Pengujian mikrobiologik terhadap produk perbekalan farmasi dan makanan yang

beredar di seluruh Indonesia sangat perlu dilakukan, dengan mengingat bahwa produk

tersebut sangat mudah dikontaminasi oleh mikroorganisme. Keberadaan mikroorganisme

dalam perbekalan farmasi dan makanan tidak diharapkan, karena dapat berdampak

negatif terhadap kesehatan para konsumen. Di samping itu juga dalam rangka

menghadapi era globalisasi dan ketersediaan semua produk-produk dalam bentuk siap

pakai, maka pengontrolan perbekalan farmasi dan makanan mutlak dibutuhkan.(3 ; 206).

Untuk menghitung secara kuantitatif mikrobiologis suatu bahan dapat dilakukan

atas beberapa kelompok yaitu:

1. Perhitungan jumlah sel

a. Hitungan mikroskopik

b. Hitungan cawan

c. MPN (Most Probable Number)

2. Perhitungan massa sel secara langsung

a. Volumetrik

b. Gravimetrik

c. Kekeruhan (turbidimetri)

3. Perhitungan massa sel secara tidak langsung

a. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP dan sebagainya)

b. Analisis produk katabolisme (metabolit primer, sekunder atau panas).

c. Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogrn, oksigen,asam amino, mineral dan

sebagainya).

(4;216)

Metode Perhitungan Cawan

Jumlah koliform dalam contoh dapat dihitung dengan metode hitungan cawan

menggunakan agar VRB (Violet Red Bile) atau agar DL (Desoxycholate Lactose). Dalam

penggunaan medium ini, setelah agar membeku pada bagian atasnya diruangkan lagi

medium yang sama sebanyak 4-5 ml per cawan berdiameter 10 cm, sehingga diperoleh

lapisan tipis pada permukaan agar, dan koloni tumbuh di bawah permukaan agar (sub

permukaan).(5;70)

Inkubasi cawan yang mengandung agar VRB atau agar DL harus dilakukan pada

suhu 35o atau 37o selama 24 jam atau kurang. Pada inkubasi yang terlalu lama, bakteri

gram negatif lainnya mungkin tumbuh sehingga membingungkan dalam menghitung

koloni yang spesifik koliform.(5;70)

Prinsip Metode MPN

Berbeda dengan metode cawan di mana digunakan medium padat (agar), dalam

metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi di mana perhitungan

dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif , yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba

setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatn tabung yang positif dapat

dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung

Durham untuk mikroba pembentuk gas.(5;70)

Dalam metode MPN, pengenceran harus dilaksanakan sedemikian rupa sehingga

beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil

pengenceran tersebut mangandung satu sel mikroba, beberapa tabung mungkin

mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel.(5;71)

Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam

contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk

padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. grup

mikrobayang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium

yang digunakan untuk pertumbuhan.(5;71)

Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara.

1. Jumlah bakteri secara keseluruhah (total cell count). Pada cara ini dihitung semua

bakteri baik yang hidup maupun yang mati.

2. Jumlah bakteri yang hidup (viable count). Cara ini hanya menggambarkan jumlah sel

yang hidup, sehingga labih tepat bila dibandingkan teknik pada butir 1.

Perhitungan Bakteri Secara Keseluruhan

a. Menghitung Langsung Secara Mikroskopik

Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Untuk ini

digunakan kaca objek khusus yang bergaris (Petroff-Hauser) berbentuk bujur sangkar.

Jumlah cairan yang terdapat antara kaca objek dan kaca penutup mempunyai volume

tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam bujur sangkar juga tertentu.(6;47)

b. Menghitung Dengan Cara Kekeruhan

Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar teknik ini adalah

banyaknya cahaya yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya banyaknya sel bakteri

pada batas-batas tertentu.(6;47)

Perhitungan Jumlah Bakteri

a. Teknik Agar Tuang-Standard Plate Count

Pada cara ini dilakukan pengenceran dengan menggunakan sejumlah botol

pengencer yang diisi aquadestillata steril. Agar cair didinginkan sampai suhu sekitar 44o

C dan baru kemudian dituangkan kle dalam cawan Petri. Setelah agar membeku cawan

dieramkan selama 24-48 jam (37o C). lempengan yang dapat digunakan dalam

perhitungan bakteri adalah lempengan yang mengandung 30-300 koloni. Jumlah bakteri

permililiter ialah jumlah koloni dikalikan faktor pengenceran.

b. Perhitungan Agar Tuang-Plate Count

c. Teknik Agar Sebar

(6;49-51)

Metode Kerapatan Optik

Jumlah mikroorganisme dalam suatu suspensi dapat ditentukan dengan menentukan

kerapatan optik (OD = optical density). Pengukuran kerapatan optik menggunakan

olorimeter yang membiaskan cahaya engan gelombang tertentu. Gelombang cahaya

melewati suspensi biakan dan banyaknya cahaya yang ditransmisikan setelah melewati

suspensi diukur. Jumlah cahaya yang ditransmisikan setelah melewati suspensi akan

berbanding terbalik dengan jumlah mikroorganisme dan jumlah cahaya yang diabsorpsi.

Jumlah cahaya yang diabsorpsi tergantung pada bentuk dan besar sel.(6;52)

Kerapatan optik dalam suatu suspensi tidak langsung menunjukkan jumlah sel

dalam suatu populasi, namun menunjukkan jumlah cahaya yang disebarkan oleh populasi

tersebut. untuk memperoleh jumlah mikroorganisme, maka nilai kerapatan optik harus

disetarakan terlebih dahulu dengan jumlah mikroorganisme (CFU/ml). untuk memperoleh

nilai ini dilakukan berbagai pengenceran sampel yang digunakan dalam OD. Jumlah

mikroorganisme ditentukan dengan cara jumlah hitung mikroorganisme hidup (viable

count). Setelah diperoleh nilai ini dibuat kurva kalibrasi dengan sumbu X sebagai jumlah

hidup (viable count) dan sumbu Y sebagai nilai OD.(6;52)

3. Djide, M. Natsir, Sartini, (2005), Analisis Mikrobiologi Farmasi , Universitas Hasanuddin, Makassar.

4. Djide, M. Natsir, Sartini, (2005), Mikrobiologi Farmasi Dasar, Universitas Hasanuddin, Makassar.

5. Fradiaz, Srikandi, (1994), Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta.

6. Lay, Bibiana W., ( ), Analisis Mikroba di Laboratorium, Institut Pertanian Bogor, Bandung