perlu diwarnai.
  Gelas alas bersih dan bebas lemak
  Umur biakan: 18-24 jam, kecuali bakteri tahan asam (M.tuberculosis) yang tumbuhnya sangat
lambat. Bakteri mengalami perubahan dalam morfologi dan strukturnya, sehingga hasil yang
diperoleh kurang tepat, bila dipakai biakan berumur kurang lebih dari 24 jam.
  Kualitas zat warna. Ada zat warna yang harus dibuat sesaat sebelum dipakai dan ada yang hanya
dapat disimpan selama beberapa waktu.
  Tebal tipisnya sediaan. Bila sediaan terlalu tebal atau tidak rata, maka penetrasi zat warna akan
berbeda-beda.
Cara memebuat sediaan.
Suspensi bakteri, yaitu satu tetes air garam faal diatas gelas alas ditambah biakan bakteri, disebar setipis
mungkin sehingga membentuk lingkaran dengan diameter kira-kira 1 cm. Sediaan dibiarkan mongering
diudara atau dapat dipercepat pengeringannya dengan menghangatkan diatas api, kemudian
direkatkan/difiksasi dengan melewatkan diatas api 3 kali dan siap untuk diwarnai.
Jenis-jenis pewarnaan bakteri yang dikenal adalah :
1.  Pewarnaan negative (back ground staining)
2.  Pewarnaan sederhana
3.  Pewarnaan diferensial
4.  Pewarnaan khusus
Suspensi bakteri dibuat dalam zat warna negrosin/tinta bak dan disebar-ratakan dengan gelas alas lain
(sediaan hapus). Disini bakteri tidak diwarnai dan tampak sebagai benda-benda terang dengan latar
belakang hitam. Pewarnaan ini dipakai untuk bakteri yang sukar diwarnai, misalkan Spirochaeta
(Triponema,Leptospira,dan Borrelia) 
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Misalkan biru metilen, air fukhsin atau ungu
Kristal selama 1-2 menit. Zat warna aniline sangat mudah diserap oleh bakteri.
Pewarnaan Diferensial
a.  Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat penting. Ditemukan oleh Christian
Gram pd thn 1884
 
Pewarnaan Gram.
Cara pewarnaan :
1)  Sediaan sudah direkatkan diwarnai dengan karbol Kristal ungu selama 5 menit.
2)  Zat warna dibuang dan diganti dengan lar. Lugol dibiarkan selama 45-60 detik.
3)  
Lar. Lugol dibuang dan srdiaan dicuci dengan alcohol 96% selama 30 detik atau digoyang-
goyangkan sampai tidak ada zat warna yang mengalir lagi.
4)  Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan air fukhsin selama 1-2 menit. Sediaan dicuci,
dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop.
Keterangan:
1)  Setelah diberi karbol ungu Kristal semua bakteri menjadi ungu, zat warna diserap dalam dinding
sel dan protoplasma
tengguli kotor.
3)  Pencucian dengan alcohol menyebabkan terjadinya diferensiasi dari dua macam bakteri :
  Bakteri tetap berwarna ungu
  Bakteri tidak berwarna, sebab zat warna yang dilarutkan oleh alcohol dan keluar dari sel
bakteri.
4)  Fukhsin sebagai pewarna kontras (counterstain) mewarnai bakteri yang tidak berwarna menjadi
merah.
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu
bakteri.
Beberapa perbedaan sifat yang dijumpai antara bakteri positif Gram dan bakteri negatif Gram.
Berdasarkan Bakteri Positif Gram Bakteri Negatif Gram
Dinding sel :
Kadar lipid 1-4% 11-22%
Kepekaan terhadap jodium Lbh peka Kurang peka
Toksin yang dibentuk eksotoksin Endotoksin
Resistensi terhadap tellurit Lbh tahan Lbh peka
Sifat tahan asam Ada yg tahan asam Tidak ada yang tahan asam
Kepekaan terhadap penisilin Lbh peka Kurang peka
Kepekaan terhadap
  Bakteri berbentuk kokus yang pathogen terhadap manusia bersifat positif Gram, kecuali kokus
dari famili Neisseriaceae 
 
Bakteri berbentuk batang atau spiral yang patogen bagi manusia umumnya bersifat negatif
Gram, kecuali batang dari genus.
Pewarnaan Tahan Asam.
  Pewarnaan Ziehl-Neelsen.
Cara pewarnaan :
1.  Sediaan bakteri diwarnai dengan larutan fukhsin karbol dan dipanaskan dengan api kecil
sehingga keluar asap, dibiarkan selama 5 menit.
2.  Sediaan dicuci dengan air dan dimasukkan dalam lar. H2SO4 5% selama 2 dtk. Untuk
ukuran bakteri M.Leprae digunakan larutan H2SO4 1%.
3.  Kemudian dicuci dengan alcohol 60% sehingga tidak ada warna merah mengalir.
4.  Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan larutan biru metilen selama 1-2 menit,
dicuci dengan air dan dikeringkan
Hasil dapat dibaca sebagai berikut :
o  Bakteri tahan asam berwarna merah
o  Bukan bakteri tahan asam berwarna biru
Sesudah pencucian dengan asam-alkohol bakteri tahan asam akan mempertahankan warna merahnya,
sedangkan bakteri bukan tahan asam akan melepaskan warna ini menjadi tdk berwarna. Sifat tahan
asam ini disebabkan karena terdapat asam mikolat yang terikat dalam dinding sel.
  Pewarnaan Kinyoun-Gabbett
Cara pewarnaan :
1.  Sediaan bakteri diwarnai dengan larutan Kinyoun selama 3 menit dan dicuci dengan air.
2.  Sediaan diwarnai dengan larutan Gabbett selama 1 menit, dicuci dengan air dan
dikeringkan.
Pewarnaan Khusus (special staining)
Pewarnaan ini dipakai untuk mewarnai bagian sel bakteri atau bakteri tertentu yang sukar diwarnai
dengan pewarna biasa.
  Spora dengan pewarnaan Klein.
  Inti dengan pewarnaan Feulgen.
  Difteri dengan pewarnaan Neisser.