pgd (1)
TRANSCRIPT
PREİMPLANTASYON GENETİK TANI
Doç. Dr. Muammer Doğan
PGD
Asıl düşünce doğal gebelik ve prenatal tanı.
PGD- IVF sonrası oluşan embryo.Oosit veya embryonal materyalin spesifik
genetik anormallikler açısından invitro kültür ortamlarında test edilmesi.
Tanı sonrası etkilenmemiş embryoların selektif transferi.
PGD
Konjenital geçişli hastalık taşıyıcılarının hastalığı çocuklarına geçirmeleri konusunda klinik bilgi vererek yardım.
Kesin sensitif ve hızlı tanı(12-48 saat)
PGD
Günümüzde PGD sıklıkla IVF başarısını yükseltmek için anöploidik embryoların saptanımında kullanılmaktadır.
PGD- Kimlere ?
Kromozomal anormalikleri olan infertil çiftler, CF taşıyıcıları veya Y kromozomal delesyonu olanlar
Kromozomal anomali nedenli tekrarlayan düşükler
Tekrarlayan IVF başarısızlığıTerminasyona dini veya
ahlaksal karşı olma?
BİOPSİZona Drilling
–Mekanik–Kimyasal ( asit tyrodes)
–LazerAspirasyon
MEKANİK • Cam mikroiğne
• ZP’ da V veya ⊔ flap kaldırımı
• Fazla zaman alır, ileri tecrübe gerektirir.
Verlisky Y, An atlas of PGD 2000.
KİMYASAL 12 mm pipetAsit Tyrode (Ph 2.35)Bastomer 3 hizasına getirilir.İlk kullanılan ve halen en sık tercih edilen
yöntemdir. ESHRE PGD Consortium Steering Committee Hum Reprod 2000;15:2673.
KONTAKT LAZER
Nontouch microdrilling.Embryoyu kültür mediumundan almak gerekmez.
Germond M Hum Reprod 1996;11:1043.Hızlı en kesin ve güvenilir yöntemdir.En sık kullanılan rutin yöntem olabilmesi için insan embryosundaki güvenirliği tam ispatlanmamıştır.ESHRE PGD Consortium Steering Committee Hum
Reprod 2000;15:2673.
KONTAKT LAZER
Alınacak blastomer 3 hizasına getirilir. Hücreli blastomer seçilir.( DNA analizi)Hücre görülemiyorsa blastomer
büyüklüğü ve sitoplazma görüntüsüne göre seçim yapılır.
30-40 μm cam pipetBiopsi sonrası alınan hücre
mikromaniplasyon dish’inde ve oda sıcaklığında bırakılabilir.
Embryoların implantasyon öncesi taraması yeni değildir. Tavşan blastokist biopsisi ile sex -spesifik kromatin örnekleri kullanımı.
Gardner RL, Edwards RG Nature 1968 ; 218:346.
PGD
PGD
• PGD için PCR yapılan tüm olgularda ICSI önerilmektedir.
( IVF sonrası zona pellücidada
kalabilecek fazla spermler paternal DNA ile PCR reaksiyonunu
kontamine ederek yanlış tanıya yol açabilir.)
Bazı PGD merkezlerinde istenmeyen FF den kaçınmak için rutin ICSI uygulanmaktadır.
Vandervorst M, Hum Reprod
Update
2000;6:364.
BİOPSİ
•Polar Body•Cleavage embryo•Blastocyst
PB BİYOPSİSİSadece oositin mayoz sonrası oluşan yan
ürünlerinin (PB) genetik analizini yapar. (oosit/zigot)
1. ve 2. Polar body’e gereksinim vardır.Çalışılan materyal extra-embryonik kökenlidir.Sadece maternal genotip hakkında bilgi verir
(Ör; yaşa bağımlı anöploidi). Paternal kökenli defektler saptanamaz.
Rechitsky S, J Assist Reprod Genet 1999;16:192.
.
PB BİYOPSİSİ
PGD yapılamadığında alternatif sunar.Fertilizasyon veya embryonik bölünme
sonrası gelişen problemler belirlenemez.Rechitsky S, J Assist Reprod
Genet 1999;16:192.
ABD’nde 2-3 grup kullanmaktadır
İşlemi zordur.
PB 1 – I. Mayoz bölünmenin yan ürünüdür. Oosit kromozomlarının kopyasını içerir. Diploidiktir.
PB 2 - Fertilizasyon sonrası oosit kromozom sayısı yarıya iner. Diğer yarı PB 2 ile atılır. Haploidiktir.
PB 1 Biopsisi
OPU sonrası ∼ 4. saatte oositten mikromaniplasyonla alınır. PB 1 genellikle oolemmadan ayrıktır.
1 saat içinde ICSI uygulanır. ( Sperm DNA kontaminasyonu ve polispermiden kaçınma)
Fertilite ve klivajı etkilemez.♀ translokasyon olgularında avantajlıdır
(FISH)Munnes S, Fertil Steril 2000;73:1209.
PB 2 BİYOPSİSİ
PB 1 nin alındığı girişten alınır.Biopsi sonrası oositler
klivaj kontrolüne kadar inkübe
edilir.
CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ
İnseminasyon sonrası 62-64 saat (Compaction)
ZP da 20-25 μm çaplı açıklık 8-16 cell aşaması16 cell aşamada tight junction
oluşumu başlar.Çoğu merkezin tercihidir.
CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ
Blastomerler totipotenttir.Compaction ve hücre lisisi problem
yaratabilir.Analiz için 1-2 hücre alınır.
Asıl dezavantajı analiz için alınan
materyal miktarının kısıtlılığıdır.
CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ
Mg ve Ca içermeyen kültürlerde kısa süreli inkübasyon yapılarak sellüler bağlantılar zayıflatılır. Hücreler arası adezyon ve bağlantı bölgeleri serbestleştirilir ve işlem kolaylaşır.
De Vos & Van Steirteghem AC, Prenat Diagn 2001;21:767.
CLEAVAGE STAGE –BLASTOMER BİOPSİSİ
1 v 2 cell Alınımı?İki hücre alımı ile embryonik hücre kitlesi azalır ve
gelişim kapasitesi azalabilir.İki hücrenin tanısı da benzerse tanı etkinliği artar.İki hücre tanısı arasındaki farklılık ET etkileyerek PR’
azaltır.
DeVos & Van Steirteghem AC, Prenat Diag 2001;21:767.Lewis CM, Hum Reprod 2001;16:43.Van de Velde H, Prenat Diag 2000;20:1030.
BLASTOKİST BİOPSİSİ
D5-D6 uygulanır. Kliniğe rutin girmemiştir. Embryo 300’ den fazla hücre içerir. PB ve
cleavage stage embryodan daha fazla hücre alınabilir. (Doğru ve yeterli tanı) Tanı süresi kısalır.Ama her zaman yeterli embryo olmayabilirTrophectoderm hücreler alınır. (Erken CVS) ICM (fetal kısım) hasarı olmaz. (Etik sorunlar azalır.)
BLASTOKİST BİOPSİSİZP ‘da delik açılır. Özel iğnelerle yumuşak ayırma hareketleri veya trophectodermal vesikülün herniasyonu sonrası hücreler alınabilir. ( 10 hücre. Erken gelişim etkilenmez
Viega A, Zygote 1997;5:351.
BLASTOKİST BİOPSİSİ
Sequential medium kullanımı , biopsi sonrası canlı doğumlar uygulanımı cesaretlendirip yaygınlaştırdı. Gardner DK, Hum Reprod1998;13:3434.
Blastokist biopsisi ve PGD analizi ile ilk canlı doğum.De Boer K, Reprod Biomed Online 2002;4:35.Biyopsi sonrası fötal gelişim
etkilenimi açısından yeterli bilgi yoktur.
BİOPSİ SONRASI KRYOPREZERVASYON
ZP bütünlüğü bozulmuştur.İntakt ZP da cryoprotectan’ ın yavaş
difüzyonu.Biopsi sonrası embryo viabilitesi, aynı
aşama biopsi yapılmayan embryolara göre
daha kötüdür.Jaris H , Hum Reprod
1999;14:2933.
BİOPSİ SONRASI KRYOPREZERVASYON
PB BiopsisiLee M, Fertil Steril 2000;73:645.
Cleavage stage embryo biyopsisi Wilton LJ, N Engl J Med
2001;345:1537sonrası frozen ET gebelikleri bildirilmiştir.
• Genetik tanı sonrası fazla embryonun rutin freezing’ i ?
Cleavage stage emb.→ Blastokist → freezing → ET (IR %25)
Lalic I, Hum Reprod 2001;16:32.
PGD
İlk başarılı kullanım X’ e bağlı hastalık için PCR tekniği ile uygulandı.– Adrenoleukodystrophy , X- linked
mental reterdasyonHandyside AH, Nature
1990;344:768.
PGD
PGD sonrası ilk canlı doğum bir cystic fibrosis olgusunda gerçekleşti.(♀)
Handyside AH, N Engl J Med 1992;327:905.
PGD-TANI
Polymerase chain reaction (PCR)Spesifik mutasyon analizi
Tek gen defektleri (%90)X’ e bağlı hastalıkta cinsiyet
belirlemeTriplet repeat diseases
(Frajil X, Myotonik distrofi, Huntington)
Saiki RK 1985,Li H 1988.
PGD-TANI
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
Kromozomların analiziX’ e bağlı hastalıkta cinsiyet belirlemeKromozom anormallikleriYaşa bağımlı anöploidi
PCR - TANI
Spesifik mutasyonu analize eder.Tek gen defektleri
Otozomal resesifOtozomal dominant
X’ e bağlı hastalıkta cinsiyet belirleme
Triplet repeat diseases (Frajil X, Myotonik distrofi, Huntington)
PGD-Otozomal resesif
Cystic fibrosisTay Sachs hastalığıRh tipiThalessemi
PGD-Otozomal dominant
Marfan sendromuHuntington koresiGenetik geçişli kanserler
Polyposis coli
PGD- X’e bağımlı spesifik tanı
Duchenne musküler distrofi
Becker musküler distrofiHemofiliCharcot Marie Tooth
KROMOZOM ANORMALLİKLERİ
Kromozomların yeniden düzenlenmesiReciprocal translokasyon 1/500 canlı doğumRobertsonian translokasyon
1/1000 İnsersiyonlarİnversiyonlar
YAŞA BAĞIMLI ANÖPLOİDİ
Düşük gebelik oranlarıYüksek abortus oranlarıIVF hastaları-ortalama yaş 35FISH (kromozom 13,16,18,21,22,X,Y)Problemler- Yaşlı hastalardan az oositMozaisizmKüçük kromozomlar
PGD• Embryonik hücre sitoplazmik enzim aktivitesi
değerlendirimi ilk kez PGD ile başarıldı.Severe combined immunodeficiency disorder Adenosine deaminase deficiency
Benson C;1988 , Monk M ; 1987.Lesch-Nyhan Syndrome
Hypoxanthinephosphoribosyl transferase deficiency
Tay-Sachs Disease Hexosaminidase deficiency
Sermon K ; 1992.
PGD - YANLIŞ TANI
PCRAllelic drop out (ADO- Allellerden birinin
saptanabilecek düzeylere çoğaltımındaki yetersizlik) %10
Kontaminasyon – sperm /kümülüs/ DNA/ hücreler (operatör)
MozaisizmTotal PCR yetersizliği
PGD - YANLIŞ TANI
FISHKontaminasyon –
kümülüsMozaisizmArka planda
boyanmaZayıf sinyalNükleus kaybıCross hibridizasyon
PGD - SINIRLAMALAR
Multistep bir işlemReprodüktif tıp ve genetik
tecrübesini birlikte gerektirir.Tek hücreden tanı zorluğuAllelic drop out (PCR)Mozaisizm
ESHRE PGD CONSORTİUM
1999-20011197 siklus%22.4 klinik PR (/ET)%97 biopsi başarısı%86 tanı5 PCR yanlış tanı1 FISH yanlış tanı Hum Reprod 2002;17:233.
PGD-Anöploidi Screening
İleri maternal yaşTekrarlayan IVF başarısızlığıAnomalili fetus öyküsü
PGD-AS ile Abortus oranı azalmıştır.
% 24.2 → % 9.6Devam eden gebelik oranı artmıştır.
%10.5 → %16.1Munne S, Hum Reprod 1999;14:2191.
PGD - ETİK
IVF ( Tüm hücrelerde N kromozom yapısı <%35 )
İnfertil olmayanlarda IVF gerekliliği ?Embryo çalışmalarıEugenic planlanan bebeklerCinsiyet seçimiİşlem sonrası erken fetal olumsuz etki
görülmemiştir.Bonduelle M, Eur J Hum Genet 1999; 7:38.
PGD - GELECEK
Floresan PCRFindlay I J Assist Reprod Genet
1996;13:96.Kromozomal anormallikler – Comparative
genomic hybridisation (CGH) 2-3gün sürer. Embryo freezingini gerektirir.
Wilton L,Fertil Steril 2001;75:S6İlk canlı doğum bildirilmiştir.
Wilton L, N Eng J Med 2001;345:1537.
PGD - GELECEK
Hastalık sınırlarını genişletmeTüm genom amplifikasyonuDNA fingerprintingKromozom değiştirme
PGD-SONUÇ
Reprodüktif tıpta 10 yıllık PGD tecrübesi ~ 2500 siklusPGD terapötik abortusa alternatif bir
yöntemdir.Etkilenmiş fetusları belirlemede güvenilirdir.
PGD özellikle anoploidi taramasında etkin olup, seçilmiş patolojilerde eve sağlıklı bebek götürme oranlarını yükseltir.
Yine de PGD nin etkinliğine rağmen prenatal tanı ilk tercih olmalıdır.