pd-l1 ihc 28-8 pharmdx sk005 50 tests til anvendelse ... · pd-1 og ctla-4 hæmmer...

PD-L1 IHC 28-8 pharmDx SK005 50 tests til anvendelse sammen med Autostainer Link 48

Indholdsfortegnelse

1. Tilsigtet anvendelse .......................................................................................................................................................2 2. Resumé og forklaring.....................................................................................................................................................2

2.1 Ikke-pladecellet NSCLC..........................................................................................................................................2 2.2 Pladecellekarcinom i hoved og hals (SCCHN) .....................................................................................................2 2.3 Blærekarcinom .......................................................................................................................................................2 2.4 Melanom..................................................................................................................................................................2

3. Princip for proceduren...................................................................................................................................................2 4. Medfølgende materialer .................................................................................................................................................3 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger .................................................................................................................4 6. Forholdsregler ................................................................................................................................................................4 7. Opbevaring......................................................................................................................................................................5 8. Klargøring af præparater ...............................................................................................................................................5

8.1 Paraffinindstøbte snit.............................................................................................................................................5 8.2 Anvendelse af afkalkede væv................................................................................................................................5 8.3 Anbefaling for opbevaring af udskårne snit.........................................................................................................5

9. Klargøring af reagens.....................................................................................................................................................5 10. Farvningsprocedure på Autostainer Link 48................................................................................................................6 11. Kvalitetskontrol ..............................................................................................................................................................6 12. Kontrol af analysen ........................................................................................................................................................6 13. Fortolkning af farvning...................................................................................................................................................7

13.1 Fortolkning af farvning: Ikke-pladecellet NSCLC.................................................................................................7 13.2 Fortolkning af farvning: Pladecellekarcinom i hoved og hals (SCCHN) ............................................................7 13.3 Fortolkning af farvning: Blærekarcinom ..............................................................................................................7 13.4 Fortolkning af farvning: Melanom.........................................................................................................................8

14. Evaluering af objektglas ................................................................................................................................................8 15. Begrænsninger .............................................................................................................................................................10

15.1 Generelle begrænsninger ....................................................................................................................................10 15.2 Produktspecifikke begrænsninger......................................................................................................................10

16. Evaluering af ikke-klinisk præstation .........................................................................................................................10 16.1 Analytisk specificitet for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ...........................................................................................10 16.2 Normalt og neoplastisk væv................................................................................................................................10

17. Evaluering af præstation..............................................................................................................................................12 17.1 Evaluering af præstation: Ikke-pladecellet NSCLC............................................................................................12 17.2 Evaluering af præstation: SCCHN.......................................................................................................................16 17.3 Evaluering af præstation: UC ..............................................................................................................................18 17.4 Evaluering af præstation: Melanom....................................................................................................................20

18. Fejlfinding .....................................................................................................................................................................22 19. Referencer.....................................................................................................................................................................23

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 1/23

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 2/23

1. Tilsigtet anvendelse

Til in vitro-diagnostisk brug.

PD-L1 IHC 28-8 pharmDx er en kvalitativ immunhistokemisk analyse, der bruger Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 og er beregnet til brug til påvisning af PD-L1-protein i formalinfikseret, paraffinindstøbt væv (FFPE-væv) af ikke-pladecellet ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), pladecellekarcinom i hoved og hals (SCCHN), blærekarcinom (UC) og melanomvæv ved brug af visualiseringssystemet EnVision FLEX på Autostainer Link 48. Ekspression af PD-L1-protein er defineret som den procentdel af evaluerbare tumorceller, der udviser delvis eller komplet membranfarvning ved en hvilken som helst intensitet, som det er defineret i retningslinjerne for fortolkningen af farvningen af den specifikke tumorindikation.

PD-L1-ekspression detekteret af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ved ikke-pladecellet NSCLC og SCCHN kan være forbundet med øget overlevelse med OPDIVO® (nivolumab).

PD-L1-ekspression detekteret af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx ved blærekarcinom kan være forbundet med øget responsrate med OPDIVO®.

PD-L1-ekspression visualiseret af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx i melanomer kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af patienter, til hvem kombinationsbehandling med OPDIVO® (nivolumab) og YERVOY® (ipilimumab) overvejes.

2. Resumé og forklaring Binding af PD-1-liganderne, PD-L1 og PD-L2, til PD-1-receptoren, der findes på T-celler, hæmmer T-celleproliferation og cytokinproduktion. Opregulering af PD-1-ligander forekommer i visse tumorer, og signalering gennem denne pathway kan bidrage til at hæmme tumorernes immunovervågning af aktive T-celler (1). OPDIVO® (nivolumab) er et monoklonalt antistof mod human immunoglobulin G4 (IgG4), der binder sig til PD-1-receptoren og blokerer dens interaktion med PD-L1 og PD-L2, som udløser PD-1-pathway-medieret hæmning af immunresponsen, herunder antitumor-immunresponsen (2). I modeller med tumorer hos syngeniske mus medførte blokering af PD-1-aktivitet mindsket tumorvækst (3). Den kliniske effekt af OPDIVO® og kliniske anvendelighed af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx er undersøgt i NSCLC, SCCHN, UC og melanomer.

2.1 Ikke-pladecellet NSCLC Detektion af PD-L1-eksprimerende tumorceller i et præparat fra en patient med ikke-pladecellet ikke-småcellet lungekræft kan være en indikation af øget overlevelse ved behandling af patienten med OPDIVO® (nivolumab). Præparater fra patienter i kliniske undersøgelser af OPDIVO®, sponsoreret af Bristol-Myers Squibb, blev testet ved anvendelse af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Den kliniske undersøgelse CA209057 skulle afdække den kliniske validitet af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx til vurdering af PD-L1-status hos patienter med ikke-pladecellet NSCLC, der fik behandling med OPDIVO® (5,11).

2.2 Pladecellekarcinom i hoved og hals (SCCHN) Detektion af PD-L1-eksprimerende tumorceller i præparater fra en patient med SCCHN kan være en indikation af øget overlevelse ved behandling af patienten med OPDIVO® (nivolumab). Præparater fra patienter i kliniske undersøgelser af OPDIVO®, sponsoreret af Bristol-Myers Squibb, blev testet ved anvendelse af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Den kliniske undersøgelse CA209141 skulle afdække den kliniske validitet af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx til vurdering af PDL1-status hos patienter med SCCHN, der fik behandling med OPDIVO® (16).

2.3 Blærekarcinom Detektion af PD-L1-eksprimerende tumorceller i præparater fra en patient med UC kan være en indikation af øget responsrate ved behandling af patienten med OPDIVO® (nivolumab). Præparater fra patienter i kliniske undersøgelser af OPDIVO®, sponsoreret af Bristol-Myers Squibb, blev testet ved anvendelse af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Den kliniske undersøgelse CA209275 skulle afdække den kliniske validitet af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx til vurdering af PD L1-status hos patienter med UC, der fik behandling med OPDIVO®.

2.4 Melanom Cytotoksisk T-lymfocyt-associeret antigen-4 (CTLA-4) er en negativ regulator af T-celle-aktiviteten. YERVOY® (ipilimumab) er et monoklonalt antistof, som binder til CTLA-4 og blokerer for interaktion af CTLA-4 med dets ligander, CD80/CD86. Blokering af CTLA-4 har vist sig at øge T-celle-aktivering og -proliferation, hvilket medvirker til en generel stigning i anti-tumor-immunresponsen (4).

PD-1 og CTLA-4 hæmmer anti-tumor-immuniteten gennem komplementære og non-redundante mekanismer. OPDIVO®-monoterapi og kombination af OPDIVO® og YERVOY® har påvist signifikant større forbedring i progressionsfri overlevelse over YERVOY® alene hos patienter med fremskredent melanom, som ikke tidligere havde modtaget behandling (8-10).

Præparater af melanomvæv fra OPDIVO®-behandlede patienter i kliniske undersøgelser sponsoreret af Bristol-Myers Squibb blev testet ved anvendelse af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Den kliniske undersøgelse CA209067 havde til formål at undersøge den kliniske validitet af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx til vurdering af PD-L1-ekspression i melanom-patienter behandlet med OPDIVO® i kombination med YERVOY® og YERVOY® alene.

OPDIVO ® og YERVOY ® er varemærker, der ejes af Bristol-Myers Squibb.

3. Princip for proceduren PD-L1 IHC 28-8 pharmDx indeholder optimerede reagenser og den påkrævede protokol til at udføre en IHC-farvningsprocedure på FFPE-præparater ved brug af Autostainer Link 48 og PT Link Pre-treatment Module (6). Efter inkubation med det primære monoklonale antistof mod PD-L1 eller Negative Control Reagent (NCR) inkuberes præparaterne med et link-antistof, der er specifikt for det primære antistofs værtsart, og de inkuberes derefter med et brugsklart visualiseringsreagens bestående af sekundære antistofmolekyler og peberrodsperoxidase-molekyler koblet til en dextranpolymerbase. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilsatte kromogen medfører udfældning af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Den kromogene reaktions farve modificeres med et reagens til kromogen forbedring. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Til brug ved validering af farvningskørslerne medfølger der kontrolobjektglas med to formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane cellelinjer.

4. Medfølgende materialer PD-L1 IHC 28-8 pharmDx (kode SK005) De nedenfor anførte materialer rækker til 50 analyser (50 objektglas inkuberet med primært antistof mod PD-L1 og 50 objektglas inkuberet med det tilsvarende Negative Control Agent; i alt 100 testobjektglas). Yderligere primært antistof mod PD-L1 leveres med sættet til farvning af 15 cellelinjekontrolglas. Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 2 x 150 µL pr. objektglas for hvert reagens bortset fra DAB+ og Target Retrieval Solution. Sættet indeholder materialer til maks. 15 individuelle farvninger.

Mængde Beskrivelse 1 x 34,5 mL Peroxidase-Blocking Reagent

Bufferopløsning, der indeholder hydrogenperoxid, detergent og 0,015 mol/L natriumazid.

1 x 19,5 mL

Primært antistof: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8

Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1 i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/L natriumazid.

1 x 15 mL

Negative Control Reagent*

Monoklonalt kanin-kontrol-IgG-antistof i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/L natriumazid. *Monoklonalt kanin-kontrol-IgG, der sælges under licens fra Cell Signaling Technology.

1 x 34,5 mL LINKER, Anti-Rabbit

Sekundært museantistof mod kaninimmunoglobuliner i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/L natriumazid.

1 x 34,5 mL Visualization Reagent-HRP

Dextran koblet med peroxidasemolekyler og sekundære gedeantistofmolekyler mod kanin- og museimmunoglobuliner i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og et antimikrobielt stof.

15 x 7,2 mL DAB+ Substrate Buffer

Bufferopløsning, der indeholder hydrogenperoxid og et antimikrobielt stof.

1 x 5 mL DAB+ kromogen

3,3'-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid i et organisk opløsningsmiddel.

1 x 34,5 mL DAB Enhancer

Cuprisulfat i vand.

6 x 30 mL EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x)

Bufferopløsning, pH 6,1, der indeholder detergent og et antimikrobielt stof.

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8

NEGATIVE CONTROL REAGENT

LINKER, ANTI-RABBIT

VISUALIZATION REAGENT-HRP

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

DAB+ CHROMOGEN

DAB ENHANCER

EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

15 objektglas

PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Control Slides

Hvert objektglas indeholder vævssnit af to pelleterede, formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer: NCI-H226** med positiv PD-L1-proteinekspression (der stammer fra pladecellekarcinom i human lunge med positiv PD-L1-proteinekspression) og MCF-7 med negativ PD-L1-proteinekspression. (der stammer fra humant bryst-adenokarcinom med negativ PD-L1-proteinekspression).

CONTROL SLIDES

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 3/23

P

D-L

1, S

K00

5 p

har

mD

x

XX

XX

X

MCF-7: PD-L1-negativ

NCI-H226: PD-L1-positiv

**Dr. AF Gazdar and Dr. JD Minna ved NIH har modtaget anerkendelse for deres bidrag til udviklingen af NCI-H226 (ATCC-nummer: CRL-5826™) (7)

Bemærk: Alle reagenser, som medfølger, er formuleret specifikt til anvendelse sammen med dette sæt. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke erstattes med andet end EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (kode K8005). PD-L1 IHC 28-8 pharmDx er skræddersyet til brug sammen med Autostainer Link 48. Der henvises til brugsanvisningerne til Autostainer Link 48 og PT Link for yderligere oplysninger. 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger

PT Link Pre-treatment Module (kode PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (kode AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kode K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kode K8008) Destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) Timer Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol og tabel 5) Objektglas: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kode K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus-ladede objektglas. Dækglas Permanent monteringsmedium og andre reagenser, der er nødvendige til montering af dækglas Lysmikroskop (4x-40x objektivforstørrelse)

6. Forholdsregler 1. Til in vitro-diagnostisk brug. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Dette produkt indeholder natriumazid (NaN3), et kemikalie, som er meget giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er

klassificeret som farlig, kan NaN3 reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb (12).

4. Primært antistof, negativt kontrolreagens, linker og visualiseringsreagens indeholder materialer af animalsk oprindelse. 5. Før og efter fiksering skal præparater og alle materialer, der kommer i berøring med disse, håndteres som værende i stand til at

overføre smitte og bortskaffes med de korrekte foranstaltninger (13). 6. Andre inkubationstider, -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 7. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvning. 8. Visualiseringsreagens, flydende DAB+ kromogen og klargjort DAB+ substratkromogenopløsning kan blive påvirket negativt, hvis de

udsættes for stærke lyskilder. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 9. Paraffinrester kan medføre forkerte negative resultater.

10. Brug af andre reagensvolumener end de anbefalede kan føre til tab af synlig PD-L1-immunreaktivitet. 11. Store vævssnit, der fylder ≥ 2/3 af objektglasset, kan kræve 3x150 µL reagens. 12. Som hovedregel gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i den

korrekte arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsanvisninger. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS).

13. Brug passende personlige værnemidler for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. 14. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal, regional, national og international lovgivning. 15. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres.

Fare DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoniumtetrachlorid H350 Kan fremkalde kræft. H341 Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. P201 Indhent særlige anvisninger før brug. P202 Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P280 Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Bær beskyttelsestøj. P308 + P313 VED eksponering eller mistanke om det: Søg lægehjælp. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og

internationale bestemmelser.

Advarsel EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% citronsyre H319 Medfører øjenirritation. H411 Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 4/23

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 5/23

P280 Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. P273 Undgå udledning til miljøet. P264 Vask hænderne grundigt efter brug. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE Skyl grundigt med vand i adskillige minutter. Fjern kontaktlinser, hvis den

tilskadekomne bærer kontaktlinser, og de er lette at fjerne. Fortsæt skylningen. P337 + P313 Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og

internationale bestemmelser. 7. Opbevaring

Alle komponenter fra PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, inklusive kontrolobjektglas, skal opbevares mørkt ved 2-8 °C i den oprindelige beholder, når de ikke er i brug på Autostainer Link 48. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt udvendigt på æsken. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end dem, der er nævnt i denne indlægsseddel, skal disse forhold først bekræftes og godkendes af brugeren. Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Derfor skal der udføres positive og negative kontroller samtidig med patientpræparater.

8. Klargøring af præparater

Præparaterne skal behandles, så vævet bevares til IHC-farvning. Der skal anvendes standardmetoder til vævsbehandling til alle præparater. 8.1 Paraffinindstøbte snit Formalinfikserede, paraffinindstøbte vævsprøver er velegnede til brug. Anbefalede forhold ved håndtering og behandling er: <30 minutters iskæmitid inden nedsænkning i fiksativ og 24-48 timers fikseringstid i 10% neutralt bufferet formalin. Alternative fikseringer er ikke blevet vurderet og godkendt, og kan give forkerte resultater. Præparaterne skal skæres ud i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm, fikseres i 10% neutralt bufferet formalin og dehydreres og renses i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin. Paraffintemperaturen må ikke overstige 60 °C. 8.2 Anvendelse af afkalkede væv Anvendelse afPD-L1 IHC 28-8 pharmDx på afkalkede væv er ikke blevet valideret og frarådes.

8.3 Anbefaling for opbevaring af udskårne snit Vævsprøver skal opskæres i snit med en tykkelse på 4-5 µm. Efter sektionering skal vævene monteres på Fisherbrand Superfrost Plus-ladede objektglas eller Dako FLEX IHC-objektglas (kode K8020) og derefter anbringes i en 58 ± 2 °C varm ovn i 1 time. For at bevare antigeniciteten skal vævssnittene, når de er monteret på objektglas, opbevares i mørke ved 2-8 °C eller ved stuetemperatur op til 25 °C og farves inden 4 måneder efter sektionering. Objektglassenes opbevaringsforhold og håndteringsforhold må ikke overstige 25 °C på noget tidspunkt efter montering af hensyn til sikring af vævsintegriteten og antigeniciteten.

9. Klargøring af reagens

Følgende reagenser skal klargøres forud for farvning: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) Klargør en passende mængde 1x Target Retrieval Solution, Low pH ved at fortynde Target Retrieval Solution, Low pH, 50x 1:50 med vand i reagenskvalitet; pH-værdien for 1x Target Retrieval Solution skal være 6,1 ± 0,2. Én 30 ml-flaske med Target Retrieval Solution, Low pH (50x), fortyndet 1:50 giver 1,5 l 1x reagens, hvilket er tilstrækkeligt til at fylde ét PT Link-kar, som kan behandle op til 24 objektglas pr. anvendelse. Bortskaf 1x Target Retrieval Solution efter brug tre gange og højst 5 dage efter fortynding. Yderligere EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) kan eventuelt bestilles med kode K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Klargør en passende mængde vaskebuffer ved at fortynde Wash Buffer 20x 1:20 med vand i reagenskvalitet til brug på vasketrinnene. Opbevar ubenyttet 1x opløsning ved 2-8 °C i højst en måned. Kasser bufferen, hvis den er uklar. Se brugsanvisningen til Autostainer Link 48 for yderligere oplysninger.

EnVision FLEX Wash Buffer (20x) leveres som kode K8007.

DAB+ substratkromogenopløsning Denne opløsning skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. DAB+ substratkromogenopløsning klargøres ved at tilsætte 1 dråbe flydende DAB+ kromogen pr. mL DAB+ substratbuffer og blande. Klargjort substratkromogen er stabilt i 5 dage, når det opbevares i mørke ved 2-8 °C. Vigtige bemærkninger: Hvis der bruges en hel flaske DAB+ substratbuffer, skal der tilsættes 9 dråber DAB+ kromogen. Selvom der står 7,2 mL på

mærkaten, er dette et udtryk for brugsvolumen og medregner ikke "dødvolumenet" i flasken. Farven på det flydende DAB+ kromogen i flasken kan variere fra klar til lavendelbrun. Dette påvirker ikke produktets effektivitet.

Fortynd i henhold til ovenstående retningslinjer. Hvis der tilsættes for meget flydende DAB+ kromogen til DAB+ substratbufferen, vil det medføre en forringelse af det positive signal.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 6/23

10. Farvningsprocedure på Autostainer Link 48 Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt og gøre sig fortrolig med alle komponenter og instrumenter inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal have stuetemperatur (20-25 °C) inden immunfarvningen. Desuden skal alle inkubationer foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise øget, uspecifik farvning. Alle de påkrævede trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i Dako Link-softwaren. Der henvises til brugsanvisningerne til Autostainer Link 48 og PT Link for yderligere oplysninger om programmeringsprotokoller og isætning af objektglas og reagenser. Bemærk: Reagenserne og vejledningen, der følger med dette system, er udviklet til at yde optimalt ved brug sammen med de anbefalede reagenser og materialer. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller -temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater.

Farvningsprotokol Vælg farvningsprotokollen for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx i indstillingerne i rullemenuen i DakoLink. Alle de påkrævede trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i DakoLink. Hvis de korrekte PD-L1 IHC 28-8 pharmDx-protokoller ikke findes på serveren, skal du kontakte den lokale teknisk service-repræsentant. Trin 1: Procedure for afparaffinering, rehydrering og target-retrieval (3-i-1) Anbefalet procedure:

Der henvises til brugervejledningen for PT LINK.

Indstil forvarmnings- og nedkølingstemperatur på PT Link (kode PT100/PT101/PT200) til 65 °C. Indstil opvarmning til 97 °C i 20 minutter.

►Fyld PT Link-karrene med 1,5 L Target Retrieval Solution, Low pH, 1x brugsopløsning pr. kar til at dække vævssnittene. ►Forvarm Target Retrieval Solution til 65 °C. ►Nedsænk Autostainer-holderne med de monterede FFPE-vævssnit i den forvarmede Target Retrieval Solution, Low pH (1x

brugsopløsning) i PT Link-karret. Inkuber i 20 minutter ved 97 °C. ►Så snart target retrieval-inkubationstiden er færdig, og temperaturen er faldet til 65 °C, skal du fjerne hver Autostainer-objektglasholder

med objektglas fra PT Link-karret og straks placere Autostainer-objektglasholderen med objektglas i et kar (f.eks. PT Link Rinse Station, kode PT109) med fortyndet Wash Buffer (kode K8007), der har stuetemperatur.

►Lad objektglassene ligge i den fortyndede vaskebuffer ved stuetemperatur i 5 minutter. Trin 2: Farvningsprocedure Efter afparaffinering, rehydrering og target-retrievalproceduren, (3-i-1-proceduren) placeres Autostainer-holderne med objektglas på Autostainer Link 48. Sørg for, at objektglassene holdes våde med buffer under indføring, og inden kørslen igangsættes. Instrumentet vil udføre farvningsproceduren ved at påføre det korrekte reagens, overvåge inkubationstiden og skylle objektglas mellem de forskellige reagenser. Reagenstiderne er forprogrammeret i Dako Link-softwaren. Trin 3: Kontrastfarve Objektglassene skal modfarves med EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kode K8008) i 7 minutter. Inkubationstiden i Hematoxylin er forprogrammeret i protokollen. Trin 4: Montering Ikke-vandigt permanent monteringsmedie er påkrævet. Bemærk: Der kan med tiden opstå en vis falmning af de farvede objektglas afhængigt af flere faktorer, omfattende, men ikke begrænset til, modfarvning, monteringsmaterialer og metoder samt objektglassenes opbevaringsforhold. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20-25 °C).

11. Kvalitetskontrol

Reagenser i PD-L1 IHC 28-8 pharmDx er kvalitetskontrolleret med immunhistokemi ved hjælp af den ovenfor angivne target retrieval- og farvningsprocedure. Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt. For hver farvningskørsel skal der medtages kvalitetskontroller. Disse kvalitetskontroller angives i tabel 5 og omfatter: Et farvet H&E-patientvævspræparat, positive og negative kontrolvæv leveret af laboratoriet og et kontrolobjektglas (15) leveret af Dako. I USA henvises til retningslinjerne for kvalitetskontrol i College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se også CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (14) i litteraturlisten for yderligere oplysninger.

12. Kontrol af analysen

Før et farvningssystem anvendes første gang i en diagnostisk procedure, skal brugeren kontrollere analysens effektivitet ved at teste den på en række væv leveret af laboratoriet, som har kendte IHC-resultatkendetegn, der repræsenterer kendte positive og negative væv. Se procedurerne for kvalitetskontrol, som er beskrevet tidligere i dette afsnit af indlægssedlen. Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hvert nyt sæt, eller når analyseparametrene ændres. Muligheder for fejlfinding ved potentielle problemer, problemernes årsager og forslag til afhjælpning beskrives i tabel 22.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 7/23

13. Fortolkning af farvning En patolog skal evaluere objektglassene ved hjælp af et lysmikroskop. Til evaluering af immunhistokemisk PD-L1-farvning og -scoring kan der anvendes 4x objektivforstørrelse til den første vurdering af hele præparatet, og herefter anvendes 10-20x-objektiver til scoring (40x kan eventuelt anvendes ved behov). PD-L1-farvning indikeres med et brunt (3,3'-diaminobenzidin, DAB) reaktionsprodukt.

PD-L1-positiv farvning er defineret som fuldstændig og/eller delvis plasmamembranfarvning af tumorceller uanset intensitet. Hele præparatet skal evalueres. Alle levedygtige tumorceller på hele det PD-L1-farvede patientobjektglas skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være minimum 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede patientobjektglas for at fastslå procentandelen af farvede celler. Se afsnittene om fortolkning af farvning af specifikke indikationer i dette dokument for detaljerede retningslinjer.

Eventuel cytoplasmisk farvning skal ikke tages med i betragtning ved scoring. Ikke-maligne celler og immunceller (f.eks. infiltrerende lymfocytter eller makrofager) kan også farves samtidig med PD-L1, men disse skal ikke medtages i scoringen til bestemmelse af PD-L1-positivitet.

For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en vurdering af præparaternes farvning for hver farvningskørsel skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 5.

Se tabellerne med fortolkning af farvning af specifikke indikationer i dette dokument og den relevante PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Interpretation Manual for hver enkelt indikation for yderligere vejledning til PD-L1-scoring.

13.1 Fortolkning af farvning: Ikke-pladecellet NSCLC Hele præparatet skal evalueres. Alle levedygtige tumorceller på hele det PD-L1-farvede patientobjektglas skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være minimum 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede patientobjektglas for at fastslå procentandelen af farvede celler. Ved ikke-pladecellede NSCLC-præparater registreres procentdelen af levedygtige tumorceller, der udviser perifer og/eller delvis lineær PD-L1-plasmamembranfarvning uanset intensitet.

Tabel 1: Fortolkning af farvning: Ikke-pladecellet NSCLC

Indikation Minimum af levedygtige

tumorceller, der kræves til scoring

Ikke-maligne celler og immunceller

Cytoplasmisk farvning, stromale, nekrotiske celler og cellerester

Andre elementer

Ikke-pladecellet NSCLC

100 Medtages ikke i scoring Tages ikke med i

betragtning ved scoring NA

13.2 Fortolkning af farvning: Pladecellekarcinom i hoved og hals (SCCHN) Denne analyse er valideret for invasive SCCHN-vævsprøver og ikke for læsioner med foci fra dysplasi eller karcinom in situ. H&E-farvede objektglas skal køres med hver PD-L1-farvet prøve af hensyn til korrekt vurdering af invasivt karcinom, karcinom in situ og tilstødende normalt epitelvæv.

Hele præparatet skal evalueres. Alle levedygtige tumorceller på hele det PD-L1-farvede patientobjektglas skal medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være minimum 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede patientobjektglas for at fastslå procentandelen af farvede celler. Ved SCCHN-præparater registreres procentdelen af levedygtige tumorceller, der udviser perifer og/eller delvis lineær PD-L1-plasmamembranfarvning uanset intensitet.

Tabel 2: Fortolkning af farvning: SCCHN





Andre elementer

SCCHN 100 Medtages ikke i scoring Tages ikke med i

betragtning ved scoring

Celler i foci af dysplasi og karcinom in situ udelukkes fra scoring.

Medfølgende H&E-objektglas giver mulighed for korrekt vurdering af invasivt karcinom, karcinom in situ og tilstødende normalt epitelvæv.

13.3 Fortolkning af farvning: Blærekarcinom Denne analyse er valideret for invasive UC-vævsprøver og ikke for læsioner med foci fra dysplasi eller karcinom in situ. H&E-farvede objektglas skal køres med hver PD-L1-farvet prøve af hensyn til korrekt vurdering af invasivt karcinom, karcinom in situ og tilstødende normalt epitelvæv.

Hele præparatet skal evalueres. Alle levedygtige tumorceller på hele det PD-L1-farvede patientobjektglas skal medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være minimum 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede patientobjektglas for at fastslå procentandelen af farvede celler. Ved UC-præparater registreres procentdelen af levedygtige tumorceller, der udviser perifer og/eller delvis lineær PD-L1-plasmamembranfarvning uanset intensitet.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 8/23

Tabel 3: Fortolkning af farvning: UC





Andre elementer

UC 100 Medtages ikke i scoring Tages ikke med i


Celler i foci af dysplasi og karcinom in situ udelukkes fra scoring.

Medfølgende H&E-objektglas giver mulighed for korrekt vurdering af invasivt karcinom, karcinom in situ og tilstødende normalt epitelvæv.

13.4 Fortolkning af farvning: Melanom Hele præparatet skal evalueres. Alle levedygtige tumorceller på hele det PD-L1-farvede patientobjektglas skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være minimum 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede patientobjektglas for at fastslå procentandelen af farvede celler. Præparater betragtes som PD-L1-positive, hvis ≥1% af melanomcellerne udviser perifer og/eller delvis lineær PD-L1-plasmamembranfarvning af tumorceller uanset intensitet. Præparater betragtes som PD-L1-negative, hvis <1% af melanomcellerne udviser perifer og/eller delvis lineær PD-L1-plasmamembranfarvning af tumorceller uanset intensitet.

BEMÆRK: Ved tolkning af melanompræparater fra patienter kan der forekomme brun melanin-pigmentering. Melanin skal udelukkes ved scoring af plasmamembranfarvning, og for at identificere og udelukke melanin-indhold kan sammenligning med et sekventielt objektglas farvet med NCR kan være nyttigt. Hvis kraftigt forhøjet melanin udelukker scoring af plasmamembranfarvning af tumorceller, kan præparatet udelukkes fra fortolkning og antages at være ubestemmeligt.

Tabel 4: Fortolkning af farvning: Melanom





Andre elementer

Melanom 100 Medtages ikke i scoring Tages ikke med i


Melanin skal udelukkes ved scoring af plasmamembranfarvning.

Sammenligning med et sekventielt objektglas farvet med NCR kan være nyttigt for at identificere og udelukke melaninindhold.

14. Evaluering af objektglas Tabel 5: Anbefalet rækkefølge for evaluering af objektglas Præparater Rationale Krav 1. H&E (leveres af laboratoriet)

Først evalueres en farvning af vævspræparaterne med hæmatoxylin og eosin (H&E) for at vurdere histologi og bevarelse af væv.

PD-L1 IHC 28-8 pharmDx- H&E-farvningen skal udføres på snit skåret efter hinanden fra samme paraffinblok af vævspræparatet. Vævspræparaterne skal være intakte, velbevarede og skal bekræfte tumorindikation.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 9/23

2. Kontrolobjektglas (leveres af Dako)

Det positive kontrolobjektglas med PD-L1 primært antistof fra PD-L1 IHC 28-8 pharmDx skal først undersøges med henblik på at sikre, at alle reagenser fungerer korrekt. Kontrolobjektglasset indeholder den PD-L1-positive cellelinje-pellet og den PD-L1-negative cellelinje-pellet.

I hver farvningskørsel skal ét kontrolobjektglas farves med det primære antistof til PD-L1. Acceptkriterier for NCI-H226 (PD-L1-positiv kontrolcellelinje, der stammer fra pladecellekarcinom i human lunge med positiv PD-L1-proteinekspression): Plasmamembranfarvning af ≥80% af cellerne ved ≥2+ gennemsnitlig

farvningsintensitet. Uspecifik farvning <1+ intensitet. Acceptkriterier for MCF-7 (PD-L1-negativ kontrolcellelinje, der stammer fra humant bryst-adenokacinom med negativ PD-L1-proteinekspression): Uspecifik farvning. Uspecifik farvning <1+ intensitet. Bemærk, at der lejlighedsvis kan

observeres farvning af nogle få celler i MCF-7-cellepillen. Følgende acceptkriterier skal anvendes: tilstedeværelse af ≤10 celler i alt med tydelig farvning af plasmamembran eller cytoplasmisk farvning med ≥1+ intensitet inden for grænserne af MCF-7-cellepillen er acceptabelt.

Hvis en af kontrolcellelinjerne ikke opfylder disse kriterier, skal alle resultater for patientpræparaterne betragtes som ugyldige.

3. Objektglas med positivt kontrolvæv (leveres af laboratoriet)

Objektglassene med positivt kontrolvæv, der er farvet med både PD-L1 primært antistof og Negative Control Reagent, skal undersøges derefter. Disse objektglas bekræfter, at fikserings- og target-retrieval-processen er effektiv. Kendte positive vævskontroller må kun anvendes til overvågning af, om det behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt – IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne.

Kontrollerne skal være friske biopsi-/kirurgiske præparater fra samme tumorindikation som patientprøven, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Anvend intakte præparater til fortolkning af farvningsresultaterne, da nekrotiske eller degenererede celler ofte farves uspecifikt. De væv, der vælges til anvendelse som positive vævskontroller, skal give svag til moderat positiv farvning ved farvning med PD-L1 som en hjælp til detektering af små forandringer analysens sensitivitet. Der skal medtages to positive vævskontrolobjektglas i hver farvningskørsel. Objektglas farvet med PD-L1: Der skal ses brunfarvning af plasmamembranen. Uspecifik farvning skal være ≤1+. Objektglas farvet med Negative Control Reagent: Ingen membranfarvning. Uspecifik farvning skal være ≤1+. Hvis de positive vævskontroller ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra de analyserede præparater betragtes som ugyldige.

4. Objektglas med negativt kontrolvæv (leveres af laboratoriet)

Objektglassene med negativt kontrolvæv (som vides at være PD-L1-negative), som er farvet med både PD-L1 primært antistof og Negative Control Reagent, skal derefter undersøges for at kontrollere specificiteten af det primære antigens mærkning af målantigenet. Alternativt kan negative områder i det positive kontrolvæv bruges som negativt kontrolvæv, men dette bør kontrolleres af brugeren.

Kontrollerne skal være friske biopsi-/kirurgiske præparater fra samme tumorindikation som patientprøven, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Der skal medtages to negative vævskontrolobjektglas i hver farvningskørsel. Objektglas farvet med PD-L1: Ingen membranfarvning i tumorceller. Uspecifik farvning skal være ≤1+. Objektglas farvet med Negative Control Reagent: Ingen membranfarvning. Uspecifik farvning skal være ≤1+. Hvis objektglassene med det negative kontrolvæv udviser specifik plasmamembranfarvning, skal resultaterne med patientpræparatet betragtes som ugyldige.

5. Objektglas med patientvæv, der er farvet med Negative Control Reagent

Undersøg patientpræparater, der er farvet med Negative Control Reagent fra PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Negative Control Reagent bruges i stedet for det primære antistof og er en hjælp i fortolkningen af specifik farvning på antigenstedet.

Fravær af plasmaspecifik membranfarvning verificerer den specifikke mærkning af målantigenet med PD-L1 primært antistof. Uspecifik farvning skal være ≤1+.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 10/23

6. Objektglas med patientvæv, der er farvet ved hjælp af PD-L1 primært antistof

Hele objektglasset med patientpræparaterne, der er farvet med PD-L1 primært antistof fra PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, skal undersøges til sidst. Der henvises til Resumé og forklaring, Begrænsninger og Evaluering af ikke-klinisk præstation for specifikke oplysninger om PD-L1 IHC 28-8 immunreaktivitet.

Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel observeret uspecifik baggrundsfarvning på objektglasset med Negative Control Reagent i samme kørsel. Som det er tilfældet med enhver immunhistokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret, ikke nødvendigvis at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Se afsnit 13 for retningslinjer for fortolkning af farvning.

15. Begrænsninger

15.1 Generelle begrænsninger 1. Immunhistokemi er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser og væv,

fiksering og behandling, klargøring af objektglas til immunhistokemi samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning,

optøning, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof-trapping eller fejlagtigt negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet.

3. For kraftig eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden,

morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske test. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede objektglas. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige.

5. Vævspræparater fra personer, som er inficeret med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non-specifik farvning med peberrodsperoxidase (17).

6. Muligheden for uventede reaktioner i testede vævstyper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv. Kontakt teknisk support hos Dako med eventuelle dokumenterede uventede reaktioner.

7. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke-immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome c) (14).

8. Reagenserne og vejledningen i dette system er udviklet til at yde optimalt. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller -temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater.

15.2 Produktspecifikke begrænsninger

1. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Når vævssnittene er monteret på objektglas, skal de opbevares i mørke ved 2-8 °C eller ved stuetemperatur op til 25 °C og farves inden 4 måneder efter sektionering. Objektglassenes opbevaringsforhold og håndteringsforhold må ikke overstige 25 °C på noget tidspunkt efter montering af hensyn til sikring af vævsintegriteten og antigeniciteten.

2. For at opnå optimale og reproducerbare resultater kræver PD-L1-proteinet target retrieval-forbehandling, når vævene fikseres (neutralt bufferet formalin) og paraffinindstøbes rutinemæssigt.

3. Udskift ikke med reagenser fra produkter med andre lotnumre eller fra andre producenter. Den eneste undtagelse er EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x), som om nødvendigt kan leveres som kode K8005.

4. Farvede kontrolcellelinjer skal kun anvendes til validering af farvningskørslen og ikke til bedømmelse af farvningsreaktionen i vævssnit. 5. Brug af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx på væv med andre fiksativer end 10% neutral bufferet formalin er ikke blevet valideret. 6. Biopsier ved excision, incision, udstansning eller nålebiopsi af kerne blev anset for acceptable prøvetyper til kliniske forsøg med

anvendelse af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx. Aspirater fra finnålsbiopsi eller andre cytologiske prøver var utilstrækkelige til biomarkøranalyser og blev udelukket fra kliniske forsøg med anvendelse af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx.

16. Evaluering af ikke-klinisk præstation

16.1 Analytisk specificitet for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx Det primære antistof i PD-L1 IHC 28-8 pharmDx er et monoklonalt anti-humant PD-L1-kaninantistof, klon 28-8. Det immunogen, der anvendes til generering af antistof, er et renset rekombinant humant PD-L1, der indeholder det ekstracellulære domæne (Phe19-Thr239) fra humant PD-L1. IHC-farvning med PD-L1 primært antistof viste ingen krydsreaktivitet for PD-L2 udtrykt eksogent i ovarieceller fra kinesiske hamstere (CHO). PD-L1 IHC 28-8 pharmDx detekterer specifikt PD-L1-membranprotein udtrykt i tumorceller i FFPE-væv, som kan fuldstændig fjernes ved tilsætning af PD-L1-antigen. PD-L1 IHC 28-8 pharmDx detekterer ikke PD-L1-membranprotein i PD-L1 knock-out-kræftceller, hvori PD-L1-genet er slettet genetisk.

16.2 Normalt og neoplastisk væv Tabel 6 giver en oversigt over immunreaktiviteten for monoklonalt anti-humant PD-L1-kaninantistof på det anbefalede panel af normalt væv. Tabel 7 giver en oversigt over immunreaktiviteten for monoklonalt anti-humant PD-L1-kaninantistof på neoplastisk væv i mikroanalyser med væv fra mange tumorer. Alle væv blev formalinfikseret, paraffinindstøbt og farvet med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx i henhold til vejledningen i denne indlægsseddel. PD-L1 IHC 28-8 pharmDx detekterede PD-L1-protein lokaliseret i plasmamembranen på celletyper, der er kendt for at udtrykke PD-L1-antigenet, som f.eks. immunceller og celler af epiteloprindelse, primært tumorceller.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 11/23

Tabel 6: Oversigt over PD-L1 IHC 28-8 pharmDx-reaktivitet i normalt væv Vævstype (antal analyserede)

Positiv plasmamembranfarvning: Vævselementer

Positiv cytoplasmisk farvning: Vævselementer

Binyre (3) 3/3 Medullære celler 3/3 Medullære celler Bryst (3) 0/3 0/3 Cerebellum (3) 0/3 0/3 Cerebrum (3) 0/3 0/3 Cervix (3) 1/3 Epitel 1/3 epitel Colon (3) 2/3 Makrofager 0/3 Hud (3) 0/3 1/3 epitel Hypofyse (3) 1/3 Anterior adenohypofyse 1/3 Anterior adenohypofyse

3/3 Posterior neurohypofyse Knoglemarv (3) 3/3 Megakaryocytter 3/3 megakaryocytter Lever (3) 2/3 Immunceller 2/3 Immunceller Lunge (3) 3/3 Alveolære makrofager 0/3 Mavesæk (3) 0/3 0/3 Mesotelceller (3) 0/3 0/3 Milt (3) 1/3 Makrofager

3/3 Littoralcelle 0/3

Muskel, hjerte (3) 0/2 0/2 Muskel, skelet (3) 0/2 0/2 Nerve, perifert (3) 0/3 0/3 Nyre (3) 3/3 Cylinderepitel 3/3 Cylinderepitel Oesophagus (3) 0/3 0/3 Ovarie (3) 0/3 0/3 Pancreas (3) 3/3 Epitel (overvejende øceller) 3/3 Epitel (overvejende øceller) Parathyroidea (3) 3/3 Epitel 0/3 Prostata (2) 0/2 0/2 Spytkirtel (3) 0/3 0/3 Testis (3) 0/3 1/3 Leydigs celler Thymus (3) 3/3 Medullært epitel 0/3 Thyroidea (3) 0/3 0/3 Tonsil (3) 3/3 Kryptepitel

3/3 Germinalcenter (immunceller) 0/3

Tyndtarm (2) 0/2 0/2 Uterus (3) 0/3 0/3 Tabel 7: Oversigt over PD-L1 IHC 28-8 pharmDx-reaktivitet i neoplastisk væv Tumortype Placering / organ PD-L1-positiv/total (N=162)

Appendix 1/1 Bronkoalveolært karcinom, lunge 0/1 Bryst, DCIS 0/2 Bryst, invasiv duktal 3/7 Bryst, invasiv duktal, metastatisk til lymfeknude 1/1 Cervix, endocervikal type 0/1 Colon 2/5 Colon, metastatisk til lever 1/1 Colon, mucinøs 0/1 Galdeblære 2/4 GI, metastatisk til lunge 0/1 Hoved og hals, hårde gane 0/1 Lunge 2/5 Mave 1/6 Mavesæk, mucinøs 0/1 Oesophagus 1/1 Ovarie 0/1 Ovarie, endometrioid 0/1 Ovarie, mucinøs 0/1 Ovarie, serøs 0/1 Pancreas 1/2 Pancreas, duktal 0/3 Prostata 2/4 Rectum 2/4 Spytkirtel/parotis 0/2 Thyroidea, follikulær 0/1 Thyroidea, follikulær-papillær 0/1 Thyroidea, papillær 0/3 Tyndtarm 0/2 Uterus, clear cell 1/1

Adenokarcinom

Uterus, endometrium 1/3 Adrenokortikalt karcinom Adrenal 0/1

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 12/23

Tumortype Placering / organ PD-L1-positiv/total (N=162) Astrocytom Cerebrum 0/3 Basalcellekarcinom Hud 0/1 Chordom Bækkenhule 0/1 Embryonalt karcinom Testikel 0/1 Ependymom Hjerne 0/1 Glioblastom Hjerne 0/1 Hepatoblastom Lever 0/1 Hepatocellulært karcinom Lever 1/5

Colon 0/1 Rectum 0/1 Interstitialom Tyndtarm 0/1

Karcinom Nasofaryngeal, NPC 0/1 Liposarkom Bughule, mucinøs 0/1 Lymfom Anaplastiske storcellet Lymfeknude 1/1 Diffus B-celle Lymfeknude 2/4 Hodgkin Lymfeknude 2/2 Non-Hodgkin Lymfeknude 1/1 Medullablastom Hjerne 0/1 Medullært karcinom Thyroidea 0/1

Næsehule 0/1 Melanom

Rectum 0/1 Meningiom Hjerne 0/2 Mesotheliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Bløddele, nedre ryg 0/1

Cervix 2/4 Hoved og hals 0/2 Hud 1/2 Lunge 1/3 Oesophagus 4/7 Pladecellekarcinom i oesophagus metasteret til lymfeknude 1/1

Pladecellekarcinom

Uterus 1/1 Primitiv neuroektodermal Retroperitoneum 0/1 Renalt cellekarcinom Clear cell Nyre 0/6 Papillær Nyre 0/1 Sarkom Chondrosarkom Knogle 0/1 Clear cell Bugvæg 0/1

Blære 0/1 Leiomoysarkom

Bløddele, brystvæg 0/1 Liposarkom Bughule, mucinøs 0/1 Osteosarkom Knogle 0/2

Bløddele, embryonal 0/1 Prostata 0/1 Rhabdomyosarkom Retroperitoneum 0/1

Synovialt sarkom Bækkenhule 0/1 Seminom Testikel 0/2

Colon 0/1 Signetringcellekarcinom

Signetringcellekarcinom i colon metasteret til ovarie 0/1 Småcellet karcinom Lunge 1/2 Spermatocytisk seminom Testikel 0/2 Storcellet karcinom Lunge 1/1 Thymom Mediastinum 1/1

Blære 3/6 Transitionalt cellekarcinom

Nyre 0/1 Øcelletumor Pancreas 0/1 17. Evaluering af præstation

17.1 Evaluering af præstation: Ikke-pladecellet NSCLC

17.1.1 Analytisk sensitivitet: Ikke-pladecellet NSCLC Analytisk sensitivitet for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev testet på 112 unikke tilfælde af FFPE-præparater af ikke-pladecellet NSCLC i stadie I til IV med anvendelse af et fremstillet produktionslot. Vurderingen af PD-L1-ekpression viste farvning i hele området af 0-100% positive tumorceller og farvningsintensitet 0-3.

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 13/23

17.1.2 Gentagelsesnøjagtighed/ekstern reproducerbarhed: Ikke-pladecellet NSCLC Gentagelsesnøjagtigheden og den eksterne reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret hos Dako og på tre eksterne testlaboratorier. Præstationsdata vises i tabel 8 og tabel 9. Negativ procentdel af overensstemmelse (NPA), positiv procentdel af overensstemmelse (PPA) og samlet procentdel af overensstemmelse (OA) for hver uafhængig parvis sammenligning af testene blev fastslået for hvert evalueret PD-L1-ekspressionsniveau. Den hyppigst forekommende observation anvendtes som reference ved beregning af NPA, PPA, OA og de tilsvarende 95% Wilson Score-konfidensintervaller, og som følge deraf blev et af resultaterne med denne observation ekskluderet fra de parvise sammenligninger.

Tabel 8: Gentagelsesnøjagtigheden for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - ikke-pladecellet NSCLC

% Overensstemmelse (95% CI) Gentagelsesnøjagtighed Metode ≥1%

Ekspressionsniveau ≥5%

Ekspressionsniveau ≥10%

Ekspressionsniveau Instrumenterne imellem Hvert af de 10 ikke-pladecellede

NSCLC-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med tre replikater på alle tre Autostainer Link 48-instrumenter. I alt udførtes 60 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100)

NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100)

NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100)

Mellem analytikere Hvert af de 12 ikke-pladecellede NSCLC-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med tre replikater af tre analytikere på ét Autostainer Link 48-instrument. I alt udførtes 72 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100)

NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100)

NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100)

Fra forskellige dage Hvert af de 10 ikke-pladecellede NSCLC-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med tre replikater på fem ikke på hinanden følgende dage på Autostainer Link 48-instrumentet. I alt udførtes 80 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100)

NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100)

NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8)

Fra forskellige lot Hvert af de 20 ikke-pladecellede NSCLC-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med to replikater med hvert af de fem reagenslot på Autostainer Link 48-instrumentet. I alt udførtes 160 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100)

NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100)

NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100)

Inden for kørsler Hvert af de 10 ikke-pladecellede NSCLC-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med otte replikater inden for en kørsel på Autostainer Link 48-instrumentet. I alt udførtes 70 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100)

NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100)

NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100)

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 14/23

Tabel 9: Reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - ikke-pladecellet NSCLC, testet på tre eksterne laboratorier

% Overensstemmelse (95% CI) Reproducer-barhed

Metode ≥1% Ekspressionsniveau ≥5% Ekspressionsniveau

Analyse på forskellige laboratorier (tre laboratorier)

Hvert af de 10 ikke-pladecellede NSCLC'er med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem laboratorier blev udført mellem tre laboratorier på i alt 140 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9)

NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1)

Analyse inden for samme laboratorie

Hvert af de 10 ikke-pladecellede NSCLC'er med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier. Analysen inden for laboratorier blev udført for tre laboratorier på i alt 120 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9)

NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2)

Mellem observatører (én observatør på hvert af de tre laboratorier)

Scoring af 15 ikke-pladecellede NSCLC-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression farvet med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev udført at tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem observatører blev udført mellem tre laboratorier på i alt 120 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5)

NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7)

Intra-observatør (én observatør på hvert af de tre laboratorier)

Scoring af 15 ikke-pladecellede NSCLC-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression farvet med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev udført at tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Intra-observatør-analyse blev udført for tre laboratorier på i alt 90 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4)

NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100)

17.1.3 Evaluering af klinisk præstation: Ikke-pladecellet NSCLC Den kliniske anvendelighed af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret i CA209057, en åben, randomiseret fase 3-undersøgelse af nivolumab vs. docetaxel hos voksne forsøgspersoner (≥ 18 år) med fremskreden eller metastatisk ikke-pladecellet NSCLC efter manglende succes med forudgående platindubletbaseret kemoterapi. I alt blev 582 forsøgspersoner randomiseret på 112 forsøgscentre i 22 lande (Argentina, Australien, Østrig, Brasilien, Canada, Chile, Tjekkiet, Frankrig, Tyskland, Hong Kong, Ungarn, Italien, Mexico, Norge, Peru, Polen, Rumænien, Rusland, Singapore, Spanien, Schweiz og USA). Forsøgspersonerne blev randomiseret 1:1 og stratificeret i henhold til 1) tidligere anvendelse af vedligeholdelsesterapi vs. ingen anvendelse af vedligeholdelsesterapi og 2) andetvalgs- vs. tredjevalgsterapi. Der blev indsamlet tumorvævspræparater før undersøgelsen (baseline) inden randomisering og inden første behandling for at udføre forudplanlagte analyser af effektivitet i henhold til foruddefinerede PD-L1-ekspressionsniveauer ved baseline (sekundært mål). Det primære endepunkt var generel overlevelse (OS). Andre sekundære endepunkter var objektiv responsrate (ORR), progressionsfri overlevelse (PFS) og forbedring af sygdomsrelaterede symptomer efter 12 uger, målt på Lung Cancer Symptom Scale (LCSS). Med hensyn til demografiske og sygdomsrelaterede karakteristika ved baseline var der generelt balance mellem randomiserede forsøgspersoner i nivolumab- og docetaxel-grupperne. Den mediane alder var 62 år (interval: 21 til 85) med 34% ≥65 år og 7% ≥75 år. Hovedparten af patienterne var hvide (92%) og mænd (55%), og ECOG-scoren ved baseline var 0 (31%) eller 1 (69%). 79% af patienterne var tidligere/nuværende rygere. Der blev indsamlet tumorpræparater fra ikke-pladecellede NSCLC-tumorer i overensstemmelse med studiets inklusionskrav. Frekvenserne for PD-L1-ekspression på hvert af de foruddefinerede ekspressionsniveauer ved baseline hos alle randomiserede forsøgspersoner i CA209057 præsenteres i tabel 10.

Tabel 10: Frekvens for PD-L1-ekspression før undersøgelsen hos alle randomiserede forsøgspersoner med ikke-pladecellet NSCLC - CA209057

PD-L1-ekspressionskategori for population Nivolumab 3 mg/kg Docetaxel I alt

Samlet 292 290 582 PD-L1-kvantificerbare ved baseline, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2)

PD-L1-ekspression ved baseline ≥1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) PD-L1-ekspression ved baseline <1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) PD-L1-ekspression ved baseline ≥5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) PD-L1-ekspression ved baseline <5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) PD-L1-ekspression ved baseline ≥10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) PD-L1-ekspression ved baseline <10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7)

PD-L1 ikke-kvantificerbare, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8)

Patienter med PD-L1-ekspression efter alle foruddefinerede ekspressionsniveauer i OPDIVO®-gruppen var forbundet med øget overlevelse sammenlignet med docetaxel, mens overlevelsen var ligesom for docetaxel hos patienter uden PD-L1-ekspression. Der blev observeret signifikante forskelle i median OS for nivolumab-undergruppen i forhold til docetaxel-undergruppen ved analyse efter PD-L1-ekspressionsniveau. Median OS var 17,1, 18,2 og 19,4 måneder for nivolumab-forsøgspersoner sammenlignet med 9,0, 8,1 og 8,0 måneder for docetaxel-forsøgspersoner med PD-L1-ekspressionsniveauer på henholdsvis ≥ 1%, ≥ 5% og ≥ 10%. Der var ingen forskelle i OS mellem behandlingsgrupperne blandt forsøgspersoner med ekspressionsniveauer på <1%, <5% og <10%, med median OS i området 9,7 til 10,4 måneder for nivolumab og 10,1 til 10,3 måneder for docetaxel. Ikke-stratificerede hazard ratios (HR) og median overlevelse (OS) vises i figur 1. Kaplan-Meier-plot af undergrupper efter PD-L1-ekspressionsniveau vises i figur 2 og figur 3.

Figur 1: Forest-plot - OS baseret på PD-L1-ekspression hos patienter med ikke-pladecellet NSCLC - CA209057

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 15/23

Bemærk: Den ikke-stratificerede hazard ratio og de tilsvarende 95% CI blev estimeret i en Cox proportional hazards-model med brug af den randomiserede arm som enkelt kovariat

Figur 2: Samlet overlevelse - patienter med ikke-pladecellet NSCLC med ≥1% PD-L1-ekspression - CA209057

Median OS (måneder)OPDIVO Docetaxel

PD-L1-ekspressionsniveau

≥1% (n = 246)

<1% (n = 209)

≥5% (n = 181)

<5% (n = 274)

≥10% (n = 165)

<10% (n = 290)

0,59 17,1 9,0

0,90 10,4 10,1

0,43 18,2 8,1

1,01 9,7 10,1

0,40 19,4 8,0

0,25 0,5 1,0 2,0

Til fordel for OPDIVO

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

San

dsyn

lighe

d fo

r ov

erle

vels

e

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

Generel overlevelse (måneder) Antal i risiko OPDIVO 123 98 86 77 73 65 27 13 5 0 Docetaxel 123 102 80 61 44 36 13 4 3 0

OPDIVO Docetaxel

Ikke-stratificeret HR

1,00 9,9 10,3

Figur 3: Samlet overlevelse - patienter med ikke-pladecellet NSCLC med <1% PD-L1-ekspression - CA209057

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 16/23

17.2 Evaluering af præstation: SCCHN

17.2.1 Analytisk sensitivitet: SCCHN Analytisk sensitivitet for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev testet på 236 unikke tilfælde af FFPE-præparater af SCCHN i stadie I til IV med anvendelse af et fremstillet produktionslot. Vurderingen af PD-L1-ekpression viste farvning i hele området af 0-95% positive tumorceller og farvningsintensitet 0-3. 17.2.2 Gentagelsesnøjagtighed/Ekstern reproducerbarhed: SCCHN Gentagelsesnøjagtigheden og den eksterne reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret henholdsvis hos Dako og i tre eksterne testlaboratorier. Præstationsdata vises i tabel 11 og tabel 12. Af hensyn til gentagelsesnøjagtigheden blev gennemsnitlig negativ procentdel af overensstemmelse (ANA), gennemsnitlig positiv procentdel af overensstemmelse (APA) og samlet procentdel af overensstemmelse (OA) for parvise sammenligninger og tilsvarende 95% Wilson Score-konfidensintervaller fastslået for hvert evalueret PD-L1-ekspressionsniveau. Af hensyn til reproducerbarheden blev negativ procentdel af overensstemmelse (NPA), positiv procentdel af overensstemmelse (PPA) og samlet procentdel af overensstemmelse (OA) for uafhængig parvis sammenligning af testene fastslået for hvert evalueret PD-L1-ekspressionsniveau. Den hyppigst forekommende observation anvendtes som reference ved beregning af NPA, PPA, OA og de tilsvarende 95% Wilson Score-konfidensintervaller.

Tabel 11: Gentagelsesnøjagtigheden for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - SCCHN % Overensstemmelse

(95% CI) Gentagelsesnøj-agtighed

Metode ≥1% Ekspressionsniveau

Fra forskellige lot Hvert af de 39 SCCHN-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med hvert af tre analyseopbygningslots på Autostainer Link 48-instrumentet. I alt udførtes 115 parvise sammenligninger.

ANA 100 (96,9, 100) APA 100 (96,6, 100) OA 100 (98,4, 100)

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

Generel overlevelse (måneder)

Antal i risiko OPDIVO 108 82 70 60 48 39 26 17 4 0 Docetaxel 101 87 69 53 38 30 13 5 2 0

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

San

dsyn

lighe

d fo

r ov

erle

vels

e

OPDIVO Docetaxel

0,0

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 17/23

Tabel 12: Reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - SCCHN, testet på tre eksterne laboratorier

% Overensstemmelse (95% CI)Reproducerbarhed Metode

≥1% Ekspressionsniveau


Et sæt med 14 SCCHN-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på tre ikke på hinanden følgende dage på hvert af de tre laboratorier. Analysen mellem laboratorier blev udført mellem tre laboratorier på i alt 126 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (94,3, 100) OA 100 (97,0, 100)

Analyse inden for samme laboratorie Et sæt med 14 SCCHN-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression

blev testet på tre ikke på hinanden følgende dage på hvert af de tre laboratorier. Analysen inden for laboratorier blev udført for tre laboratorier på i alt 126 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (94,3, 100) OA 100 (97,0, 100)

Mellem observatører (tre observatører)

To separate scoringsevalueringer af et sæt med 30 SCCHN-præparater, der viser farvning af et område af PD-L1 IHC-ekspression, farvet med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, blev udført af tre patologer med en udvaskningsperiode på minimum 5 dage mellem aflæsningerne. Analysen mellem observatører blev udført mellem tre patologer på i alt 180 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 96,7 (90,7, 98,9) PPA 97,8 (92,3, 99,4) OA 97,2 (93,7, 98,8)

Fra samme observatør To separate scoringsevalueringer af et sæt med 30 SCCHN-præparater, der viser farvning af et område af PD-L1 IHC-ekspression, farvet med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, blev udført af tre patologer med en udvaskningsperiode på minimum 5 dage mellem aflæsningerne. Intra-observatør-analyse blev udført for tre patologer på i alt 180 uafhængige parvise sammenligninger.

NPA 100 (95,6, 100) PPA 94,8 (88,4, 97,8) OA 97,2 (93,7, 98,8)

17.2.3 Evaluering af klinisk præstation: SCCHN Den kliniske anvendelighed af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret i CA209141, en åben, randomiseret fase 3-undersøgelse af nivolumab vs undersøgerens eget valg af terapi ved tilbagevendende eller metastatisk platin-refraktært pladecellekarcinom i hoved og hals (SCCHN). Patienterne blev randomiseret på 55 forsøgscentre i 15 lande (Argentina, Brasilien, Canada, Frankrig, Tyskland, Hong Kong, Italien, Japan, Korea, Holland, Spanien, Schweiz, Taiwan, Storbritannien og USA). Forsøgspersonerne blev randomiseret 2:1 (nivolumab: undersøgerens eget valg) og stratificeret i henhold til tidligere behandling med cetuximab (ja/nej). Der blev indsamlet tumorvævspræparater før undersøgelsen (baseline) inden randomisering og inden første behandling for at udføre forudplanlagte analyser af effektivitet i henhold til foruddefinerede PD-L1-ekspressionsniveauer ved baseline (eksploratorisk mål). Måleenheden for det primære virkningsresultat var OS. Yderligere måleenheder for virkningsresultater var PFS og ORR. I dette forsøg blev i alt 361 patienter randomiseret: 240 til OPDIVO og 121 patienter til undersøgerens eget valg (45% modtog docetaxel, 43% modtog methotrexat, og 12% modtog cetuximab). Den mediane alder var 60 år (interval: 28 til 83) med 31% ≥65 år, 83% var hvide, 12% asiatiske, 4% var sorte og 83% mænd. ECOG-scoren ved baseline var 0 (20%) eller 1 (78%), 76% var tidligere/nuværende rygere, 90% havde sygdom i stadie IV, 45% af patienterne havde kun modtaget ét tidligere regime af systemisk behandling, de resterende 55% havde modtaget to eller flere tidligere regimer af systemisk terapi, og 25% havde HPVp16-positive tumorer, 24% havde HPV p16-negative tumorer, og for 51% var status ukendt. Der blev indsamlet tumorpræparater fra ikke-pladecellede SCCHN-tumorer fra enten et primært eller et metastatisk område i overensstemmelse med studiets inklusionskrav. Hos 327 forsøgspersoner (ud af i alt 361 forsøgspersoner) blev der indsamlet tumorvæv ved baseline med følgende forhold mellem områderne: 29,7% primært, 52,0% metastase og 18,3% ikke rapporteret. Frekvenserne for PD-L1-ekspression på hvert af de foruddefinerede ekspressionsniveauer ved baseline hos alle randomiserede forsøgspersoner i CA209141 præsenteres i tabel 13.

Tabel 13: Frekvens for PD-L1-ekspression før undersøgelsen hos alle randomiserede forsøgspersoner med SCCHN – CA209141

PD-L1-ekspressionskategori for population Nivolumab 3 mg/kg

(N = 240) Undersøgerens valg

(N = 121) I alt

(N = 361)

Samlet 240 121 361

PD-L1-kvantificerbare ved baseline (N (%)) 161 (67,1) 99 (81,8) 260 (72,0)

PD-L1-ekspression ved baseline ≥1% 88/161 (54,7) 61/99 (61,6) 149/260 (57,3)

PD-L1-ekspression ved baseline <1% 73/161 (45,3) 38/99 (38,4) 111/260 (42,7)

PD-L1 ikke-kvantificerbare (N (%)) 79 (32,9) 22 (18,2) 101 (28,0)

Fase 3-forsøget CA209141 viser en statistisk signifikant forbedring af OS hos forsøgspersoner randomiseret til nivolumab sammenlignet med undersøgerens eget valg i en foruddefineret midtvejsanalyse (78% af antallet af hændelser, der var planlagt til den endelige analyse). Den mediane OS var 7,5 måneder hos forsøgspersoner behandlet med nivolumab sammenlignet med 5,1 måneder hos forsøgspersoner behandlet med undersøgerens eget valg med en hazard ratio på 0,70 (95% CI: 0,53, 0,92).

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 18/23

I præspecificerede, eksploratoriske undergruppeanalyser, der anvendte PD-L1 IHC 28-8 pharmDx-testen, var hazard ratio for overlevelse 0,89 (95% CI: 0,54, 1,45) med median overlevelse på 5,7 og 5,8 måneder for henholdsvis nivolumab- og kemoterapi-behandlingsgrenene, hos patienter med <1% PD-L1-ekspression. Hazard ratio for overlevelse var 0,55 (95% CI: 0,36, 0,83) med median overlevelse på 8,7 og 4,6 måneder for henholdsvis nivolumab- og kemoterapi-behandlingsgrenene hos forsøgspersoner med ≥1% PD-L1-ekspression (16).

17.3 Evaluering af præstation: UC

17.3.1 Analytisk sensitivitet: UC Analytisk sensitivitet for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev testet på 138 unikke tilfælde af FFPE-præparater af humant blærekarcinom i stadie III til IV med anvendelse af et fremstillet produktionslot. Vurderingen af PD-L1-ekpression viste farvning i hele området af 0-90% positive tumorceller og farvningsintensitet 0-3. 17.3.2 Gentagelsesnøjagtighed/ekstern reproducerbarhed: UC Gentagelsesnøjagtigheden og den eksterne reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret hos Dako og på tre eksterne testlaboratorier. Præstationsdata vises i tabel 14 og tabel 15. Gennemsnitlig negativ procentdel af overensstemmelse (ANA), gennemsnitlig positiv procentdel af overensstemmelse (APA) og samlet procentdel af overensstemmelse (OA) for parvise sammenligninger og tilsvarende 95% Wilson Score-konfidensintervaller blev fastslået for hvert evalueret PD-L1-ekspressionsniveau.

Tabel 14: Gentagelsesnøjagtigheden for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - UC

% Overensstemmelse (95% CI) Gentagelsesnøjagtighed Metode

≥1% Ekspressionsniveau ≥5% Ekspressionsniveau

Kombineret præcision Hvert af 30 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet under følgende forhold: 5 operatører/instrumenter/dage ved hjælp af ét analyselot. I alt udførtes 286 uafhængige parvise sammenligninger.

ANA 96,6 (93,8, 98,1) APA 96,4 (93,5, 98,1) OA 96,5 (94,6, 97,7)

ANA 98,4 (96,5, 99,3) APA 97,0 (93,5, 98,6) OA 97,9 (96,3, 98,8)

Mellem observatører Hvert af 72 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev aflæst 3 gange af 3 forskellige patologer med en skylning på 2 uger mellem aflæsninger. I alt udførtes 1944 uafhængige parvise sammenligninger.

ANA 90,3 (88,7, 91,7) APA 93,1 (91,9, 94,1) OA 91,9 (91,0, 92,8)

ANA 87,1 (85,4, 88,6) APA 88,1 (86,5, 89,5) OA 87,6 (86,5, 88,7)

Fra samme observatør Hvert af 72 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev aflæst 3 gange af den samme patolog med en skylning på 2 uger mellem aflæsninger. I alt blev der anvendt 3 patologer og udført 648 uafhængige parvise sammenligninger.

ANA 95,2 (93,0, 96,7) APA 96,6 (95,0, 97,7) OA 96,0 (94,7, 96,9)

ANA 92,0 (89,5, 93,9) APA 92,6 (90,2, 94,4) OA 92,3 (90,6, 93,7)

Fra forskellige lot Hvert af de 30 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med 3 forskellige analyseopbygningslots på Autostainer Link 48-instrumentet. I alt udførtes 87 uafhængige parvise sammenligninger.

ANA 97,8 (92,3, 99,4) APA 97,6 (91,4, 99,3) OA 97,7 (94,2, 99,1)

ANA 98,1 (93,2, 99,5) APA 97,1 (90,0, 99,2) OA 97,7 (94,2, 99,1)

Inden for kørsler Hvert af de 30 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med fem replikater inden for den samme kørsel af den samme operatør på det samme Autostainer Link 48-instrument. I alt udførtes 290 uafhængige parvise sammenligninger.

ANA 96,3 (93,2, 98,0) APA 96,8 (94,1, 98,3) OA 96,6 (94,7, 97,8)

ANA 96,5 (93,9, 98,0) APA 95,0 (91,4, 97,2) OA 95,9 (93,9, 97,2)

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 19/23

Tabel 15: Reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - UC, testet på tre eksterne laboratorier

% Overensstemmelse (95% CI) Reproducerbarhed Metode

≥1% Ekspressionsniveau ≥5% Ekspressionsniveau


Hvert af de 46 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem laboratorier blev udført mellem tre laboratorier på i alt 3440 parvise sammenligninger.

ANA 88,0 (87,1, 88,8) APA 85,6 (84,6, 86,5) OA 86,9 (85,7, 88,0)

ANA 94,7 (94,1, 95,2) APA 90,5 (89,7, 91,2) OA 93,2 (92,3, 94,0)


Hvert af de 46 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage. Analysen inden for laboratorier blev udført for tre laboratorier på i alt 1376 parvise sammenligninger.

ANA 93,5 (92,4, 94,4) APA 92,2 (91,0, 93,2) OA 92,9 (91,4, 94,1)

ANA 95,9 (95,1, 96,6) APA 92,7 (91,6, 93,7) OA 94,8 (93,5, 95,8)


Scoring af 78 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev udført af tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem observatører blev udført mellem tre laboratorier på i alt 2106 parvise sammenligninger.

ANA 91,9 (91,0, 92,7) APA 92,5 (91,6, 93,3) OA 92,2 (91,0, 93,3)

ANA 96,0 (95,4, 96,6) APA 94,4 (93,6, 95,1) OA 95,4 (94,4, 96,2)

Fra samme observatør

Scoring af 78 blærekarcinompræparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev udført af tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Sammenligningsanalysen for samme observatør blev udført for tre laboratorier på i alt 702 parvise sammenligninger.

ANA 96,1 (95,0, 97,1) APA 96,4 (95,3, 97,3) OA 96,3 (94,6, 97,5)

ANA 96,8 (95,7, 97,7) APA 95,6 (94,3, 96,6) OA 96,3 (94,6, 97,5)

17.3.3 Evaluering af klinisk præstation: UC Den kliniske anvendelighed af PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret i CA209275, et fase II enkeltarms klinisk forsøg af nivolumab hos forsøgspersoner med metastatisk eller inoperabel blærekræft, som har udviklet sig eller er genopstået efter behandling med et platinstof. I alt 270 forsøgspersoner blev randomiseret til nivolumab på 63 laboratorier i 11 lande (Australien, Belgien, Den Tjekkiske Republik, Finland, Italien, Japan, Polen, Spanien, Sverige, Tyskland og USA). Der blev systematisk indsamlet tumorvævspræparater før undersøgelsen (baseline) inden randomisering og inden første behandling. Måleenheder for det primære virkningsresultat inkluderede bekræftet objektiv responsrate (ORR) som bedømt af en uafhængig radiografisk gennemgangskomite (Independent Radiographic Review Committee, IRRC) ved hjælp af Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST v1.1) og varighed af respons (DOR). Den mediane alder var 66 år (interval 38 til 90), 78% var mænd, 86% af patienterne var hvide. Syvogtyve procent havde ikke-blære blærekarcinom, og 84% havde viscerale metastaser. Fireogtredive procent af patienterne oplevede sygdomsprogression efter forudgående platin-indeholdende neoadjuvant eller adjuvant behandling. Niogtyve procent af patienterne havde modtaget ≥2 forudgående systemiske regimer i det metastatiske miljø. Seksogtredive procent af patienterne modtog kun forudgående cisplatin, 23% modtog kun forudgående carboplatin, og 7% blev behandlet med både cisplatin og carboplatin i det metastatiske miljø. Seksogfyrre procent af patienterne havde en ECOG-score på 1. Atten procent af patienterne havde en hæmoglobin på <10 g/dl, og otteogtyve procent af patienterne havde levermetastaser ved baseline. Patienterne blev inkluderet uanset deres PD-L1-status. Ud af de 270 patienter i undersøgelse CA209275 var 46% defineret som havende PD-L1-ekspression på ≥1% (defineret som ≥1% af tumorceller eksprimerende PD-L1). De resterende 54% af patienterne var klassificeret som havende PD-L1-ekspression på <1% (defineret som <1% af tumorceller eksprimerende PD-L1). Bekræftet ORR hos alle patienter og de to PD-L1-undergrupper er opsummeret i tabel 16. Den mediane tid til respons var 1,9 måneder (interval: 1,6-7,2).

Tabel 16: Virkningsresultater i CA209275

Alle behandlede forsøgspersoner

N=270 PD-L1 <1%

N=146 PD-L1 ≥1%

N=124

Bekræftet objektiv responsrate n (%) 53 (19,6%) 22 (15,1%) 31 (25,0%)

95% KI 15,1 – 24,9 9,7 – 21,9 17,7 – 33,6

Komplet responsrate 7 (2,6%) 1 (0,7%) 6 (4,8%)

Delvis responsrate 46 (17,0%) 21 (14,4%) 25 (20,2%)

Median varighed af respons*

Måneder (interval)

10,3 (1,9+, 12,0+) 7,6 (3,7+,12,0+) NE (1,9+, 12,0+)

*Estimeret ud fra Kaplan-Meier-kurven

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 20/23

17.4 Evaluering af præstation: Melanom

17.4.1 Analytisk sensitivitet: Melanom Analytisk sensitivitet for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev testet på 104 unikke tilfælde af FFPE-præparater af melanom i stadie I til IV. Vurderingen af PD-L1-ekpression viste farvning i hele området af 0-100% positive tumorceller og farvningsintensitet 0-3.

17.4.2 Gentagelsesnøjagtighed/Ekstern reproducerbarhed: Melanom Gentagelsesnøjagtigheden og den eksterne reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret hos Dako og på tre eksterne testlaboratorier. Før scoring af farvede vævssnit blev disse snit blindet og randomiseret. Præstationsdata vises i tabel 17 og tabel 18. Gennemsnitlig negativ procentdel af overensstemmelse (ANA), gennemsnitlig positiv procentdel af overensstemmelse (APA) og samlet procentdel af overensstemmelse (OA) for hver ikke-redundant parvis sammenligning af testene blev fastslået for hvert evalueret PD-L1-ekspressionsniveau.

Tabel 17: Gentagelsesnøjagtigheden for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - melanom

% Overensstemmelse (95% CI) Gentagelsesnøjagtighed Metode

≥1% Ekspressionsniveau ≥5% Ekspressionsniveau Instrumenterne imellem Hvert af de 16 melanom-præparater med et område

af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på alle de fem Autostainer Link 48-instrumenter. Objektglassene blev blindet og randomiseret inden scoring. I alt udførtes 160 parvise sammenligninger.

ANA 89,5 (83,2, 93,6) APA 90,5 (84,8, 94,2) OA 90,0 (86,0, 92,9)

ANA 90,8 (85,7, 94,2) APA 85,5 (77,6, 90,9) OA 88,8 (84,6, 91,9)

Mellem analytikere Hvert af de 16 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet af seks analytikere på ét Autostainer Link 48-instrument. Objektglassene blev blindet og randomiseret inden scoring. I alt udførtes 235 parvise sammenligninger.

ANA 96,4 (92,9, 98,2) APA 96,8 (93,8, 98,4) OA 96,6 (94,5, 97,9)

ANA 91,3 (87,1, 94,2) APA 88,8 (83,4, 92,6) OA 90,2 (87,0, 92,7)

Fra forskellige dage Hvert af de 16 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage på Autostainer Link 48-instrumentet. Objektglassene blev blindet og randomiseret inden scoring. I alt udførtes 160 parvise sammenligninger.

ANA 95,5 (90,3, 97,9) APA 96,8 (93,1, 98,6) OA 96,3 (93,5, 97,9)

ANA 90,0 (84,0, 93,9) APA 90,0 (84,0, 93,9) OA 90,0 (86,0, 92,9)

Fra forskellige lot Hvert af de 16 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med hvert af de tre reagenslot på Autostainer Link 48-instrumentet. Objektglassene blev blindet og randomiseret inden scoring. I alt udførtes 702 parvise sammenligninger.

ANA 98,6 (97,3, 99,3) APA 98,8 (97,8, 99,4) OA 98,7 (98,0, 99,2)

ANA 92,6 (90,6, 94,2) APA 86,6 (83,1, 89,5) OA 90,5 (88,7, 91,9)

Inden for kørsler Hvert af de 16 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet med fem replikater inden for en kørsel på Autostainer Link 48-instrumentet. Objektglassene blev blindet og randomiseret inden scoring. I alt udførtes 153 parvise sammenligninger.

ANA 97,1 (92,6, 98,9) APA 97,7 (94,1, 99,1) OA 97,4 (94,9, 98,7)

ANA 93,6 (89,0, 96,4) APA 89,8 (82,7, 94,2) OA 92,2 (88,4, 94,8)

Tabel 18: Reproducerbarhed for PD-L1 IHC 28-8 pharmDx - Melanom, testet på tre eksterne laboratorier

% Overensstemmelse (95% CI) Reproducerbarhed Metode

≥1% Ekspressionsniveau ≥5% Ekspressionsniveau Analyse på forskellige laboratorier (tre laboratorier)

Hvert af de 18 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem laboratorier blev udført mellem tre laboratorier på i alt 1350 parvise sammenligninger.

ANA 99,3 (98,8, 99,7) APA 99,3 (98,8, 99,7) OA 99,3 (98,7, 99,7)

ANA 93,8 (92,5, 95,1) APA 92,7 (91,2, 94,2) OA 93,3 (91,9, 94,7)


Hvert af de 18 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier. Analysen inden for laboratorier blev udført for tre laboratorier på i alt 540 parvise sammenligninger.

ANA 99,3 (98,4, 99,8) APA 99,3 (98,5, 99,8) OA 99,3 (98,5, 99,8)

ANA 97,3 (95,8, 98,5) APA 96,8 (95,1, 98,2) OA 97,0 (95,6, 98,3)


Scoring af 30 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression farvet med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev udført at tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem observatører blev udført mellem tre laboratorier på i alt 810 parvise sammenligninger.

ANA 90,4 (88,1, 92,5) APA 91,7 (89,7, 93,6) OA 91,1 (89,1, 93,1)

ANA 93,2 (91,3, 94,8) APA 91,9 (89,8, 93,9) OA 92,6 (90,7, 94,3)

Intra-observatør (én observatør på hvert af de tre laboratorier)

Scoring af 30 melanom-præparater med et område af PD-L1 IHC-ekspression farvet med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev udført at tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Analysen fra samme observatør blev udført for tre laboratorier på i alt 270 parvise sammenligninger.

ANA 99,2 (97,9, 100) APA 99,3 (98,2, 100) OA 99,3 (98,1, 100)

ANA 97,9 (96,1, 99,4) APA 97,6 (95,4, 99,2) OA 97,8 (95,9, 99,3)

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 21/23

17.4.3 Evaluering af klinisk præstation: Melanom PD-L1 IHC 28-8 pharmDx blev evalueret ved hjælp af prøvemateriale fra patienter indskrevet i det kliniske forsøg CA209067, en randomiseret, dobbeltblindet fase 3-undersøgelse af nivolumab som monoterapi eller nivolumab i kombination med ipilimumab sammenlignet med ipilimumab som monoterapi til patienter med tidligere ubehandlet metastatisk melanom. I alt blev 1296 patienter rekrutteret på 137 centre i 21 lande (Australien, Østrig, Belgien, Canada, Tjekkiet, Danmark, Finland, Frankrig, Holland, Irland, Israel, Italien, Holland, New Zealand, Norge, Polen, Spanien, Sverige, Schweiz, Storbritannien og USA). Af de1296 rekrutterede patienter blev 945 patienter randomiseret til én af tre behandlingsgrupper i forholdet 1:1:1 og stratificeret efter PD-L1-status (≥5% ved en klinisk afprøvning), BRAF-status og AJCC M-stadie. Med hensyn til demografiske og sygdomsrelaterede karakteristika ved baseline var der generelt balance mellem randomiserede forsøgspersoner i behandlingsgrupperne. Den mediane alder var 60 år (interval: 18 til 90) med 40% ≥65 år og 13% ≥75 år. De fleste patienter var hvide (97%) og mænd (65%).

Før undersøgelsen (ved baseline) blev der indsamlet tumorpræparater fra melanom-patienter, hvoraf 86% blev indsamlet fra metastatiske områder. Af de 945 randomiserede patienter i undersøgelsen blev der udført retrospektiv undersøgelse af arkiveret tumorvæv med PD-L1 IHC 28-8 pharmDx-testen blev udført for 915 (97%) patienter. For 55 (6%) af patienterne i undersøgelsen udelukkede melanin evaluering af PD-L1-ekspressionsstatus, og PD-L1-ekspressionsstatus var ukendt for 47 (5%) patienter grundet disses tilbagetrækning af samtykke eller manglende prøver. Dermed blev PD-L1-ekspressionsstatus fastslået for 843 (89%) patienter. Andelen af patienter med PD-L1-tumorekspression ved ≥1%- og <1%-niveauet var ligeligt fordelt i behandlingsgrupperne. PD-L1-ekspressionsstatus for patienterne i undersøgelsen med PD-L1 IHC pharmDx-testresultater i CA209067 er gengivet i tabel 19.

Tabel 19: Frekvens for PD-L1-ekspression hos alle randomiserede forsøgspersoner med melanom - CA209067

Antal forsøgspersoner, n (%) nivolumab nivolumab + ipilimumab ipilimumab

PD-L1-kvantificerbare forsøgspersonera 288 278 277 PD-L1-ekspressionsniveau: ≥1% 171 (59,4) 155 (55,8) 164 (59,2) <1% 117 (40,6) 123 (44,2) 113 (40,8) ≥5% 80 (27,8) 68 (24,5) 75 (27,1) <5% 208 (72,2) 210 (75,5) 202 (72,9)

a Kun antal kvantificerbare PD-L1-resultater; omfatter ikke antallet af ubestemmelige PD-L1-resultater

I undergrupperne med PD-L1-ekspression viste nivolumab og kombinationen af nivolumab med ipilimumab forbedret PFS sammenlignet med ipilimumab. Sammenligningen af nivolumab + ipilimumab versus nivolumab var ikke et primært mål med undersøgelsen, og derfor var undersøgelsen ikke stillet op til at kunne afspejle denne forskel. Men hos forsøgspersoner med lave PD-L1-ekspressionsniveauer viste kombination af nivolumab + ipilimumab forbedret PFS sammenlignet med nivolumab-behandling. Hos forsøgspersoner med høj PD-L1-ekspressionsniveauer var PFS ensartet i grupperne med nivolumab- og kombination af nivolumab + ipilimumab-behandling.

Der blev observeret højere ORR'er i nivolumab- og nivolumab + ipilimumab-behandlingsgrupperne ved begge definitioner af PD-L1-ekspressionsstatus (≥1% eller ≥5% tumorcellemembran-ekspression) sammenlignet med ipilimumab-behandlingsgruppen. Forsøgspersoner behandlet med nivolumab og nivolumab + ipilimumab, som havde ≥1% eller ≥5% tumorcellemembran-ekspression, havde en numerisk højere ORR sammenlignet med patienter, der havde <1% eller <5% tumorcellemembran-ekspression. I ipilimumab-gruppen var ORR'erne var ensartede i PD-L1-ekspressionsundergrupperne uanset definitionen af PD-L1-ekspression (≥1% eller ≥5% tumorcellemembran-ekspression). Derudover blev der observeret en højere ORR med nivolumab + ipilimumab end med monoterapi med nivolumab uanset PD-L1-niveau.

Baseret på PD-L1-ekspressionsanalyser fra denne undersøgelse vil den største PFS-fordel med kombinationen af nivolumab + ipilimumab versus nivolumab alene muligvis være ved forholdet med <5% PD-L1-ekspression. PD-L1-ekspression kan anvendes som hjælpemiddel ved evalueringen af patienter, for hvem kombinationen af nivolumab med ipilimumab versus nivolumab som monoterapi overvejes, men denne information bør overvejes sammenholdt med alle tilgængelige kliniske oplysninger, idet der blev observeret klinisk betydningsfulde responser i PD-L1-ekspressionsundergrupper. I de forskellige PD-L1-ekspressionsniveauer oplevede den intent-to-treat-population, der fik kombinationen af nivolumab med ipilimumab, forbedret virkning sammenlignet med ipilimumab alene.

PFS Hazard Ratios (HR'er) og median PFS ud fra PD-L1-ekspressionsniveau er vist i tabel 20. Undersøgers vurderede ORR efter PD-L1-ekspressionsniveau vises i tabel 21.

Tabel 20: Sammenfatning af progressionsfri overlevelse ud fra PD-L1-niveau og behandlingsgruppe - Alle randomiserede forsøgspersoner med melanom – CA209067

Behandling

PD-L1-ekspressionsniveau

Antal hændelser/Antal

patienter

Median PFS i måned (95% CI)

HR vs. Ipilimumab (95% CI)

HR vs. nivolumab som monoterapi

(95% CI)

≥5% 28/68 13,96(9,72, NR) 0,39 (0,25, 0,62) 0,96 (0,58, 1,58)

<5% 103/210 11,24(7,98, NR) 0,42 (0,32, 0,54) 0,70 (0,54, 0,91)

≥1% 72/155 12,35(8,51, NR) 0,44 (0,32, 0,58) 0,95 (0,69, 1,31)

nivolumab +ipilimumab

<1% 59/123 11,17(6,93, NR) 0,38 (0,27, 0,53) 0,56 (0,40, 0,79)

≥5% 33/80 14,00(9,07, NR) 0,41 (0,26, 0,63) --

<5% 122/208 5,32(2,83, 7,06) 0,59 (0,47, 0,75) --

≥1% 79/171 12,39(8,11, NR) 0,46 (0,34, 0,61) -- nivolumab

<1% 76/117 2,83(2,76, 5,13) 0,67 (0,49, 0,92) --

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 22/23

≥5% 53/75 3,94 (2,79, 4,21) -- --

<5% 154/202 2,83 (2,76, 3,09) -- --

≥1% 122/164 3,91 (2,83, 4,17) -- -- ipilimumab

<1% 85/113 2,79 (2,66, 2,96) -- --

Forkortelser: CI = konfidensinterval, NR = ikke opnået, PFS = progressionsfri overlevelse

HR = Hazard ratio for behandlingseffekt baseret på "Cox proportional hazard"-model med interaktion mellem behandling, PD-L1-status og behandling med PD-L1-status

Tabel 21: Undersøgers vurderede ORR: Melanom-patienter med PD-L1-ekspression - PD-L1-testede forsøgspersoner - CA209067 ORR Behandling

PD-L1 Ekspressionsniveau

Antal patienter % [95% CI]

≥5% 68 72% (59,9, 82,3) <5% 210 55% (47,8, 61,6) ≥1% 155 65% (56,4, 72,0)

Nivolumab + ipilimumab

<1% 123 52% (42,8, 61,1) ≥5% 80 58% (45,9, 68,5) <5% 208 41% (34,6, 48,4) ≥1% 171 54% (46,6, 62,0)

Nivolumab

<1% 117 33% (24,9, 42,6) ≥5% 75 21% (12,7, 32,3) <5% 202 18% (12,8, 23,8) ≥1% 164 19% (13,2, 25,7)

Ipilimumab

<1% 113 19% (11,9, 27,0)

18. Fejlfinding Tabel 22: Fejlfinding Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpning

1a. Programmeringsfejl. 1a. Kontroller, at SK005 PD-L1 IHC 28-8 pharmDx-programmet er valgt til programmering af objektglas.

1b. Fravær af reaktion med DAB+ substratkromogenopløsning (DAB)

1b. Kontroller, at DAB+ substratkromogenopløsning blev klargjort korrekt.

1c. Natriumazid i vaskeopløsningen. 1c. Brug kun Dako Wash Buffer, kode K8007.

1. Ingen farvning af kontrol- eller præparatobjektglas

1d. Degraderet/nedbrudt kontrolobjektglas

1d. Kontroller sættets udløbsdato og opbevaringsbetingelserne, der er trykt på pakningen.

2a. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 2a. Sørg for, at der kun anvendes neutral bufret formalinfiksativ og kun anvendes godkendte fikseringsmetoder.

2b. Der er anvendt utilstrækkelig reagensvolumen

2b. Kontroller størrelsen af vævssnittet og anvendt reagensvolumen.

2. Svag farvning af præparatobjektglas.

2c. Der er anvendt en uegnet vaskebuffer

2c. Brug kun Dako Wash Buffer, kode K8007

3a. Utilstrækkelig target-retrieval. 3a. Kontroller, at 3-i-1-forbehandlingsproceduren blev udført korrekt.

3. Svag farvning af objektglas med præparat eller af positiv cellelinje på kontrolobjektglas leveret af Dako. 3b. Der er anvendt en uegnet

vaskebuffer. 3b. Brug kun Dako Wash Buffer, kode K8007

4a. Paraffinen er ikke helt fjernet. 4a. Kontroller, at 3-i-1-forbehandlingsproceduren blev udført korrekt.

4b. Objektglassene er tørret ud under indføringen i Autostainer Link 48.

4b. Sørg for, at objektglassene holdes våde med buffer under indføring, og inden kørslen igangsættes.

4c. Uspecifik reagensbinding til vævssnittet.

4c. Kontroller, om præparatet er fikseret korrekt, og/eller om der er nekrose til stede.

4. For megen baggrundsfarvning af objektglas.

4d. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 4d. Sørg for, at der kun anvendes neutral bufret formalinfiksativ og kun anvendes godkendte fikseringsmetoder.

5a. Der er brugt forkerte objektglas. 5a. Brug Dako FLEX IHC Microscope Slides (kode K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus-objektglas.

5. Vævet løsner sig fra objektglasset.

5b. Utilstrækkelig klargøring af præparater

5b. De skårne snit skal placeres i en 58 ± 2 °C varm ovn i 1 time inden farvning.

6a. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 6a. Sørg for, at der kun anvendes godkendte fikseringsvæsker og -metoder.

6. For kraftig specifik farvning.

6b. Der er anvendt en uegnet vaskebuffer.

6b. Brug kun Dako Wash Buffer, kode K8007.

7. Target-retrievalopløsning er uklar ved opvarmning.

7. Target-retrievalopløsning bliver uklar ved opvarmning.

7. Dette er normalt og påvirker ikke farvningen.

BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes teknisk support hos Dako for yderligere hjælp. Yderligere oplysninger om farvningsteknikker og klargøring af præparater findes i Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (15) (kan bestilles hos Dako).

19. Referencer 1. Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Targeting the PD-1/B7-H1 (PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol

2012; 24(2):207-212. 2. Wang C, Thudium KB, Han M, et al. In vitro characterization of the anti-PD-1 antibody nivolumab, BMS-936558, and in vivo

toxicology in non-human primates. Cancer Immunol Res 2014; 2(9):846-56. 3. OPDIVO® package insert. 4. YERVOY® package insert. 5. Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al. Nivolumab versus Docetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer. N Engl J

Med 2015; 10.1056/NEJMoa1507643. 6. Phillips T, Simmons P, Inzunza HD, et al. Development of an automated PD-L1 immunohistochemistry (IHC) assay for non-small cell

lung cancer. Appl Immuno Molec Morph 2015; 23(8):541-9. 7. Phelps RM, et al. NCI-navy medical oncology branch cell line data base. J. Cell. Biochem. 1996; 63: 32-91. 8. Weber JS, D’Angelo SP, Minor D, et al. Nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who progressed after

anti-CTLA-4 treatment (CheckMate 037): a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 2015; 16: 375–84. 9. Postow M, Chesney J, Pavlick A, et al. Nivolumab and ipilimumab versus ipilimumab in untreated melanoma. N Engl J Med. 2015;

372(21):2006-17. 10. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl

J Med. 2015; 373(1):23-34. 11. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. New Eng. J. Med.

2012; 366(26):2455-2465. 12. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for

the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976.

13. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Fourth Edition. CLSI document M29-A4 [ISBN 1-56238-962-9]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2014.

14. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Design Control and Implementation of Immunohistochemistry Assays; Approved guideline. CLSI document I/LA28-A2; Vol. 31 No. 4 (ISBN 1-56238-745-6) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA; 2011.

15. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.

16. Ferris RL, Blumenschein G, Fayette J, et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck, N Engl J Med. 2016: DOI: 10.1056/NEJMoa1602252.

17. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626.

Udgave 05/17

P03914DK_04/SK00521-2/2017-05 p. 23/23

pd-l1 ihc 28-8 pharmdx sk005 50 tests til anvendelse ... · pd-1 og ctla-4 hæmmer...

Documents