penetapan kadar histamin dalam produk · pdf filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan...

51
PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK PANGAN IKAN KALENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) DAN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh SITI AMINAH NIM : 20712319 (Program Studi Magister Farmasi) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2015

Upload: dangnhan

Post on 15-Feb-2018

278 views

Category:

Documents


12 download

TRANSCRIPT

Page 1: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK

PANGAN IKAN KALENGAN MENGGUNAKAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) DAN

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

TESIS

Karya tulis sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Magister dari

Institut Teknologi Bandung

Oleh

SITI AMINAH

NIM : 20712319

(Program Studi Magister Farmasi)

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2015

Page 2: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK

PANGAN IKAN KALENGAN MENGGUNAKAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) DAN

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Oleh

SITI AMINAH

NIM : 20712319

(Program Studi Magister Farmasi)

Institut Teknologi Bandung

Menyetujui

Tanggal Maret 2015

Pembimbing

(Dr.rer.nat. Sophi Damayanti)

Page 3: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

i

ABSTRAK

PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK PANGAN IKAN KALENGAN

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

DAN ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Oleh

Siti Aminah

NIM : 20712319

(Program Studi Magister Farmasi)

Latar belakang: Ikan penyebab keracunan karena pelepasan histamin umumnya berasal dari

famili ikan scombroidae seperti ikan tuna (Thunnus spp) dan mackerel (Scomber spp)

sehingga sering disebut Scombrotoxin Fish Poisoning (SFP). Selain itu, famili non-

scombroidae seperti sardine (Sardinella spp), salmon (Arripis truttaceus), tongkol, cakalang,

dan kembung juga menjadi penyebab SFP. Menurut Food and Drug Administration (FDA)

Amerika Serikat, keracunan histamin akan timbul jika seseorang mengkonsumsi ikan dengan

kandungan histamin 50 mg/100 g. Ikan dengan kandungan histamin lebih dari 20 mg/100 g

tidak boleh dikonsumsi. Penentuan konsentrasi histamin dalam produk pangan memerlukan

adanya suatu metoda analisa atau metoda uji yang terpercaya sesuai yang dipersyaratkan

dalam standar atau regulasi. Penelitian ini bertujuan untuk memverifikasi metode dan

menetapkan kadar histamin dalam produk pangan secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT) dan Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Metode: Metode analisis

histamin dalam sampel ikan kalengan menggunakan KCKT Agilent Infinity VWD 1260

series yang dilengkapi dengan kolom C18 Zorbax Eclipse Plus (4,6 x 100 mm, 5µm) dan

detektor ultraviolet 254 nm. Fase gerak merupakan campuran ammonium asetat 0,01 M -

asetonitril (6:4). Laju alir diatur pada 0,6 ml/menit dan suhu kolom 30 ºC. Sampel dipreparasi

dengan cara diderivatisasi terlebih dahulu dengan larutan benzoil klorida 2% dalam

asetonitril. Metode analisis dengan ELISA menggunakan kit Ridascreen® Histamin R-

Biopharm Art No. R1604 Lot. 12404. Hasil: Persamaan linier kurva kalibrasi untuk derivat

histamin dengan menggunakan metode KCKT adalah y = 284,9204 x + 673,5903, koefisien

korelasi r = 0,9961, batas deteksi 7,62 µg/g dan batas kuantisasi 23,09 µg/g. Presisi metode

diperoleh dengan nilai koefisien variansi adalah 1,62% sedangkan akurasi dilihat dari

perolehan kembali sebesar 86,26 – 92,39%. Kurva kalibrasi linier untuk metode ELISA

adalah y = -1,7269 x + 1,6450, koefisien korelasi r = -0,9927, batas deteksi 2,61 µg/g dan

batas kuantisasi 7,91 µg/g. Presisi metode ditunjukkan dengan nilai koefisien variansi 5,33%

dan akurasi dilihat dari perolehan kembali sebesar 81,32%. Berdasarkan hasil yang diperoleh,

dapat disimpulkan bahwa kedua metode dapat digunakan untuk penetapan kadar histamin

dalam sampel ikan kalengan. Kadar histamin dalam sampel menggunakan metode KCKT

sebesar 95,65±1,55 µg/g dan kadar histamin menggunakan metode ELISA sebesar 80,32±4,28

µg/g.

Kata kunci : Scombrotoxin Fish Poisoning (SFP), histamin, KCKT, ELISA, ikan kalengan.

Page 4: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

ii

ABSTRACT

DETERMINATION OF HISTAMINE IN CANNED FISH PRODUCTS USING

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) AND

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) METHOD

by

Siti Aminah

NIM : 20712319

(Master Program of Pharmacy)

Background: Fish poisoning due to the release of histamine generally come from families

scombroidae fish such as tuna (Thunnus spp) and mackerel (Scomber spp), so called

Scombrotoxin Fish Poisoning (SFP). In addition, families of non-scombroidae such as sardine

(Sardinella spp), salmon (Arripis truttaceus), skipjack, and „kembung‟ also commonly known

as a cause of SFP. According to the United States of Food and Drug Administration (FDA),

consumption of histamine in 50 mg/100 g fish will cause poisoning. Therefore, level of

histamine more than 20 mg/100 g has forbidden to be consumed. Determination of histamine

in food products requires a methods in accordance to the regulation. This study was aimed to

verify and determine histamine in canned fish products by High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) and Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods.

Method: Histamine in canned fish samples were analyzed using HPLC Agilent 1260 Infinity

Series VWD with Zorbax Eclipse Plus C18 column (4.6 x 100 mm, 5μm) and ultraviolet

detector of 254 nm. Mobile phase was consisted of mixture of 0,01 M ammonium acetate-

acetonitrile (6:4). Flow rate was adjusted at 0.6 mL min-1

and column temperature was

maintained at 30 ºC. Samples were prepared using derivatization with 2% solution of benzoyl

chloride in acetonitrile. ELISA analysis was carried out using instrument Histamine

Ridascreen® R-Biopharm Art No. R1604. Lot.12404. Result: Calibration curve of histamine

using HPLC method showed the regression equation of y = 284.9204 x + 673.5903 and

correlation coefficient of r = 0.9961. The limits of detection and limit of quantitation, were

7.62 and 23.09 µg g-1

, respectively. The precision of the method was shown in coefficient of

variance value of 1.62% whereas accuracy was in value of recoveries of histamine standard

addition from canned fish samples of 86.26 to 92.39%. Calibration curve for determination of

histamine using ELISA method showed the regression equation of y = -1.7269 x + 1.6450 and

correlation coefficient of r = -0.9927. The limits of detection and limit of quantitation, were

2.61 and 7.91 µg g-1

, respectively. The precision of the method was in coefficient of variance

value of 5.33% whereas it‟s accuracy was 81.32% of recovery. Based on the results, it was

concluded that the proposed method can be applied for determination of histamine in canned

fish samples. Concentration of histamine in sample using HPLC and ELISA method was

95.65±1,55 µg/g and 80.32±4,28 µg/g respectively.

Keywords : Scombrotoxin Fish Poisoning (SFP), histamine, High Performance Liquid

Chromatography, Enzyme Linked Immunosorbent Assay, canned fish.

Page 5: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

iii

PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS

Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut

Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta

ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut

Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi

pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus

disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya.

Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin

Dekan Sekolah Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.

Page 6: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

iv

Dipersembahkan untuk ibundaku tercinta Djedje Sangkidjenab,

suamiku tersayang Yana Supriatna,

serta kedua putraku Canra Aliffian dan Thoriq Maulana Adzra

Page 7: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

v

KATA PENGANTAR

Bismillaahirrohmaanirrohiim..

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang Maha luas

ilmu-Nya, atas limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga buku tesis yang

berjudul “Penetapan Kadar Histamin dalam Produk Pangan Ikan Kalengan

menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan Enzyme

Linked Immunosorbent Assay (ELISA)” ini dapat diselesaikan dengan baik. Tesis

ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Master Sains dari

Program Studi Magister Farmasi, Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung.

Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ungkapan rasa terimakasih

yang sebesar-besarnya kepada yang terhormat :

1. Ibu Dr.rer.nat. Sophi Damayanti, selaku pembimbing utama yang telah

memberikan bimbingan dan pengarahan untuk menyelesaikan tesis ini.

2. Pimpinan dan seluruh staf Balai Besar POM di Bandung, khususnya staf

Laboratorium Pengujian Pangan dan Bahan Berbahaya BBPOM Bandung.

3. Suamiku tercinta Yana Supriatna serta kedua anakku Canra Aliffian dan Thoriq

Maulana Adzra atas dukungan dan doanya.

4. Yang tercinta ibunda Djedje Sangkidjenab dan keluarga besar yang telah

memberikan bantuan moril, doa, dan juga dorongan selama melakukan

penelitian ini.

5. Teman-teman seperjuangan Kelompok Keilmuan Farmakokimia-Badan POM

RI Tahun 2013 atas segala bantuan, dukungan dan kerjasamanya.

6. Semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan penelitian ini.

Dengan segala kerendahan hati dan keterbatasan penulis, penulis mengharapkan

tesis ini bisa bermanfaat bagi kita semua.

Februari, 2015

Penulis

Page 8: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

vi

DAFTAR ISI

ABSTRAK ..................................................................................................... i

ABSTRACT ................................................................................................... ii

PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS ...........................................................

LEMBAR PERSEMBAHAN ........................................................................

KATA PENGANTAR ...................................................................................

DAFTAR ISI ..................................................................................................

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................

DAFTAR TABEL ..........................................................................................

Bab I Pendahuluan ......................................................................................

I.1 Latar Belakang ...............................................................................

I.2 Tujuan Penelitian ...........................................................................

I.3 Manfaat Penelitian .........................................................................

Bab II Tinjauan Pustaka ................................................................................

II.1 Definisi Pangan .............................................................................

II.2 Definisi Ikan Kalengan .................................................................

II.3 Skombrotoksin ............................................................................

II.4 Histamin .......................................................................................

II.4.1 Absorpsi, Distribusi, Metabolisme dan Ekskresi ................

II.4.2 Mekanisme Kerja dan Toksisitas ........................................

II.4.3 Intoleransi Histamin ............................................................

II.5 Metode Analisis Histamin ............................................................

II.5.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ........................

II.5.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) .................

II.6 Verifikasi Metode Analisis ...........................................................

II.6.1 Linieritas .............................................................................

II.6.2 Batas Deteksi dan Batas Kuantisasi ....................................

II.6.3 Akurasi ................................................................................

II.6.7 Presisi ..................................................................................

iii

iv

v

vi

viii

ix

1

1

3

4

5

5

5

5

8

9

10

11

12

12

13

14

14

15

16

16

Page 9: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

vii

Bab III Metodologi Penelitian .....................................................................

III.1 Penetapan dengan Metode KCKT ..................................................

III.2 Penetapan dengan Metode ELISA .................................................

III.3 Verifikasi Metode Analisis .............................................................

Bab IV Percobaan ........................................................................................

IV.1 Bahan ...........................................................................................

IV.2 Alat .............................................................................................

IV.3 Tahapan Penelitian .......................................................................

IV.3.1 Penetapan dengan Metode KCKT ........................................

IV.3.2 Penetapan dengan Metode ELISA .......................................

IV.3.3 Verifikasi Metode Analisis ..................................................

Bab V Hasil dan Pembahasan ......................................................................

V.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ....................................

V.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ...........................

Bab VI Kesimpulan dan Saran ......................................................................

VI.1 Kesimpulan ....................................................................................

VI.2 Saran ...............................................................................................

DAFTAR PUSTAKA.....................................................................................

18

18

18

18

19

19

19

19

19

21

22

24

24

31

36

36

36

37

Page 10: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

viii

DAFTAR GAMBAR

Gambar II.1 Sintesis Histamin ........................................................... 8

Gambar II.2

Gambar II.3

Struktur Molekul Histamin ............................................

Prinsip Reaksi Enzim Immunoassay Kompetitif ...........

9

14

Gambar V.1 Reaksi Asil Klorida dengan Amina Primer......................

24

Gambar V.2 Kromatogram Derivat Histamin.....................................

27

Gambar V.3 Kurva Kalibrasi Derivat Histamin .................................

29

Gambar V.4 Kurva Baku Seri Histamin Hasil Percobaan .................

32

Gambar V.5 Kurva Baku Seri Histamin dari Quality Assurance

Certificate (QAC)......................................................... ...

33

Gambar V.6 Kurva Kalibrasi Histamin ................................................ 33

Page 11: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

ix

DAFTAR TABEL

Tabel V.1 Kondisi Sistem KCKT............................................................

26

Tabel V.2 Data Hasil Uji Kesesuaian Sistem Larutan Derivat Histamin

Konsentrasi 14,31 ppm...........................................................

28

Tabel V.3 Konsentrasi dan Luas Area Baku Seri Derivat Histamin........

29

Tabel V.4 Presisi Derivat Histamin dalam Produk Ikan Kalengan ........

30

Tabel V.5 Akurasi Derivat Histamin dalam Produk Ikan Kalengan ......

31

Tabel V.6 Konsentrasi dan Absorbansi Baku Seri N-Asil Histamin.......

32

Tabel V.7 Presisi Metode Penetapan Kadar Histamin dalam Produk

Ikan Kalengan ........................................................................

34

Tabel V.8 Akurasi Metode Penetapan Kadar Histamin dalam Produk

Ikan Kalengan.........................................................................

35

Page 12: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

1

BAB I PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang Masalah

Scombrotoxin Fish Poisoning (SFP) sering disebut keracunan histamin yang

berasal dari famili ikan scombroidae seperti ikan tuna (Thunnus spp), bonito

(Sarda spp), mackerel (Scomber spp), skipjack (Katsuwonus polamis), dan mahi-

mahi (varietas ikan lumba-lumba). Tetapi famili non-scombroidae seperti sardine

(Sardinella spp), ikan herring (Clupea spp) salmon (Arripis truttaceus), tongkol,

cakalang, kuwik dan kembung juga menjadi penyebab SFP. Jenis ikan ini

mengandung sejumlah histidin bebas yang tinggi dalam jaringannya, sementara

bakteri tertentu mempunyai enzim histidine decarboxylase, yaitu enzim yang

mampu memecah histidin menjadi histamin. Enzim histidine decarboxylase dapat

ditemukan pada bakteri Enterobacteriaceae, Clostridium, Lactobacillus, Vibrio,

Pseudomonas dan Photobacterium. Pembentukan zat beracun ini dapat terjadi

baik pada ikan yang sudah dimasak termasuk ikan yang diawetkan dengan cara

pengasapan dan pengalengan maupun ikan yang masih mentah karena tidak

segera ditangani, misalnya ikan sudah terlalu lama ditangkap dan tidak segera

dibekukan atau ikan yang tidak segera diolah (Arisman, 2009).

Menurut Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat, keracunan

histamin akan timbul jika seseorang mengonsumsi ikan dengan kandungan

histamin 50 mg/100 g ikan. Ikan dengan kandungan histamin lebih dari 20

mg/100 g ikan sudah tidak boleh dikonsumsi.

Histamin [2-(1 H -imidazol-4-yl)ethanamine] merupakan zat endogen yang

terjadi secara alami dalam tubuh manusia yang berperan sebagai mediator reaksi-

reaksi alergi dan reaksi inflamasi, serta sekresi asam lambung. Histamin adalah

neurotransmitter yang terlibat dalam respon imun lokal, disintesis dari histidin

dengan adanya enzim histidine decarboxylase, bisa diinaktifkan secara cepat oleh

enzim histamine N-methyltransferase dan diamine oxidase (Maintz, dkk., 2007).

Histamin berinteraksi dengan reseptor spesifik pada berbagai jaringan target.

Reseptor histamin ditemukan pada sel basofil, sel mast, neutrofil, eosinofil,

limfosit, makrofag, sel epitel dan endotel. Histamin dilepaskan dari sel mast

Page 13: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

2

sebagai hasil reaksi antigen-antibodi IgE yang merupakan hasil respon terhadap

senyawa asing dalam tubuh. Senyawa allergen dapat berupa spora, debu rumah,

sinar UV, cuaca, racun, tripsin, dan enzim proteolitik lain, deterjen, zat warna,

obat makanan dan beberapa turunan amina (Joint FAO/WHO, 2012).

Histamin endogen diperlukan untuk fungsi fisiologis normal, tetapi histamin

dengan dosis besar beracun karena masuk ke sistem peredaran darah. Hal ini

sering menyebabkan gejala keracunan, yang melibatkan berbagai organ. Dampak

histamin melalui aktivasi dari empat jenis reseptor histamin (H1, H2, H3 dan H4)

dalam membran sel. Reseptor histamin ini diekspresikan pada tipe sel yang

berbeda dan bekerja melalui jalur sinyal yang berbeda, sehingga dalam beberapa

respons biologis. Histamin dapat meningkatkan vasopermeabilitas dan

vasodilatasi sehingga menyebabkan urtikaria, flushing, hipotensi dan sakit kepala.

Histamin juga menginduksi kontraksi otot polos usus, menyebabkan kram perut,

diare dan muntah (Joint FAO/WHO, 2012).

Berbagai metode pengujian yang ada untuk penentuan kadar histamin pada ikan,

termasuk metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) telah diusulkan.

Setelah ekstraksi amina langkah derivatisasi diperlukan, dapat dilakukan sebelum

atau sesudah pemisahan kolom, derivatif utama yang digunakan adalah o-

phthaldialdehyde (OPA), dansil klorida, dan benzoil klorida. Metode derivatisasi

dengan agen fluorogenik memiliki beberapa keterbatasan, yaitu memerlukan

pemisahan amina sebelum derivatisasi karena derivatif fluorogenik yang tidak

selektif. Oleh karena itu, reagen asil klorida, seperti tosyl-dansil, atau benzoil

klorida, lebih disukai untuk derivatisasi amina biogenik. Di antara reagen ini,

benzoil klorida memiliki keuntungan, karena derivatisasi dan waktu elusi yang

pendek, struktur kimia yang sederhana, dan relatif murah (Ozogul, dkk., 2002,

Ozdestan, dkk., 2009).

Metode Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) juga dapat dikembangkan

untuk pengukuran histamin dalam makanan. Prinsipnya berdasarkan kompetisi

antara antigen yang terdapat dalam sampel dengan enzim berlabel kemudian

Page 14: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

3

enzim dan antigen bersaing dengan binding-site antibodi yang dilapisi ke dalam

well. Setelah inkubasi, well dicuci untuk menghentikan reaksi kompetisi. Setelah

substrat bereaksi, intensitas warna diukur dimana intensitasnya berbanding

terbalik dengan jumlah antigen dalam sampel. Hasil dapat ditentukan langsung

menggunakan kurva kalibrasi standar (Muscarella, dkk., 2005, Muscarella, dkk.,

2013).

Badan POM mempunyai visi menjadi Institusi Pengawas Obat dan Makanan yang

inovatif, kredibel dan diakui secara internasional untuk melindungi masyarakat,

serta salah satu misinya yaitu memberdayakan masyarakat agar mampu

melindungi diri dari obat dan makanan yang berisiko terhadap kesehatan. Untuk

mewujudkan visi dan misi tersebut, Badan POM melakukan pengawasan Pre

Market dan Post Market secara internasional. Salah satu perangkat pendukung

pengawasan tersebut adalah adanya suatu metoda analisa atau metoda uji yang

valid dan handal sesuai yang dipersyaratkan dalam standar atau regulasi sehingga

dapat menentukan konsentrasi suatu zat atau racun dalam produk pangan.

Hingga saat ini metoda analisa penetapan kadar histamin dalam produk pangan

hanya menggunakan metode ELISA. Metode ini merupakan salah satu metode

skrining yang cepat namun memiliki kendala antara lain ketersediaan alat ini di

sebagian besar Balai/Balai Besar POM di seluruh Indonesia yang masih sedikit

sehingga diperlukan suatu metoda analisa lain yang kuantitatif, mudah, dan dapat

diaplikasikan di Balai/Balai Besar POM di seluruh Indonesia, sementara itu,

instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) tersedia di Balai/Balai

Besar POM di seluruh Indonesia. Hasil penelitian dengan melakukan metoda

analisa ELISA dan KCKT diharapkan memiliki tingkat validitas dengan presisi

dan akurasi yang baik.

I.2 Tujuan Penelitan

Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar histamin dalam produk pangan

secara ELISA dan KCKT. Dengan terujinya metode analisa penetapan kadar

histamin dalam produk pangan secara ELISA dan KCKT maka diharapkan

Page 15: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

4

metode yang valid diantara kedua metode tersebut dapat diterapkan dalam

pemeriksaan terhadap berbagai jenis sampel pangan untuk pengujian rutin di

Laboratorium Balai/Balai Besar POM di seluruh Indonesia.

I.3 Manfaat Penelitian

Metode ELISA merupakan salah satu metode skrining yang cepat namun

memiliki kendala antara lain ketersediaan alat ini di sebagian besar Balai/Balai

Besar POM di seluruh Indonesia yang masih sedikit sedangkan metode KCKT

bisa dijadikan metode analisa alternatif yang kuantitatif, mudah, dan dapat

diaplikasikan di Balai/Balai Besar POM di seluruh Indonesia. Dengan

diketahuinya metode analisa penetapan kadar histamin dalam produk pangan

secara ELISA dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) maka diharapkan

metode yang valid di antara kedua metode tersebut dapat diterapkan dalam

pemeriksaan terhadap berbagai jenis sampel pangan untuk pengujian rutin di

Laboratorium Balai/Balai Besar POM di seluruh Indonesia.

Page 16: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Definisi Pangan

Pangan menurut Undang-Undang No. 7 Tahun 1996 tentang Pangan adalah segala

sesuatu yang berasal dari sumber hayati dan air, baik yang diolah maupun tidak

diolah, yang diperuntukkan sebagai makanan atau minuman bagi konsumsi

manusia, termasuk bahan tambahan pangan, bahan baku pangan, dan bahan lain

yang digunakan dalam proses penyiapan, pengolahan, dan atau pembuatan

makanan atau minuman. Sedangkan pangan olahan menurut Undang-Undang No.

7 Tahun 1996 tentang Pangan adalah makanan atau minuman hasil proses dengan

cara atau metode tertentu dengan atau tanpa bahan tambahan.

II.2 Definisi Ikan Kalengan

Yang dimaksud dengan ikan kalengan menurut Kategori Pangan Badan POM RI

Tahun 2006 adalah produk yang diperoleh dari ikan segar atau potongan ikan

segar dan dihilangkan isi perutnya, dicuci dengan air bersih, disusun dalam

kaleng, dengan atau tanpa diberi media, dengan atau tanpa bumbu-bumbu atau

bahan lainnya, kemudian dikemas secara kedap (hermetis) dan disterilisasi atau

dipasteurisasi dengan cara pemanasan.

II.3 Skombrotoksin

Scombrotoxin Fish Poisoning (SFP) sering disebut keracunan histamin yang

berasal dari famili ikan scombroidae seperti ikan tuna (Thunnus spp), bonito

(Sarda spp), mackerel (Scomber spp), skipjack (Katsuwonus polamis), dan mahi-

mahi (varietas ikan lumba-lumba). Tetapi famili non-scombroidae seperti sardine

(Sardinella spp), ikan herring (Clupea spp) salmon (Arripis truttaceus), tongkol,

cakalang, kuwik dan kembung juga menjadi penyebab SFP. Jenis ikan ini

mengandung sejumlah histidin bebas yang tinggi dalam jaringannya, sementara

bakteri tertentu mempunyai enzim histidine decarboxylase, yaitu enzim yang

mampu memecah histidin menjadi histamin. Enzim histidine decarboxylase dapat

ditemukan pada bakteri Enterobacteriaceae, Clostridium, Lactobacillus, Vibrio,

Pseudomonas dan Photobacterium (Joint FAO/WHO, 2012). SFP merupakan

Page 17: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

6

masalah keamanan pangan di seluruh dunia dan menjadi penyebab umum dari

keracunan ikan yang terjadi pada manusia. Keracunan makanan disebabkan

scombrotoksin yang stabil terhadap panas, timbul dari kerja bakteri pada ikan.

Meskipun komponen skombrotoksin belum teridentifikasi, umumnya terdapat

amina biogenik, terutama histamin, memainkan peran penting dalam patogenesis

SFP. Ikan yang dicurigai mengandung histamin tingkat tinggi akibat dari aktivitas

bakteri karena kondisi penanganan, pengolahan atau penyimpanan yang tidak

layak.

Berbagai gejala SFP telah diamati di antara manusia, seperti urtikaria, hipotensi,

sakit kepala, diare, muntah, dan lain-lain. Keracunan individu mungkin

menunjukkan satu atau lebih dari gejala-gejala ini, dan tingkat keparahan respon

terhadap ikan yang terkontaminasi dapat bervariasi. Rasa mual dengan atau tanpa

muntah/diare, rasa terbakar pada tenggorokan, bibir bengkak, sakit kepala, muka

dan leher kemerah-merahan, kulit gatal dan badan lemas adalah gejala yang

timbul akibat keracunan histamin. Gejala biasanya berkembang cepat (dari 5

menit sampai 2 jam setelah konsumsi ikan), dengan durasi 8-12 jam dan dengan

gejala biasanya tidak lagi diamati setelah 24 jam.

Diagnosis SFP sebagian besar tergantung pada gejala, waktu onset, riwayat alergi

makanan dan konsumsi ikan yang terkontaminasi. Diagnosis dapat

dikonfirmasikan dengan mendeteksi tingkat histamin yang tinggi dalam makanan,

sisa-sisa makanan atau produk serupa yang diperoleh dari sumber yang sama

(Joint FAO/WHO, 2012).

Pengobatan antihistamin adalah terapi optimal untuk SFP. Gejala biasanya mereda

dengan cepat setelah pengobatan tersebut. Kedua antagonis H1 (misalnya

diphenhydramine) dan antagonis H2 (misalnya simetidin) telah digunakan untuk

pengobatan keracunan histamin. Mengingat bahwa gejala dapat sembuh dalam

waktu yang cukup singkat, intervensi farmakologis mungkin tidak diperlukan

dalam kasus ringan dan pasien hanya memerlukan dukungan pemeliharaan

(misalnya penggantian cairan) (Joint FAO/WHO, 2012).

Page 18: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

7

Histamin adalah penyebab signifikan dari SFP. Hal ini dibuktikan pada pasien

keracunan histamin terdapat tingkat histamin yang tinggi dalam darah atau urin,

dan obat antihistamin dapat efektif mengurangi gejala. Histamin ternyata bukan

merupakan faktor tunggal penyebab keracunan. Biogenik amin lain, misal

kadaverina dan putresin dalam daging ikan dapat memperkuat efek toksik

histamin. Penguatan efek ini terjadi karena adanya hambatan kerja enzim yang

memetabolisme histamin, yaitu enzim diamine oxidase atau histaminase dan

histamine N-methyltransferase (Joint FAO/WHO, 2012, Maintz, dkk., 2007).

Ikan penyebab keracunan histamin biasanya mengandung histidin bebas dalam

jumlah tinggi (kadar histidin bebas lebih dari 1%). Kandungan histamin pada

ikan segar/sehat adalah kurang dari 0,1 mg/gram ikan, sedangkan bila ikan

diletakkan pada suhu kamar, histamin akan meningkat dengan cepat mencapai 1

mg/gram ikan dalam waktu 24 jam. Histamin tidak membahayakan jika

dikonsumsi dalam jumlah yang rendah, yaitu 8 mg/100 g ikan. Menurut Food and

Drug Administration (FDA) Amerika Serikat, keracunan histamin akan timbul

jika seseorang mengkonsumsi ikan dengan kandungan histamin 50 mg/100 g ikan.

Ikan dengan kandungan histamin lebih dari 20 mg/100 g ikan sudah tidak boleh

dikonsumsi. Gejala keracunan akan terjadi jika mengkonsumsi ikan dengan

kandungan histamin tinggi (lebih dari 70 mg/100 gr ikan). Tampilan ikan yang

telah mengandung racun biasanya tidak berubah dan tidak menunjukan tanda

pembusukan.

Histamin bersifat stabil selama pemanasan dan pembekuan. Sehingga, jika ikan

yang mengandung histamin dalam jumlah tinggi diolah lebih lanjut menjadi

produk olahan ikan, baik dalam bentuk ikan beku, ikan yang telah dimasak,

dikuring atau dikalengkan maka produk akhir yang dihasilkan akan tetap

mengandung histamin dalam jumlah tinggi. Kadar histamin dalam ikan kaleng

bisa sebesar 68 sampai 280 mg/100 g. Karena itu tidak mengherankan jika

keracunan histamin bisa tetap terjadi padahal ikan telah dimasak dengan sempurna

(Arisman, 2009).

Page 19: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

8

II.4 Histamin

Histamin merupakan zat endogen yang terjadi secara alami dalam tubuh manusia

yang berperan sebagai mediator reaksi-reaksi alergi dan reaksi inflamasi, serta

sekresi asam lambung. Histamin adalah neurotransmitter yang terlibat dalam

respon imun lokal, disintesis dari histidin dengan adanya enzim histidine

decarboxylase, bisa diinaktifkan secara cepat oleh enzim histamine N-

methyltransferase dan diamine oxidase (Maintz, dkk., 2007).

Histidin Histamin

Gambar II.1 Sintesis Histamin

Histamin berinteraksi dengan reseptor spesifik pada berbagai jaringan target.

Reseptor histamin ditemukan pada sel basofil, sel mast, neutrofil, eosinofil,

limfosit, makrofag, sel epitel dan endotel. Histamin dilepaskan dari sel mast

sebagai hasil reaksi antigen-antibodi IgE yang merupakan hasil respon terhadap

senyawa asing/allergen dalam tubuh. Senyawa allergen dapat berupa spora, debu

rumah, sinar UV, cuaca, racun, tripsin, dan enzim proteolitik lain, deterjen, zat

warna, obat makanan dan beberapa turunan amina.

Histamin terdapat dalam makanan tertentu yang mengandung histidin bebas dan

dihasilkan oleh bakteri tertentu selama pembusukan dan fermentasi ikan.

Makanan kaya histamin dapat menyebabkan intoleransi pada individu yang

sensitif dan kontaminasi histamin pada ikan dan produk ikan dapat menyebabkan

keracunan makanan (Joint FAO/WHO, 2012).

Histamin dapat menimbulkan efek bila berinteraksi dengan reseptor

histaminergik, yaitu reseptor histamin 1 (H1), histamin 2 (H2), histamin 3 (H3) dan

histamin 4 (H4). Interaksi histamin dengan reseptor H1 menyebabkan interaksi

otot polos usus dan bronki, meningkatkan permeabilitas vaskular dan

meningkatkan sekresi usus, yang dihubungkan dengan peningkatan cGMP dalam

L-histidine

decarboxylase

HOOC

Page 20: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

9

sel. Interaksi dengan reseptor H1 juga menyebabkan vasodilatasi arteri sehingga

permeabel terhadap cairan dan plasma protein yang menyebabkan sembab,

pruritik, dermatitis dan urtikaria. Efek ini di blok oleh antagonis H-1. Interaksi

histamin dengan reseptor H2 dapat meningkatkan sekresi asam lambung dan

kecepatan kerja jantung. Produksi asam lambung di sebabkan penurunan cGMP

dalam sel dan peningkatan cAMP. Peningkatan sekresi asam lambung dapat

menyebabkan tukak lambung. Efek ini di blok oleh antagonis H2. Reseptor H3

adalah reseptor histamin yang terletak pada ujung syaraf jaringan otak dan

jaringan perifer yang mengontrol sintesis dan pelepasan histamin, mediator alergi

lain dan peradangan. Efek ini di blok antagonis H3. Reseptor H4 banyak terdapat

pada sel basofil dan sumsum tulang. Juga ditemukan pada kelenjar timus, usus

halus, limfa dan usus besar.

Gambar II.2 Struktur Molekul Histamin

(Chemdraw 8.0)

Histamin dengan rumus kimia C5H9N3 atau 2-(1 H -imidazol-4-yl)ethanamine

berbentuk higroskopis, kristal berwarna, yang mencair pada 84°C, dan mudah

larut dalam air atau etanol, tetapi tidak dalam eter.

Histamin memiliki dua dasar pusat, yaitu alifatik gugus amino dan atom nitrogen

dari cincin imidazol yang sudah memiliki proton. Dalam kondisi fisiologis, gugus

amino alifatik (memiliki pKa sekitar 9,4) akan terprotonasi, sedangkan nitrogen

kedua cincin imidazol (pKa sekitar 5,8) tidak akan terprotonasi. Dengan demikian,

histamin biasanya terprotonasi sebagai kation tunggal (Paiva, dkk., 1970).

II.4.1 Absorpsi, Distribusi, Metabolisme dan Ekskresi

Subyek manusia dapat mentolerir hingga 180 mg histamin murni tanpa harus ada

efek nyata, sedangkan pemberian intravena 0,007 mg histamin menghasilkan

vasodilatasi dan peningkatan denyut jantung. Perbedaan ini menunjukkan bahwa

histamin tidak efisien diserap oleh tubuh karena adanya enzim dalam saluran usus

Page 21: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

10

yang mencegah penyerapan histamin ke dalam sistem peredaran darah (Joint

FAO/WHO, 2012).

Pada manusia dan hewan percobaan, histamin terutama dimetabolisme oleh enzim

diamin oksidase (DAO) dan histamin-N-methyltransferase (HMT). DAO

mengkonversi histamin menjadi asam asetat imidazol, yang dapat terkonjugasi

dengan ribosa sebelum diekskresikan. HMT mengkonversi histamin ke

methylhistamine, yang kemudian diubah oleh monoamine oxidase (MAO)

menjadi asam asetat N-imidazol. Produk akhir utama metabolisme histamin

diekskresikan dalam urin (Maintz, dkk., 2007).

II.4.2 Mekanisme Kerja dan Toksisitas

Dampak histamin melalui aktivasi dari empat jenis reseptor histamin (H1, H2, H3

dan H4) dan/atau dalam membran sel. Reseptor histamin ini diekspresikan pada

tipe sel yang berbeda dan bekerja melalui jalur sinyal yang berbeda, sehingga

dalam beberapa respons biologis. Misalnya, histamin meningkatkan

vasopermeabilitas dan vasodilatasi, menyebabkan urtikaria, flushing, hipotensi

dan sakit kepala. Histamin juga menginduksi kontraksi otot polos usus,

menyebabkan kram perut, diare dan muntah.

Histamin endogen diperlukan untuk fungsi fisiologis normal, tetapi histamin

dengan dosis besar beracun karena masuk ke sistem peredaran darah. Hal ini

sering menyebabkan gejala keracunan, yang melibatkan berbagai organ. Efek

toksikologi histamin adalah berkaitan dengan tindakan fisiologis normal dalam

tubuh dan meliputi berikut ini :

Dilatasi pembuluh darah perifer, terutama arteri, mengakibatkan hipotensi,

flushing dan sakit kepala. Histamin juga menyebabkan peningkatan permeabilitas

kapiler, sehingga gejala seperti edema, urtikaria, haemoconcentration dan

peningkatan viskositas darah. Syok dapat terjadi akibat dari pemberian histamin

dengan dosis yang sangat tinggi. Efek pada permeabilitas kapiler dimediasi oleh

reseptor H1 dan H2 (Joint FAO/WHO, 2012).

Page 22: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

11

Histamin menstimulasi langsung pada jantung. Histamin meningkatkan

kontraktilitas jantung dan meningkatkan laju dan kekuatan kontraksi. Efek

histamin pada jantung menjelaskan palpitasi oleh beberapa orang yang mengalami

keracunan histamin. Histamin dapat menyebabkan kontraksi atau relaksasi otot

polos ekstravaskuler. Kontraksi dimediasi oleh reseptor H1, sedangkan relaksasi

dikaitkan dengan reseptor H2 (Shahid, dkk., 2009).

Pada manusia, histamin dapat menyebabkan kontraksi pada otot polos

ekstravaskular. Kontraksi otot polos ini paling sering terjadi dalam bronkus dan

usus. Pada keracunan histamin, kontraksi otot polos usus sangat jelas, karena

awalnya histamin memasuki saluran pencernaan. Kontraksi otot polos usus

menyebabkan kram perut, diare dan muntah yang sering dicatat dalam kasus

keracunan histamin.

Histamin juga merupakan stimulan yang kuat dari kedua neuron sensorik dan

motorik. Stimulasi ini mungkin penting dalam memproduksi rasa sakit dan gatal

yang sering menyertai lesi urtikaria akibat keracunan histamin. Stimulasi saraf ini

dimediasi oleh reseptor H1 (Joint FAO/WHO, 2012, Nuutinen, dkk., 2010).

II.4.3 Intoleransi Histamin

Intoleransi Histamin adalah jenis intoleransi makanan dengan gejala seperti alergi.

Hal ini terjadi ketika makanan kaya histamin, seperti keju dan anggur, yang

dikonsumsi oleh individu yang rentan. Histamin yang tertelan tidak dapat

terdegradasi secara efisien dalam saluran gastrointestinal. Menghasilkan

pembentukan histamin yang menyebabkan serangkaian sistem efek racun yang

mirip dengan alergi terhadap makanan yang umum, seperti pembengkakan, ruam,

gatal-gatal, dan gejala asma seperti kesulitan dalam bernapas, mengi dan kontraksi

otot polos. Makanan kaya histamin yang sama tidak akan menyebabkan reaksi-

reaksi ini untuk individu yang tidak rentan. Kondisi ini bisa menjelaskan variasi

antara kerentanan individu untuk diet histamin akibat dekomposisi ikan. Individu

dengan intoleransi histamin disarankan untuk diet bebas histamin (Joint

FAO/WHO, 2012).

Page 23: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

12

II.5 Metode Analisis Histamin

Berbagai metode pengujian yang ada untuk penentuan kadar histamin pada ikan,

termasuk Association of Analytical Communities (AOAC) metode fluorometri

(AOAC 977,13), metode spektrofluorometri, metode enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA), tes kolorimetri enzim dan metode kromatografi

cair kinerja tinggi (KCKT) yang dapat mengukur beberapa amina biogenik

(Etienne, dkk., 2006). Sementara masing-masing metode memiliki kelebihan dan

keterbatasan dari segi biaya, keahlian operator, waktu untuk memperoleh hasil,

dan lain-lain. Metode yang paling baik dan handal dalam mengukur histamin

dalam makanan laut menurut Standar Codex adalah metode fluorometri (AOAC

977,13) atau metode ilmiah lainnya yang setara dan divalidasi.

II.5.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi merupakan teknik pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu

sampel yang dibawa fase gerak melewati fase diam (dapat berbentuk padat atau

cairan). Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah kromatografi cair kolom

modern, dimana teori dasarnya bukan baru tapi hasil pengembangan dari

kromatografi cair kolom klasik. Kemajuan dalam teknologi kolom, pompa

tekanan tinggi dan detektor yang peka telah menyebabkan perubahan

kromatografi cair kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Pada KCKT diperkenalkan penggunaan fase diam yang berdiameter kecil dalam

kolom yang efisien. Teknologi kolom partikel kecil (3-5 µm) ini memerlukan

sistem pompa bertekanan tinggi yang mampu mengalirkan fase gerak dengan

tekanan tinggi agar tercapai laju aliran 1-2 ml/menit. Oleh karena sampel yang

digunakan sangat kecil (< 20µg) maka diperlukan detektor yang sangat. Dengan

teknologi ini, pemisahan berlangsung sangat cepat dengan daya pisah sangat

tinggi.

Selama bertahun-tahun sejumlah metode KCKT yang berbeda telah diusulkan.

Setelah ekstraksi amina langkah derivatisasi diperlukan, dapat dilakukan sebelum

atau sesudah pemisahan kolom, derivatif utama yang digunakan adalah o-

phthaldialdehyde (OPA), dansil klorida dan benzoil klorida. Metode derivatisasi

Page 24: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

13

dengan agen fluorogenik memiliki beberapa keterbatasan, yaitu memerlukan

pemisahan amina sebelum derivatisasi karena derivatif fluorogenik menghasilkan

resolusi yang kurang bagus. Oleh karena itu, reagen asil klorida, seperti tosyl-

dansil, atau benzoil klorida, lebih disukai untuk derivatisasi amina biogenik

(Etienne, dkk., 2006). Di antara reagen ini, benzoil klorida memiliki keuntungan,

karena derivatisasi dan waktu elusi yang pendek, struktur kimia yang sederhana,

dan relatif murah (Zogul, dkk., 2002, Ozdestan, dkk., 2009). Beberapa prosedur

menggunakan dansil klorida untuk derivatisasi telah diterbitkan (Widjaya, dkk.,

2001, Lubis, dkk., 2008). Metode dengan pra atau pasca kolom derivatisasi

dengan orthophthalaldehyde digambarkan Solano, dkk., 2012, Muscarella, dkk.,

2013. Beberapa prosedur menggunakan benzoil klorida untuk derivatisasi juga

telah diterbitkan antara lain oleh Hwang, dkk., 1997, Zogul, dkk., 2002, 2004,

Tsai, dkk., 2005, Yegin, dkk., 2008, Anderson, 2008, Chang, dkk., 2008,

Ozdestan, dkk., 2009, Tahmouzi, dkk., 2011, Naila, dkk., 2011, Chong,

dkk.,2012, Zare, dkk., 2013 dan Gezginc, dkk., 2013.

Metode KCKT lain tidak melibatkan derivatisasi, tetapi menggunakan

kromatografi ion diikuti oleh deteksi elektrokimia atau detektor diode array.

II.5.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan

atas reaksi spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai sensitivitas dan

spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikator. Prinsip

dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen antibodi yang teradsorpsi

secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat antibodi

atau antigen yang berlabel enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan

menghasilkan warna. Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif atau

kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi pada ELISA plate reader

(Thompson, 2010).

Metode ELISA dikembangkan untuk pengukuran histamin dalam makanan.

Prinsipnya berdasarkan kompetisi antara antigen yang terdapat dalam sampel

Page 25: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

14

dengan enzim berlabel kemudian enzim dan antigen bersaing dengan binding-site

antibodi yang dilapisi ke dalam well. Setelah inkubasi, well dicuci untuk

menghentikan reaksi kompetisi. Setelah substrat bereaksi, intensitas warna diukur

dimana intensitasnya berbanding terbalik dengan jumlah antigen dalam sampel.

Hasil dapat ditentukan langsung menggunakan kurva kalibrasi standar

(Muscarella, dkk., 2005, 2013).

Enzim Immunoassay Kompetitif

Gambar II.3 Prinsip Reaksi Enzim Immunoassay Kompetitif

II.6 Verifikasi Metode Analisis

Verifikasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Verifikasi

dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik,

reprodusibel. Parameter analisis yang ditentukan pada verifikasi pada kedua

metode adalah linieritas, limit deteksi, limit kuantisasi, akurasi, dan presisi.

II.6.1 Linearitas

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang

secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Pengujian kelinieran

dilakukan untuk membuktikan bahwa larutan sampel memberikan respon analit

yang berbanding lurus dengan konsentrasi (Ibrahim, 2005).

Fase padat dilapisi

dengan antibodi

Tambahkan antigen free

dan antigen berlabel

Antigen free dan antigen

berlabel ditangkap

Pembentukan warna

dengan oksidasi substrat

menjadi senyawa

berwarna

Page 26: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

15

Parameter linearitas ini diuji dengan membuat kurva baku. Persamaan umum

kurva baku menunjukkan hubungan yang linier, yang diberikan oleh persamaan

garis regresi y = bx + a, di mana y adalah nilai respon instrumen, x adalah

konsentrasi analit, b adalah tetapan proporsionalitas atau kemiringan garis dan a

adalah tetapan empirik yang menggambarkan titik potong sumbu y (Ibrahim,

2005).

II.6.2 Batas Deteksi dan Batas Kuantisasi

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi

yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas

deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter

pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel

yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Ibrahim, 2004).

Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi

linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada

persamaangaris linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan

simpangan baku residual (Sy/x).

………………. (1)

Dengan yi adalah sinyal hasil pengukuran, yi^ adalah semua titik pada garis yang

berpadanan dengan Xi (i = 1,2,3,…n) yang dihitung dari persamaan regresinya,

dan n adalah jumlah pengukuran

a. Batas deteksi (Q)

Karena k = 3 atau 10, Simpangan baku (Sb) = Sy/x,

maka

………………. (2)

b. Batas kuantitasi (Q)

………………. (3)

(Miller, dkk, 2000).

Page 27: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

16

II.6.3 Akurasi

Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan

kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan

kembali pada saat analisis, menggunakan prosedur analisis yang tepat, dengan

cara penambahan sejumlah analit yang telah diketahui kadarnya terhadap sampel.

Akurasi ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-placebo

recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method). Dalam

metode simulasi, sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia CRM

atau SRM) ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi

(plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan

kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Dalam metode

penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa

ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil

dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam

kedua metode tersebut, persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara

hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya (AOAC, 2012).

Perhitungan persen perolehan kembali dinyatakan dengan rumus :

………………. (4)

CF = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran

CA = konsentrasi sampel sebenarnya

C*A = konsentrasi analit yang ditambahkan (AOAC, 2012).

II.6.4 Presisi

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang

homogen.

Page 28: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

17

Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien

variasi). Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku

relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang (ICH, 1994).

Presisi diukur sebagai simpangan baku (SB) atau simpangan baku relatif (SBR)

atau Koefisien Variasi (KV)

………………. (5)

Dari nilai KV yang diperoleh dibandingkan dengan KV Horwitz, yaitu suatu

kurva berbentuk terompet yang menghubungkan ketertiruan (reproducibility)

(presisi yang dinyatakan sebagai % KV) dengan konsentrasi analit. Presisi metode

analisis dinyatakan sebagai fungsi dari konsentrasi melalui persamaan :

KV Horwitz = 2 1-0,5 log C

………………. (6)

Dengan C adalah konsentrasi yang dinyatakan dengan sebagai fraksi desimal.

Dengan menggunakan pembanding KV Horwitz nilai yang dapat diterima untuk

keterulangan (repeatability) adalah :

SBR < 0,67 x 2 1-0,5 log C

………………. (7)

Jika nilai simpangan baku relatif dari percobaan dibandingkan terhadap

simpangan baku relatif yang dihitung berdasarkan persamaan terompet Horwitz

akan diperoleh Horwitz Ratio atau HorRat. HorRat ≤ 2 menandakan metode

analisis mempunyai presisi yang memadai (AOAC, 2012).

Page 29: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

18

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

III.1 Penetapan dengan Metode KCKT

Penentuan histamin dalam produk pangan ikan kalengan dengan metode KCKT

diawali dengan proses ekstraksi dengan larutan asam trikloroasetat 6% kemudian

diderivatisasi menggunakan larutan benzoil klorida 2% dalam asetonitril yang

sebelumnya telah dibasakan dengan NaOH 5N. Kemudian campuran diinkubasi

pada suhu kamar selama 15 menit, ditambahkan larutan NaCl jenuh kemudian

diekstraksi dengan pelarut organik dietil eter. Pelarut organik diuapkan dan residu

dilarutkan dengan asetonitril. Sistem KCKT yang digunakan adalah kolom Zorbax

C18 (4,6 x 100 mm), dengan fase gerak campuran ammonium asetat 0,01 M:

asetonitril (40:60). Pengukuran dilakukan dengan menggunakan detektor UV

pada panjang gelombang 254 nm.

III.2 Penetapan dengan Metode ELISA

Penentuan histamin dalam produk pangan ikan kalengan dengan metode ELISA

menggunakan kit Ridascreen® Histamin R-Biopharm Art No. R1604 Lot. 12404.

Larutan baku dan sampel diderivatisasi dengan Acylation Reagen dan Acylation

Buffer kemudian ditambahkan Anti-Histamin Antibody, dan dicuci dengan

Washing Buffer. Kemudian Conjugate ditambahkan dan dicuci dengan Washing

Buffer kembali. Substrate/Chromogen dan Stop Solution ditambahkan kemudian

diukur serapannya pada 450 nm.

III.3 Verifikasi Metode Analisis

Verifikasi metode analisis metode KCKT dan ELISA meliputi linearitas, presisi,

akurasi, batas deteksi dan batas kuantisasi. Tahapan dalam linearitas meliputi

pembuatan kurva larutan baku yang diderivatisasi sehingga diperoleh kurva

kalibrasi derivat histamin. Batas deteksi dan batas kuantisasi ditentukan secara

statistik dari persamaan regresi linier yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Presisi

dan akurasi dilakukan dengan menggunakan produk ikan kalengan.

Page 30: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

19

BAB IV PERCOBAAN

IV.1. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah sampel ikan

kalengan yang ada di pasaran, baku histamin bersertifikat (PPOMN), air pro

KCKT, asetonitril pro KCKT, natrium klorida, natrium hidroksida, asam

trikloroasetat, benzoil klorida, dietil eter, Kit ELISA Ridascreen®Histamine

Competitive Enzyme Immunoassay.

IV.2. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain labu ukur, gelas ukur, pipet

ukur, erlenmeyer, timbangan analitik, tabung sentrifugasi, sentrifugasi Kubota

2420, vortex Barnstead Thermolyne 37600, KCKT Agilent Infinity VWD 1260

series detektor UV, Kolom Agilent Zorbax C18 (3.5µm; 4.6 x 100 mm), penyaring

membrane 0,45 µm, dan ELISA Reader Manual Chromate.

IV.3. Tahapan Penelitian

IV.3.1. Penetapan dengan metode KCKT

a. Penyiapan larutan baku induk

Larutan baku induk histamin dibuat dengan melarutkan senyawa baku histamin

dalam asam klorida 0,1 N sehingga diperoleh larutan baku induk dengan

konsentrasi 10 mg/mL.

b. Penyiapan larutan baku intermediet

Larutan baku intermediet histamin dibuat dengan melarutkan senyawa baku induk

histamin dalam asam klorida 0,1 N sehingga diperoleh larutan baku intermediet

dengan konsentrasi 200 µg/mL.

c. Penyiapan larutan baku kerja

Larutan baku intermediet yang telah dibuat dengan konsentrasi 200 µg/mL,

kemudian diencerkan hingga diperoleh baku seri dengan konsentrasi 0, 4, 8, 12,

16, 20, 24, dan 28 µg/ mL. Masing-masing baku histamin dilarutkan dengan

menggunakan asam klorida 0,1 N hingga tanda.

Page 31: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

20

d. Tahapan asilasi dengan larutan benzoil klorida

Dua mL benzoil klorida dilarutkan dalam 100 mL asetonitril (benzoil klorida 2%).

Derivatisasi dilakukan dengan menambahkan larutan baku kerja dan sampel

dengan 1 mL benzoil klorida 2% dan 2 mL NaOH 2 M, vortex selama 1 menit.

Diamkan dalam temperatur ruang selama 5 menit dan di sentrifugasi selama 10

menit 25000 rpm. Reaksi asilasi dihentikan dengan penambahan 2 mL NaCl

jenuh. Hasil derivatisasi diekstraksi tiga kali dengan 3 mL dietil eter. Lapisan

organik dievaporasi, residu yang diperoleh dilarutkan dengan 2 mL asetonitril.

Alikuot 20 uL diinjeksikan ke sistem KCKT.

e. Penyiapan Fase gerak

0,7708 gram ammonium asetat ditimbang dan dilarutkan dalam air pro KCKT

sampai 1000 mL sehingga diperoleh ammonium asetat 0,01 M. Fase gerak

merupakan campuran ammonium asetat 0,01 M:asetonitril dengan perbandingan

40:60.

f. Pembuatan Kurva kalibrasi

Kurva kalibrasi dibuat dengan menghubungkan antara konsentrasi dengan luas

puncak larutan derivat histamin. Konsentrasi derivat histamin yang digunakan

antara 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, dan 28 µg/ mL. Dari hubungan konsentrasi larutan

derivat histamin terhadap luas kromatogram yang terukur diperoleh persamaan

regresi linier.

g. Sistem KCKT

Fase gerak sistem gradien campuran ammonium asetat 0,01 M: asetonitril dengan

perbandingan 40:60. Disaring dengan penyaring membran 0,45 µm dan

diawaudarakan. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan detektor UV pada

panjang gelombang 254 nm. Uji kesesuaian sistem dilakukan terhadap salah satu

konsentrasi larutan derivat histamin Nilai simpangan baku relatif dari luas area

dan waktu retensi < 2,0 %. Kondisi optimum untuk pengukuran dicari dengan

mengubah parameter perbandingan fase gerak dan laju alir.

Page 32: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

21

h. Penetapan kadar histamin dalam sampel ikan kalengan

Sejumlah lebih kurang 5 gram sampel ikan ditimbang seksama kemudian

ditambahkan 20 mL asam trikloroasetat dan dikocok selama 3 menit kemudian

disentrifugasi 2500 rpm selama 10 menit dan disaring dengan kertas Whatman

No.1. Alikuot dilarutkan dengan 50 mL asam trikloroasetat kemudian disimpan di

refrigerator sebelum dianalisis. Tahapan asilasi dilakukan seperti larutan baku dan

disaring dengan penyaring membran 0,45 µm dan diawaudarakan, kemudian

dianalisis dengan KCKT detektor UV pada panjang gelombang 254 nm.

IV.3.2. Penetapan dengan metode ELISA

a. Persiapan

Semua reagen didiamkan kurang lebih 1 jam termasuk reagen asilasi pada suhu

kamar (20-25 °C) sebelum digunakan, kemudian dilarutkan 1 bagian washing

buffer ke dalam 24 bagian aquadest.

b. Tahapan Asilasi

Setiap larutan standar dan sampel dipipet 100 μl ke dalam masing-masing tabung

asilasi. Kemudian ditambahkan 25 μl reagen asilasi ke dalam masing-masing

tabung dan 200 μl buffer asilasi ke dalam masing-masing tabung. Campuran

dalam plate mikrowell digoyangkan dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu

kamar (20-25 °C) kemudian alikuot 25 μl larutan digunakan untuk tahap ELISA.

c. Penetapan kadar histamin dalam sampel ikan kalengan

Sejumlah lebih kurang 1 gram sampel ikan ditimbang seksama, kemudian

dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 9 ml aquadest. Divortex

selama 3 menit dan disentrifus selama 5 menit pada 2500 g pada suhu kamar (20-

25 °C). Cairan supernatan dipipet langsung sebanyak 1 ml dan dipindahkan ke

dalam vial/tabung bertutup ukuran 10 ml. Kemudian ditambahkan 9 ml aquadest

divortex selama 30 detik. Larutan tersebut dipipet 200 μl ke dalam vial/tabung

baru dan ditambahkan 9.8 ml aquadest, kemudian divortex kembali selama 30

detik dan 100 μl larutan digunakan untuk tahap asilasi.

Page 33: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

22

d. Tahapan ELISA

Setiap larutan standar dan sampel dipipet 25 μl dari tabung asilasi ke dalam

masing-masing mikrowell. Kemudian ditambahkan 100 μl Anti-Histamin

Antibody dan di campur plate mikrowell dengan cara menggoyangkannya,

kemudian diiinkubasi selama 40 menit pada suhu kamar (20-25 °C). Cairan dari

dalam mikrowell dibuang dan ditambahkan 250 μl Washing Buffer, plate

digoyangkan kemudian cairan dibuang lagi dari dalam mikrowell. Pencucian

dilakukan 3 kali, kemudian ditambahkan 100 μl Conjugate ke dalam masing-

masing mikrowell, dan plate mikrowell digoyangkan dan diinkubasi selama 20

menit pada suhu kamar (20-25 °C). Kemudian ditambahkan 250 μl washing

buffer, plate digoyangkan kemudian cairan dibuang lagi dari dalam mikrowell.

Pencucian dilakukan 3 kali, kemudian ditambahkan 100 μl Substrate/Chromogen

ke dalam masing-masing mikrowell. Plate mikrowell digoyangkan dan diinkubasi

selama 15 menit pada suhu kamar (20-25 °C) di tempat gelap. Kemudian

ditambahkan 100 μl Stop Solution ke dalam masing-masing mikrowell, dicampur

dengan cara menggoyangkan plate mikrowell dan absorbansi diukur pada 450 nm.

IV.3.3 Verifikasi Metode Analisis

Verifikasi metode ELISA dan KCKT meliputi linieritas, batas deteksi dan batas

kuantisasi, kecermatan dan keseksamaan.

a. Linieritas

Uji linieritas metode analisis dilakukan dengan menggunakan satu seri larutan

baku histamin dengan konsentrasi yang berbeda. Kemudian dihitung lineritasnya

menggunakan koefisien korelasi (r).

b. Batas deteksi dan batas kuantisasi

Penentuan batas deteksi dan batas kuantisasi dilakukan dengan menggunakan data

dari penentuan linieritas. Perhitungan didasarkan pada nilai simpangan baku

residual (Sy/x).

Page 34: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

23

c. Kecermatan

Parameter kecermatan ditentukan dengan menghitung persen perolehan kembali

melalui metode penambahan baku (standard addition method). Sampel ditambah

standar histamin dengan tiga rentang konsentrasi. Masing-masing konsentrasi

dianalisis 3 kali pengulangan dan dihitung persen perolehan kembali.

d. Keseksamaan

Keseksamaan diukur dengan mengulang pengukuran suatu konsentrasi senyawa

baku histamin sebanyak 6 kali. Hasil pengukuran keseksamaan dinyatakan

sebagai simpangan baku relative, SBR.

Page 35: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

24

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

V.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Ada sekitar 10 famili ikan yang memiliki kadar histidin bebas yang sangat tinggi,

diantaranya adalah famili ikan Clupeidae dengan salah satu spesiesnya ikan

sarden. Ikan sarden umumnya memiliki kadar histidin sekitar 1500-7500 mg/kg

(Joint FAO/WHO, 2012). Di Indonesia banyak ikan sarden diolah menjadi ikan

kalengan. Ikan kalengan merupakan produk yang diperoleh dari ikan segar atau

potongan ikan segar dan dihilangkan isi perutnya, dicuci dengan air bersih,

disusun dalam kaleng, dengan atau tanpa diberi media, dengan atau tanpa bumbu-

bumbu atau bahan lainnya, kemudian dikemas secara kedap (hermetis) dan

disterilisasi atau dipasteurisasi dengan cara pemanasan (BPOM RI, 2006).

Metode analisis histamin dalam ikan kalengan dengan menggunakan KCKT

detektor UV memerlukan proses ekstraksi padat cair dengan menggunakan pelarut

asam trikloroasetat (TCA) untuk mengendapkan protein dalam ikan yang akan

mengganggu proses pengukuran histamin. Kemudian baik larutan standar maupun

larutan sampel diderivatisasi dengan reagen penderivat asil klorida. Proses

derivatisasi dilakukan karena histamin tidak memiliki kromofor. Pada penelitian

ini dilakukan derivatisasi pre kolom, yaitu derivatisasi dilakukan sebelum proses

kromatografi. Derivatisasi prekolom lebih dipilih karena tidak memerlukan

peralatan khusus.

Metode KCKT dengan derivatisasi prekolom oleh fluorogenik menggunakan

orthophthalaldehyde atau reagen asil klorida. Metode derivatisasi dengan agen

fluorogenik memiliki beberapa keterbatasan, yaitu memerlukan pemisahan amina

sebelum derivatisasi karena derivatif fluorogenik menghasilkan resolusi yang

kurang bagus. Oleh karena itu, reagen asil klorida, seperti tosil klorida, dansil

klorida, atau benzoil klorida, lebih disukai untuk derivatisasi amina biogenik

(Etienne, dkk., 2006). Beberapa prosedur menggunakan dansil klorida untuk

derivatisasi telah diterbitkan (Widjaya, dkk., 2001, Lubis, dkk., 2008). Metode

dengan pra atau pasca kolom derivatisasi dengan orthophthalaldehyde

Page 36: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

25

digambarkan Solano, dkk., 2012 dan Muscarella, dkk., 2013. Di antara reagen ini,

benzoil klorida memiliki keuntungan, karena derivatisasi dan waktu elusi yang

pendek, struktur kimia yang sederhana, dan relatif murah (Zogul, dkk., 2002,

Ozdestan, dkk., 2009).

Reagen asil klorida seperti benzoil klorida dikenal dapat bereaksi dengan

beberapa gugus fungsi, seperti amin primer, amin sekunder dan alkohol melalui

substitusi nukleofilik (Solomon, 2004). Reaksi suatu asil klorida dengan gugus

amina menghasilkan suatu senyawa amida ditunjukkan dengan gambar berikut :

Gambar V.1. Reaksi Asil Klorida dengan Amina Primer

Derivatisasi histamin dilakukan dengan penambahan larutan NaOH 5N dan

larutan benzoil klorida 2% dalam asetonitril. Benzoil klorida 2% dalam asetonitril

berfungsi sebagai agen penderivat dan penambahan NaOH bertujuan untuk

memberikan kondisi pH basa yang merupakan kondisi pH optimum reaksi

derivatisasi. Proses reaksi derivatisasi optimum pada suhu kamar selama 15 menit.

Penambahan larutan natrium klorida jenuh bertujuan untuk menghentikan reaksi

derivatisasi (Ozogul, dkk., 2002). Reagen asil klorida seperti benzoil klorida

memiliki karakteristik sangat reaktif, bahkan dengan air pun akan bereaksi.

Sehingga untuk memperkecil reaksi samping dilakukan tahap pemurnian melalui

ekstraksi dengan pelarut organik dietil eter. Kemudian hasil reaksi diuapkan dan

residu dilarutkan dengan asetonitril. Larutan histamin hasil derivat inilah yang

kemudian disuntikkan ke sistem kromatografi (Ozogul, dkk., 2002, Ozogul, 2004,

Ozdestan, dkk., 2009, dan Zare, dkk., 2013).

Asil klorida Amina primer Amida

Page 37: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

26

Penentuan sistem KCKT dilakukan terhadap beberapa faktor yang mempengaruhi

pemisahan antara lain pemilihan kolom, komposisi fase gerak dan laju alir. Hasil

kondisi sistem KCKT dijabarkan pada tabel V.1.

Tabel V.1. Kondisi Sistem KCKT

Parameter Deskripsi

Alat

Detektor

Kolom

Fase Gerak

Laju Alir

Temperatur Kolom

Waktu Retensi

Resolusi

Agilent Infinity VWD 1260 series

UV ʎ=254 nm

Zorbax C 18; 3,5 µm; 4.6 mm x 100 mm

Ammonium asetat : Asetonitril (6:4)

0,6 mL/min

30˚C

Derivat Histamin (senyawa amida) = 4,889 menit

4,800

Detektor yang digunakan untuk analisis histamin adalah detektor ultraviolet

karena penderivat yang digunakan merupakan pereaksi asil klorida untuk

menambahkan gugus kromofor. Benzoil klorida suatu asil klorida dapat

digunakan sebagai agen penderivat berbagai senyawa seperti senyawa amina pada

panjang gelombang 254 nm.

Pemilihan kolom pada proses KCKT merupakan hal yang penting karena proses

pemisahan yang dikendalikan oleh interaksi antara solut, fasa gerak dan fasa diam

yang terdapat dalam kolom. Pemilihan kolom dapat dilakukan berdasarkan jenis

fase kolom (polar atau nonpolar), diameter internal, ketebalan film dan panjang

kolom. Kolom yang digunakan adalah kolom Zorbax® C18, 4,6 x 100 mm, ukuran

partikel 3,5 µm. Derivat histamin menghasilkan suatu senyawa amida yang

merupakan senyawa yang bersifat polar. Dengan menggunakan kolom C18 yang

bersifat non polar, diharapkan pemisahan terjadi dengan baik dengan waktu

retensi yang lebih cepat.

Laju alir yang digunakan adalah 0,6 mL/menit untuk meningkatkan resolusi

karena panjang kolom hanya 100 mm. Waktu retensi derivat histamin 4,889

menit. Benzoil klorida bereaksi dengan gugus amina menghasilkan suatu senyawa

amida.

Page 38: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

27

Selanjutnya dilakukan pemilihan perbandingan komposisi fase gerak dan

pemilihan laju alir. Dengan mengubah perbandingan komposisi asetonitril dan

ammonium asetat didapat perbandingan asetonitril:ammonium asetat (60:40) yang

memberikan profil puncak derivat histamin yang terpisah satu sama lain dengan

resolusi yang baik serta terpisah dari puncak-puncak pengganggu.

Dengan kondisi sistem KCKT yang ditampilkan pada Tabel V.1. maka diperoleh

kromatogram derivat histamin seperti berikut :

Gambar V.2. Kromatogram Derivat Histamin

Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan efektivitas sistem

kromatografi yang digunakan. Hasil penentuan UKS dapat dilihat pada tabel

berikut.

Waktu retensi (menit)

Page 39: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

28

Tabel V.2. Data Hasil Uji Kesesuaian Sistem Larutan Derivat Histamin

Konsentrasi 14,31 ppm

Derivat Histamin (senyawa amida)

Luas Area Waktu Retensi

4807,240 4,882

4813,894 4,895

4801,571 4,891

4814,941 4,885

4822,197 4,891

4808,577 4,892

Rata 4811,403 4,889

SD 7,172 0,005

SBR(%) 0,149 0,099

Tabel V.2. menunjukkan hasil keberulangan penyuntikan larutan derivat histamin

konsentrasi 14,3136 ppm sebanyak 6 kali. Nilai SBR dari waktu retensi dan luas

area untuk derivat histamin adalah 0,149%. Hal ini memenuhi persyaratan

keberulangan penyuntikan yaitu maksimal SBR 2%.

Setelah memenuhi persyaratan uji kesesuaian sistem kemudian dilakukan

verifikasi metode meliputi parameter linearitas, presisi, akurasi, batas deteksi, dan

batas kuantisasi.

Kurva kalibrasi diperoleh dengan memplot hubungan antara konsentrasi dengan

luas area derivat histamin. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan

koefisien korelasi (r) dan koefisien variansi fungsi regresi pada analisis regresi

linier y = bx + a (Tabel V.3 dan Gambar V.3).

Penentuan kelinieran dilakukan dengan memplot respon instrumen yang

dinyatakan dengan luas area, dengan konsentrasi larutan derivat histamin yang

terdiri dari 7 level konsentrasi. Kemudian diperoleh kurva kalibrasi dan ditentukan

parameter korelasi (r) dan koefisien fungsi regresi.

Page 40: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

29

Tabel V. 3. Konsentrasi dan Luas Area Baku Seri Derivat Histamin

Konsentrasi Luas Area

(µg/mL)

3,5784 1862,9200

7,1568 2509,1252

10,7352 3823,7500

14,3136 4822,1968

17,8920 5583,5300

21,4704 6588,9200

25,0488 8072,3500

y = 284,92x + 673,59

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ug/mL)

Luas

Are

a

Gambar V.3. Kurva Kalibrasi Derivat Histamin

Persamaan regresi linier yang diperoleh adalah y = 284,9204x + 673,5903 dengan

koefisien korelasi r = 0,996101794. Batas deteksi (BD) dan batas kuantisasi (BK)

dihitung secara statistik dari kurva kalibrasi, yaitu 7,62 µg/g dan 23,09 µg/g.

Presisi atau presisi adalah ukuran keterulangan metode analisis dan dinyatakan

sebagai simpangan baku relatif (SBR) atau koefisien variasi (KV). Uji presisi

dilakukan pada produk nyata dengan matriks ikan kalengan untuk melihat

pengaruh matriks pembawa terhadap hasil presisi. Presisi dilakukan pada 6 produk

dengan konsentrasi 100% (Tabel V.4).

Page 41: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

30

Tabel V.4. Presisi Derivat Histamin dalam Produk Ikan Kalengan

Waktu Luas Area Kadar Histamin

Retensi (ug/g)

4,882 3476,8820 93,7828

4,885 3423,4528 94,3518

4,869 3436,8110 95,6470

4,871 3529,7388 97,7650

4,864 3430,0038 95,2216

4,859 3504,8370 97,1481

Rata-rata 95,6527

SD 1,5539

%SBR 1,6245

KV Horwitz 8,0537

0,67 KV Horwitz 5,3960

HORRAT 0,2017

Kadar histamin dalam sampel ikan kalengan adalah sebesar 95,65 µg/g. Untuk

syarat keberterimaan presisi adalah SBR < 0,67 KV Horwitz, dari seluruh hasil

presisi diatas diperoleh % SBR adalah sebesar 1,62%, lebih kecil dari 0,67 KV

Horwitz. Berdasarkan teori terompet Horwitz, simpangan baku relatif dari suatu

metode akan meningkat dengan menurunnya konsentrasi. Persamaan Horwitz

yang menggambarkan peningkatan simpangan baku relatif dengan menurunnya

konsentrasi adalah SBR = 2(1-0,5 Log C)

. Jika nilai simpangan baku relatif dari

percobaan dibandingkan terhadap simpangan baku relatif yang dihitung

berdasarkan persamaan terompet Horwitz akan diperoleh HORWITZ RATIO atau

HORRAT. HORRAT ≤ 2 menandakan metode analisis mempunyai presisi yang

memadai. Dari hasil uji presisi dapat dilihat bahwa nilai koefisien variasi yang

dihasilkan memenuhi syarat KV teori terompet Horwitz dan memiliki HORRAT ≤

2 yaitu sebesar 0,20 sehingga dikatakan bahwa metode yang digunakan memenuhi

syarat presisi.

Selanjutnya dilakukan uji akurasi menggunakan metode standar adisi yang

ditambahkan baku dengan tiga rentang konsentrasi. Hasil akurasi bisa di lihat

dalam tabel V.5.

Page 42: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

31

Tabel V.5. Akurasi Derivat Histamin dalam Produk Ikan Kalengan

Konsentrasi

Teoritis (ug/g)

Luas

Area

Konsentrasi

yang diperoleh

(ug/g)

Perolehan

Kembali

(%)

Rata-rata

Perolehan

Kembali

(%)

72,6859

72,6859

72,6859

106,0958

106,0958

106,0958

121,9181

121,9181

121,9181

5197,774

5157,698

5188,959

6312,252

6312,930

6315,309

6652,020

6582,908

6597,223

64,6490

63,2205

64,3348

97,9787

98,0020

98,0836

106,5607

104,2230

104,7072

88,94

86,98

88,51

92,35

92,37

92,45

87,40

85,49

85,88

87,26

92,39

86,26

Dari tabel dapat dilihat bahwa nilai persen perolehan kembali berkisar antara

86,26 – 92,39%, sementara syarat persen perolehan kembali untuk analit adalah

80 - 110%. Hasil ini menunjukkan bahwa metode analisis yang digunakan

memenuhi syarat akurasi.

Dari gambar kromatogram derivat histamin dalam produk ikan kalengan diatas

dapat dilihat bahwa puncak tidak terganggu oleh puncak dari matriks yang

dihasilkan. Nilai resolusi untuk derivat histamin adalah 4,80. Dengan demikian

parameter spesifisitas memenuhi syarat keberterimaan yaitu nilai resolusi lebih

dari 1,5.

II. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Analisis Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) berdasarkan reaksi

antara antigen dan antibodi. Standar dan sampel diderivatisasi dengan reagen

asilasi menjadi N-asil-histamin. Well yang dilapisi dengan antibodi spesifik

terhadap N-asil-histamin. Standar dan sampel histamin terasilasi ditambahkan

enzim berlabel N-asil-histamin (enzim konjugat). N-asil-histamin bebas dan

enzim konjugat bersaing untuk berikatan dengan antibodi. Enzim konjugat yang

tidak terikat kemudian dihilangkan dengan langkah pencucian. Tambahkan

substrat enzim, hidrogen peroksida dan kromogen, tetramethylbenzidine ke dalam

Page 43: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

32

well. Enzim konjugat yang terikat antibodi akan mengubah kromogen menjadi

larutan berwarna biru. Tambahkan pereaksi stop solution, asam sulfat untuk

menghentikan reaksi sehingga menyebabkan perubahan warna dari biru menjadi

kuning. Intensitas warna yang timbul ditentukan secara kuantitatif dengan

membaca Optical Density (OD) pada 450 nm. Nilai OD yang dihasilkan

berbanding terbalik dengan konsentrasi N-asil histamin sampel. Semakin kuning

warna yang dihasilkan semakin kecil N-asil histamin yang terdapat pada sampel.

Kurva baku dibuat dengan memplot antara nilai OD dan konsentrasi baku

histamin. Kemudian digunakan untuk menghitung kadar histamin pada sampel

(Tabel V.6).

Tabel V.6. Konsentrasi dan Absorbansi Baku Seri N-Asil Histamin

Konsentrasi Nilai

(ng/mL) OD

0 1,6105

0,5 1,4605

1,5 1,2770

5 0,9295

15 0,5785

50 0,4080

Gambar V.4.. Kurva Baku Seri Histamin Hasil Percobaan

Page 44: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

33

Gambar V.5. Kurva Baku Seri Histamin dari Quality Assurance Certificate

y = -1,7269x + 1,645

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

-0,5 0 0,5 1 1,5 2

Log Konsentrasi

Log

It

Gambar V.6. Kurva Kalibrasi Histamin

Page 45: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

34

Persamaan regresi diperoleh dengan memplot log konsentrasi terhadap log it yaitu

y = -1,7269x + 1,6450 dengan koefisien korelasi r = -0,9927689.

Batas deteksi (BD) dan batas kuantisasi (BK) dihitung secara statistik dari kurva

kalibrasi untuk derivat histamin yaitu 2,61 µg/g dan 7,91 µg/g.

Presisi adalah ukuran keterulangan metode analisis dan dinyatakan sebagai

simpangan baku relatif (SBR) atau koefisien variasi (KV). Uji presisi dilakukan

pada produk nyata dengan matriks ikan kalengan untuk melihat pengaruh matriks

pembawa terhadap hasil presisi. Presisi dilakukan pada 6 produk dengan

konsentrasi 100% (Tabel V.7).

Tabel V.7. Presisi Metode Penetapan Kadar Histamin dalam Produk Ikan Kalengan

Penimbangan Nilai Pengenceran Kadar Histamin

(g) OD (µg/g)

1,0329 0,556 5000 80,7855

1,0641 0,561 5000 76,5883

1,0423 0,564 5000 77,1133

1,0265 0,551 5000 83,2823

1,0313 0,541 5000 87,1857

1,0258 0,568 5000 76,9430

Rata-rata 80,3163

SD 4,2835

%SBR 5,3333

KV Horwitz 8,2683

0,67 KV Horwitz 5,5398

HORRAT 0,6450

Kadar histamin dalam sampel ikan kalengan adalah sebesar 80,32 µg/g. Untuk

syarat keberterimaan presisi adalah SBR < 0,67 KV Horwitz, dari seluruh hasil

presisi diatas diperoleh % SBR sebesar 5,33%, lebih kecil dari 0,67 KV Horwitz.

Berdasarkan teori terompet Horwitz, simpangan baku relatif dari suatu metode

akan meningkat dengan menurunnya konsentrasi. Persamaan Horwitz yang

menggambarkan peningkatan simpangan baku relatif dengan menurunnya

Page 46: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

35

konsentrasi adalah SBR = 2(1-0,5 Log C)

. Jika nilai simpangan baku relatif dari

percobaan dibandingkan terhadap simpangan baku relatif yang dihitung

berdasarkan persamaan terompet Horwitz akan diperoleh HORWITZ RATIO atau

HORRAT. HORRAT ≤ 2 menandakan metode analisis mempunyai presisi yang

memadai. Dari hasil uji presisi dapat dilihat bahwa nilai koefisien variasi yang

dihasilkan memenuhi syarat KV teori terompet Horwitz dan memiliki HORRAT ≤

2 yaitu sebesar 0,65 sehingga dikatakan bahwa metode yang digunakan memenuhi

syarat presisi.

Selanjutnya dilakukan uji akurasi menggunakan metode standar adisi yang

ditambahkan baku dengan konsentrasi yaitu 101,48 µg/mL. Hasil akurasi bisa di

lihat dalam tabel V.8.

Tabel V.8. Akurasi Metode Penetapan Kadar Histamin dalam Produk Ikan Kalengan

Konsentrasi

Teoritis

(ug/g)

Nilai

OD

Konsentrasi yang

diperoleh (ug/g)

Perolehan

Kembali (%)

507,4000

507,4000

507,4000

507,4000

507,4000

507,4000

0,319

0,314

0,316

0,303

0,301

0,305

456,3468

486,3750

468,9760

514,8225

527,3583

503,8348

74,11

80,03

76,60

85,63

88,10

83,47

Rata-rata

SD

%SBR

81,32

5,38

6,63

Dari tabel dapat dilihat bahwa nilai persen perolehan kembali untuk histamin

sebesar 81,32% ± 6,63, sementara syarat persen perolehan kembali untuk analit

adalah 80 - 110%. Hasil ini menunjukkan bahwa metode analisis yang

digunakan memenuhi syarat akurasi.

Page 47: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

36

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

VI.1 KESIMPULAN

Metode analisis histamin dalam sampel ikan kalengan ditentukan dengan

menggunakan metode KCKT dan ELISA.

Hasil metode KCKT diperoleh persamaan linier kurva kalibrasi untuk derivat

histamin adalah y = 284,9204 x + 673,5903 dengan koefisien korelasi r = 0,9961.

Batas deteksi dan batas kuantisasi metode ini sebesar 7,62 µg/g dan 23,09 µg/g.

Presisi metode diperoleh dengan nilai koefisien variansi adalah 1,62%. Akurasi

dilihat dari perolehan kembali dalam produk ikan kalengan adalah sebesar 86,26 –

92,39%.

Hasil metode ELISA diperoleh kurva kalibrasi linier y = -1,7269 x + 1,6450

dengan koefisien korelasi r = -0,9927. Batas deteksi dan batas kuantisasi metode

ini sebesar 2,61 µg/g dan 7,91 µg/g. Presisi metode ditunjukkan dengan nilai

koefisien variansi 5,33%. Akurasi dilihat dari perolehan kembali histamin dalam

produk ikan kalengan adalah sebesar 81,32%.

Berdasarkan hasil yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa kedua metode dapat

digunakan untuk penetapan kadar histamin dalam sampel ikan kalengan. Kadar

histamin dalam sampel menggunakan metode KCKT sebesar 95,65±1,55 µg/g dan

kadar histamin menggunakan metode ELISA sebesar 80,32±4,28 µg/g.

VI.2 SARAN

Untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan penentuan kadar histamin dalam

jenis produk pangan lainnya seperti udang, keju, dan anggur.

Page 48: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

37

DAFTAR PUSTAKA

Anderson, A.K. (2008) : Biogenic and Volatile Amine-related Qualities of Three

Popular Fish Spesies Sold at Kuwait Fish Market, Food Chemistry, 107, 761-

767.

Anonim Ridascreen® Histamin Instruction Manual, Enzyme Immunoassay for the

Quantitative Analysis of Histamine, R-Biopharm AG, Germany.

Arisman, (2009) : Keracunan Makanan : Buku Ajar Ilmu Gizi, Buku Kedokteran

Indonesia, Cetakan ke-1, Jakarta.

Badan POM RI (2006) : Kategori Pangan, Jakarta.

Chang, S.C., Kung, H.F., Chen, H.C., Lin, C.S., Tsai, Y.H. (2008) :

Determination of Histamine and Bacterial Isolation in Swordfish Fillets

(Xiphias gladius) implicated in a Food Borne Poisoning, Food Control,

19, 16-21.

Chong, C.Y., Bakar, F.A, Rahman, R.A., Bakar, J., Zaman, M.Z. (2014) :

Biogenic Amines, Amino Acids and Microflora Changes in Indian

Mackerel Stored at Ambient (25-29˚C) and Ice Temperature, J. Food

Sci.Technology, 51 (6), 1118-1125.

Codex-Adopted AOAC Method (2012) : AOAC Official Methods Histamine in

Seafood.

Etienne, M.. Ifremer, Nantes. (2006) : Methodology for Histamine and Biogenic

Amines Analysis, Methods for Chemical Quality Assesment, France.

Food and Drug Administration (2011) : Fish and Fishery Products Hazards and

Control Guidance, U.S. Department of Health and Human Services,

Centre for Food Safety and Applied Nutrition.

Gezginc, Y., Akyol, I., Kuley, E., Ozogul, F. (2013) : Biogenic Amines Formation

in Streptococcus thermophilus Isolated from Home-made Natural

Yoghurt, Food Chemistry, 138 (1), 655-662.

Hwang, D.F., Chang, S.H., Shiua, C.Y., Chai, T. (1997) : High Performance

Liquid Chromatographic Determination of Biogenic Amines in Fish

implicated in Food Poisoning, Journal of Chromatography, 693, 23-30.

Page 49: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

38

Ibrahim, S. (2004) : Berbagai Pendekatan pada Penaksiran Batas Deteksi dan

Batas Kuantisasi Suatu Metode Analisis Instrumental, Acta Pharm. Ind,

Vol.29 (4).

Ibrahim, S. (2005) : Berbagai Pendekatan Pengujian Kelinieran Kurva Baku pada

Metode Analisis Instrumental. Acta Pharm. Ind, Vol.30 (1).

ICH Harmonized Tripartit Guideline (1994) : Text On Validation Of Analytical

Procedure

ICH Harmonized Tripartit Guideline (1997) : ICH Q2B, Validation of Analytical

Procedures : Methodology

Joint FAO/WHO (2012) : Public Health Risks of Histamine and Other Biogenic

Amines from Fish and Fishery Products, Italy.

Lubis, N., Kartasasmita, R.E. (2008) : Pemantauan pembentukan Histamin dan

Cemaran Mikroba pada Tepung Ikan Patin, Tesis Sekolah Farmasi ITB,

Bandung.

Maintz, L. dan Novak, N. (2007) : Histamine and Histamine Intolerance,

American Journal of Clinical Nutrition, 85, 1185 – 1196.

Miller, J.C. dan Miller, J.N. (2000) : Statistic and Chemometrics for Analytical

Chemistry, 4th ed, Prentice Hall, Harlow Essex.

Muscarella, M., Iammarino, M., Centonze, D., Pallermo, C. (2005) : Measurement

of Histamine in Seafood by HPLC, CE, and ELISA: Comparison of Three

Techniques, Veterinary Research Communications, 29 (Suppl. 2), 343 –

346.

Muscarella, M., Magro, S.L., Companiello, M., Armentano, A. (2013) : Survey of

Histamine Levels in Fresh Fish and Fish Products collected in Puglia

(Italy) by ELISA and HPLC with Fluorimetric Detection, Journal Food

Control, 31, 211 – 217.

Naila, A., Flint, S., Fletcher, G.C., Bremer, P.J., Meerdink, G. (2011) : Biogenic

Amines and Potential Histamine-forming Bacteria in Rihaakuru (A

Cooked Fish Paste), Food Chemistry, 128, 479-484.

Nuutinen, S., dan Panula, P. (2010) : Histamine in Neurotransmission and Brain

Diseases, Histamine in Inflammation, Advances in Experimental Medicine

and Biology, 709, 95-107.

Page 50: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

39

Ozdestan, Z., dan Uren, A. (2009) : A Method for Benzoyl Chloride

Derivatization of Biogenic Amines for High Performance Liquid

Chromatography, Talanta, 78, 1321 – 1326.

Ozogul, F., Taylor, K.D.A., Quantick, P., Ozogul, Y. (2002) : Biogenic Amines

Formation in Atlantic herring (Clupea harengus) Stored under Modified

Atmosphere Packaging using a Rapid HPLC Method, International

Journal of Food Science and Technology, 37, 515 – 522.

Ozogul, F. (2004) : Production of Biogenic Amines by Morganella morganii,

Klebsiella pneumoniae and Hafnia alvei using Rapid HPLC Method,

European Food Research and Technology, 219, 465 – 469.

Paiva, T.B., Tominaga, M., Paiva, A.C.M. (1970) : Ionization of Histamine, N-

acetylhistamine and their Iodinates Derivatives, Journal of Medicinal

Chemistry, 13 (4), 689-692.

Presiden RI (1996) : Undang-Undang Nomor 7 Tahun 1996 tentang Pangan,

Jakarta.

Shahid, M., Tripathi, T., Sobia, F., Moin, S., Siddiqui, M., Khan, R.A. (2009) :

Histamine, Histamine Receptors, and Their Role in Immunomodulation :

an updated Systematic Review. Open Immunol. J., 2: 9–41.

Solano, C.B., Cervantes, J.L., Machado, D.S., Baypoli, O.C. (2012) : HPLC

Determination of Histamine, Tyramine and Amino Acids in Shrimp By-

Products, J. Braz. Chem. Soc., 23 (I), 96-102.

Solomon dan Fryhle (2004) : Amines, Organic Chemistry II, 8th Edition, Wiley.

Tahmouzi, S., Khaksar, R., Ghasemlou, M. (2011) : Development and Validation

of an HPLC-FLD Method for Rapid Determination in Skipjack Tuna Fish

(Katsuwonus pelamis), Food Chemistry, 126, 756-761.

Thompson, M. (2010) : Immunoanalysis, Basic Principles of ELISA, Analytical

Method Commitee.

Tsai, Y.H., Kung, H.F., Lee, T.M., Chen, H.C., Chou, S.S., Wei, C.I., Hwang,

D.F. (2005) : Determination of Histamine in Canned Mackerel implicated

in a Food Borne Poisoning, Food Control, 16, 579-585.

United State Pharmacopeia 36 - National Formulary 31 Volume 2 : Validation of

Compendial Procedures (1225), USA.

Page 51: PENETAPAN KADAR HISTAMIN DALAM PRODUK · PDF filepenetapan kadar histamin dalam produk pangan ikan kalengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) dan enzyme linked

40

Widjaya, W.P., Ibrahim, S., Kartadarma, E., Kisman S. (2001) : Penentuan

Beberapa Senyawa Amina dalam Produk Ikan secara KCKT, Tesis

Sekolah Farmasi ITB, Bandung.

Yegin, S., dan Uren, A. (2008) : Biogenic Amine Content of Boza : A Traditional

Cereal based, Fermented Turkish Beverage, Food Chemistry, 111, 983-

987.

Zare, D., Muhammad, K., Bejo, M.H., Ghazali, H.M. (2013) : Changes in

Urocanic Acid, Histamine, Putrescine and Cadaverine Levels in Indian

Mackerel (Rastrelliger kanagurta) during Storage at Different

Temperature, Food Chemistry, 139, 320-325.