgânica e é responsável pela
conversão de cerca 40-70 % do substrato. A fase aquosa
contém todo o substrato e levedura. A fase orgânica é
parcialmente dispersada na fase aquosa, mas tende a migrar
para o topo do fermentador devido a sua baixa densidade. A
fração do etanol produzido, inibidores e uma pequena
quantia de água do processo são extraídos para a fase
orgânica, assim melhorando o desempenho e produtividade da
fermentação e concentrando o substrato. Otimizadas
concentrações de etanol no volume aquoso também permitem a
máxima partição da maioria dos inibidores hidrolisados para
a fase orgânica.
Outros fluxos que entram no fermentador são o eventual
micro-organismo concentrado e reativado da unidade de
reativação das células (Q) e solvente reciclado e
refrigerado (I) que não contém inibidores e etanol. A
temperatura do solvente na entrada da dorna é ajustada para
permitir refrigeração do meio da fermentação, enquanto
permanecer em torno de três graus acima do ponto da
solidificação ou turvação deste solvente. Na simulação, uma
variedade de temperaturas de fermentação alvo é avaliada
por sua influência no desempenho da fermentação.
A mistura de vinho e solvente é retirada da parte de
cima do biorreator onde a concentração de solvente é mais
alta devido à diferença de densidade entre o solvente e a
fermentação média. Este fluido (D) é conduzido a uma
unidade decantadora da qual o solvente, rico em etanol e
água, é atraído do topo (E) enquanto o vinho decantado ou
fase aquosa (J) é recuperado no fundo do decantador. Por
ter um ponto de ebulição mais alto que ambos, etanol e
água, o solvente enriquecido com etanol (E) é aquecido e o
etanol e água são separados do solvente por evaporação, um
estágio que não é incluído no modelo. A ração de água e
etanol recuperada do solvente (F) é conduzida diretamente a
um retificador, unidade da qual o etanol pode ser
recuperado com alto grau de pureza (R) . O fluido de vinho
decantado (J) é alimentado a um segundo e terceiro
fermentador, os quais são colocados em séries através do
fluxo (K) .
Os dois fermentadores contêm apenas uma fase aquosa de
um terço do tamanho da fase aquosa do primeiro fermentador
e servem para conversão do substrato restante. Porque a
maior parte do etanol produzido no primeiro fermentador foi
removida, a inibição por acumulação adicional de etanol
produzido nestes últimos dois fermentadores é limitada. A
remoção adicional de inibidores hidrolisados também não é
necessária porque a concentração desses inibidores já
deveria ser pelo menos baixa o suficiente para viabilizar a
fermentação no primeiro fermentador e quantias baixas de
furfural têm demonstrado ter um efeito positivo para o
rendimento de etanol. O resfriamento do segundo e do
terceiro fermentador é feito convencionalmente, presumindo
temperaturas de fermentação iguais às temperaturas alvo do
primeiro fermentador e considerando que a geração de calor
nestas dornas é limitado devido a pequena quantidade de
substrato a ser convertido nestes volumes. Após da saida do
fluido do terceiro fermentador (L) , a levedura neste fluido
é separada por centrifugação e conduzido para unidades d
sangramento e tratamento da mesma por fluxo (N) , enquanto o
vinho clarificado (M) é bombeado para destilação e unidades
retificadoras, purificando o etanol (R) de fluidos de
produtos secundários, vinhaça e óleos de fusão (S) , um
estágio do processo que por si mesmo não incluido no
modelo. Uma porção menor da levedura é sangrada (O) e a
fração restante (P) é tratada por arejamento, ácido,
aeração e nutrientes em uma unidade de tratamento para
leveduras antes de re-introduzir no fermentador através de
fluxo (Q) .
A escolha do solvente, um etil-éster de ácido
ricinoléico ou biodiesel de óleo de mamona, foi elaborado
conforme o trabalho descrito nos itens acima e baseado nas
propriedades desejadas: coeficientes de partição favoráveis
para produto e inibidores, alta seletividade para estes
compostos comparada ao substrato, alta biocompatibilidade,
baixa solubilidade na fase aquosa, alta capacidade de
absorção de água para concentrar o substrato do
fermentador, características termodinâmicas favoráveis para
remoção do produto do solvente e regeneração do solvente
como alto ponto de ebulição, sem formação de emulsões
estáveis, rápida separação da fase aquosa, alta
estabilidade química em altas temperaturas, baixa
viscosidade, baixo custo, possivelmente fabricada
localmente e reutilização para outros propósitos, entre
outros .
A cinética do processo microbiológico de fermentação
com aplicação na presente invenção foi modelado usando
funções cinéticas de temperaturas e concentrações de
substrato, etanol, biomassa e inibidores hidrolisados, os
quais foram elaborados no trabalho de Zautsen et al ., 2011
(submetido em Nov. 2011 para publicação sob título
'Kinetics of ethanol fermentation and inhibition by
hydrolyzed lignocellulosic biomass' ), e incorporados aqui
em sua totalidade por referência. Para a maioria das etapas
do processo, apenas balanços de massa simplificados foram
modelados. A recuperação de etanol e reciclagem de
solvente, destilagem e retificação não foram modelados. A
energia calorífica introduzida nas dornas dos biorreatores
por atividade metabólica relacionada à produção de etanol e
a energia dissipada pelos agitadores nestas dornas foram
incluídas no modelo. A energia introduzida por movimento de
mistura foi apenas considerada para os fermentadores e o
calor introduzido por dissolução exotérmica de produção de
etanol não foi considerado.
Dimensões e suposições
O primeiro fermentador foi dimensionado com um volume
de fase aquosa de 600m3, enquanto o segundo e terceiro
fermentadores ambos continham 200m3 de caldo. A fase
orgânica no primeiro fermentador teve um volume de 20% da
fase aquosa. A taxa de diluição da fase aquosa do primeiro
fermentador foi fixada para 0.125h -1, pelo ajusto da taxa
de alimentação, reconhecendo as diferentes densidades de
todos os fluidos com suas composições e temperaturas. Os
custos das matérias-primas caldo de cana clarificado .e
licor hidrolitico foram relacionados como 3:1.
Os componentes considerados no modelo foram substrato,
biomassa, etanol, furfural, baunilha, ácido acético, água,
biodiesel como solvente e dióxido de carbono. Sacarose,
glicose, frutose e xilose foram consideradas como
substratos iguais, sem diferenciação para conversão
cinética que dependeria das características e capacidades
específicas da linhagem da levedura aplicada no processo
real. Caldo de cana clarificado e liquor hidrolitico são
supostos a não evaporar durante a preparação do "mosto",
embora em um esquema mais realístico, as concentrações de
alguns inibidores mais voláteis como ácido acético e
furfural podem muito bem serem reduzidos neste estágio.
Compostos presentes em melaço e xarope que inibem a
fermentação tais como sulfeto, ácidos orgânicos, altas
concentrações de sal, cálcio e magnésio e sólidos
insolúveis não são considerados. Todavia as taxas de
conversão biológica de inibidores diferem para cada
composto furânico ou fenólico, dependendo principalmente do
grupo funcional distinto. A inibição por furfural e HMF é
considerada cumulativa, e é representada no modelo por
furfural como sua soma total de furanos, como é a baunilha,
um aldeído fenólico, escolhido como representante para a
soma de todos os fenóis. O ácido acético representa todos
os ácidos orgânicos. As densidades dos líquidos são
calculadas como a soma média das densidades de todos os
componentes e onde for possível com dependência de
temperatura. O Etanol foi recuperado a 100% do fluxo
solvente de saída e o solvente de fluxo de saída foi
reintroduzido seco no primeiro fermentador e livre de
compostos inibidores previamente extraídos. A temperatura
limite mais baixa para solvente entrando no fermentador foi
determinada como três graus acima de seu ponto de
solidificação, que é aproximadamente -5°C. A cinética do
transporte de compostos da fase aquosa à orgânica não foi
considerada e condições de mistura em todos os equipamentos
envolvidos foram considerados ideais. O número de Reynolds
Re foi fixado a IO6 como foi o número da potência Np em 5.5
para a turbina do misturador com regulagém. Para cálculo de
potência e turbulência, três misturadores foram supostos
por fermentador, cada um com um diâmetro igualando-se a 30%
de diâmetro da dorna, e a razão entra a altura e o diâmetro
da dorna foi dois para todos os fermentadores . Nestas
condições, a velocidade de ponta do agitador foi entre 3.3
e 6.4 m-s - , dependendo da viscosidade e densidade do caldo
e da fase orgânica. Os valores das coeficientes de partição
dos componentes sobre a fase orgânica e aquosa no
fermentador e no fluxo de saida do biorreator foram iguais
aos coeficientes de partição como medidos em 3 °C em
equilíbrio para concentrações diferentes de etanol na fase
aquosa.
A viabilidade celular foi modelada somente dependente
da temperatura, com taxas de morte celular relativas ao
desvio da temperatura do mosto da temperatura máxima,
estabelecida em 39°C, e somente a fração viável da levedura
contribuiu para o crescimento celular e a produção de
etanol enquanto a fração restante acrescentou à perda do
rendimento do produto. A taxa de produção de dióxido de
carbono foi presumida como equivalente a 95.7% da produção
do etanol por peso, e a captura de etanol na exaustão de
CO2 não foi considerado, nem de água, por nenhum dos três
biorreatores . A geração de água devido a processos químicos
metabólicos não foi considerada. A densidade da levedura
foi presumida a 1200 Kg m- . Para cada 1000 litros de
etanol produzido, uma fração de 20kg de creme de levedura
foi sangrada e o restante foi reativada e retornada ao
fermentador. Nenhum calor foi introduzido pelo processo de
centrifugação ou em qualquer outro estágio do processo,
exceto na fermentação como detalhado acima. A transferência
de calor do meio da fermentação para o solvente foi
presumida como rápida em todos os casos, de maneira que as
temperaturas da fase orgânica e o caldo da fermentação
foram iguais logo após da introdução do solvente na dorna.
Método de cálculo
O processo de fermentação foi modelado usando Python
como linguagem de computação. Um método de cálculo numérico
foi escolhido para o qual milhões de combinações de valores
de parâmetros de entrada foram avaliadas em paralelo. O
cálculo continuava até os variáveis de estado foram
constantes para todas as combinações de valores de
parâmetros de entrada.
Resultados
Os resultados do cálculo mostraram as faixas para as
melhores condições de fermentação, otimizando a
produtividade volumétrica e minimizando os custos de
matéria-prima . Como ponto de referência para avaliar o
desempenho da fermentação extrativa, foi feito primeiro uma
simulação para a fermentação convencional, ou seja, sem
solvente como agente extrator.
Fermentação convencional
Fermentações sem solvente também foram simuladas
usando dimensões e suposições iguais para permitir a
comparação com fermentação com a proposta tecnologia de
extração aplicada. Neste caso, três parâmetros de entrada
foram variados: a proporção de licor hidrolítico no mosto,
a concentração final de substrato no mosto de alimentação e
a temperatura da fermentação.
Os resultados mostraram que a otimização da taxa de
produção volumétrica, e a minimização dos custos de
matéria-prima, ambos dependem da razão entre caldo
clarificado e licor hidrolítico e da concentração de
substrato. Porque o resfriamento foi fornecido
convencionalmente para esta fermentação, a quantia de
inibidores no mosto final foi o único fator limitador para
a fermentação. Para baixas f ações de licor hidrolítico, a
taxa de crescimento foi suficientemente alta para prevenir
perda total da levedura por diluição do meio.
Para mosto contendo apenas suco, as taxas de produção
volumétricas foram maximizadas usando uma concentração de
substrato de em torno de 24%. Concentrações mais altas de
substratos reduziram a taxa do crescimento e
consequentemente as taxas de produção de etanol
(volumétrico) . Embora na concentração ideal de 24% de
substrato, o rendimento total (dados não demonstrados) foi
meramente 53% do máximo teórico devido a uma produção mais
alta de biomassa em detrimento de etanol.
O custo de substrato por volume de etanol produzido
foi menor apenas para os substratos de mais baixas
concentrações de açúcares usados nas simulações, mas não
alcançando menos que 20% dos valores calculados menores
para ambos, fermentação convencional e fermentação
extrativa. As concentrações mais altas de substratos
causaram conversão incompleta de açúcares, e , portanto,
diminuiu o rendimento geral, que está diretamente
relacionado à produção por custo de substrato.
Para fermentações convencionais, as proporções de
caldo hidrolitico não podiam ser maiores do que 2% e
temperaturas de fermentação ideais para taxas de produção
volumétrica ideal foram aproximadamente 32° C , enquanto que
para um menor custo de substrato, as temperaturas ideais
foram mais altas perto de 37°C.
Fermentação extrativa
Para fermentações com solvente, a taxa do fluxo do
solvente foi usada como um quarto parâmetro independente e
expresso como taxa de diluição de solvente sobre o volume
aquoso.
Resultados mostraram a dependência da taxa de produção
volumétrica e os custos de substrato por volume de etanol
produzido, como a da proporção do caldo hidrolitico e da
taxa de diluição do solvente. A quantidade de inibidores no
mosto final foi um fator limitador para o desempenho da
fermentação para qualquer taxa de diluição de solvente
dada, causando depleção de levedura para altas
concentrações destes inibidores, mas não tão grave como no
caso da fermentação convencional.
Outro fator limitador foi o resfriamento oferecido
pelo solvente. Para baixas taxas de diluição de solvente,
ambas as taxas de produções volumétricas, e a produção por
custo de substrato entraram em colapso devido ao
resfriamento insuficiente. Acima de uma taxa de diluição de
0.25h _ , o solvente forneceu resfriamento suficiente para
todas as composições do mosto. Com taxas de diluição do
solvente maiores, as taxas de produção volumétrica
aumentaram devido à remoção de etanol e inibidores
provenientes do caldo hidrolitico. E ainda mais, as taxas
aumentadas de diluição do solvente permitiram que frações
mais altas de hidrolisado fossem fermentadas e diminuíram o
custo mínimo de substrato, embora mesmo a taxa de diluição
de l h não foi suficiente para viabilizar a fermentação de
um hidrolisado puro. Entretanto, as consequências
económicas de altas taxas de diluição de solvente, em
termos de custos de operação e energia, não foram
calculadas e são propensas a aumentar o total de custos da
produção, limitando assim a viabilidade do uso de taxas
muito altas de diluição do solvente.
Para a produção por custo de substrato, com o suco
sendo três vezes mais caro que o hidrolisado, uma
composição otimizada de mosto foi encontrada, diferente
para cada taxa de diluição de solvente.
Para uma composição de mosto com a proporção de caldo
hidrolítico fixo a 30%, concentrações de substrato acima de
20% requeriam consideráveis taxas de diluição de solventes
para obter altas taxas de produção volumétrica. Para taxas
de produção volumétrica, diferentes concentrações
otimizadas de substrato foram encontradas para diferentes
taxas de diluição de solventes. Por outro lado, custos
mínimos de substrato foram apenas obtidos para
concentrações mínimas de substratos e diminuíram levemente
com a taxa de diluição de solvente acima do ápice da
provisão do resfriamento.
Para esta mesma proporção de caldo hidrolitico fixo a
30%, mostos com concentrações de substrato mais elevadas
geraram taxas de fermentação mais altas e elevaram a
produção de calor por atividade metabólica.
Consequentemente, taxas de diluição de solventes mais altas
foram necessárias para fornecer resfriamento suficiente
para concentrações mais altas de substratos.
Para a taxa de produção volumétrica, uma concentração
otimizada de substrato foi encontrada a um porcentagem mais
baixa do que para a fermentação convencional e difere de
uma concentração otimizada de substrato para máximo
rendimento ou minimo custo de substrato, que foram ótimos
ambos a mais baixa concentração de substrato de 15%.
Como também foi notado para fermentações sem remoção
de inibidores e em regime continuo, no trabalho de Horvath
et al . 2001 e incorporado aqui em sua totalidade por
referência, perca total de fermento devido a taxa de
diluição do meio já ocorre a relativamente baixos níveis de
concentrações de inibidores.
O efeito tóxico sinérgico da baunilha, ácido acético e
furfural diminuiu a concentração de furfural para a qual a
taxa de redução de furfural foi ao máximo. A inibição do
crescimento foi um fator limitador para taxas máximas de
conversão de inibidores específicos por redução metabólica.
Contudo foi provado, por meio de modelagem e
simulação, que a fermentação extrativa em regime contínua,
permitiu uma extração simultânea in-situ de inibidores
presentes no hidrolisado e etanol como produto de
fermentação, bem como resfriamento efetivo do processo de
fermentação pelo mesmo agente extrativo.
Para a fermentação extrativa modelada, o furfural
migrou para a fase orgânica como ocorreu com a baunilha e
ácido acético, cada um com diferentes coeficientes de
partição dependendo das concentrações de etanol no sistema,
melhorando as taxas de conversão de inibidor, aumento de
taxas e taxas de produção de etanol, especialmente a taxas
de solvente aumentadas.
Assim, o modelo combinou remoção de diversas
inibidores por extração e conversão biológica, ambas
afetada por temperaturas e composição do caldo de
fermentação. Diferentes valores para a proporção de caldo
hidrolítico no mosto, concentração de substrato,
temperaturas alvo de fermentação e taxas de diluição de
solvente foram avaliadas, enquanto incluindo a geração de
calor mecânico e metabólico, efeito de inibição pelo
produto etanol, coeficientes de partição dos diferentes
compostos e efeitos de temperatura na conversão cinética
inibidora. Deste modo, efeitos combinatórios no desempenho
de diversas chaves de indicadores de fermentação foram
revelados .
A taxa de diluição do solvente precisava apenas ser
alto o suficiente para assegurar o crescimento de levedura
tão rápido quanto a taxa de diluição da fase aquosa, sobre
os três fermentadores, e providenciando refrigeração
suficiente do meio de fermentação. Antes de chegar a
condições de washout' do fermento, devido a altas
concentrações de inibidor ou de substrato, baixas taxas de
conversão de açúcar causaram perda de substrato e baixas
taxas de produção de etanol .
As taxas otimizadas de diluição de solvente reduziram
de melhor forma a inibição para ambos, inibidores
provenientes de caldo hidrolitico e o produto etanol,
melhorando as taxas de fermentação.
No contexto de diferentes regimes de fermentações, as
concentrações de inibidor podem ser mantidas baixas em
relação à concentração de biomassa para fermentação em
regime batelada do licor hidrolitico, por controle da taxa
de alimentação do mosto para fermentação em regimes
batelada-alimentada ou continua, e taxa de diliução da fase
orgânica no caso da fermentação continua como apresentada
nesta simulação. Porém, para fermentações em regime
batelada ou continuo sem a aplicação de uma fase orgânica,
isto não é possível. Consequentemente, taxas de conversão
de furfural e baunilha foram mais altas na fermentação
extrativa apresentada do que na fermentação contínua
convencional, permitindo a fermentação de frações de caldo
hidrolítico no mosto mais altas, gerando taxas de produção
volumétricas mais altas e diminuindo os custos totoal de
substrato .
Deve-se ainda notar que as concentrações de inibidores
provenientes do caldo hidrolítico foram pressupostos a não
diminuir durante a preparação do mosto, que representa um
cenário piorado considerando a alta volatilidade de
inibidores como ácido acético. Dependendo da fonte de licor
hidrolítico e do método e severidade da hidrolise da
matéria-prima, pode-se esperar que as concentrações finais
de inibidores no alimento do mosto são mais baixas que os
valores presumidos neste trabalho, levando a resultados até
mesmo mais favoráveis. Ao todo, pode ser concluído que para
fermentação contínua, o sistema de fermentação extrativa
duas-fases líquido-a-líquido é uma integração eficiente e
uma promissora integração de redução ín-situ da
concentração de inibidores, recuperação do produto e
resfriamento da fermentação.
Resumo
Os ésteres orgânicos, mais conhecidos como biodieseis,
à base de ácidos graxos como, por exemplo, ácido
ricinoléico ou ácido oléico, são os solventes mais
adequados para ser empregados no processo de fermentação
extrativa conforme revelado pela presente invenção, uma vez
que possuem características fundamentais, tais como:
Biocompatibilidade - o solvente tem uma alta
biocompatibilidade, de importância vital para o desempenho
do bioprocesso. O tamanho da molécula sendo maior do que 12
carbonos impede a miscibilidade da molécula com a parede
celular do fermento e , assim, garante a biocompatibilidade,
desde que não há grupos especiais na molécula que podem
tornar o mesmo em componente tóxico;
Viscosidade, ponto de ebulição e densidade - A
estrutura, contendo pelo mínimo uma ligação dupla por ser
um éster metílico, etílico ou propílico, faz com que a
superfície de interação molecular do solvente seja limitada
na terceira dimensão, resultando em uma viscosidade
limitada e densidade baixa em comparação à fase aquosa,
ambas são propriedades favoráveis. Por outro lado, o
tamanho da molécula, a superfície da mesma e a quantidade
de pontes de hidrogénio que podem ser formados entre as
moléculas, garantem um ponto de ebulição alto e bastante
diferenciado do produto da fermentação e dos demais
componentes voláteis, permitindo a recuperação do produto e
do próprio solvente de forma economicamente viável;
Polaridade - A polaridade da molécula,
principalmente determinada pelo tamanho da cadeia principal
da molécula e pelos grupos e ligações polares, promove a
extração de substâncias polares e apoiares (inibidores e
produtos como etanol, butanol, acetona entre outros.), mas
justamente não as substâncias que são tão polares como os
açúcares (substrato) . Por razões ambientais, o solvente não
pode dissolver na fase aquosa. Por outro lado, água pode
ser absorvida na fase orgânica e assim concentrar o
substrato. Muitos possíveis grupos polares, como OH, NH3,
ésteres, entre outros e combinações dos mesmos podem formar
uma polaridade ideal .
Coeficientes de partição - capacidades de
absorção e coeficientes de partição altas para o produto e
inibidores provenientes do mosto e seletividade baixa para
substrato.
> Viabilidade económica - a alta disponibilidade no
mercado local e baixo preço da sua matéria-prima, no caso
de biodieseis um óleo vegetal como óleo de mamona, são
fatores muito importantes para que tal molécula possa ser
economicamente viável ou não, além da opção de re¬
utilização do solvente por outros fins, como, por exemplo,
biocombustível;
Toxicidade - a baixa toxicidade é importante
tanto para operários no local da utilização do solvente, no
caso a usina, como para a eventual introdução no meio-
ambiente, no caso que frações mínimas do solvente misturam
com um fluxo de saido do processo que será exposto ao meio-
ambiente, por exemplo, a vinhaça ou célula sangrada.
Emulsão - não formar emulsões (estáveis) durante
a fermentação e/ou processos downstream;
Estabilidade química do solvente - o solvente não
pode degradar o produto ou causar sua degradação, ou ainda
reagir com o produto para formar outro, independente da
utilização de altas temperaturas nos processos de
recuperação ou da presença de componentes reativos, como os
ácidos, no meio fermentativo;
Em sistema bifásico vale para ambos solventes, óleo de
mamona e biodiesel em base deste óleo, para maiores
concentrações de etanol na fase aquosa, os coeficientes de
partição dos principais inibidores são mais elevados e a
razão entre absorção de etanol e água também é maior,
especialmente para biodiesel. Biodiesel absorve
relativamente mais água, resultando em maior capacidade de
concentração de substrato no meio da fermentação.
As fermentações em fermentadores de 1L em regime
batelado, mostraram o efeito positivo do uso de biodiesel
como solvente na fermentação extrativo liquido-liquido, na
presença de inibidores furfural, baunilha e ácido acético
no mosto. As taxas de redução de furfural e baunilha em
produtos sem efeito inibidor foram mais elevadas na
presença do solvente, diminuindo a fase lag e aumentando a
taxa de crescimento e a produtividade especifica e
volumétrica, enquanto mesmas concentrações destes
inibidores frequentemente inibibem a fermentação
convencional, diminuindo a viabilidade e até levando a
morte completa do inoculo antes do mesmo sair da fase lag.
Uma série de experimentos permitiu a construção de um
modelo cinético da redução de furfural e baunilha, na
presença de ácido acético e para várias temperaturas e
concentrações destes inibidores. O modelo descreve, entre
outros, as taxas de conversão de furfural e baunilha, a
taxa de crescimento e taxa de produção de etanol em função
da temperatura, substrato e concentração de inibidores e
produto, ajustado por estimação de parâmetros e validado
para várias possíveis combinações chaves das variáveis
independentes envolvidas.
A modelagem e simulação de um sistema integrado de
fermentação extrativa liquido-liquido com recuperação de
solvente e resfriamento do meio de fermentação pelo próprio
solvente da presente invenção, permitiram a otimização da
taxa de diluição de solvente, a concentração de substrato,
a temperatura alvo da fermentação e a fração de caldo
hidrolitico. Utilizando um modelo de custos relativos das
matérias primas, obtém uma relação importante entre os
custos da mistura do mosto e a produtividade do processo,
baseado no rendimento total do mesmo e admitindo o limite
para a utilização de caldo hidrolitico. Sobretudo, mostrou-
se a vantagem da utilização do biodiesel como agente
extratante de inibidores proveniente de caldo hidrolitico,
etanol e agente de resfriamento para o processo
fermentativo, permitindo a fermentação de maiores frações
de caldo hidrolitico e elevando a produtividade e
rendimento do processo integrado.
Assim, embora tenham sido mostrados apenas algumas
modalidades e modelos da presente invenção, será entendido
que várias omissões, substituições e alterações no processo
de fermentação extrativa para mostos provenientes de
processos hidroliticos de matéria-prima ligno-celulósica,
amilácea, carboidratos diretamente extraiveis, melaços
fortemente esgotados com alto conteúdo de inibidores
naturais como, entre outros, biotina, ou mostos similares,
ricos em carboidratos e com objetivos de fermentação, da
presente invenção, que emprega um solvente capaz de remover
produtos e inibidores simultaneamente, alem de resfriar o
meio, podem ser feitas por um técnico versado no assunto,
sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção.
É expressamente previsto que todas as combinações ou
omissões dos elementos que desempenham a mesma função
substancialmente da mesma forma, para alcançar resultados
semelhantes, estão dentro do escopo da invenção.
Substituições de elementos de uma modalidade descrita por
outra ou omissões dos mesmos são também totalmente
pretendidas e contempladas.
Também é preciso entender que os desenhos não estão
necessariamente em escala, mas que eles são apenas de
natureza conceituai. A intenção é , portanto, ser limitada,
tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.
REIVINDICAÇÕES
1. Processo de fermentação extrativa caracterizado
por compreender as seguintes etapas:
a ) Entrada de um mosto rico em carboidratos no
biorreator;
b ) Entrada de um inoculo no biorreator;
c ) Injeção do solvente no biorreator;
d ) Remoção do solvente do biorreator;
e ) Recuperação do solvente;
f ) Purificação da fase vapor;
g ) Remoção da fase aquosa do biorreator;
h ) Recuperação do micro-organismo .
2 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (a) compreender a
alimentação de um mosto selecionado dentre hidrolisados de
material ligno-celulósicos, amiláceos, carboidratos
diretamente extraiveis e mostos similares ricos em
carboidratos .
3 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (b) compreender a entrada
do inoculo por reciclagem ou reativação.
4 . Processo, de acordo com a reivindicação 3 ,
caracterizado pelo fato da reativação compreender
tratamento aeróbico, tratamento ácido e/ou alimentação de
nutrientes .
5 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (b) ser realizada
opcionalmente .
6 . Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (c) compreender a entrada
do solvente pelo fundo do fermentador ou através de furos
nos propulsores e/ou defletores.
7 . Processo, de acordo com as reivindicações 6 ,
caracterizado pelo fato do solvente ser injetado a uma
temperatura variando entre -10 e 25 °C.
8 . Processo, de acordo com a reivindicação 6 ,
caracterizado pelo fato de que o solvente é um biodiesel.
9 . Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,
caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser
selecionado do grupo dos óleos vegetais tais como óleo de
soja, óleo de milho, óleo de mamona, óleo de dendezeiro,
óleo de macaúba.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,
caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser
selecionado do grupo dos álcoois com cadeia longa tais como
álcool oléico, fitol, isofitol, álcool estearilico, álcool
cetiloco, octildodecanol .
11. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,
caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser
selecionado do grupo dos ácidos graxos tais como ácido
ricinoléico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido
linolênico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido
palmitoléico, ácido esteárico.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,
caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser
selecionado do grupo dos etanoatos tais como dodecil
acetato, butil dodecanoato.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,
caracterizado pelo fato de que o referido biodiesel ser
selecionado dentre outras substâncias de cadeia longa como
dibutilsebacate, di (2-etilhexil) sebacato, dibutiladipato,
di (2-etilhexil) adipato, di (2-etilhexil) ftalato, di (3,5,5-
trimetilhexil) phthalato, glicerol tridecanoato, 2-
dodecanone e dodecanal .
14. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,
caracterizado pelo fato de que o solvente é
preferencialmente um éster metílico, éster etílico ou éster
propílico de um ácido graxo.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ,
caracterizado pelo fato de que o solvente é mais
preferencialmente o ácido ricinoléico.
16. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (d) compreender a remoção
dos inibidores e/ou dos produtos pelo solvente.
17. Processo, de acordo com as reivindicações 16,
caracterizado pelo fato de que o solvente é separado da
fase aquosa por decantação ou centrifugação.
18. Processo, de acordo com as reivindicações 16,
caracterizado pelo fato de que a remoção do solvente é
realizada durante ou após a fermentação.
19. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (e) compreender a
recuperação do solvente por aquecimento ou evaporação a
vácuo e re-introdução no biorreator.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (f) compreender a
purificação da fase vapor por colunas de separação ou
destilação e retificação.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (g) compreender o
bombeamento da camada aquosa.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (h) compreender a
recuperação do micro-organismo por centrifugação,
ultraf iltração, separação por membrana ou qualquer método
de separação e concentração de células.
23. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato da etapa (h) ser realizada
opcionalmente .
24. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ,
caracterizado pelo fato de que utiliza um solvente
biocompativel capaz de remover simultaneamente in-situ os
produtos da fermentação e os inibidores da hidrólise da
matéria-prima, além de resfriar o meio.
25. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,
caracterizado pelo fato de que a etapa de detoxificação do
mosto e remoção do produto serem integradas.
26. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ,
caracterizado por poder ser executado de forma continua,
batelada ou batelada alimentada.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 26,
caracterizado por ser realizado, preferencialmente, em
forma continua.
28. Uso do processo conforme definido pelas
reivindicações de 1 a 27, caracterizado pelo fato de ser
aplicável na fermentação alcoólica convencional e de
segunda geração.
29. Uso do processo conforme definido pelas
reivindicações de 1 a 27, caracterizado pelo fato de ser
aplicável na fermentação de produtos microbiológicos tais
como álcoois, ácidos orgânicos, enzimas, aminoácidos,
terpenos, matéria-prima para bioplásticos, lipídeos,
polihidroxialcanoatos .
.
PCT/BR201 2/000470
A . CLASSIFÍCATION OF SUBJECT M A T T E
C12P7/06 (2006.01), B01D11/04 (2006.01), C12P 7/00 (2006.01)
According to International Patent Classifícation (IPC) or to both national classifícation and IPC
B . FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classifícation s ste followed by classifícation symbols)
C12P, B01D
Docunientation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search .terms used)
Epodoc, Espacenet
C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.
X US 4865973 A (UNIV KINGSTON [CA]) 1 to 2912 September 1989 ( 1989-09- 12)col. 1, lines 9-13; col. 2, lines 34-47; col. 2, Mnes 57 a col. 3, Mnes 3;
tables of columns 3&4, col. 7 , lines 4 1-46; claims
WO 2008 147705 A l ( KRUKONIS VAL [US])UÍDecember 2008 (2008-12-04)
MX 20 100 12736 A (JJ FLORIDA PROPERTIES LLC [US])20 July 201 1 (201 1-07-20)
WO 2009042950 A l ( SANCHEZ-RIERAFERNANDO [US])2 April 2009 (2009-04-02)
Further documents are listed in the continuation of Box C. See patent family annex.
Special categories of cited documents: "T" .later document published after tlie international filing date or prioritydocument defining the general state of the artwhich is not considered date and not in conflict with the application but cited to understandto be of particular relevance the principie or theory únderlying the invention
earlier application or patent but published on or after the international "X" document of particular relevance; the claimed invention cannot befiling date considered novel or cannot be considered to involve an inventivedocument which may throw doubts on priority claim(s) or which is step when the document is taken alonecited to establish the publication date of another citation or otherspecial reason (as specifíed) "Y document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered to involve an inventive step when the document isdocument referring to an oral disclosure, use, exhibition or other combined with one or more other such documents, such combinationmeans being obvious to a person skilled in the artdocument published prior to the international filing date but laterthan "&" document member of the sarhe patent familythe priority date claimed
Date of the actual completion of the international Date of mailing of the international search report
13/01/2013 27/02/2013Name and mailing address of the ISA/ Authorized officer
INSTITUTO NACIONAL DA Elielton Rezende CoelhoPROPRIEDADE INDUSTRIALRua' Sao Bento n° , 17° andar +55 2 1 3037-3984/3742cep: 20090-010, Centro - Rio de Janeiro/RJ Telephone No.
Form PCT/ISA/210 (second sheet) (July 2009)
C (Continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category* Citation of document, with indication, where appropriate of the reievant passages Reievant to claim No.
WO 20101 19339 A2 ( PATNAIK RANJAN [US] )2 1 October 201 0 (20 10- 10-2 1)
Curtis L Ivfunson e Judson King: "Factors influencing solvent selectionfor extraction of ethanol from aqueous solutions."Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev.Vol. 23(1), pp 109-1 15. 1984.
Finn Kollerup and Andrew J . Daugulis: "Ethanol production by extractivefermentation - solvent identifícation and prototype development"The. Cafiadian Journal of Chemical EngineeringVol. 64(4); Pages 529-704. 1986.
Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (July 2009)
.Information on patent family members
PCT/BR201 2/000470
US 4865973 A 1989-09-12 CA 1280705 C 1991-02-26DE 3689966 D l 1994-08-18EP 0216221 A2 1987-04-01JP 62065675 A 1987-03-24JP 8029108 B 1996-03-27
WO 2008147705 A l 2008-12-04 AU 2008257031 A l 2008- 12-04CA 2687573 A l 20.08-12-04CN 101765378 A 2010-06-30EP 2150135 A 1 . 2010-02-10I 202252 D O 2010-06-16US 2010069686 A l 2010-03-18US 8263814 B2 2012-09-11
MX 2010012736 A 2011-07-20 CN 102597250 A 2012-07-18EP 2291527 A l 2011-03-09IL 209466 D O 2011-01-31US 2009291481 A l 2009- 11-26WO 2009143059 A l 2009-11-26
WO 2009042950 Al 2009-04-02 AU 2008304180 A l 2009-04-02CA 2692266 A l 2009-04-02CN 101802208 A 20.10-08-11US 2009084025 A 2009-04-02US 8313934 B2 2012- 11-20
WO 201011-9339 A2 2010-10-21 CA 2756538 A l 2010- 10-21CN 102439162 A 2012-05-02EP 2419517 A2 2012-02-22JP 2012523245 A 2012-10-04US 2011097773 A l 2011-04-28WO 20 O 19339 A3 2011-02-24
Form PCT/ISA/210 (patent family annex) (July 2009)
RELATÓRIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Depósito internacional N°
PCT/BR201 2/000470
A . CLASSIFICAÇÃO D O OBJETOC12P7/06 (2006.01), B01D11/04 (2006.01), C12P 7/00 (2006.01)
De acordo com a Classificação Internacional de Patentes (IPC) ou conforme a classificação nacional e IPC
B. DOMÍNIOS ABRANGIDOS PELA PESQUISA
Documentação mínima pesquisada (sistema de classificação seguido pelo símbolo da classificação)
C12P, B01D
Documentação adicional pesquisada, além da mínima, na medida em que tais documentos estão incluídos nos domínios pesquisados
Base de dados eletrônica consultada durante a pesquisa internacional (nome da base de dados e, se necessário, termos usados na pesquisa)
Epodoc, Espacenét
c . DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES .
Relevante para asCategpria* Documentos citados, com indicação de partes relevantes, se apropriado
reivindicações N °
X U S 4865973 A (UNIV KINGSTON [CA]) 1 a 2 912 setembro 1989 ( 1989-09- 12)col. 1, lns 9-13; col. 2, Ins 34-47; col. 2, ln. 57 a col. 3, ln. 3; Tabela das colunas 3 e4 ; col. 7, lns 41-46; reivindicações
W O 2008 147705 A l ( KRUKONIS VAL J [US])04 dezembro 2008 (2008-12-04)
MX 20 100 12736 A (JJ FLORIDA PROPERTIES LLC [US])20 julho 201 1 (201 1-07-20) ' '
W O 2009042950 A l ( SANCHEZ-RIERAFERNANDO [US])02 abril 2009 (2009-04-02)
Documentos adicionais estão listados na continuação do quabro C 1 Ver o anexo de famílias das patentes
* Categorias especiais dos documentos citados: ' documento publicado depois da data de depósito internacional, ou deA" documento que define o estado geral da técnica, mas não c considerado de ' prioridade e que não conãita como depósito, porém citado para entender o
particular relevância. princípio ou teoria na qual se baseia a invenção.
" E" pedido ou patente anterior, mas publicada após ou na data do depósito " X documento de particular relevância; a invenção reivindicada não pode serinternacional considerada nova e não pode ser considerada envolver umaattvidade
L" documento que pode lançar dúvida na(s) reivintiicação(Oes) de prioridade ou inventiva quando o documento é considerado isoladamente.
na qual é citado para determinara data de outra citação ou por outra razão V documen de particular relevância; a invenção reivindicada não pode serespecial considerada envol ver atividade inventiva quando o documento é combinado
0 " documento referente a uma divulgação oral, uso, exibição ou por outros meios. comum outro documento ou mais de m tal combinação sendo óbvia paraumtécnico no assunto.
' P" documento publicado antes do depósito internacional, porém posterior a datade prioridade reivindicada. " &" documento membro da mesma àm ia de patentes.
Data da conclusão da pesquisa internacional Data do envio do relatório de pesquisa internacional:
' . 13/01/13 2 7Nome e endereço postal da ISA/BR Funcionário autorizado
INSTITUTO NACIONAL DAPROPRIEDADE INDUSTRIALRua ' Sao Bento n° , 17° andar Elielton Rezende Coelhocep: 20090-010, Centro - Rio de Janeiro/RJ
N° de fax: +55 2 1 3037-3663 N° de telefone: +55 2 1 3037-3984/3742Formulário PÇT/ISA/210 (segunda página) (Julho 2009)
RELATÓRIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Depósito internacional N°
PCT/BR201 2/000470
C. DOCUM ENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES
Relevante para asCategoria* Documentos citados, com indicação de partes relevantes, se apropriado
reivindicações N°
WO 2010119339 A2 ( PATNAI RANJAN [US] )2 1 outubro 2010 (2010-10-21)'
Curtis L Munson e Judson King: "Factors influencing solvent selectionfor extraction of ethanol from aqueous solutions."Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev.Vol. 23(1), pp 109-115. 1984.
Finn Kollerup and Andrew J . Daugulis: "Ethanol production by extractivefermentation - solvent identifícation and prototype development"The. Cahadian Journal of Chemical EngineeringVol. 64(4); Pages 529-704. 1986.
Formulário PCT7ISA/210 (continuação da segunda página) (Julho 2009)
RELATÓRIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Depósito internacional N°Informação relativa a membros da família da patentes PCT/BR201 2/000470
Documentos de patente Data de publicação Membro(s) da família d patentes ' Data de publicaçãocitados no relatório de pesquisa
US 4865973 A 1989-09-12 CA 1280705 C 1991-02-26DE 3689966 D l 1994-08-18EP 0216221 A2 1987-04-01JP 62065675 A 1987-03-24JP 8029108 B 1996-03-27
WO 2008147705 A l 2008-12-04 AU 2008257031 A l 2008- 12-04CA 2687573 A l 20.08-12-04CN 101765378 A 2010-06-30EP 2150135 A 1 . 2010-02-10I 202252 D O 2010-06-16US 2010069686 A l 2010-03-18US 8263814 B2 2012-09-11
MX 2010012736 A 2011-07-20 CN 102597250 A 2012-07-18EP 2291527 A l 2011-03-09IL 209466 D O 2011-01-31US 2009291481 A l 2009- 11-26WO 2009143059 A l 2009-11-26
WO 2009042950 Al 2009-04-02 AU 2008304180 A l 2009-04-02CA 2692266 A l 2009-04-02CN 101802208 A 20.10-08-11US 2009084025 A 2009-04-02US 8313934 B2 2012- 11-20
WO 201011-9339 A2 2010-10-21 CA 2756538 A l 2010- 10-21CN 102439162 A 2012-05-02EP 2419517 A2 2012-02-22JP 2012523245 A 2012-10-04US 2011097773 A l 2011-04-28WO 20 O 19339 A3 2011-02-24
Formulário PCT/ISA/210 (anexo da família de patentes) (Julho 2009)