Teknologi DNA RekombinanTeknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya. DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan memiliki dua keuntungan. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksisecara konvensional.Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. Gambar 2 menunjukan proses DNA rekombinan.

Gambar 2. Proses DNA rekombinan

www.wikipedia.com

Unsur-unsur yang diperlukan dalam pembentukan DNA rekombinan adalah plasmid, enzim restriksi, DNA ligase, dan tranformasi. Tranformasi merupakan pemindahan potongan segmen DNA dari suatu organisme ke mikroorganisme yang lain. Berikut ini merupakan perangkat yang diperlukan : 1. Plasmid: Plasmid merupakan molekul DNA sirkular berukuran kecil umumnya berasal dari bakteri, sering dianggap sebagai ektrakromosom Terdapat pada bakteri DNA selain kromosom Berbentuk sirkuler Umumnya berukuran kecil( lebihkecildari ukuran kromosombakteri ) Jenis, jumlah, dan ukurannya bervariasi antar sel dan antar jenis bakteri

Fungsi plasmid pada pembentukan DNA rekombinan:a. Digunakan sebagai vector untuk klon gen atau klon fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri.b. Untuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan bantuan sel bakteri

2. Enzim restriksiEnzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang basa. enzym restriksi dapat menghasilkan potongan DNA dengan bentuk sticky ends (ujung lancip) sehingga mampu berpasangan dengan basa yang cocok/sesuai. Contoh dari enzim restristik adalah : Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali olehHerbert Boyer tahun1969 dari E.coli. Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G danA pada sekuens GAATTC. Perhatikan pada gambar 3.

Gambar 3. Enzim EcoR1

Sumber : academic.brooklyn.cuny.edu

Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan, yaitu enzim restriksi tipe I, tipe II dan tipe III. Enzim restristik tipe IMemotong DNA secara acak dan jauh dari sekuen pengenalannya. Enzim ini tidak dapat menghasilkan potongan fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.

Enzim restristik tipe IIMemiliki ciri sebagai berikut : Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hinggan tujuh basa di dalam molekul dna Memotong ke dua untai molekul DNA ditempat tertentu Menghasilkan fragmen-fragmen DNA Tipe ini yang umum digunakan adalah EcoRI

Enzim restristik tipe IIIEnzim yang tidak digunakan dalam laboratorium, hal ini dikarenakan enzim ini memotong diluar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna

3. Dna ligase DNA ligasemerupakanenzimyang dapat mengkatalisis pembentukanikatan fosfodiesterantara ujung 5-fosfat dan 3-hidroksil yang digunakan saat proses ligasi padaDNAyang mengalamipemotongan dengan enzim restriksi sebelumnya. DNA ligase diperlukan untuk menggabungkanfragmensaat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA. DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaituNAD+atauATP.DNA ligase NAD+-dependentditemukan hanya di bakteri, Sementara DNA ligase ATP-dependentditemukan di bakteriofage, eubacteria, archae danvirus. DNA ligase ATP-dependentyang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase.

Isolasi DNAIsolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yangdapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-lelehmaupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalahlisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalammedium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukandengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasimenggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alcohol.