PENGEMBANGAN MIKROORGANISME

INDUSTRIOleh

Khaswar SyamsuPusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi

Institut Pertanian Bogor

MUTASI DAN SELEKSIMutasi: perubahan yang terjadi pada material genetikMutan: organisme yang mengalami mutasiMutagen: bahan penyebab mutasi

Mekanisme terjadinya mutasi1. Mutasi Titik (point mutation)Substitusi pasangan basa oleh pasangan basa lain berlangsungbersamaan dengan proses replikasi. a. TransisiPenggantian satu basa purin (A atau G) oleh purin yang lain, atau satu basapirimidin (C atau T) oleh pirimidin lain.

A C T G T A A T C C T T G AT G A C A T T A G G A A C T

A C T G C A A T C C T T G AT G A C G T T A G G A A C T

b. Transversi

Penggantian satu basa purin oleh satu basa pirimidin, atau sebaliknya satubasa pirimidin oleh basa purin.

AT

TA

GC

Berdasarkan jenis kodon baru yang dimunculkan, mutasi dapat dibagi atas;a. Mutasi BisuMutasi yang menghasilkan kodon yang menyandi asam mino yang sama.Ex: Substitusi ACG menjadi ACA menghasilkan asam amino yang sama,

yaitu cystein, UCU dan UCA, keduanya sama-sama menyandi asam amino serine.

b. Mutasi Rubah ArahMutasi yang menghasilkan kodon yang menyandikan asam amino yang

berbeda dari yang dihasillkan kodon semula. Ex: perubahan ACG menjadi ACC menyebabkan cystein diganti oleh

triptofan.

c. Mutasi Hilang ArahMutasi yang menghasilkan kodon akhir, sehingga sintesis polipeptida berakhirpada titik tempat terjadinya mutasi.

Ex: Perubahan ACG menjadi ACT menyebabkan polipeptida yang dihasilkanlebih pendek dari seharusnya.

2. Mutasi Rubah AngkaTerjadi melalui penyisipan atau penghilangan pasangan basa pada DNAEx:DNA Protein DNA ProteinA Ser A SerG GT TT SerCGA penghilangan CT Tyr G AlaG GCG AlaG

Penyisipan atau penghilangan basa pada DNA menyebabkan rantai polipeptida yang terbentuk bertambah panjang atau bertambah pendek.

Faktor Penyebab Mutasi1. Mutasi Spontan

Terjadi akibat kesalahan secara acak yang berlangsung dalam proses transkripsi

2. Mutasi Akibat Rangsangan dari Luara. Akibat unsur fisik

Gelombang cahaya pada sinar matahari atau sinar radioaktif, seperti ultraviolet,inframerah, sinar gamma dapat mengakibatkan perubahan struktur basa padaDNA sehingga tidak berfungsi pada proses replikasi.

b. Akibat Bahan Kimiai). Senyawa yang mirip dengan basa DNA (seperti 5-Bromo Urasil dan 2-AminoPurin) sehingga ikut tersisipkan sebagai penyusun rantai polinukleotida padawaktu replikasi DNA.

ii). Bahan kimia yang dapat merubah struktur basa pada rantai polinukleotida,bahan kimia tersebut antara lain:

Hidroksi amin, asam nitrous, Etil Metil ⇒ Dapat beraksi dengan basaSulfonat (EMS), Etil Etan Sulfonat (EES), DNANitroso Guanidin (NS), proflavin, danquinarcrin.

SELEKSI MUTANT YANG DIINGINIMutasi dapat digunakan untuk merubah aturan metabolisme dan meyebabkankelebihan produksi produk yang diinginkan.Ex: Produksi penisilin dari 0.001 g/L pada tahun 1939 menjadi 50 g/L.

1. Seleksi LangsungDapat dilakukan terhadap mutan yang karena proses mutasi justru dapat tumbuhdan bertahan pada suatu kondisi lingkungan spesifik.Ex: mutan yang tahan terhadap antibiotik dapat ditumbuhkan pada media yangmengandung antibiotik.

2. Seleksi Tidak LangsungBila mutasi meyebabkan mutan tidak mampu memproduksi suatu faktorpertumbuhan (seperti asam amino atau vitamin) auxotrof

Ex: auxotrof lysine kehilangan kemampuan memproduksi lysine sehingga lysineharus disuplai ke dalam media pertumbuhan

REKAYASA GENETIKA

Tonggak sejarah penting ditemukan enzim spesifik untuk memotongrantai polinukleotida pada lokasi spesifik.

Enzim Restriksi (Restriction Endonuclease)

Sistem Penamaan:

Huruf 1: pangkal nama genus mikroorganisme asal

Huruf 2, 3 (dan 4) : pangkal nama spesies mikroorganisme asal

Angka Romawi: jenis retriksi

Mikroba Asal Nama Enzim Lokasi Pemotongan

Bacillus amyloliquefaciens HEschericia coli RY13Haemophilus aegyptiusHaemophilus influenzae Rd

Haemophilus influenzaeProvidencia stuartiiStreptomyces albus GStreptomyces stanford

Bam HIEco RIHae IIIHind II

Hind IIIPst ISal ISstI

G↓GATCCG↓AATCCGG↓CCGTT↓GACGTC↓AACA↓AGCTTCTGCA↓GG↓TCGACGAGCT↓C

REKAYASA GENETIKA“Manipulasi DNA di luar sel untuk menciptakan gen-gen buatan atau kombinasi barugen-gen yang sudah dirancang dan ditentukan sebelumnya dengan tujuan yang jelas”

TEKNIK DNA REKOMBINAN“Suatu teknik mengisolasi gen-gen dari suatu organisme, mengkombinasikan kembalidengan DNA lain, untuk dapat diperbanyak dalam sel induk”

Langkah-langkah:

1. Pemotongan molekul DNA

DNA dari organisme donor dipotong dngan enzim restriksi (restriction endonuclease). Tiap enzim mempunyai tempat pemotongan yang spesifik.

Misalnya: Enzim EcoRI selalu memotong DNA pada posisis G AATTC

Sebelum dipotong:G G C C T G A A T T C C TA CC C G G A C T T A A G G A T G1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15 bp (base pairs) Setelah dipotong dengan EcoRIG G CC T G dan A A T T C C TA CC C G G A C T T A A G G A T GJenis pemotongan seperti ini disebut “sticky end”

Ada juga enzim yang memotong molekul DNA dengan struktur yang lain,misalnya enzim Haelll yang memotong pada posisi GG CCSebelum dipotong:G G C C T G A A T T C C T A CC C G G A C T T A A G G A T G

Setelah dipotong dengan Haelll:G G dan C C T G A A T T C C T A CC C G G A C T T A A G G A T G potongan jenis “blunt end”(tumpul)

2. Penggabungan molekul DNA

Dua molekul DNA dapat digabungkan kembali dengan menggunakan enzim ligase.

Contoh: enzim E. coli DNA ligase dan T4 DNA ligase (enzim yang dihasilkan E. coli yang terinfeksi virus T4).

Kedua enzim mensintesa pembentukan ikatan “phosphodiester”yang menghubungkanantara satu nukleotida dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaannya hanyalah pada “cofactor” yang membantu reaksi pembentukan ikatantersebut.

Cofaktor untuk T4 DNA ligase adalah ATP

Cofaktor untu E. coli DNA ligase adalah NAD+ (Nicotinamide Adenin Dinucleotida)

molekul A + molekul B molekul ABATATGTGTG CCGTACGT ATATGTGTGCCGTACGTTATAC ACACGGCATGCA TATACACACGGCATGCA

PLASMID

Plasmid merupakan molekul DNA di luar kromosom (dalam sitoplasma), biasanyaberbentuk bulat dan mampu berkembang biak sendiri.

Panjang molekul DNA-nya bervariasi antara 1000 pasang basa (1 kbp) sampaidengan 200 000 pasang basa (200 kbp).

Plasmid biasa digunakan sebagai alat untuk memindahkan./membawa gen dari satuorganisme ke organisme lain vektor

Plasmid mempunyai beberapa gen yang ikut berperan dalam menentukan sifat selpembawanya, seperti ketahanan terhadap antibiotik tertentu, logam berat, penghasil enzim β-galactosidase, dan sebagainya.

Gen-gen ini dapat berfungsi sebagai “marker” dalam menyeleksi sel rekombinandari sel-sel lainnya.

3. Transformasi

Setelah DNA dari organisme donor dan DNA dari plasmid dipotong dengan enzimretriksi yang sama, kemudian digabungkan kembali dengan emzim ligase, makatugas selanjutnya adalah memasukkan plasmid ke dalam sel untuk dapatdikembangbiakkan.

4. Seleksi Sel RekombinanPerlakuan pemotongan, penyelipan gen asing dan penyambungan kembali dapatmengakibatkan aktif atau inaktifnya “selectable markers”.

Sebagai contoh, gen Lac Z, bakteri yang mengandung Lac Z bila ditempatkan padamedia yang mengandung Xgal, akan membentuk koloni berwarna biru tua. Bila gen ini rusak atau dirusak, akan menimbulkan koloni berwarna putih.Dengan cara melihat perubahan warna koloni inilah manusia dapat memonitorberhasil tidaknya suatu gen asing disisipkan, karena ukuran molekul DNA yang sangat kecil tidak memungkinkan manusia melihat DNA tersebut.