phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------

NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID BENZOIC,

SORBIC, MUỐI CỦA CHÚNG VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐƢỜNG HÓA

HỌC TRONG ĐỐI TƢỢNG THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NGUYỄN THỊ HỒNG THÚY

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID

BENZOICSORBIC, MUỐI CỦA CHÚNG VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU

ĐƢỜNG HÓA HỌC TRONG ĐỐI TƢỢNG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – Năm 2014

i

LƠI CAM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận đƣợc sự

giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè, đồng nghiệp, những ngƣời thân

trong gia đình và các cơ quan có liên quan.

Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới:

PGS.TS. Tạ Thị Thảo

cô đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn

thành đề tài này.

Tôi vô cùng biết ơn Tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Bộ môn

Hóa Phân tích- trương Đai hoc Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã

tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Labo Xét nghiệm An toan vê sinh

Thưc phâm, Khoa Y tế Công cộng / Y học Dự phòng, Khoa Xét nghiệm - Trường

Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, cho tôi cơ hội đƣợc đi học chuyên sâu vê xet

nghiêm Hoa - Độc, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác để tôi hoàn thành

đề tài nghiên cứu.

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã hết lòng

ủng hộ, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài.

Nguyễn Thị Hồng Thúy

ii

LƠI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan , luân văn nay la kêt qua nghiên cưu va lam viêc cua tôi , các kêt

quả, sô liêu cua luân văn la trung thưc, thưc tê tai nơi nghiên cưu.

Hải Dương, tháng 12 năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng Thúy

Học viên cao học khoá học 2012-2014

iii

MỤC LỤC

LƠI CAM ƠN ............................................................................................................................. i

LƠI CAM ĐOAN ...................................................................................................................... ii

DANH MUC CAC KÝ HIỆU, CAC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................ v

DANH MỤC CAC BANG ...................................................................................................... vi

DANH MUC CAC SƠ ĐÔ, HINH VE ................................................................................. vii

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................................... 1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt ........................................ 3

1.1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam ............. 3

1.1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và

saccharin, aspartam. ............................................................................................ 4

1.2. Một số phƣơng pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và

aspartam ................................................................................................................... 7

1.2.1. Phƣơng pháp trắc quang ........................................................................... 7

1.2.2 Phƣơng pháp chuẩn độ .............................................................................. 9

1.2.3. Phƣơng pháp điện di mao quản (CE) ....................................................... 9

1.2.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................ 11

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHAP NGHIÊN CỨU ............................... 14

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 14

2.1.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................... 14

2.1.2. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm lấy mẫu phân tích .............................. 14

2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu ................................... 14

2.2.1. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................. 14

2.2.2. Hóa chất, thuốc thử ................................................................................ 15

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 16

2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ ........................................... 16

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích ......................... 17

2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu : .................................................................... 22

iv

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 23

3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích .............................................. 23

3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích ............................................................ 23

3.1.2. Tối ƣu quá trình xử lý mẫu ..................................................................... 33

3.2. Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp .................................................... 38

3.2.1. Kêt qua nghiên cƣu tính phù hợp của hệ thống ...................................... 38

3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc .......................................................................... 38

3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị đo ..................... 40

3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ................ 58

3.2.5. Khoảng tuyến tính .................................................................................. 41

3.2.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích .................................................... 43

3.2.8. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp bằng phân tích đối chứng ...... 58

CHƢƠNG IV: KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI .................................................................... 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 63

PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 66

v

DANH MUC CAC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

AOAC Assosiation of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hóa phân tích

chính thức)

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

Asp Aspartam

BA Acid benzoic

BYT Bộ y tế

DAD Diode Array Detector (Detector mảng diod)

GC Gas chromatography (Sắc ký khí)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

R (%) Độ thu hồi (đơn vi %)

Sac Saccharin

SA Acid sorbic

KPH Không phat hiên (nhỏ hơn ngƣỡng phát hiện của phƣơng pháp)

MeOH Methanol

LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lƣợng)

S/N Signal to noise ratio (Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)

SOP Standard Operation Procedure (Quy trình thao tác chuẩn)

ppm Nông đô ppm (mg/kg)

QC Quality control (Kiểm soát chất lƣợng).

RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tƣơng đối)

UV-VIS Ultraviolet – Visible (Tử ngoại khả kiến)

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam.

INS International numbering system (hệ thống đánh số quốc tế).

ADI Acceptable daily intake (lƣợng ăn vào hằng ngày có thể chấp nhận đƣợc)

ML Maximum Level (lƣợng phụ gia tối đa của một chất phụ gia thực phẩm),

tính bằng mg/kg thực phẩm dạng rắn và mg/l đối với thực phẩm dạng lỏng

CTCT Công thức cấu tạo

CTPT Công thức phân tử

KLPT Khối lƣợng phân tử

vi

DANH MỤC CAC BANG

Bảng 1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam .......................... 3

Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật ........................................... 4

Bảng 3.1 : Ảnh hƣởng bản chất cột đến thời gian lƣu và diện tích pic .... Error! Bookmark

not defined.

Bảng 3.2: Tính chất của 1 sô loai dung môi dung lam pha đông ......................................... 26

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng thành phần pha động đến thời gian lƣu và diện tích pic................... 26

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của pH pha động đến thời gian lƣu của chất phân tích .................... 28

Bảng 3.5. Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 ................................................................... 30

Bảng 3.6. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3 .......................................... 31

Bảng 3.7. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4 .......................................... 31

Bảng 3.8. Diện tích pic theo các chƣơng trình gradient ........................................................ 32

Bảng 3.9. Chƣơng trình gradient pha động và tốc độ dòng tối ƣu ........................................ 33

Bảng 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm ............................................... 35

Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thể tích MeOH thêm vào mẫu .......................... 36

Bảng 3.12: Kêt qua tinh toan sự phù hợp của hệ thống ......................................................... 38

Bảng 3.13. Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích ........................................ 40

Bảng 3.14 : Giới hạn phát hiện của thiết bị đối với các chất đang nghiên cứu .................... 40

Bảng 3.15. LOD và LOQ của từng nền mẫu ......................................................................... 58

Bảng 3.16: Phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ ............................................................. 42

Bảng 3.17: Phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan của đƣờng chuẩn ........................... 44

Bảng 3.18: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng saccharin trong mẫu thực (n=6) .............. 44

Bảng 3.19: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng aspartam trong mẫu thực (n=6)............... 46

Bảng 3.20: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng acid benzoic trong mẫu thực (n=6) ......... 47

Bảng 3.21: Kết quả phân tích lặp lại hàm lƣợng acid sorbic trong mẫu thực (n=6) ............ 49

Bảng 3.22: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu xúc xích .................... 51

Bảng 3.23: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu bánh đậu xanh .......... 52

Bảng 3.24: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu thạch bách vị ............ 53

Bảng 3.25: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu dƣa chuột muối ........ 54

Bảng 3.26: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu ô mai .................... 55

Bảng 3.27: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu kẹo ........................ 56

Bảng 3.28: Kết quả xác định độ thu hồi của phƣơng pháp trên mẫu nƣớc ngọt ............ 57

Bảng 3.29. Kết quả mẫu kiểm nghiệm đối chứng ................................................................. 60

vii

DANH MUC CAC SƠ ĐÔ, HINH VE

Sơ đồ 2.1. Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010 ......................................................... 17

Sơ đồ 2.2: Qui trình phân tích mẫu dự kiên ........................................................................... 34

Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam ............................................................................ 23

Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic .............................................................................................. 24

Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic ................................................................................................ 24

Hình 3.4. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C8 (150mm× 4,6mm × 5μm) ...... Error!

Bookmark not defined.

Hình 3.5. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chất bằng cột C18 (150mm×4,6mm× 5μm) ...... Error!

Bookmark not defined.

Hình 3.6. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm) ............ 25

Hình 3.7: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích, thành phần pha động K2HPO4 : ACN = 80 : 20

(v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm. ....................................................................... 27

Hình 3.8. Sắc đồ các chất phân tích theo chê độ gradient 1 ................................................. 29

Hình 3.9. Sắc đồ các chất phân tích theo chê độ gradient 2 ................................................. 30

Hình 3.10. Sắc đồ các chất phân tích theo chê độ gradient 3 ............................................... 31

Hình 3.11. Sắc đồ các chất phân tích theo chê độ gradient 4 ............................................... 32

Hình 3.12: Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B) ............................. 39

Hình 3.13: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin .......................................................... 40

Hình 3.14: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam .......................................................... 41

Hình 3.15: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid benzoic..................................................... 41

Hình 3.16: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid sorbic ....................................................... 41

Hình 3.17: Đường chuẩn của saccharin trong khoảng nông độ 0,02 ÷ 80 ppm ................. 42

Hình 3.18: Đường chuẩn của aspartam trong khoảng nông độ 0,5 ÷ 90 ppm ................... 42

Hình3.19: Đường chuẩn của A. benzoic trong khoảng nông độ 0,08÷90 ppm ................... 43

Hình 3.20: Đường chuẩn của A.sorbic trong khoảng nông độ 0,01 ÷ 85 ppm ................... 43

Hình 3.21. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp chuẩn 1 ppm của các chất phân tích. ............................ 43

Hình 3.22. Sắc đồ của mẫu nước ngọt ................................................................................... 50

Nguyễn Thị Hồng Thúy 1 Trường ĐH Khoa học Tự nhiên

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất lƣợng thực phẩm nói chung, chất lƣợng an toàn vệ sinh thực phẩm nói

riêng là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe con

ngƣời và nền kinh tế của xã hội.

Gần đây, liên tiếp xảy ra các vụ ngộ độc tại nhiều địa phƣơng trên toàn quốc,

cũng nhƣ việc xuất hiện nhiều mặt hàng không rõ nguồn gốc xuất xứ hoặc sử dụng

những phụ gia ngoài danh mục cho phép hay sử dụng quá hàm lƣợng cho phép. Tác

hại do sử dụng phụ gia sai quy định có thể ảnh hƣởng đối với sức khỏe con ngƣời.

Những tác động này thƣờng không xảy ra cấp tính, rầm rộ và nguy kịch mà diễn

biến lâu dài do tích lũy trong cơ thể. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ở Việt Nam hàng

năm có khoảng hơn 3 triệu trƣờng hợp nhiễm độc, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD

(khoảng 4000 tỷ VND).

Acid sorbic, acid benzoic và một số muối của chúng là những phụ gia đƣợc phép

sử dụng với nồng độ đủ để bảo quản sản phẩm thì chúng không gây độc cho cơ thể

con ngƣời. Tuy nhiên, một số nhà sản xuất đã dùng quá hàm lƣợng cho phép ảnh

hƣởng tới sức khoẻ, gây ngộ độc cấp và mãn tính. Tổ chức Y tế thế giới, tổ chức

Nông Lƣơng thế giới đã thử nghiệm natri benzoat trên chuột sau nhiều ngày trọng

lƣợng chuột giảm, hại gan và thận dẫn tới chết, thử nghiệm trên chó thì dẫn tới thần

kinh, kết hợp với acid ascobic trong thực phẩm natri benzoat có thể gây ung thƣ do

tạo ra benzen.

Năm 2012, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hƣơng trên địa bàn tỉnh

Quảng Bình cho thấy: Tổng số mẫu xét nghiệm acid benzoic là 291 có 69 mẫu thực

phẩm sử dụng chất bảo quản acid benzoic chiếm là 23,7%, trong các thực phẩm sử

dụng chất bảo quản acid benzoic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn

cho phép là 46,4%. Tổng số mẫu xét nghiệm acid sorbic là 286 có 50 mẫu thực

phẩm sử dụng chất bảo quản acid sorbic chiếm là 17,5%, trong các thực phẩm sử

dụng chất bảo quản acid sorbic tỷ lệ mẫu thực phẩm sử dụng vƣợt quá giới hạn cho

phép là 50% [3].


Đƣờng hóa học (hay là chất ngọt tổng hợp) là chất không có trong tự nhiên,

có vị ngọt rất cao so với đƣờng kính saccharose và không hề có một giá trị dinh

dƣỡng. Thƣờng dùng trong việc điều trị cho những ngƣời bệnh thừa cân hay đái

tháo đƣờng. Các đƣờng hóa học nhƣ: saccharin, manitol, acesulfam K, aspartam,

isomalt, sorbitol, sucraloza đƣợc phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới

hạn tối đa và có quy định của Bộ Y tế [12]. Tuy vậy, các chất này có thể gây ảnh

hƣởng tới sức khỏe ngƣời dùng ở các mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào liều lƣợng

đƣa vào cơ thể. Điều nguy hiểm là loại đƣờng này hòa tan trong nƣớc, không

màu, không mùi nên khó phát hiện. Chỉ có thể chỉ tên "đích danh" qua phân

tích hoá học. Nếu nhà sản xuất chỉ cần cho 7 phần đƣờng mía và 3 phần đƣờng hóa

học thì ngay cả các chuyên gia cũng không thể phát hiện ra.

Cho đến nay có rất nhiều phƣơng pháp khác nhau để xác định chất bảo quản

và chất tạo ngọt. Tuy nhiên, để định lƣợng đƣợc đồng thời chất quản: acid benzoic,

acid sorbic và chất tạo ngọt trong thực phẩm, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC) có nhiều ƣu điểm vƣợt trội. Phƣơng pháp này có độ nhạy, độ chính xác

cao, thao tác đơn giản, có thể đồng thời xác định dƣợc nhiều chất. Xuất phát từ vấn

đề trên, đề tài: “Nghiên cứu phương pháp phân tích acid benzoic, acid sorbic, muối

của chúng và một số chỉ tiêu đường hóa học trong đối tượng thực phẩm” nhằm giải

quyết 2 mục tiêu:

1. Xây dƣng đƣơc quy trinh phân tich acid benzoic, acid sorbic và chất tạo ngọt

saccharin, aspartam trong thực phẩm tại Labo Xét nghiệm ATVSTP.

2. Thâm đinh đƣơc phƣơng phap xac đinh acid benzoic, acid sorbic và chất tạo

ngọt saccharin, aspartam trong thực phẩm đa xây dƣng tại Labo XN ATVSTP.


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về chất bảo quản và chất tạo ngọt

1.1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam

Tên hóa học, các tính chất, công thức cấu tạo của acid benzoic, acid sorbic,

saccharin và aspartam đƣợc cho trong bảng 1.1. [7], [8], [11]

Bảng 1.1. Tính chất của acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam

Acid benzoic Acid sorbic saccharine Aspartam

Tên

hóa

học

Acid benzoic,

acid benzen

carboxylic,

acid phenol

arboxylic

Acid sorbic,

acid 2.4 –

hexadienoic

1,2-Benzisothiazol-

3(2H)-on-1,1-

dioxid;

3-oxo-2,3-

dihydrobenzo[d]iso

thiazol-1,1-dioxid

Aspartyl

phenylamin

metyl ester,

3-Amino-N-(α

carbomethoxy-

phenyletyl)-acid

succinamic

CTPT C7H6O2

(C6H5COOH)

C6H8O2 C7H5NO3S C14H18N2O5

KLPT 122,12 g/mol 112,12 g/mol 183,18 g/mol 294,31 g/mol

pKa 4,21 4,76 3,86 4,5-6,0

CTCT

Tính

chất

vật lý

- Tinh thể rắn

màu trắng, có

dạng vảy hoặc

hình kim

- có mùi đặc

trƣng rất nhẹ

- tan ít trong

nƣớc, tan vô

hạn trong

etanol.

- Tinh thể hình

kim không màu

hoặc bột trơn

chảy màu trắng,

- có mùi nhẹ đặc

trƣng

- ít tan trong

nƣớc, tan nhiều

trong ethanol,

methanol.

- Tinh thể hoặc bột

tinh thể trắng,

- không mùi hoặc

có mùi thơm nhẹ.

- Ít tan trong nƣớc,

ethanol, tan trong

dung dịch kiềm.

- Giữ đƣợc độ ngọt

ở nhiệt độ cao.

- Tinh thể màu

trắng, không mùi

có vị ngọt mạnh.

- Ít tan trong

nƣớc và ethanol


1.1.2. Tác dụng và tác hại của việc sử dụng acid sorbic, acid benzoic và

saccharin, aspartam.

Tác dụng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật được thể hiện ở bảng 1.2. [1]

Bảng 1.2. Ảnh hưởng của một số chất bảo quản trên vi sinh vật

Chất chống vi sinh vật Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc

Nitrit + + - -

Sulfit + + + + +

Acid formic + + + + +

Acid propionic + + + + +

Acid benzoic + + + + + + + +

Acid sorbic + + + + + + +

Acid este-p hydrobenzoic + + + + + + + +

Biphenyl - + + + +

Chú thích: - Không tác dụng + Tác dụng yếu

+ + Tác dụng trung bình + + + Tác dụng mạnh

1.1.2.1. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng acid benzoic

Acid benzoic và các benzoat là chất sát trùng mạnh đối với nấm men và các

nấm mốc, có tác dụng yếu đối với các vi khuẩn. Tác dụng bảo quản chỉ xảy ra ở môi

trƣờng acid pH = 2,5 – 3,5. Đảm bảo hiệu quả tác dụng bảo quản, nồng độ natri

benzoat có trong sản phẩm phải đạt tới 0,07 – 0,1%. Các nồng độ này của acid

benzoic và natri benzoat không có hại đối với cơ thể con ngƣời. [11]

Acid benzoic và các benzoat không gây độc khi dùng đúng liều quy định mà

chỉ ảnh hƣởng tới mùi và vị của sản phẩm khi cảm quan (natri benzoat cho dƣ vị ở

nồng độ 0,04%). Nƣớc quả và rau quả nghiền bảo quản bằng các benzoat thƣờng có

màu thâm đen so với sản phẩm sunfit hoá. Trong cơ thể acid benzoic và các benzoat

tác dụng với acid ascorbic hình thành benzen, một chất gây ung thƣ. Natri benzoat

có thể phá huỷ và khử hoạt tính của ADN trong ti thể tế bào. Ti thể tiêu thụ ôxi để

tổng hợp ATP, cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, khi ADN bị phá huỷ sẽ gây ra các


triệu chứng về thần kinh bao gồm hội chứng Parkinson và các hội chứng thoái hoá

thần kinh khác, làm tăng quá trình lão hóa của cơ thể. [3]

Giới hạn cho phép (ML) của acid benzoic trong thịt và các sản phẩm từ thịt,

trong nƣớc chấm và các sản phẩm tƣơng tự 1000mg/kg; trong các loại thủy sản, sản

phẩm thủy sản ngâm dấm, kể cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai 2000mg/kg. [12]

1.1.2.2. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng acid sorbic

Acid sorbic và các sorbate có tác dụng sát trùng mạnh đối với nấm men và

nấm mốc, các vi sinh vật này là nguyên nhân chủ yếu gây hƣ hỏng sản phẩm rau quả,

tác dụng rất yếu đối với vi khuẩn. Sử dụng Acid sorbic đem lại kết quả tốt trong công

nghiệp chế biến rau quả, trong công nghiệp rƣợu nho, trong sản xuất đồ hộp sữa và

các sản phẩm sữa, các sản phẩm cá, các sản phẩm thịt loại thịt dồi, xúc xích, các sản

phẩm bánh mỳ... [11]

Khi sử dụng acid sorbic với hàm lƣợng vƣợt mức cho phép sẽ ảnh hƣởng

không tốt đến sức khoẻ ngƣời sử dụng. Các chất này có thể gây dị ứng, gây hiện

tƣợng đầy bụng, đầy hơi, khó tiêu. Nếu tích tụ lâu ngày sẽ gây hại cho gan, thận,

thậm chí có thể gây ung thƣ. [3]

Giới hạn cho phép (ML) của acid sorbic trong các loại pho mát cao nhất là

3000mg/kg; trong các loại bánh nƣớng là 2000mg/kg; trong nƣớc chấm và các sản

phẩm tƣơng tự : 2000mg/kg; viên xúp và nƣớc thịt: 1000mg/kg. [12]

1.1.2.3. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng saccharin

Là chất làm ngọt nhân tạo không có năng lƣợng, độ ngọt gấp khoảng 300 lần

đƣờng mía, nhƣng có dƣ vị kim loại hơi đắng, đặc biệt là ở nồng độ cao. Khi đi vào

cơ thể, saccharin không bị hấp thụ vào các bộ phận trong cơ thể mà đƣợc thải hồi

sau đó qua đƣờng tiểu tiện. Dùng để làm ngọt các sản phẩm nhƣ đồ uống, kem, chè,

bánh kẹo, bánh quy, các loại thuốc và kem đánh răng [7], [11].

Năm 1977, Canada và FDA Hoa Kỳ cấm sử dụng hóa chất này vì phát hiện

gây ung thƣ bàng quang ở chuột. Nhƣng trƣớc áp lực của dân chúng và nhà sản

xuất, Quốc hội Hoa Kỳ cho phép dùng với điều kiện phải có hàng chữ “có nguy cơ

độc hại cho sức khỏe” (potentially hazardous to health). Năm 2000, FDA Hoa Kỳ

http://en.wikipedia.org/wiki/Artificial_sweetener

http://en.wikipedia.org/wiki/Food_energy


lấy hàng chữ này ra vì có những nghiên cứu chứng minh sự an toàn của saccharin.

Tuy nhiên, hiện nay một số nghiên cứu hiện đại lại chỉ ra rằng, saccharin có thể tạo

ra dị ứng cho cơ thể nhƣ nhức đầu, tiêu chảy, da bị tróc v.v… Đối với các phụ nữ

đang mang thai, saccharin có thể đi thẳng vào bào thai và nằm yên trong đó trong

suốt thời kỳ mang thai, do đó thai nhi có thể bị ảnh hƣởng và tạo nên những chứng

rối loạn chức năng của cơ bắp. Dùng nhiều lƣợng saccharin có thể sinh ra chứng

béo phì. Tuy nhiên tất cả những biến chứng do việc xử dụng saccharin vẫn còn là

một tranh cãi và chƣa có kết luận nào có tình cách thuyết phục. [30]

Một khả năng gây nguy hiểm khác của saccharin là khả năng gây dị ứng.

Phản ứng dị ứng này là do nhóm hợp chất sufonamides gây ra đối với những ngƣời

không đáp ứng đƣợc thuốc chứa sulfa. Phản ứng này bao gồm đau đầu, khó thở,

phát ban và tiêu chảy. Một số sản phẩm dành cho trẻ em có chứa saccharin đƣợc

cho là có thể gây kích ứng và rối loạn cơ bắp. [30]

Giới hạn cho phép (ML) của saccharin trong kẹo cao su cao nhất là 2500

mg/kg, trong các loại gia vị là 1500 mg/kg, trong thực phẩm bổ xung là 1200

mg/kg, trong sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú, thủy sản và cá đã qua xử lý

nhiệt, rau củ đông lạnh là 500 mg/kg,...[12]

1.1.2.4. Tác dụng, tác hại và giới hạn cho phép của việc sử dụng aspartam

Hiện nay, aspartam là chất ngọt rất đƣợc ƣa chuộng. Nó đƣợc sử dụng rộng

rãi trên thế giới với sự hiện diện trong hơn 6000 loại thực phẩm khác nhau nhƣ bánh

kẹo, yogurt, trong các thức uống ít nhiệt năng nhƣ Coke diete, Pepsi và cả trong

dƣợc phẩm. [29]

Một gram aspartam tạo ra bốn kcal năng lƣợng khi chuyển hóa nên lƣợng

calo là không đáng kể. Đa số ngƣời tiêu dùng có nhận xét là aspartam không để lại

dƣ vị khó chịu , tuy nhiên môt sô ngƣơi nhạy cảm cho rằng đƣờng này đê lai trên

lƣơi môt hâu vi không ngon . Điều này có thể khắc phục bằng cách trộn aspartam

với các loại đƣờng khác (nhƣ acesulfame - K hay saccharin). [7]

Khi vao cơ thê , aspartam không hấp thụ vào máu ma tan ra trong ruột thành

ba chất: acid aspartic (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%).


+ Methanol là một chất có độc tính thấp. Vào cơ thể, methanol đƣợc oxy hóa

tạo nên formaldehyd, chất này lại tiếp tục bị oxy hóa tạo nên acid formic (hoặc

formate, tùy theo pH). Acid formic có độc tính rất cao. Chính acid formic là nguyên

nhân gây nên tình trạng toan chuyển hóa (nhiễm acid) và mù lòa, những tổn thƣơng

đặc trƣng của nhiễm độc methanol.

+ Phenylalanine là một chất độc thần kinh. Quá nhiều phenylalanine gây động

kinh, chậm phát triển trí óc , mất ngủ… Chinh phenylalanine tao ra bệnh

phenylketonuria (PKU), làm chậm phát triên tri tuê nghiêm trong và làm tổn hại đến

hê thân kinh.

+ Dƣ thừa acid aspartic có thể gây ra rối loạn nội tiết và các vấn đề về thị lực.

acid Aspartic là một chất kích thích thần kinh, ảnh hƣởng đến hệ thống thần kinh

trung ƣơng, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn

giấc ngủ, vấn đề về thị lực, trầm cảm, và bệnh suyễn, động kinh… [11]

Giới hạn cho phép (ML) của aspartam trong sản phẩm tạo màu trắng cho đồ

uống là 6000 mg/kg, trong thực phẩm bổ sung là 5500 mg/kg, trong bánh mỳ và các

sản phẩm bánh nƣớng thông thƣờng và hỗn hợp là 4000 mg/kg, trong kẹo, kẹo

mềm, kẹo cứng, kẹo ca su, dấm là 3000 mg/kg, viên xúp và nƣớc thịt là 1200

mg/kg,....[12]

1.2. Một số phƣơng pháp xác định acid benzoic, acid sorbic, saccharin, và

aspartam

Hiện nay trên thế giới có nhiều phƣơng pháp phân tích đã đƣợc triển khai và

chuẩn hóa và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm, bao gồm các phƣơng pháp xác định

riêng chất bảo quản cũng nhƣ đƣờng hóa học và các phƣơng pháp xác định đồng

thời cả chất bảo quản và đƣờng hóa học: phƣơng pháp chuẩn độ, quang phổ hấp thụ

phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và điện di mao quản.

1.2.1. Phương pháp trắc quang

* Xác định hàm lƣợng acid benzoic trong các mẫu thực phẩm:

Mẫu thử đƣợc đồng hóa, sau đó đƣợc pha loãng và acid hóa phần mẫu

thử . Acid benzoic đƣợc chiết bằng dietyl ete , rồi đƣợc chiết tiếp bằng kiềm


tinh chế bằng oxi hóa sử dụng kali dicromat trong môi trƣờng acid. Acid benzoic

tinh sạch hòa tan trong dietyl ete đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng

267,5 nm; 272 nm và 276,5 nm.

Độ hấp thụ tính theo acid benzoic trong công thức này đối với phƣơng pháp

so sánh ở bƣớc sóng 272 nm là: A2 – (A1 + A3)/2

A1 là độ hấp thụ ở 267,5 nm

A2 là độ hấp thụ ở 272 nm

A3 là độ hấp thụ ở 276,5 nm

Chuẩn bị dãy chuẩn acid benzoic với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo

độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid

benzoic trong mẫu phân tích.[14]

* Xác định hàm lƣợng acid sorbic trong các mẫu thực phẩm:

Cất acid sorbic từ mẫu bằng hơi nƣớc, oxy hóa bằng acid crom, dùng acid

barbituric tạo phức màu hồng, đo cƣờng độ màu của phức bằng máy đo quang phổ

ở bƣớc sóng 532 nm.

Để tính kết quả hàm lƣợng acid sorbic cần chuẩn bị dãy chuẩn acid sorbic

với các nồng độ khác nhau, tiến hành đo độ hấp thụ, dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào

đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng acid sorbic trong mẫu phân tích.[15]

Phƣơng pháp này tuy có độ chính xác cao nhƣng phức tạp và tốn nhiều dung

môi hóa chất. Đặc biệt là không phân tích đƣợc đồng thời 2 acid.

* Xác định đƣờng hóa học:

- Nếu mẫu là chất rắn: hòa tan lƣợng mẫu thích hợp và định mức 25 ml với

nƣớc khử ion. Nếu là mẫu lỏng, pha loãng thể tích mẫu thích hợp thành 25 ml. Lấy

500 µl dung dịch trên pha loãng thành 10 ml với dung dịch đệm Clark and Lubs

(dung dịch gồm KCl 0,2 M và HCl 0,2 M) pH = 1,3. Để xác định Saccharin

acesulfam-K trong các chất làm ngọt và bột nƣớc trái cây, sử dụng bƣớc sóng phát

hiện saccharin là 206 nm, acesulfam - K là 226 nm. Độ thu hồi đối với cả hai chất

phân tích trên nền mẫu thực trong khoảng 93,5 105,1%, sai số tƣơng đối < 5%. [26]


- Để xác định đồng thời 3 chất ngọt nhân tạo (Saccharin, Aspartam,

Acesulfame-K) và vitamin C trong đồ uống bằng phƣơng pháp PLS - UV: cân chính

xác 0,05 g mẫu, hòa tan và chuyển vào bình định mức 100 ml bằng dung dịch

H3PO4 0,1N. Chất phân tích đƣợc đo ở bƣớc sóng từ 190 – 300 nm. Nếu mẫu có

chứa màu thực phẩm, các chất phân tích đƣợc chiết bằng dung dịch n - butanol và

đƣợc đo ở bƣớc sóng từ 190 – 300 nm. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng cho đồ uống

thƣơng mại, đồ uống có màu (dạng bột và chất lỏng). [28]

Phƣơng pháp này tƣơng đối chính xác nhƣng tốn dung môi, hóa chất độc hại,

không xác định đƣợc đồng thời các chất cần phân tích.

1.2.2 Phương pháp chuẩn độ

* Xác định acid benzoic và acid sorbic: Cân 50g mẫu chính xác đến 0,001g

chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml, dùng NaOH 10% trung hòa đến trung tính thử

bằng giấy đo pH. Thêm 10ml kali feroxyanua 15% lắc đều, để lắng sau đó lọc.

Hút 50ml dịch lọc chuyển vào phễu chiết chia độ, trung hòa bằng HCl 10%,

thử bằng giấy đo pH sau đó thêm 5ml HCl 10%. Thêm 30ml clorofooc vào phễu

chiết lắc trong 5 phút để phân lớp, chiết phần dung dịch nƣớc sang phễu chiết khác,

cho thêm 15 ml clorofooc và chiết lại hai lần nữa. Gộp toàn bộ cloroform, có thể

cho vào bộ cất thu hồi bớt cloroform ở 650 đến còn lại ¼ thể tích. Chuyển phần cặn

còn lại trong cốc sứ và làm bốc hơi trên bếp ở 500

để nguội, dùng 50ml etanol hòa

tan cặn trong cốc, thêm 2 giọt phenolphthalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05 M.

Phƣơng pháp này tốn dung môi hóa chất, độc hại, đặc biệt là phƣơng pháp này phân

tích đối với mẫu có hàm lƣợng lớn. [8], [14], [21]

* Xác định saccharin: Cân khoảng 0,5g (chính xác đến mg) mẫu thử đã đƣợc làm

khô, hòa tan trong 75 ml nƣớc nóng. Làm nguội nhanh và thêm dung dịch

phenolphtalein (TS), chuẩn độ với dung dịch natri hydroxyd 0,1 M. Mỗi ml natri

hydroxyd 0,1N tƣơng đƣơng với 18,32 mg C7H5NO3S. [7]

Phƣơng pháp này cần hóa chất độc hại, chỉ phân tích đƣợc nếu hàm lƣợng

chất lớn.

1.2.3. Phương pháp điện di mao quản (CE)


Đây là phƣơng pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không

ion nhƣng có mối quan hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa

đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trƣờng. Do độ linh động điện di của các ion khác

nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau.

Ứng dụng phƣơng pháp này, tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto

Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus đã xác định đồng thời aspartam, cyclamate,

saccharin và acesulfam - K trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao

quản với detector độ dẫn. Phƣơng pháp sử dụng hỗn hợp đệm tris (hydroxymetyl)

aminometan (TRIS) 100 mmol/L và 1 histidin (HIS) 10 mmol/L với thời gian phân

tích là 6 phút, hiệu suất thu hồi các chất trong khoảng từ 94% đến 108%, độ lệch

chuẩn tƣơng đối (RSD) trong khoảng 1,5 6,5%.[22]

Tác giả Richard A. Frazier và các cộng sự đã xác định đồng thời các chất ngọt

nhân tạo acesulfam-K, aspartam, saccharin, chất bảo quản acid benzoic, acid sorbic và 7

phẩm màu quinolin yellow, sunset yellow FCF, carmoisin, ponceau 4R, brilliant lue

FCF, green S và black PN trong mẫu nƣớc giải khát bằng phƣơng pháp điện di mao

quản. Phƣơng pháp sử dụng chế độ sắc ký điện động học mixen, dung dịch đệm

cacbonat 20 mM ở pH 9,5 với dun dịch natri dodecyl sulfat 62 mM trong vòng 15 phút.

Kết quả cho thấy giới hạn định lƣợng đối với tất cả các chất là 0,01 mg/ml. [25]

Tác giả Trần Phúc Nghĩa đã xây dựng phƣơng pháp định lƣợng Acesulfame - K,

Saccharin, Aspartam trong đồ uống, nƣớc giải khát với các điều kiện điện di: bƣớc sóng

phát hiện các chất là 215,5 nm, sử dụng dung dịch đệm borat 20 mM ở pH = 9,5, điện

thế đặt vào hai đầu mao quản là 25kV, nhiệt độ 25oC, với áp suất bơm mẫu 50 mbar

trong thời gian 5s, dòng điện 100µA. Xác định đƣợc giới hạn phát hiện LOD với Asp,

Sac, Ace-K lần lƣợt là 3,79 ppm; 6,46 ppm; 4,43 ppm. Giá trị LOQ tìm đƣợc là 4,8 ppm;

1,5 ppm và 3,0 ppm. Sai số tƣơng đối từ 0,75 – 1,85%, giá trị biến thiên CV < 3%. Độ

lặp lại tƣơng đối tốt với độ lệch chuẩn (SD) từ 0,2 – 1,5%, hiệu suất thu hồi trên mẫu

giả là 96,6 - 101,8%. Đồng thời cũng đánh giá phƣơng pháp trực tiếp trên mẫu thực

với hiệu suất thu hồi là 95,2 – 107,0%.[6]


Phƣơng pháp này có độ nhạy cao, xác định đƣợc đồng thời các chất cần phân tích

nhƣng thiết bị đắt tiền, quy trình phân tích phức tạp.

1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tác giả Ion Trandafir , Violeta Nour, Mira Elena Ionică đa phat triên phƣơng

pháp HPLC pha đảo để định l ƣợng đồng thời acesulfame - K, saccharin, aspartam,

caffeine và acid benzoic trong nƣớc giải khát cola không đƣờng. Việc tách sắc ký

đƣợc thực hiện bởi sử dụng pha đông la đệm kali dihydrogen orthophosphate (pH =

4,3) và acetonitrile (88:12, v/v). Côt DS hypersil C18 (250 mm x 4,6mm) và

detector DAD vơi bƣơc song λ = 227 nm cho acesulfame - K , λ = 265 nm cho

saccharin và λ = 217 nm cho aspartam, caffeine và acid benzoic. Thời gian cac phân

tích khoảng 40 phút, các đƣờng chuẩn tuyến tính tốt trên phạm vi nồng độ 0-100

mg/L. Viêc xac nhân gia tri sƣ dung cua phƣơng pháp phân tích đã thƣc hiên về đô

nhạy, khoảng tuyến tính, độ tái lặp, đô lặp lại, đô thu hôi. [27]

Môt phƣơng phap săc ky ion mơi đƣơc Qing - Chuan Chen, Jing Wang đề

xuât đê xac đinh đông thơi các chất làm ngọt nhân tạo (natri saccharin, aspartam,

acesulfame - K ), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic ), caffeine, theobromine

và theophylline. Mẫu đƣợc rung siêu âm, pha loãng, loại tạp bằng K4[Fe(CN)6 và

ZnSO4 (mẫu sữa lên men) rồi cho qua cột chiết pha rắn C18. Việc tách đƣợc thực

hiện trên một cột trao đổi anion của máy HPLC, phân tich đƣơ c tiên hanh ở 40°C

trong vòng 45 phút va giải hấp theo chê đô isocratic với dung môi la dung dịch

NaH2PO4 5mM (pH 8,20) và acetonitrile theo ti lê 4% (v/v), và detector UV. Các

giới hạn phát hiện (signal/noise = 3:1) cho tất cả các chất phân tích ơ mức dƣơi

µg/ml. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng cho các chế phẩm thực phẩm và dƣợc

phẩm, và sự thu hồi trung bình cho mẫu thật trong khoảng 85 -104%. [23]

Tác giả N. Dossi và các cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp RP – LC để xác

định các chất phụ gia trong nƣớc giải khát. Các chất ngọt nhân tạo (acesulfam,

aspartam, saccharin), chất bảo quản (acid benzoic, acid sorbic) và phẩm màu

(Ponceau 4R, sunset yellow, tatrazin) đƣợc tách trên cột LiChrosorb RP 18. Pha

động là dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH = 4,0) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thời


gian phân tích trong khoảng 20 phút. Pha động đƣợc chạy theo chế độ gradient nhƣ

sau: trong 5 phút đầu tỷ lệ dung môi là dung dịch đệm : MeOH = 95% : 5% (v/v),

sau đó MeOH tăng lên là 40% trong vòng 5 phút và đƣợc giữ ở tỷ lệ đó trong 10

phút rồi dung môi đƣợc đƣa về tỷ lệ ban đầu trong 5 phút. Bằng kỹ thuật chuyển đổi

bƣớc sóng, giới hạn phát hiện của các chất phân tích trong khoảng 0,1 - 0,3 mg/l.

Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng để xác định một số mẫu nƣớc ngọt, mẫu đƣợc siêu

âm loại khí và lọc bằng 0,45 – 0,2 µm trƣớc khi bơm mẫu vào cột. [24]

Tại Việt Nam, chúng tôi đã khảo sát và nhận thấy có một số phƣơng pháp xử

lý mẫu nhƣ sau:

Phƣơng pháp 1: Mẫu phân tích đƣợc hòa tan vào trong nƣớc hoặc đƣợc chiết

bằng dung dịch đệm amoni acetat/acid acetic, và đƣợc khử tạp bằng hỗn hợp Carrez I

(K4[Fe(CN)6].3H2O) và Carrez II (ZnSO4.7H2O). Sau đó lọc, thu dịch lọc đem phân

tích trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) bằng cột sắc ký pha đảo RP-18, 250 mm x

4,6 mm, cỡ hạt 5µm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích bơm 10 µl với đầu dò UV-

VIS, bƣớc sóng phát hiện chất là 235 nm. [17]

Phƣơng pháp 2: Mẫu đƣợc pha loãng hoặc đƣợc chiết bằng siêu âm với

nƣớc. Dung dịch mẫu có nồng độ chất tạo ngọt cao đƣợc tinh sạch trên cột chiết pha

rắn hoặc bằng thuốc thử Carrez, nếu cần. Mẫu đƣợc chuyển vào ống ly tâm và ly

tâm ở tốc độ 1400 vòng/phút, trong 10 phút. Lấy dịch nổi, định mức, lọc qua giấy

lọc, màng lọc whatman 0,45µm rồi bơm vào máy HPLC. Các chất phân tích đƣợc

tách trên cột sắc kí pha đảo của HPLC với pha động là dung dịch đệm phosphat và

acetonitril (80%:20%, v/v) và pha tĩnh là cột C18 chiều dài từ 100 mm đến 300 mm,

đƣờng kính trong từ 3 mm đến 4 mm. Bƣớc sóng để xác định chất tạo ngọt bằng

phép đo phổ là 220 nm với detector UV hoặc DAD. Nền mẫu của phƣơng pháp này

là các sản phẩm lỏng trong (nƣớc chanh, cola, các loại đồ uống), các sản phẩm đục

(nƣớc quả, đồ uống từ sữa có hƣơng vị), mứt, mứt quả, mứt cam, sản phẩm rắn và

nửa rắn... [18]

Phƣơng pháp 3: Mẫu đƣợc đồng nhất toàn bộ rồi tiến hành chiết acid benzoic

và sorbic khỏi nền mẫu bằng NaOH, sau đó loại tạp bằng K3Fe(CN)6,


(CH3COO)2Zn, lọc qua giấy lọc, màng lọc whatman 0,45µm và định lƣợng bằng

phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vơi detector DAD hoăc UV -VIS. [19]

Phƣơng pháp 4: Mẫu đƣợc đồng nhất và đƣợc acid hóa bằng acid tartaric rồi

tiến hành chƣng cất lôi cuốn theo hơi nƣớc nhằm tách lƣợng acid benzoic và acid

sorbic có trong mẫu thử . Sau đó lọc dịch cất thu đƣợc qua màng lọc whatman 0.45

µm va định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao v ới detector DAD

hoăc UV-VIS. [4], [16], [20]

Phƣơng pháp 5: Mẫu sau khi đồng nhất đƣợc cân vào ống ly tâm 50 ml, thêm

nƣớc, lắc đều rồi thủy phân ở 500C trong 30 phút, để nguội, loại tạp bằng hỗn hợp

carrez, ly tâm 6000 vòng/phút và định mức 100 ml, lọc qua giấy lọc rồi bơm vào

HPLC với cột anion, detector PDA, bƣớc sóng phát hiện chất đối với aspartam,

saccharin là 210 nm, acid benzoic, acesulfam K là 225 nm và acid sorbic là 254 nm.

Pha động là dung dịch NaH2PO4 5 mM (pH = 8,2) và acetonitril, chƣơng trình rửa

giải theo gradient với tốc độ 1 ml/phút. [13]

Trong quá trình nghiên cứu, tìm hiểu phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng

saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic, chúng tôi nhận thấy: do aspartam

không bền trong môi trƣờng nhiệt độ và pH cao [29] nên không nên chiết chất này

ra khỏi nền mẫu bằng NaOH [19] hay chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc [4], [16], [20].

Mặt khác, TCVN 8471:2010 tuy chỉ để xác định một số chất tạo ngọt nhƣng lại cho

thấy có khả năng ứng dụng để đồng thời xác định hàm lƣợng saccharin, aspartam,

acid benzoic và acid sorbic trong đa dạng nền mẫu. Do vậy, trong nghiên cứu này

chúng tôi cũng chọn phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột

sắc ký pha đảo C18 và detector DAD (có thể đo đƣợc ở nhiều bƣớc sóng khác nhau)

để xác định đồng thời các chất bảo quản và chất tạo ngọt, tối ƣu hóa các điều kiện

cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện có với quy trình phân tích mẫu

phù hợp sao cho vừa tiết kiệm đƣợc thời gian lại vừa giảm đƣợc giá thành phân tích.


CHƢƠNG II

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

Trong luận văn này, hƣớng nghiên cứu tập trung vào phân tích acid benzoic,

acid sorbic, saccharin, aspartam có trong thực phẩm.

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời acid

benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao, từ đó áp dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng acid benzoic, acid

sorbic, saccharin, aspartam có trong thực phẩm đang lƣu thông trên thị trƣờng.

2.1.2. Đối tượng, thời gian và địa điểm lấy mẫu phân tích

Mẫu thực phẩm là mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiên tại một số cửa hàng bánh kẹo

cạnh trƣờng học, chợ, siêu thị trên địa bàn Hải Dƣơng và mẫu đƣợc gửi tới labo

kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm trƣờng Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dƣơng.

Thời gian: 05/2014 đến 11/2014

Thực phẩm các loại bao gồm;

- Bánh đậu xach, ô mai, nƣớc giải khát

- Rau củ đóng hộp: dƣa chuột muối

- Sản phẩm từ thịt: xúc xích

2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.2.1. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị chính:

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): AGILENT TECHNOLOGIES

Model: 1200HPL/6310MSD


Hình 2.1: Hệ thống HPLC 1200 hãng Agilent

- Cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm

- Van của máy sắc ký: G1311A

- Bơm gradient bốn kênh dung môi: G1311A (số: DE 62968696)

- Detector: PAD

Các thiết bị và dụng cụ khác

- Bộ lọc hút chân không thủy tinh, kích thƣớc lỗ giấy loc 0,45 µm

- Bể rung siêu âm (wise clean): Daihan, WUC-A10H

- Máy ly tâm: Hermle, Z300

- Cân phân tích (độ chính xác 0,0001g): Shimadzu, AW220

- Cân kĩ thuật (độ chính xác 0,01g): Citizen, CG 3102

- Máy đồng nhất mẫu: IKA, T25 BASIC ULTRA-TURRAX

- Máy đo pH: Elmetron, CP 501

- Bình định mức thủy tinh loại A: 1000 ml, 500 ml và 100 ml, 25ml, 20ml, 10ml

- Pipet thủy tinh loại A: 100 ml, 25 ml, 20 ml, 10 ml, 5 ml và 1 ml.

- Micropipet: 100 - 1000µl, 10 - 100 µl.

- Ống đong thủy tinh chia độ loại A, dung tích 1000 ml.

- Ống ly tâm nhựa

2.2.2. Hóa chất, thuốc thử

Các loại hóa chất dùng trong phƣơng pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích (P.A.)


- Chất chuẩn gốc riêng rẽ thuộc hãng Sigma: acid benzoic 99%, acid sorbic

99%, saccharin 100%, aspartam 99,85%.

- Các hóa chất khác: K4[Fe(CN)6].3H2O (merk), ZnSO4.7H2O (merk), KH2PO4

(merk), H3PO4 (merk), MeOH Trung Quốc, Acetonitril (merk)

Cách pha hóa chất cần thiết

- Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm của mỗi chất: Cân chính xác 0,1g acid

benzoic chuẩn vào cốc có mỏ 50 ml hòa trong 1 - 2ml methanol cho tan hoàn toàn.

Chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng rửa cốc và định mức vừa đủ 100ml bằng

nƣớc cất.

- Pha acid acid sorbic, saccharin, aspartam chuẩn gốc tƣơng tự nhƣ trên vào các

bình định mức 100ml. Các dung dịch trên đƣợc bảo quản ở 2 - 40C trong 3 tháng.

Dung dịch chuẩn trƣớc khi sử dụng phải lắc đều, rung siêu âm 10 phút.

- Dung dịch chuẩn trung gian: Hút chính xác 10 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc

(acid benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam) bằng pipet vào các bình định mức

100ml và định mức tới vạch bằng nƣớc cất để đƣợc hỗn hợp dung dịch chuẩn trung

gian 100ppm mỗi loại đƣờng.

- Dung dịch Carrez 1: cân chính xác 15g K4[Fe(CN)6].3H2O bằng cân kĩ thuật

vào bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nƣớc cất.

- Dung dịch Carrez 2: cân chính xác 30g ZnSO4.7H2O bằng cân kĩ thuật vào

bình định mức 100ml và định mức tới vạch bằng nƣớc cất.

- Dung dịch phosphoric 5%: hút 3ml acid phosphoric vào bình định mức 50ml

và định mức đến vạch bằng nƣớc cất.

- Dung dịch KH2PO4 0,02M (pH = 4,3): cân chính xác 2,72g KH2PO4 vào

bình định mức 1 lít và định mức đến vạch bằng nƣớc cất. Dung dịch đƣợc đem lọc

qua bộ lọc màng thích hợp và siêu âm trƣớc khi sử dụng.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ

- Lấy mẫu ở các cửa hàng cạnh trƣờng học , ở chợ, đai ly, cƣa hang, siêu thị tai khu

vƣc Tp. Hải Dƣơng.


- Mỗi mẫu lấy khoảng 200 – 500 gam đối với mẫu rắn vào túi polyethylen khô,

sạch, đóng kín, và khoảng 500 ml đối với mẫu lỏng cho vào chai nhựa điền đầy đủ

thông tin chuyển về phòng thí nghiệm phân tích.

- Đối với mẫu rắn, mẫu đƣợc nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu đến khi nhỏ

mịn, đồng đều. Đồng nhất xong cho vào túi kín, tránh ẩm. Đối với mẫu lỏng, mẫu

đƣợc lắc kỹ trƣớc khi đem phân tích.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích

2.3.2.1. Phương pháp xử lý mẫu

Nguyên tắc: Các nghiên cứu đƣợc xây dựng dựa trên TCVN 8471 : 2010

nhƣng có sự điều chỉnh trong quá trình xử lý mẫu và điều kiện chạy máy HPLC.

Xử lý mẫu theo TCVN 8471 : 2010: Mẫu đƣợc chiết hoặc đƣợc pha loãng với nƣớc.

Dung dịch mẫu có nồng độ chất tạo ngọt cao đƣợc tinh sạch trên cột chiết pha rắn

hoặc bằng thuốc thử Carrez, nếu cần. Các chất tạo ngọt với nồng độ cao có trong

dung dịch mẫu thử đƣợc tách trên cột sắc kí pha đảo của HPLC và đƣợc xác định

bằng phép đo phổ tại bƣớc sóng 220 nm.[18]

Sơ đồ 2.1. Quy trình phân tích theo TCVN 8471:2010

2ml Dung dịch Carrez 1 Lắc vortex


vortex

Mẫu cân khoảng (2-10g) hoặc (5-20ml)

HPLC

+ 30ml H2O

Bình định mức 100 ml

Định mức bằng nƣớc

Lọc qua giấy lọc

Đồng nhất mẫu

Rung siêu âm

lọc qua màng lọc 0,45 µm


2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu các điều kiện phân tích

Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu để xác định đồng thời hàm lƣợng acid

benzoic, acid sorbic, saccharin, aspartam đƣợc thực hiện theo các trình tự sau:

Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký trên máy HPLC

- Chọn detector: Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của

phƣơng pháp. Acid benzoic, acid sorbic, saccharin và aspartam có khả năng hấp thụ

ánh sáng trong vùng tử ngoại rất tốt do trong cấu tạo phân tử của các chất phân tích

này đều có liên kết . Vì vậy, detector DAD (diode array detector) và detector UV

đều có thể đƣợc sử dụng cho việc định tính và định lƣợng các chất trên. Nhƣng

detector DAD cho phép đo đồng thời tại nhiều bƣớc sóng (đo phổ UV) trong quá

trình sắc ký. Để thuận lợi cho công việc chung của phòng nên chúng tôi lựa chọn

detector DAD để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

- Chọn bƣớc sóng: Dựa vào tính chất của chất cần phân tích và điều kiện

trang thiết bị của phòng thí nghiệm để lựa chọn detector phù hợp, dùng detector vừa

lựa chọn để quét phổ và tìm bƣớc sóng tối ƣu cho mỗi chất cần phân tích.

- Chọn pha động: Có hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có

độ phân cực thấp.

Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất

hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc

dùng trong sắc ký pha liên kết ngƣợc. Loại pha động này phù hợp với chất phân tích

là chất phân cực yếu.

- Chƣơng trình gradient: Sự thay đổi thành phần pha động diễn ra theo thời gian

- Ảnh hƣởng của pH của pha động: Các chất phân tích đều là những acid hoặc

muối của dạng acid nên pH của pha động sẽ quyết định chất phân tích trong cột tồn

tại ở dạng acid hay dạng muối. Khi thay đổi pH sẽ thay đổi thời gian lƣu của chất

phân tích trên cột.

Tối ƣu hóa quy trình xử lý mẫu

- Khảo sát thời gian rung siêu âm: Quá trình chiết chất phân tích ra khỏi nền

mẫu thực hiện chủ yếu thông qua quá trình rung siêu âm. Vì vậy quá trình chiết có


triệt để hay không phụ thuộc rất lớn vào thời gian rung siêu âm. Chúng tôi khảo sát

thời gian rung siêu âm từ 0 phút đến 60 phút.

- Khảo sát lƣợng MeOH thêm vào: Tùy từng loại thực phẩm, nhà sản suất có

thể thêm chất phụ gia ở dạng acid hay dạng muối. Nếu chất phụ gia đƣợc thêm vào

ở dạng muối, chỉ cần sử dụng nƣớc để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu. Nếu

chất phụ gia thêm vào ở dạng acid, khó tan trong nƣớc. Cho MeOH vào mẫu để

chiết dạng acid trƣớc rồi thêm nƣớc để chiết nốt dạng muối của chất phân tích (nếu

còn). Lƣợng MeOH cho vào xử lý mẫu đƣợc khảo sát từ 2 ml đến 10 ml.

Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích

- Đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký: Chuẩn bị một dung dịch chuẩn có

nồng độ xác định, tiến hành phân tích trên HPLC lặp lại 6 lần. Xác định độ lệch

chuẩn tƣơng đối của các thông số: thời gian lƣu, diện tích pic.

- Độ chọn lọc/ đặc hiệu

Tính đặc hiệu nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt các

tạp chất khác. Tính đặc hiệu liên quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích.

Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc xác

định một số hay nhiều chất phân tích chung một quy trình. Nếu chất cần phân tích

phân biết rõ với các chất khác thì phƣơng pháp phân tích có tính chọn lọc.

Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm

chất chuẩn.

+ Hệ số chọn lọc α (selectivity factor), còn gọi là hệ số tách: α = '

'

RA

RB

t

t

Theo qui ƣớc, B là chất bị lƣu giữ mạnh hơn A vì vậy α luôn luôn lớn hơn 1.

α còn đƣợc gọi là độ lƣu giữ tỷ đối (relative retention).

Để tách riêng hai chất, cần có α > 1, thƣờng chọn α trong khoảng 1,05 đến 2,0. α

càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, với α quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo dài.


+ Độ phân giải: Độ phân giải (RS) là đại lƣợng đo mức độ tách hai chất trên

một cột sắc ký. RS = )(2/1 AB

RARB

WW

tt

WA, WB là chiều rộng đáy pic của các chất 1 và 2

tRA, tRB là thời gian lƣu thực của các chất 1 và 2

Rs = 0,75 hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.

Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt,còn xen phủ nhau 4%

Rs =1,5 hai pic tách gần hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)

- Khoảng tuyến tính

Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính

giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn với nồng độ của chất đó.

Phƣơng trình hồi quy tuyến tính bxay

Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic nội chuẩn

x là nồng độ chất khảo sát

Sau khi xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đƣờng chuẩn và xác định hệ

số hồi quy tƣơng quan(R): hệ số tƣơng quan hồi quy, R phải đạt theo yêu cầu sau:

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác

định đƣợc nhƣng không nhất thiết phải định lƣợng đƣợc trong điều kiện thí nghiệm

cụ thể. Trong sắc ký LOD có thể đƣợc xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại

đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3).

Giới hạn định lƣợng LOQ là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong

mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chụm nhận

đƣợc. Trong sắc ký LOQ có thể đƣợc xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại


đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10). Có thế

tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD.

- Độ chụm (độ lặp lại)

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của

các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích đƣợc áp dụng lặp lại trên cùng một

mẫu. Độ lặp lại đƣợc thể hiện bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD. Tiến hành thí

nghiệm lặp lại 6 lần. Tính độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% của hàm lƣợng chất phân

tích. Các công thức tính toán nhƣ sau:

Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại.

+ Giá trị trung bình :

n

1i

ixn

1x

Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi là giá

trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm.

+ Độ lệch chuẩn :

1n

)xx(

SD

2n

1i

i

+ Độ lệch chuẩn tƣơng đối :

100

X

SDRSD

So sanh RSD(%) tính đƣợc so với RSD(%) cho phep ơ nông đô chât tƣơng ƣng

theo AOAC. RSD(%) tính đƣợc không đƣợc lớn hơn trị giá trong bảng ở hàm lƣợng

chất tƣơng ứng, độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích. Nồng độ chất càng thấp

thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD càng lớn. Mối liên quan

giữa nồng độ chất phân tích và RSD (%) đƣợc thể hiện trong phụ lục 1. [9]

- Độ đúng (độ thu hồi)


Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực

(true value) hoặc đƣợc chấp nhận thực (accepted value).

- Độ thu hồi : Độ thu hồi đƣợc xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn. Lƣợng

chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần

nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi (R%)

đƣợc tính nhƣ sau:

100C

CC%R

c

mcm

Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ trong mẫu

Cc: Nồng độ chuẩn thêm

Sau khi tinh độ thu hồi , so sánh kết quả tinh đƣơc với các giá trị cho bởi trong

phụ lục 2. Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau . Thông

thƣơng đô thu hôi tinh đƣơc phai năm trong khoang cho phep cua AOAC ơ nông đô

chât tƣơng ƣng . Mối liên quan giữa nồng độ chất phân tích và độ thu hồi (%) đƣợc

thể hiện trong phụ lục 2.

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu :

- Tính toán kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel

- Tính toán thời gian lƣu, diện tích peak, chiều cao peak và tỷ lệ tín hiệu trên

nhiễu bằng phần mềm của thiết bị.


CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu, xây dựng phƣơng pháp phân tích

3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích

3.1.1.1. Lựa chọn detector

Xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các chất đang nghiên cứu: sử dụng

detector DAD để quét tìm, với khoảng quét phổ là 190 ÷ 400 nm. Các chất đều

đƣợc pha với nồng độ 10 ppm. Xác định đƣợc bƣớc sóng hấp thụ cực đại của

sacchari và aspartam là 210 nm, acid benzoic là 198 nm và 226 nm, acid sorbic

254nm. Hình ảnh quét phổ của saccharin và aspartam thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1: Phổ của Saccharin và Aspartam

Hình ảnh quét phổ của acid benzoic thể hiện ở hình 3.2.


Hình 3.2: Phổ của acid Benzoic

Hình ảnh quét phổ của acid sorbic thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3: Phổ của acid Sorbic

Dựa vào kết quả quét phổ chúng tôi lựa chọn bƣớc sóng 210 nm để xác định

đồng thời saccharin và aspartam, bƣớc sóng 226 nm để xác định acid benzoic và

bƣớc sóng 254 nm để xác đinh acid sorbic.


3.1.1.2 Lựa chọn cột tách

Cột tách là trái tim của hệ thống HPLC, nó quyết định quá trình tách có độ

phân giải tốt hay không. Căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân

tích để lựa chọn cột tách phù hợp.

Do cấu trúc phân tử saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic là chất phân cực

yếu. Vì vậy, để tách đƣợc các chất này nên chọn pha tĩnh là pha ngƣợc. Mặt khác, sử dụng

chất nhồi pha ngƣợc thì hệ dung môi là những chất phân cực nên kinh tê hơn, ổn đinh va

không phụ thuộc nhiêu vào nhiệt độ, độ ẩm nhƣ chất nhồi cua pha thƣờng. [6], [7]

Sắc đồ hỗn hợp các chất đƣợc phân tích bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm)

đƣợc thể hiện ở hình 3.4

Hình 3.4. Sắc đồ phân tích hỗn hợp chấtc bằng cột C18 (250mm×4,6mm× 5μm)

Cột C18 (250mm× 4,6mm × 5μm) có hình ảnh pic tách tốt, ít doãng, nhọn và cân

đối. Thích hợp cho phân tích đƣợc nhiều chất, để thuận tiện cho công việc chung

của phòng phân tích, chúng tôi chọn sử dụng cột Agilent C18 (250mm× 4,6mm ×

5μm) cho các khảo sát tiếp theo.

3.1.1.3. Lựa chọn pha động

Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc

ký. Thành phần pha động ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả tách sắc ký.


Trong săc ky pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết,

có thể sử dụng khá nhiều dung môi. Tuy nhiên, kinh nghiệm thực tế cho thấy

methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và nƣớc đƣơc lƣa chon nhiêu . Bên canh đo ,

một số loại đệm (đệm phosphat, đệm acetat…) cũng là dung môi hay đƣợc sƣ dung,

những dung môi này đem lai hiêu qua cao , chi phi rẻ. [6], [7], [13], [15]. Độ phân

cực của một số dung môi dùng làm pha động đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3.2: Tính chất của 1 sô loai dung môi dung lam pha đông

Để tách saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic ra khỏi các chất cản

trở trong nền mẫu và định lƣợng nó dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải

phân cực. Dựa trên độ phân cực của các dung môi ở bảng 3.2 có thể chọn dung môi

có độ phân cực phù hợp. Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát pha động gồm

đệm phosphat (KH2PO4), methanol (MeOH), Acetonitrile (ACN) với tỉ lệ thể tích

khác nhau theo phƣơng pháp đẳng dòng.

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thành phần pha động đến diện tích pic và

thời gian lƣu đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Ảnh hưởng thành phần pha động đên thời gian lưu và diện tích pic

Thành

phần

pha

động

%

K2HPO4 95 90 85 80 75 70 90 80 70

ACN 5 10 15 20 25 30 0 0 0

MeOH 0 0 0 0 0 0 10 20 30


Thời

Gian

Lƣu

(phút)

Saccharin 9,40 5,04 3,31 2,77 2,68 2,90 9,06 4,60 3,16

Aspartam 77,1 21,7 8,36 4,41 3,02 3,86 97,6 31,5 13,4

A. Benzoic 30,7 15,9 9,38 6,40 4,83 5,04 32,4 16,9 9,65

A. Sorbic 54,5 25,7 14,2 8,98 6,30 6,28 60,7 28,3 14,6

Kết quả thực nghiệm cho thấy: Chế độ chạy sắc ký pha động thành phần

không đổi (isocratic) với các tỷ lệ khác nhau của thành phần pha động thì khi giảm

tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, thời gian lƣu giữ của một số chất phân tích

trên cột giảm, chúng ra sớm nên rất dễ lẫn với tạp chất khi phân tích mẫu thực tế.

Khi tăng tỷ lệ thể tích dung dịch đệm KH2PO4, các chất phân tích ra muộn, đặc biệt

là aspartam bị doãng pic. Nhƣ vậy sẽ làm giảm độ nhạy của phƣơng pháp phân tích.

Sắc đồ hỗn hợp các chất phân tích với thành phần pha động KH2PO4 : ACN = 80 :

20 (v/v) tại bƣớc sóng 210nm, 226nm và 254nm đƣợc thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chất phân tích, thành phần pha động KH2PO4 : ACN =

80 : 20 (v/v) tại bước sóng 210nm, 226nm và 254nm.

Qua kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy: việc tách và định lƣợng các

chất theo chế độ đẳng dòng là không phù hợp với thực tế yêu cầu phân tích (trong

cùng một tỷ lệ dung môi, có chất thời gian lƣu quá ngắn, có chất thời gian lƣu quá

dài). Do đó chúng tôi chuyển sang chế độ gradient pha động. Bên cạnh đó, chúng

tôi chọn hệ dung môi là KH2PO4 : ACN vì khoảng cách thời gian lƣu của các chất

khi chạy với hệ dung môi này khá đều, thuận tiện cho chế độ chạy gradient.


3.1.1.4. Khảo sát pH của pha động

Nếu pH của pha động cao, aspartam sẽ bị phân hủy. pH của pha động chỉ nên

trong khoảng 2-7, vì lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của các hạt silic

trên pha tĩnh. pH tốt nhất để tách các chất phân tích này là vùng acid vì ở vùng pH

này, các chất phân tích tồn tại ở dạng acid nên hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn. Sau khi

tham khảo tài liệu [18], chúng tôi sử dụng pha động là dung dịch đệm KH2PO4 0,02M

(pH = 4,3) và ACN. Điều chỉnh để đƣợc dung dịch KH2PO4 pH = 3 và pH = 5 bởi dung

dịch acid H3PO4 đặc và dụng dịch KOH trên máy đo pH. Tiến hành khảo sát các điểm

pH khác nhau của dung dịch KH2PO4 (pH = 3, pH = 4,3, pH = 5), tỷ lệ dung môi pha

động là KH2PO4 : ACN = 80 : 20 (v/v). Tốc dộ dòng là 1 ml/phút, thể tích bơm mẫu 20

µl, chất chuẩn hỗn hợp có nồng độ 5 ppm. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của pH pha

động đến thời gian lƣu của các chất phân tích đƣợc thể hiện ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH pha động đên thời gian lưu của chất phân tích

pH Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic (mAU)

Sac Asp BA SA Sac Asp BA SA

3 3,120 4,843 14,617 14,092 615,68 165,79 441,25 845,84

4,3 2,759 4,464 6,174 8,822 661,46 167,06 416,38 891,96

5 2,786 4,276 3 3,297 970,9 171,2 - 925,53

Saccharin và aspartam là hai chất có độ phân cực cao nhất trong các chất đang

nghiên cứu, nên 2 chất này thƣờng có thời gian lƣu ngắn nhất (đặc biệt là saccharin),

còn 2 chất bảo quản có thời gian lƣu dài hơn vì có độ phân cực thấp hơn. Dung dịch

đệm có pH = 3, pH này nhỏ hơn so với pKa của các chất nghiên cứu (bảng 1.1) nên

tất cả các chất nghiên cứu đều tồn tại dạng phân tử aid, vì vậy các chất bị lƣu giữ lâu

nhất. Với điều kiện pH = 4,3, saccharin và acid benzoic đã bắt đầu chuyển sang dạng

ion nên thời gian lƣu ngắn đi hẳn. Hai chất còn lại vẫn tồn tại dạng acid nên thời gian

lƣu có giảm nhƣng ít hơn. Với pH = 5, thời gian lƣu của cả 4 chất đều giảm rất lớn.

Tuy vậy, trong điều kiện pH = 4,3 thời gian lƣu của các chất cách đều nhau hơn,

thuận tiện cho việc khảo sát phƣơng pháp bằng chế độ gradient. Mặt khác, đa số diện

tích pic của các chất ở pH này cao hơn, pic nhọn và cân đối hơn so với pic ở pH = 3.

Nên chúng tôi chọn pH của dung dịch đệm là 4,3 để thực hiện nghiên cứu.

3.1.1.5. Khảo sát chương trình gradient pha động


Để giảm thiểu đƣợc chi phí phân tích các chất trên trong thực phẩm, thời

gian lƣu của 1 chất không đƣợc quá dài, nếu thời gian lƣu dài, ngoài việc tăng chi

phí, các pic sẽ kém nhọn và kém cân đối, làm giảm sự chính xác của phép đo.

Nhƣng nếu pic ra sớm quá sẽ lẫn tạp chất có trong nền mẫu hoặc pic dung môi. Nói

chung, phù hợp nhất là thời gian lƣu từ 6 – 10 phút.

Vì chƣơng trình chạy đẳng dòng không đáp ứng đƣợc yêu cầu trên nên chúng

tôi tiến hành khảo sát chƣơng trình rửa giải gradient. Cố định các điều kiện sắc ký:

- Agilent C18 (250mm× 4,6mm × 5μm)

- Pha động: Kênh A (ACN), kênh D (KH2PO4 0,02M, pH=4,3)

- Detector DAD với bƣớc sóng 210 nm, 226 nm, 254 nm

- Mẫu phân tích là hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khoảng 10 ppm

- Tốc độ dòng vẫn giữ 1 ml/phút

Các kết quả nhƣ sau:

Chê độ gradient 1: Tỷ lệ dung môi là 95% dung dịch đệm pH= 4,3: 5% ACN (theo

thể tích) đƣợc duy trì từ lúc chạy nền đến khi bơm mẫu đƣợc 1 phút, sau đó tỷ lệ đó

đƣợc thay đổi dần đến phút thứ 3 thì đạt 80% đệm : 20% ACN. Duy trì tỷ lệ này

đến khi kết thúc phân tích 1 mẫu. Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 1

đƣợc biểu diễn ở hình 3.6.

Hình 3.6. Sắc đồ các chất phân tích theo chê độ gradient 1


Bảng 3.3 cho thấy: với tỷ lệ 95% dung dịch đệm:5% ACN (theo thể tích) thì

các chất phân tích ra rất muộn, trong khi đó, ở tỷ lệ 80% dung dịch đệm:20% ACN

(theo thể tích) các chất lại ra rất sớm. Kết hợp 2 tỷ lệ trên trong một chƣơng trình

gradient, thời gian lƣu của các chất ra sớm đã đƣợc lùi lại, sau đó lại nhanh chóng

kéo các chất còn lại ra nhanh hơn. Mặc dù thời gian lƣu của chất ra đầu tiên đã là

hơn 6 phút nhƣng thời gian lƣu của chất ra cuối cùng vẫn dài hơn 10 phút. Vì vậy

chúng tôi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi lên từ sau phút thứ 6. Tốc độ dòng vẫn giữ 1

ml/phút trong chế độ gradient 2.

Chê độ gradient 2

Tỷ lệ dung môi của chế độ gradient 2 đƣợc thể hiện ở bảng 3.5

Bảng 3.5. Tỷ lệ dung môi của chê độ gradient 2

t (phút) 0 1 3 6

% đệm 95 95 80 55

Sắc đồ các chất phân tích theo chế độ gradient 2 đƣợc biểu diễn ở hình 3.7.


Mặc dù pic ra cuối cùng vào khoảng 8,70 phút nhƣng các pic quá gần nhau,

có thể khó khăn khi tách chất ở nền mẫu thự tế. Để cải thiện vấn đề trên, chúng tôi

đã giảm tốc độ dòng tại thời điểm tỷ lệ dung môi cao nhất so với dung dịch đệm.


Chê độ gradient 3

Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 3 đƣợc thể hiện ở bảng 3.6

Bảng 3.6. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chê độ gradient 3

t (phút) 0 1 3 6 7,5

% đệm 95 95 80 55 55

Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 0,8 1



Các pic đã giãn ra đôi chút so với chƣơng trình gradient 2 nhƣng vẫn cần điều chỉnh

giảm tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng để pic giãn phù hợp hơn, đồng thời giúp cho pic

của aspartam cân đối.

Gradient 4

Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chế độ gradient 4 đƣợc thể hiện ở bảng 3.7

Bảng 3.7. Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng của chê độ gradient 4

t (phút) 0 1 3 6 7,5 9 9,5 10

% đệm 95 95 80 55 55 55 95 95

Tốc độ dòng (ml/phút) 1,0 1,0 1,0 0,8 0,6 0,8 1,0 1,0




Chất phân tích trong sắc đồ thu đƣợc có thời gian lƣu hợp lý hơn (bảng 3.8):

saccharin: 6,519; aspartam: 8,231; acid benzoic: 9,393; acid sorbic: 9,866 (phút).

Diện tích pic và thời gian lƣu của các chất trong 4 chƣơng trình gradient vừa

khảo sát đƣợc so sánh trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Thời gian lưu và diện tích pic theo các chương trình gradient

Chê độ

gradient 1

Chê độ

gradient 2

Chê độ

gradient 3

Chê độ

gradient 4

Thời

gian

lưu

(phút)

Sac 6,149 6,147 6,526 6,519

Asp 7,906 7,268 7,719 8,231

BA 9,615 8,203 8,626 9,393

SA 12,096 8,700 9,080 9,866

Diện

tích píc

(mAU)

Sac 1273,85 1267,09 1481 1726,06

Asp 429,191 451,404 405,442 626,816

BA 850,642 893,268 896,601 977,314

SA 793,79 829,201 977,314 826,708


Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, diện tích pic đƣợc chạy bằng chƣơng trình

gradient 4 là lớn nhất, pic cũng cân đối hơn. Vì vậy chúng tôi chọn chƣơng trình

gradient 4 cho việc rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột và giữ cố định điều kiện

này cho các bƣớc tiếp theo.

Nhƣ vây, nghiên cƣu co cac thông sô đê chay HPLC nhƣ sau:

- Cột tách: RP18 - C18 (250mm × 4,6mm × 5μm) - Hãng Agilent.

- Nhiệt độ cột: 30OC

- Thể tich bơm mẫu: 20l

- Detecter: DAD ơ bƣớc song 210 nm, 226 nm, 254 nm

Thành phần pha động: Kênh A: ACN; kênh D: KH2PO4 (pH = 4,3)

- Tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng: tuân theo chƣơng trình gradient ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Chương trình gradient pha động và tốc độ dòng tối ưu

Thời gian

(phút) % ACN

% KH2PO4

pH = 4,3

Tốc độ dòng

ml/phút

0 5 95 1,0

1 5 95 1,0

3 80 20 1,0

6 45 55 0,8

7,5 45 55 0,6

9 45 55 0,8

9,5 5 95 1,0

10 5 95 1,0

3.1.2. Tối ưu quá trình xử lý mẫu

Trong quá trình chế biến thực phẩm, khi các chất phụ gia thêm vào sẽ liên

kết, hòa trộn trong thực phẩm. Để xác định đƣợc các chất đó, chúng ta phải tách

đƣợc các chất phụ gia ra khỏi nền mẫu. Chúng tôi chọn mẫu phân tích là mẫu thạch

bách vị để khảo sát xử lý mẫu phân tích hàm lƣợng saccharin, aspartam, acid

benzoic và acid sorbic vì trong mẫu này chứa cả 4 chất cần phân tích trên.

Dự kiến quy trình phân tích tham khảo TCVN 8471:2010 nhƣ sơ đồ 3.1:


Sơ đồ 3.1: Qui trình phân tích mẫu dự kiên

Các chất bảo quản hoặc chất tạo ngọt, khi thêm vào mẫu hầu nhƣ ở dạng

muối của chúng, vì vậy ta có thể chiết chúng ra khỏi nền mẫu bằng nƣớc. Tuy

nhiên, cung có thực phẩm có mặt cả dạng acid và dạng muối của phụ gia đó. Dạng

acid ít tan trong nƣớc nhƣng tan nhiều trong MeOH. Vì vậy, khi xử lý chúng tôi

thêm MeOH vào mẫu trƣớc khi chiết với nƣớc.

Trong quy trình xử lý mẫu này, thời gian rung siêu âm và lƣợng MeOH thêm

vào là yếu tố có khả năng ảnh hƣởng nhiều nhất đến kết quả. Vì vậy chúng tôi tiến

hành khảo sát hai yếu tố này.




vortex

HPLC

30ml H2O




Rung siêu âm

Ly tâm

MeOH Lắc vortex

Rung siêu âm


3.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm

Cân 4 mẫu thạch bách vị với khối lƣợng tƣơng đồng nhau, thực hiện quy

trình xử lý mẫu tƣơng tự nhau trừ thời gian siêu âm. Mẫu 1: chỉ lắc với nước, mẫu

2: lắc đều rồi siêu âm 15 phút, mẫu 3: lắc đều rồi siêu âm 30 phút, mẫu 4: lắc đều

và rung siêu âm 60 phút. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.10.

Bảng 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thời gian siêu âm

Mẫu 1: không

siêu âm

Mẫu 2: Siêu

âm 15 phút

Mẫu 3: Siêu

âm 30 phút

Mẫu 4: Siêu

âm 60 phút

Khối lƣợng mẫu (g) 3,2453 3,2438 3,3016 3,0123

Diện tích pic Sac (SSac) 879,121 905,184 950,522 864,89

SSac/ Khối lƣợng mẫu 270,9 279,1 287,9 287,1

Diện tích pic Asp 75,618 139,844 152,367 149,223

SAap/ Khối lƣợng mẫu 23,30 43,11 46,15 49,54

Diện tích pic BA 7041,83 7177,93 7574,34 6943,76

SBA/ Khối lƣợng mẫu 2169,9 2212,8 2294,1 2305,1

Diện tích pic SA 2025,86 1976,67 2090,4 1923,26

SSA/ Khối lƣợng mẫu 624,2 609,4 633,1 638,5

Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, diện tích pic/khối lƣợng mẫu tăng dần khi

tăng thời gian siêu âm. Nhƣng khi rung siêu âm 60 phút thì hầu nhƣ diện tích

pic/khối lƣợng mẫu của các chất không tăng. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian rung

siêu âm 30 phút cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.


3.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng lượng MeOH thêm vào mẫu

Mẫu sau khi đƣợc cân vào ống ly tâm 50 ml thì thêm nƣớc và MeOH nhƣ

sau: mẫu 1: chỉ cho 35ml nƣớc; mẫu 2: cho 2 ml MeOH và 32 ml nƣớc, mẫu 3: cho

5 ml MeOH và 30 ml nƣớc; mẫu 4: cho 10 ml MeOH và 25 ml nƣớc. Phân tích theo

quy trình và điều kiện đã xác định. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.11.

Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào thể tích MeOH thêm vào mẫu

Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, tăng lƣợng MeOH thêm vào dể xử lý mẫu

thì diện tích pic/khối lƣợng mẫu của chất phân tích tăng, nhƣng khi thêm 10 ml

MeOH vào để xử lý thì diện tích pic/khối lƣợng mẫu của chất phân tích hầu nhƣ

không tăng. Tức là, nếu thêm MeOH nhiều quá, không những không chiết đƣợc

chất ra nhiều hơn mà lại tốn kém. Vậy mỗi một mẫu, sau khi cân xong, thêm 5 ml

MeOH, lắc kỹ rồi thêm nƣớc, siêu âm 30 phút là phù hợp.

* Tóm lại: Qua qua trinh thƣc hiên , nghiên cƣu đa đƣa ra quy tri nh phân tich nhƣ

sơ đồ 3.2:

Mẫu 1: thêm

0 ml MeOH

Mẫu 2:

thêm 2 ml

MeOH

Mẫu 3:

thêm 5 ml

MeOH

Mẫu 4:

thêm 10 ml

MeOH

Khối lƣợng mẫu (g) 3,9863 3,464 3,0362 3,2209

Diện tích pic Sac (SSac) 75,193 666,754 602,791 637,25

SSac/ Khối lƣợng mẫu 18,86 192,48 198,53 197,85

Diện tích pic Asp (SAsp) 202,347 168,769 161,277 170,862

SAsp/ Khối lƣợng mẫu 50,76 48,72 53,12 53,05

Diện tích pic BA (SBA) 5834,75 5207,6 4748,51 4984,68

SBA/ Khối lƣợng mẫu 1463,7 1503,3 1564,0 1547,6

Diện tích pic SA (SSA) 1776,62 1542,31 1433,92 1529,58

SSA/ Khối lƣợng mẫu 445,68 445,24 472,27 474,89


Sơ đồ 3.2: Qui trình phân tích mẫu

Thuyết minh quy trình: Cân khoảng 2 ÷ 5 gam mẫu đối với mẫu rắn và 5 ÷ 10 ml

đối với mẫu lỏng vào ống ly tâm; thêm 5ml MeOH, votex kỹ, thêm 30 ml nƣớc cất,

rung siêu âm 30 phút. Sau khi siêu âm, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 2 ml

carrez 1, lắc đều, thêm 2 ml carrez 2, lắc đều, định mức vạch rồi lọc qua giấy lọc

băng xanh, lọc qua màng lọc whatman 0,45 µm và định lƣợng bằng phƣơng pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD ở bƣớc sóng 210nm, 226 nm, 254 nm,

dƣa vao thơi gian lƣu, diên tich pic để định tính và định lƣợng.

- Hàm lƣợng chất phân tích đƣợc tính theo công thƣc:

X(mg/100g) = Cm . m

Vm .

1000

100

Trong đo: Cm : Nông đô tinh theo đƣơng chuân (ppm).

Vm: Thê tich dung dich chiêt sau khi xƣ ly mâu(ml).

m : Khôi lƣơng mâu cân ban đâu (g)




vortex

HPLC

30ml H2O

Bình định mức 100 ml




Rung siêu âm 30 phút

5 ml MeOH Lắc vortex

Rung siêu âm


3.2. Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp

3.2.1. Kêt qua nghiên cưu tính phù hợp của hệ thống

Tiên hanh bơm 6 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn saccharin 10,36 ppm, aspartam

11,603 ppm, acid benzoic 10,108 ppm và acid sorbic có nồng độ 10,623 ppm, tính độ

lặp lại của thời gian lƣu (tR), diện tích pic, kết quả thu đƣợc trong bang 3.12:

Bảng 3.12: Kêt qua tinh toan sư phù hợp của hệ thống

Sô lân

bơm

Thơi gian lƣu (phút) Diên tich peak (mAU)

Sac Asp BA SA Sac Asp BA SA

1 6,619 8,311 9,45 9,933 1764,85 588,96 959,64 2637,36

2 6,639 8,321 9,471 9,948 1796,79 595,20 955,12 2634,18

3 6,644 8,323 9,476 9,95 1790,32 602,70 955,73 2633,45

4 6,647 8,322 9,478 9,952 1799,25 597,02 954,35 2639,28

5 6,663 8,329 9,482 9,955 1800,95 602,53 953,58 2640,20

6 6,646 8,322 9,476 9,951 1791,1 596,27 955,94 2646,99

Xtb 6,643 8,321 9,472 9,948 1790,54 597,11 955,73 2638,58

S 0,014 0,006 0,011 0,008 13,2939 5,1245 2,1090 4,9227

RSD(%) 0,215 0,07 0,121 0,078 0,7424 0,8582 0,2207 0,1866

Nhận xét: Qua bảng thấy kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký

cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) của thời gian lƣu và diện tích pic của các

chất phân tích trong 6 lần thử nằm trong khoảng 0,07 đến 0,86 % nằm trong khoảng

cho phép theo AOAC, điều này khăng đinh hê thông săc ky phu hơp , ổn định, đảm

bảo cho phân tích.

3.2.2. Độ đặc hiệu, chọn lọc

Để xác định tính chọn lọc, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu trắng và

mẫu trắng có thêm chất chuẩn, so sánh mẫu trắng có thêm chuẩn acid benzoic và

acid sorbic. Kết quả thu đƣợc ở hình 3.10:


(A)

(B)

Hình 3.10: Sắc đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B)

Trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện pic tại các thời gian lƣu của

saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic. Còn trên sắc đồ mẫu thêm chuẩn

có xuất hiện các pic tại các thời gian lƣu tƣơng ứng của acid benzoic và acid sorbic.

Nhƣ vậy phƣơng pháp có tính đặc hiệu và chọn lọc đáp ứng yêu cầu.

- Độ phân giải RS = )(2/1 AB

RARB

WW

tt

và hệ số tách α =

'

'

RA

RB

t

t


Từ sắc đồ của mẫu trắng thêm chuẩn thể hiện ở hình 3.9, xác định hệ số tách và độ

phân giải của 2 pic liền kề nhau:

Bảng 3.11. Hệ số tách và độ phân giải của pic các chất phân tích

Thông số Độ phân giải (α)

Saccharin Aspartam A. Benzoic A. Sorbic

Thời gian (phút) 6,416 8,172 9,367 9,861

Hệ số tách α 1,27 1,15 1,05

Độ rộng đáy pic (W) 0,0892 0,0898 0,0890 0,0820

Độ phân giải (RS) 19,6 13,4 5,8

Bảng 3.11 cho thấy: hệ số tách lớn hơn hoặc bằng 1,05, độ phân giải lớn hơn

1,5. Vậy, các chất phân tích đã đƣợc tách khỏi nhau hoàn toàn, mức độ chọn lọc cao.

3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đo

Chúng tôi đã xác định giới hạn phát hiện của thiết bị đối với các chất cần

phân tích và thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Bảng 3.12 : Giới hạn phát hiện của thiêt bị đối với các chất đang nghiên cứu

Chất phân tích LOD (ppm) LOQ (ppm) S/N

Saccharin 0,0216 0,07128 3,8

Aspartam 0,58 1,914 3,2

Acid benzoic 0,0843 0,27819 3,0

Acid sorbic 0,0162 0,05346 2,7

Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với saccharin đƣợc biểu diễn theo hình 3.13

Hình 3.13: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với saccharin


Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với aspartam đƣợc biểu diễn theo hình 3.14

Hình 3.14: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với aspartam

Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với acid benzoic đƣợc biểu diễn theo hình3.15

Hình 3.15: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid benzoic

Sắc đồ xác định LOD của thiết bị đối với acid sorbic đƣợc biểu diễn theo hình 3.16

Hình 3.16: Sắc đồ LOD của thiết bị đối với acid sorbic

3.2.4. Khoảng tuyến tính

Trong phân tích định lƣợng khi tăng nồng độ chất phân tích đến một giá trị

giới hạn nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn

phụ thuộc tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích phụ thuộc tuyến tính vào

chiều cao hay diện tích pic gọi là khoảng tuyến tính, thƣờng đƣợc tính từ giới hạn

định lƣợng đến giới hạn tuyến tính.


Với các điều kiện chạy HPLC đã chọn, chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ

thuộc tuyến tính của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của saccharin, aspartam, acid

benzoic và acid sorbic. Từ dung dịch chuẩn gốc 1000ppm chúng tôi đã pha loãng

thành chuẩn trung gian 100ppm và sau đó pha thành dãy dung dịch chuẩn làm việc

của các chất phân tích với các nồng độ khác nhau rồi tiến hành bơm vào hệ thống

HPLC. Kết quả phân tích dãy chuẩn trên máy HPLC đƣợc chỉ ra trong bảng 3.13:

Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích

Nồng

độ Sac

(ppm)

Diện tích

pic Sac

(mAU)

Nồng

độ Asp

(ppm)

Diện tích

pic Asp

(mAU)

Nồng

độ BA

(ppm)

Diện tích

pic BA

(mAU)

Nồng

độ SA

(ppm)

Diện tích pic SA

(mAU)

0,0216 3,673 0,58 22,658 0,0843 6,478 0,0162 2,578

0,518 93,439 1,166 59,130 0,505 47,764 0,531 131,83

1,036 184,694 5,802 302,98 1,011 97,137 1,062 264,43

5,18 910,542 11,603 588,96 5,054 489,032 5,312 1336,44

10,36 1764,85 17,405 906,35 10,108 959,641 10,623 2637,36

15,54 2687,81 23,206 1231,34 15,162 1450,87 15,935 3986,59

20,72 3627,47 46,412 2328,79 20,216 1956,81 21,246 5386,59

41,44 7023,94 69,618 3552,07 40,432 3744,21 42,492 10470,8

62,16 10448,1 92,824 4697,92 60,648 5678,09 63,738 15533

82,88 13420,2 80,864 7438,14 84,984 19850,6

Hình 3.17: Đường chuẩn của saccharin

trong khoảng nông độ 0,02 ÷ 80 ppm

Hình 3.18: Đường chuẩn của aspartam



Hình ảnh pic của chuẩn hỗn hợp nồng độ 1 ppm đƣợc thể hiện ở hình 3.21

Hình 3.21. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp chuẩn 1 ppm của các chất phân tích.

3.2.5. Độ lặp lại của phương pháp phân tích

Qua nghiên cứu chúng tôi thấy kết quả phân tích của phƣơng pháp phụ thuộc

rất nhiều vào nền mẫu. Muốn đƣa ra đƣợc qui trình phân tích chung cho các đối

tƣợng thực phẩm chúng ta phải tiến hành xác định độ lặp lại của phƣơng pháp trên

các nền mẫu khác nhau. Lựa chọn 7 đối tƣợng mẫu khác nhau: Xúc xích đại diện

cho thực phẩm giàu chất béo và protein, bánh ngọt đại diện cho thực phẩm giàu

Hình 3.19: Đường chuẩn của A. benzoic

trong khoảng nông độ 0,08÷90 ppm

Hình 3.20: Đường chuẩn của A.sorbic



cacbon hydrat, và thạch bách vị đại diện cho thực phẩm tạo gel, dƣa chuột muối đại

diện cho rau củ đóng hộp, ô mai, kẹo và nƣớc ngọt.

Xác định độ lặp lại bằng cách phân tích mẫu lặp lại 6 lần bắt đầu từ bƣớc cân

mẫu (áp dụng cho 7 đối tƣợng mẫu khác nhau ), xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối

RSD(%), để đánh giá RSD (%) của phƣơng pháp với RSD (%) của AOAC ở nồng

đô chât tƣơng ƣng.

Lâp đƣơng chu ẩn với cac nông đô tƣ giới hạn phát hiện của máy đến nồng

độ phù hợp với chất phân tích trong mẫu, kêt qua đƣợc thể hiện trong bảng 3.14 và

phụ lục 9.1

Bảng 3.14: Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn

Chất phân tích Khoảng nồng độ

ppm

Phƣơng trình hồi quy Hệ số tƣơng quan

Saccharin 0,05 – 20 y = 174,07x + 1,4182 R² = 0,9999

Aspartam 1,16 – 23 y = 42,936x - 1,0979 R² = 0,9999

Acid benzoic 0,08-20 y = 94,011x + 0,9942 R² = 1

Acid sorbic 0,02-21 y = 178,25x - 3,5319 R² = 1

Kết quả xác định lặp lại saccharin trên các đối tƣợng mẫu khác nhau theo các

bảng dƣới đây:

Bảng 3.15: Kêt quả phân tích lặp lại hàm lượng saccharin trong mẫu thực (n=6)

Tên

mẫu

Khối

lƣợng

mẫu (g)

Diện tích

pic mAU

Hàm lƣợng

Sac

(mg/100g)

Hàm

lƣợng Sac

(mg/100g)

SD RSD %

Xúc

xích

3,1102 21,7397 0,187 0,182 0,0102 5,61

3,0042 20,4645 0,168

3,1315 21,3961 0,179

3,1253 21,1482 0,175

3,1028 21,8105 0,189

3,0233 21,918 0,196

Bánh

đậu

xanh

3,7609 300,304 4,58 4,62 0,0649 1,40

3,6821 300,286 4,67

3,5425 291,007 4,70

3,6682 294,084 4,59


3,6587 298,34 4,66

3,6233 287,042 4,53

Thạch

bách

vị

3,3217 766,995 12,7 12,8 0,0753 0,589

3,3270 769,674 12,8

3,2650 759,402 12,8

3,1520 726,68 12,7

3,1250 729,252 12,8

3,1370 737,389 12,9

Dƣa

chuột

muối

đóng

hộp

3,2309 47,8873 0,664 0,630 0,0248 3,94

3,0314 45,1916 0,655

3,1205 43,9134 0,611

3,0425 44,2305 0,633

3,1841 44,163 0,604

3,0126 42,939 0,614

Ô mai 3,312 2528,087 44,4 44,3 0,172 0,389

3,314 2516,61 44,2

3,314 2521,52 44,2

3,292 2519,5 44,5

3,293 2517,1 44,5

3,321 2520,19 44,1

Kẹo 3,5609 - - - - -

3,4121 - -

3,2425 - -

3,1462 - -

3,2121 - -

3,2133 - -

Nƣớc

ngọt

5 (ml) 110,262 1,31 1,31 0,0138 1,06

5 (ml) 111,707 1,32

5 (ml) 110,663 1,31

5 (ml) 107,807 1,28

5 (ml) 110,673 1,31

5 (ml) 109,451 1,30

Kết quả xác định lặp lại aspartam trên các đối tƣợng mẫu khác nhau theo

bảng 3.16 dƣới đây


Bảng 3.16: Kêt quả phân tích lặp lại hàm lượng aspartam trong mẫu thực (n=6)

Tên

mẫu

Khối

lƣợng mẫu

(g)

Diện tích

pic mAU

Hàm lƣợng

Asp

(mg/100g)

Hàm

lƣợng

Asp TB

SD RSD %

Xúc

xích

3,1102 - - - - -

3,0042 - -

3,1315 - -

3,1253 - -

3,1028 - -

3,0233 - -

Bánh

đậu

xanh

3,7609 - - - - -

3,6821 - -

3,5425 - -

3,6682 - -

3,6587 - -

3,6233 - -

Thạch

bách vị

3,3217 199,411 11,11

11,2 0,151 1,35

3,3270 196,241 10,9

3,2650 199,689 11,3

3,1520 190,837 11,2

3,1250 190,555 11,3

3,1370 189,256 11,1

Dƣa

chuột

muối

đóng

hộp

3,2309 32,2806 1,70

1,68 0,0668 3,98

3,0314 29,6205 1,64

3,1205 31,8874 1,73

3,0425 29,7113 1,64

3,1841 29,9637 1,59

3,0126 31,5202 1,77

Ô mai 3,312 - - - - -

3,314 - -

3,314 - -

3,292 - -


3,293 - -

3,321 - -

Kẹo 3,5609 - - - - -

3,4121 - -

3,2425 - -

3,1462 - -

3,2121 - -

3,2133 - -

Nƣớc

ngọt

5 (ml) 807,586 30,9

30,9 0,204 0,661

5 (ml) 811,231 31,1

5 (ml) 806,33 30,9

5 (ml) 796,144 30,5

5 (ml) 809,101 31,0

5 (ml) 807,853 30,9

Kết quả xác định lặp lại acid benzoic trên các đối tƣợng mẫu khác nhau theo


Bảng 3.17: Kêt quả phân tích lặp lại hàm lượng acid benzoic trong mẫu thực (n=6)

Tên

mẫu

Khối

lƣợng

mẫu (g)

Diện tích

pic mAU

Hàm lƣợng

BA

(mg/100g)

Hàm

lƣợng

BA TB

SD RSD %

Xúc

xích

3,1102 - -

- - -

3,0042 - -

3,1315 - -

3,1253 - -

3,1028 - -

3,0233 - -

Bánh

đậu

xanh

3,7609 - -

- - -

3,6821 - -

3,5425 - -

3,6682 - -

3,6587 - -


3,6233 - -

Thạch

bách

vị

3,3217 5813,02 188

188 0,816 0,434

3,3270 5802,26 188

3,2650 5706,25 189

3,1520 5479,24 187

3,1250 5469,99 189

3,1370 5484,19 189

Dƣa

chuột

muối

đóng

hộp

3,2309 - -

- - -

3,0314 - -

3,1205 - -

3,0425 - -

3,1841 - -

3,0126 - -

Ô mai

3,312 2920,65 94,3

94,4 0,320 0,340

3,314 2922,08 94,2

3,314 2918,55 94,1

3,292 2924,32 94,9

3,293 2915,06 94,6

3,321 2922,69 94,1

Kẹo

3,5609 35,395 1,03

1,06 0,0346 3,27

3,4121 34,625 1,05

3,2425 35,023 1,12

3,1462 32,82 1,08

3,2121 32,61 1,05

3,2133 32,12 1,03

Nƣớc

ngọt

5 (ml) 1341,13 28,1

28,0 0,358 1,28

5 (ml) 1344,85 28,2

5 (ml) 1338,76 28,0

5 (ml) 1305,04 27,3

5 (ml) 1339,88 28,1

5 (ml) 1350,21 28,3


Kết quả xác định lặp lại acid sorbic trên các đối tƣợng mẫu khác nhau theo


Bảng 3.18: Kêt quả phân tích lặp lại hàm lượng acid sorbic trong mẫu thực (n=6)

Tên

mẫu

Khối

lƣợng mẫu

(g)

Diện tích

pic mAU

Nồng độ SA

(mg/100g)

Nồng độ

SA TB

SD RSD %

Xúc

xích

3,1102 3480,896 76,8 77,3 1,35 1,75

3,0042 3462,004 79,0

3,1315 3456,847 75,7

3,1253 3475,055 76,3

3,1028 3477,23 76,9

3,0233 3473,607 78,8

Bánh

đậu

xanh

3,7609 1272,2 19,0 19,3 0,200 1,04

3,6821 1261,02 19,3

3,5425 1235,27 19,6

3,6682 1261,77 19,4

3,6587 1256,13 19,3

3,6233 1238,05 19,2

Thạch

bách

vị

3,3217 1153,204 13,3 13,3 0,0816 0,615

3,3270 1146,933 13,2

3,2650 1131,82 13,3

3,1520 1091,38 13,2

3,1250 1084,8 13,2

3,1370 1099,41 13,4

Dƣa

chuột

muối

đóng

hộp

3,2309 - - - - -

3,0314 - -

3,1205 - -

3,0425 - -

3,1841 - -

3,0126 - -

Ô mai 3,312 - - - - -

3,314 - -

3,314 - -

3,292 - -

3,293 - -

3,321 - -

Kẹo 3,5609 114,178 1,86 2,04 0,107 5,23

3,4121 115,852 1,96

3,2425 116,191 2,07

3,1462 116,358 2,14

3,2121 116,57 2,10


3,2133 116,692 2,10

Nƣớc

ngọt

5 (ml) - - - - -

5 (ml) - -

5 (ml) - -

5 (ml) - -

5 (ml) - -

5 (ml) - -

Ghi chú: dấu (-) trong bảng là các mẫu có hàm lƣợng nhỏ hơn LOD.

Các kết quả thực nghiệm đƣợc so sánh với số liệu trong bảng phụ lục 1 cho

thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) nằm trong khoảng cho phép theo AOAC [9]

Nhƣ vậy phƣơng pháp có độ lặp lại tốt.

Sắc đồ của mẫu nƣớc ngọt sau khi đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp đang

nghiên cứu thể hiện ở hình 3.22.

Hình 3.22. Sắc đồ của mẫu nước ngọt

3.2.6. Độ đúng

Để xác định độ đúng chúng tôi thực hiện xác định độ thu hồi bằng cách thêm

một lƣợng các chất chuẩn vào mẫu phân tích và tiến hành phân tích nhƣ quy trình

đã nêu. Kết quả đƣợc thể hiện trong các bảng 3.18, bảng 3.19, bảng …


3.2.6.1. Mẫu xúc xích

Mẫu xúc xích đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin:

103,6 ppm; aspartam: 98,03 ppm; acid benzoic: 80,864 ppm; acid sorbic: 106,23

ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.

Bảng 3.19: Kêt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu xúc xích

Lƣợng

cân (g)

Diện

tích pic

Hàm lƣợng

mẫu thêm

chuẩn Cm+C

(mg/100g)

Hàm

lƣợng

chuẩn

thêm CC

(mg/100g)

Hàm

lƣợng TB

Cm

(mg/100g)

Độ thu

hồi

(%)

Độ thu

hồi TB

(%)

Sac

3,1141 709,18 13,4 13,3

0,182

99,3

96,5

3,1034 704,38 13,4 13,4 98,6

3,0558 695,80 13,4 13,6 97,4

3,1477 1012,8 19,0 19,7 95,4

3,2166 1003,3 18,4 19,3 94,5

3,1852 996,2 18,5 19,5 93,8

Asp

3,1141 220,37 13,1 12,6

0

103,8

104,2

3,1034 223,53 13,3 12,6 105,3

3,0558 221,69 13,4 12,8 104,4

3,1477 331,74 19,6 18,7 104,7

3,2166 328,16 18,9 18,3 103,5

3,1852 328,71 19,1 18,5 103,7

BA

3,1141 311,08 9,90 10,4

0

95,3

96,0

3,1034 314,40 10,0 10,4 96,4

3,0558 316,39 10,3 10,6 97,0

3,1477 470,29 14,8 15,4 96,1

3,2166 468,16 14,4 15,1 95,6

3,1852 467,74 14,6 15,2 95,5

SA

3,1141 4070,1 89,6 13,6

77,3

90,2

93,7

3,1034 4060,1 89,7 13,7 90,5

3,0558 4015,1 90,1 13,9 92,0

3,1477 4510,2 98,2 20,2 103,3

3,2166 4476,5 95,4 19,8 91,3

3,1852 4475,2 96,3 20,0 95,0

3.2.6.2. Mẫu bánh đậu xanh


Mẫu bánh đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin: 103,6

ppm; aspartam: 104,427 ppm; acid benzoic: 101,08 ppm; acid sorbic: 106,23 ppm.

Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.

Bảng 3.20: Kêt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu bánh đậu xanh

Lƣợng

cân (g)

Diện

tích

pic

Hàm lƣợng

mẫu thêm

chuẩn Cm+C

(mg/100g)

Hàm

lƣợng

chuẩn

thêm CC

(mg/100g)

Hàm

lƣợng TB

Cm

(mg/100g)

Độ thu

hồi

(%)

Độ thu

hồi TB

(%)

Sac 3,0161 962,59 18,3 13,7

4,62

99,9

101,2

3,0242 984,17 18,7 13,7 102,8

2,9361 983,30 19,2 14,1 103,4

3,0046 1334,2 25,5 20,7 100,9

2,9044 1319,7 26,1 21,4 100,4

2,9855 1318,4 25,4 20,8 99,9

Asp 3,0161 170,19 13,2 13,8

0

95,7

94,8

3,0242 171,46 13,2 13,8 95,7

2,9361 168,48 13,3 14,2 93,7

3,0046 249,19 19,4 20,9 92,8

2,9044 256,17 20,6 21,6 95,4

2,9855 257,43 20,1 21 95,7

BA 3,0161 368,88 13,4 13,4

0

100,0

98,7

3,0242 372,44 13,4 13,4 100,0

2,9361 359,19 13,8 13,8 100,0

3,0046 543,71 19,2 20,2 95,0

2,9044 559,16 20,4 20,9 97,6

2,9855 568,17 20,2 20,3 99,5

SA 3,0161 1717,7 32,0 14,1

19,3

90,1

91,4

3,0242 1719,5 32,0 14,1 90,1

2,9361 1716,1 32,9 14,5 93,8

3,0046 2055,9 38,5 21,2 90,6

2,9044 2045,8 39,6 21,9 92,7

2,9855 2053,9 38,7 21,3 91,1


3.2.6.3. Mẫu thạch bách vị

Mẫu thạch bách vị đƣợc thêm 2ml; 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ:

saccharin: 103,6 ppm; aspartam: 116,03 ppm; acid benzoic: 101,08 ppm; acid

sorbic: 106,23 ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 2 lần.

Bảng 3.21: Kêt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu thạch bách vị

Lƣợng

cân (g)

Diện

tích

pic

Hàm lƣợng

mẫu thêm

chuẩn Cm+C

(mg/100g)

Hàm

lƣợng

chuẩn

thêm CC

(mg/100g)

Hàm

lƣợng TB

Cm

(mg/100g)

Độ thu

hồi

(%)

Độ thu

hồi TB

(%)

Sac

3,6092 1194,9 18,8 5,74

12,8

104,5

103,2

3,617 1200,5 18,8 5,73 104,7

4,171 1689,0 23,3 9,94 105,6

4,211 1670,4 22,8 9,84 101,6

3,7895 1926,7 29,4 16,4 101,2

3,8047 1929,3 29,3 16,3 101,2

Asp

3,6092 324,96 17,1 6,43

11,1

93,3

93,0

3,617 323,12 16,9 6,42 90,3

4,171 472,46 21,8 11,1 96,4

4,211 471,18 21,5 11 94,5

3,7895 546,61 27,8 18,4 90,8

3,8047 552,11 28,0 18,3 92,3

BA

3,6092 6489,8 194 5,60

188,3

103,6

101,3

3,617 6500,7 194 5,59 102,0

4,171 7672,7 198,8 9,69 108,4

4,211 7680,5 197 9,60 90,6

3,7895 7184,6 205 16,0 104,4

3,8047 7179,3 204 15,9 98,7

SA

3,6092 1750,5 19,0 5,89

13,3

96,8

97,9

3,617 1746,9 19,0 5,87 97,1

4,171 2466,1 23,5 10,2 100

4,211 2482,3 23,4 10,1 100

3,7895 2814,4 29,7 16,8 97,6

3,8047 2805,8 29,4 16,8 95,8


3.2.6.4. Mẫu dưa chuột muối đóng hộp

Mẫu dƣa chuột muối đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ:

saccharin: 103,6 ppm; aspartam: 98,03 ppm; acid benzoic: 80,864 ppm; acid sorbic:

106,23 ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.

Bảng 3.22: Kêt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu dưa chuột muối

Lƣợng

cân (g)

Diện

tích pic

Hàm lƣợng

mẫu thêm

chuẩn Cm+C

(mg/100g)

Hàm lƣợng

chuẩn thêm

CC

(mg/100g)

Hàm

lƣợng TB

Cm

(mg/100g)

Độ

thu

hồi

(%)

Độ thu

hồi TB

(%)

Sac

3,2124 718,497 13,2 12,9

0,63

97,4

96,9

3,2014 718,033 13,2 12,9 97,4

3,6225 704,134 11,4 11,4 94,5

3,3487 1062,09 18,8 18,6 97,7

3,0145 1058,54 20,8 20,6 97,9

3,2136 1050,86 19,3 19,3 96,7

Asp

3,2124 251,868 14,5 12,2

1,68

105

98,9

3,2014 250,904 14,5 12,2 105

3,6225 259,446 13,3 10,8 108

3,3487 370,69 20,6 20,8 91,0

3,0145 375,325 23,1 23,1 92,7

3,2136 372,9 21,6 21,7 91,8

BA

3,2124 316,757 9,78 10,1

0

96,8

97,0

3,2014 318,106 9,85 10,1 97,5

3,6225 318,777 8,72 8,93 97,7

3,3487 474,888 14,1 14,5 97,2

3,0145 472,732 15,5 16,1 96,3

3,2136 472,393 14,6 15,1 96,7

SA

3,2124 586,4 12,6 13,2

0

95,5

95,3

3,2014 585,366 12,7 13,3 95,5

3,6225 585,889 11,2 11,7 95,7

3,3487 878,179 18,1 19,0 95,3

3,0145 874,752 20,0 21,1 94,8

3,2136 873,934 18,8 19,8 94,9


3.2.6.5. Mẫu ô mai

Mẫu ô mai đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin:


ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần.

Bảng 3.23: Kêt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu ô mai

Lƣợng

cân (g)

Diện

tích pic

Hàm

lƣợng mẫu

thêm

chuẩn

Cm+C

(mg/100g)

Hàm

lƣợng

chuẩn

thêm CC

(mg/100g)

Hàm

lƣợng TB

Cm

(mg/100g)

Độ thu

hồi

(%)

Độ thu

hồi TB

(%)

Sac

3,8794 3772,45 56,8 11,8

44,3

106,4

98,2

3,8742 3754,91 56,6 11,8 104,7

3,8657 3704,58 56,0 11,8 99,0

3,6061 3801,16 61,6 19,0 91,2

3,5659 3802,88 62,3 19,2 93,9

3,5947 3823,21 62,2 19,0 93,8

Asp

3,8794 189,596 8,8 9,6

0,0

92,1

96,1

3,8742 191,884 8,9 9,6 93,3

3,8657 192,115 9,0 9,6 93,5

3,6061 294,979 15,3 15,4 99,0

3,5659 301,478 15,8 15,6 101,3

3,5947 290,791 15,1 15,5 97,5

BA

3,8794 3728,86 103 9,38

94,4

91,5

96,5

3,8742 3720,45 103 9,39 90,4

3,8657 3722,82 103 9,41 93,3

3,6061 3683,68 109 15,1 99,3

3,5659 3674,25 110 15,3 104,4

3,5947 3678,34 110 15,2 100,3

SA

3,8794 975,003 9,78 9,86

0,0

99,2

99,8

3,8742 967,251 9,71 9,87 98,4

3,8657 968,541 9,75 9,89 98,5

3,6061 1467,6 16,1 15,9 101,0

3,5659 1469,16 16,3 16,1 101,1

3,5947 1465,72 16,1 16,0 100,8


3.2.6.6. Mẫu kẹo

Mẫu kẹo đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin: 103,6

ppm; aspartam: 122,78 ppm; acid benzoic: 80,864 ppm; acid sorbic: 84,984 ppm.

Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần

Bảng 3.24: Kêt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu kẹo

Lƣợng

cân (g)

Diện

tích pic

Hàm

lƣợng mẫu

thêm

chuẩn

Cm+C

(mg/100g)

Hàm

lƣợng

chuẩn

thêm CC

(mg/100g)

Hàm

lƣợng TB

Cm

(mg/100g)

Độ thu

hồi

(%)

Độ thu

hồi TB

(%)

Sac

3,2161 665,941 11,9 12,9

0

92,2

95,1

3,0242 683,061 13,0 13,7 94,6

3,2461 680,97 12,0 12,8 94,0

3,5823 1044,62 16,7 17,4 96,0

3,3175 1049,31 18,2 18,7 97,3

3,3329 1045,1 18,0 18,7 96,3

Asp

3,2161 218,434 15,9 15,3

0

103,9

104

3,0242 220,692 17,0 16,2 104,9

3,2461 222,365 16,0 15,1 106,0

3,5823 328,334 21,5 20,6 104,4

3,3175 331,108 23,4 22,2 105,4

3,3329 322,23 22,6 22,1 102,3

BA

3,2161 331,878 10,9 10,1

1,06

97,4

100

3,0242 331,539 11,6 10,7 98,5

3,2461 333,045 10,9 9,96 98,8

3,5823 504,444 14,9 13,5 102,5

3,3175 499,212 16,0 14,6 102,3

3,3329 497,447 15,8 14,6 101,0

SA

3,2161 667,121 11,7 10,6

2,04

91,2

96,1

3,0242 676,128 12,6 11,2 94,3

3,2461 674,911 11,7 10,5 92,0

3,5823 1024,11 16,1 14,2 99,0

3,3175 1028,17 17,5 15,4 100,4

3,3329 1024,34 17,3 15,3 99,8


3.2.6.7. Mẫu nước ngọt

Mẫu nƣớc ngọt đƣợc thêm 4 ml; 6ml chuẩn trung gian có nồng độ: saccharin:


ppm. Mỗi nồng độ thêm chuẩn đƣợc lặp lại 3 lần

Bảng 3.25: Kêt quả xác định độ thu hồi của phương pháp trên mẫu nước ngọt

Thể

tích

mẫu

(ml)

Diện

tích pic

Hàm lƣợng

mẫu thêm

chuẩn Cm+C

(mg/100ml)

Hàm lƣợng

chuẩn thêm

CC

(mg/100ml)

Hàm lƣợng

TB Cm

(mg/100ml)

Độ

thu

hồi

(%)

Độ thu

hồi TB

(%)

Sac

5 786,146 9,06 8,29

1,31

93,5

94,3

5 789,659 9,1 8,29 94,0

5 790,981 9,11 8,29 94,1

5 1122,66 12,9 12,4 93,5

5 1130,12 13,0 12,4 94,3

5 1129,73 13,0 12,4 94,3

Asp

5 1036,65 39,8 9,28

30,9

95,9

92,1

5 1036,9 39,8 9,28 95,9

5 1039,73 39,9 9,28 97,0

5 1130,18 43,4 13,9 89,9

5 1135,65 43,7 13,9 92,1

5 1136,02 43,7 13,9 92,1

BA

5 1696,04 35,6 8,09

28,0

93,9

94,2

5 1696,12 35,6 8,09 93,9

5 1698,03 35,7 8,09 95,2

5 1855,64 39 12,1 90,9

5 1866,3 39,3 12,1 93,4

5 1871,67 39,4 12,1 94,2

SA

5 995,274 8,06 8,50

0,0

94,8

95,3

5 995,555 8,06 8,50 94,8

5 996,076 8,07 8,50 94,9

5 1487,58 12,0 12,7 94,5

5 1488,96 12,1 12,7 95,3

5 1490,95 12,1 12,7 95,3


Các kết quả đƣợc so sánh với số liệu trong phụ lục 2 cho thấy độ thu hồi của

saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic trên đối tƣợng xúc xích, bánh đậu

xanh, thạch bách vị, dƣa chuột muối đóng hộp, ô mai, kẹo, nƣớc ngọt trong khoảng

90% - 104,2%, đạt yêu cầu trong quy định về độ thu hồi của AOAC.

Chú ý: Phƣơng pháp nghiên cứu tính kết quả theo hàm lƣợng acid benzoic và acid

sorbic. Thực phẩm bổ sung chất bảo quản là muối benzoat hoặc muối sorbat. Hàm

lƣợng muối benzoat hoặc muối sorbat đƣợc tính:

Hàm lƣợng muối benzoat = K× hàm lƣợng acid benzoic

Hàm lƣợng muối sorbat = K× hàm lƣợng acid sorbic

Trong đó K là hệ số qui đổi phụ thuộc vào loại muối.

VD: Với muối kali sorbate K=1,339 (Khối lƣợng phân tử kali sorbate/ khối lƣợng

phân tử acid sorbic)

3.2.7. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ = 3,3 × LOD)

của phƣơng pháp bằng cách phân tích mẫu thực và tiến hành pha loãng chất phân tích tới

nồng độ nhỏ nhất mà vẫn thu đƣợc tín hiệu gấp 3 lần tín hiệu đƣờng nền (S/N = 3). LOD

hính bằng nồng độ trƣớc khi pha loãng chia cho hệ số pha loãng.

Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đƣợc xác định đồng thời trong mỗi nền

mẫu sử dụng để xác định độ chụm và độ thu hồi. Kêt qua thƣc hiên nhƣ bảng 3.26:

Bảng 3.26. MDL và MQL của từng nền mẫu

Mẫu

Diện

tích

pic

S/N

MDL theo

đƣờng chuẩn

mg/100g

MQL theo

đƣờng chuẩn

mg/100g

MDL

Thực tế

mg/100g

MQL

thực tế

mg/100g

Xúc

xích

Sac 8,1087 3,6 0,062 0,205 0,0642 0,212

SA 21,787 3,6 0,644 2,125 0,687 2,27

Bánh Sac 5,2848 4,1 0,063 0,208 0,0623 0,205


3.2.8. Đánh giá độ chính xác của phương pháp bằng phân tích đối chứng

Trong quá trình xác nhận giá trị phƣơng pháp, mẫu nƣớc ngọt và mẫu thạch

bách vị đƣợc chúng tôi chia hai, một nửa thực hiện độ chụm, độ thu hồi, LOD theo

phƣơng pháp đang nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Labo xét nghiệm an toàn vệ

sinh thực phẩm, trƣờng Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dƣơng. Một nửa đƣợc gửi tới

Viện Kiểm nghiệm Quốc gia (VKNQG), Hà Nội. Tại Viện Kiểm nghiệm Quốc Gia,

mẫu gửi phân tích đối chứng đƣợc thủy phân ở 500C, rung siêu âm và loại tạp rồi

bơm vào hệ thống HPLC với cột phân tích là cột anion để xác định đồng thời các

chất phân tích là saccharin, aspartam, acid benzoic và acid sorbic.

Kết quả so sánh của hai phòng thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.27:

đậu

xanh SA 5,0689 4,6 0,136

0,449

0,149 0,491

Thạch

bách

vị

Sac 8,9441 2,8 0,142 0,469 0,138 0,454

Asp 31,154 3,0 1,85 6,105 1,99 6,56

BA 16,068 2,8 0,331 1,092 0,327 1,08

SA 8,0163 2,2 0,074 0,244 0,0756 0,249

Dƣa

chuột

muối

Sac 13,107 4,1 0,133 0,439 0,137 0,453

Asp 10,468 2,7 0,565 1,865

0,571 1,89

Ô mai Sac 13,151 6,5 0,074 0,244 0,0754 0,25

BA 14,649 2,6 0,304 1,003 0,315 1,04

Kẹo BA 35,22 3,0 0,372 1,228 0,372 1,23

SA 5,556 2,6 0,084 0,277 0,0874 0,288

Nƣớc

ngọt

Sac 5,41 3,1 0,065 0,215 0,0689 0,227

Asp 38,47 2,5 1,545 5,099 1,68 5,54


Bảng 3.27. Kêt quả mẫu kiểm nghiệm đối chứng

Hàm lƣợng

Sac

(mg/100g)

Hàm lƣợng

Asp

(mg/100g)

Hàm lƣợng

BA

(mg/100g)

Hàm lƣợng

SA

(mg/100g)

Mẫu

nƣớc

ngọt

VKNQG KPH

(<0,2) 29,5 26,8

KPH

(<0,2)

Hàm lƣợng

trung bình

(mg/100g)

(n=6)

1,30 30,86 27,99 KPH

(< 0,16)

Mẫu

thạch

bách

vị

VKNQG 12,0 11,5 195 15,0

Hàm lƣợng

trung bình

(mg/100g)

(n=6)

12,79 10,29 188,37 13,27

Bảng 3.27 cho thấy, các kết quả đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp đang nghiên cứu

khá tƣơng đồng với kết quả của Viện Kiểm nghiệm Quốc gia, thậm chí, đối với chỉ

tiêu saccharin, phƣơng pháp chúng tôi đang nghiên cứu còn tỏ ra nhạy hơn khi xác

định đƣợc nồng độ saccharin trong mẫu nƣớc ngọt nhƣng Viện Kiểm nghiệm Quốc

gia thì không phát hiện.

.


CHƢƠNG IV

KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI

Nhƣ vây, qua qua trinh phân tich thực nghiệm , nghiên cƣu đã thu đƣợc các

kết quả phù hợp với mục tiêu đề ra:

1. Đã khảo sát, xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích đồng thời saccharin,

aspartam, acid sorbic và acid benzoic phù hợp: Cân khoảng 2 ÷ 5 gam mẫu đối với

mẫu rắn và 5 ÷ 10ml đối với mẫu lỏng vào ống ly tâm; thêm 5 ml MeOH, votex kỹ

rồi thêm 30 ml nƣớc cất, rung siêu âm 30 phút, cho sang bình định mức 100 ml,

thêm 2 ml dung dịch K4[Fe(CN)6] và 2 ml ZnSO4, lọc qua giấy lọc sau khi định

mức, rồi lọc dịch thu đƣợc qua màng lọc whatman 0,45 µm và định lƣợng bằng

phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện:

- Nhiệt độ buồng cột: 30oC - Thể tích bơm: 20µl

- Cột C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm) - Nồng độ chuẩn bơm: 1ppm

- Detector: DAD 210 nm, 26 nm, 254 nm - Tỷ lệ dung môi pha động

tuân theo gradient:

Thời gian

(phút)

% KH2PO4 0,02M

(pH = 4,3)

Tốc độ dòng

(ml/phút)

0 95 1,0

1 95 1,0

3 80 1,0

6 55 0,8

7,5 55 0,6

9 55 0,8

9,5 95 1,0

10 95 1,0

2. Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp nghiên cứu trên 7 đôi

tƣơng mâu la xúc xíc, bánh ngọt, thạch bách vị, dƣa chuột muối, ô mai, kẹo và nƣớc

ngọt tại phòng thí nghiệm cho kết quả tốt. Các kết quả thẩm định cụ thể thể hiện ở

bảng 4.1 nhƣ sau:


Bảng 4.1. Bảng tổng kêt kêt quả thẩm định

Sac Asp BA SA

Khoảng tuyến

tính (mg/l)

0,0216–82,88 0,58- 92,824 0,0843-80,864 0,0162-84,984

PT đƣờng chuẩn y = 174,07x +

1,4182

y = 42,936x

- 1,0979

y = 94,011x +

0,9942

y = 178,25x -

3,5319

Hệ số tƣơng quan R² = 0,9999 R² = 0,9999 R² = 1 R² = 1

LOD (mg/l) 0,0216 0,580 0,0843 0,0162

LOQ (mg/l) 0,0713 1,91 0,278 0,0535

MDL (g/100g) 0,0623-0,138 0,571-1,99 0,315-0,372 0,0756-0,687

MQL (g/100g) 0,205-0,454 1,89-6,56 1,04-1,23 0,249-2,27

RSD% 0,389-5,61 0,661-3,98 0,340-3,27 0,615-5,23

Độ thu hồi (%) 92,1 – 104,2 94,2 – 101,3 94,2 – 101,3 91,4 – 99,8

Bảng 4.1. cho thấy phƣơng pháp nghiên cứu có giá trị sử dụng, đáp ứng đủ các yêu

cầu của AOAC.

Kiên nghi:

Để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn, chúng tôi kiến nghị tiếp tục nghiên cứu thực

hiện một số vấn đề sau:

Với những kết quả bƣớc đầu này, chúng tôi mong muốn sẽ tiếp tục phát triển

nghiên cứu để có thể đƣa ra một quy trình và điều kiện chạy máy tối ƣu để phân tích

các chất bảo quản là acid benzoic, acid sorbic, các chất tạo ngọt là saccharin,

aspartam, acesulfame–K, cyclamate và một số chất tạo màu thực phẩm.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tài liệu tiếng Việt

1. Hồ Phú Hà (2012), Bài giảng Cơ sở các phương pháp bảo quản thực phẩm.

Viên Công nghê sinh hoc & Thƣc phâm – trƣơng Đai Hoc Bach Khoa Ha Nôi.

2. Nguyễn Đức Hoàng (2012), Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng

RhodaminB bằng phương pháp HPLC và ứng dụng phân tích hóa chất này

trong một số loại thực phẩm trên địa bàn thành phố Hải Dương. Luận văn thạc

sĩ – Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội

3. Nguyễn Thị Thanh Hƣơng (2012), Thực trạng và giải pháp nâng cao năng lực

quản lý việc sử dụng một số phụ gia trong chê biên thực phẩm tại Quảng Bình.

Luận án tiến sĩ – Viện Dinh Dƣỡng Quốc Gia

4. Khoa An toàn Vệ sinh Thực phẩm - Viện Dinh Dƣỡng Quốc gia, Phương pháp

xác định hàm lượng acid benzoic và acid sorbic trong thực phẩm.

5. Phạm Luận (1987), Cơ sở ly thuyêt sắc ky lỏng hiệu năng cao , Khoa Hoa học -

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

6. Trần Phúc Nghĩa (2011), Ứng dụng kỹ thuật sắc ký điện di mao quản phân tích

Acesulfame-K, Saccharin, Aspartam trong đồ uống. Luận văn thạc sỹ – Khoa

Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

7. QCVN 4-8: 2010/BYT, Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia thực phẩm – chất ngọt

tổng hợp.

8. QCVN 4-12:2010/BYT, Qui chuẩn kỹ thuật quốc gia thực phẩm – chất bảo quản.

9. Trân Cao Sơn (2010), Thâm đinh phương phap trong phân tich hoa hoc và vi

sinh vât, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật .

10. Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đê các phương pháp tách chiêt , Khoa hoa -

Trƣờng ĐH KHTN Hà Nội.

11. Nguyễn Duy Thịnh (2008), Bài giảng Các chất phụ gia dùng trong sản xuất thực

phẩm, Viên Công nghê sinh hoc & Thƣc phâm – trƣơng Đai Hoc Bach Khoa Ha Nôi.


12. Thông tƣ 27/2012/TT-BYT, Hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm.

13. Bùi Thị Minh Thúy (2014), “Xác định một số đƣờng hóa học và chất bảo quản trong

thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng, hiệu năng cao (HPLC)“. Luận văn thạc sỹ

khoa học –Khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

14. TCVN 4714:1989, Đồ hộp rau quả: Phương pháp xác định hàm lượng acid

benzoic.

15. TCVN 6428:2007, Rau, quả và sản phẩm rau quả - Xác định hàm lượng acid

benzoic – Phương pháp quang phổ.

16. TCVN 7807:2007, Rau, quả và sản phẩm rau quả - Xác định hàm lượng

acid sorbic.

17. TCVN 8122:2009, Sản phẩm rau, quả - Xác định hàm lượng acid benzoic và

acid sorbic – Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

18. TCVN 8471:2010, Thực phẩm – Xác định hàm lƣợng acesulfame-K, aspartam

và saccharin

19. Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, Phương pháp xác

định hàm lượng acid benzoic và acid sorbic trong thực phẩm.

B. Tài liệu tiếng tiếng Anh:

20. AOAC 967.15, Benzoic acid in food – Thin_layer chromatographic method,

Officical Methods of Analysis of AOAC International 18th

Edition, 2005.

21. AOAC 963.19, Benzoic acid in food – Titrimetric method, Officical Methods

of Analysis of AOAC International 18th

Edition, 2005.

22. Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus

(2011), “Simultaneous determination of aspartam, cyclamate, saccharin and

acesulfame – K in soft drinks and tabletop sweetener formulations by capillary

electrophoresis with capacitively coupled contractless conductivity detection”,

Food Chemistry 124, page 1714-1717.

23. Qing-Chuan Chen, Jing Wang (2001), “Simultaneous determination of

artificial sweeteners, preservatives, caffeine, theobromine and theophylline in


food and pharmaceutical preparations by ion chromatography”, Journal of

Chromatography A, Volume 937, Issues 1–2, 7, Pages 57–64

24. N. Dossi, et al (2006), “Simultaneous RP-hplc determination of additives in

soft drink”, Chromatographia, 63, pp 557 – 562.

25. Richard A. Frazier, Elizabeth L. Inns, Nicolo Dossi, Jennifer M. Harry E.

Nursten (2000), “Development of a capillary electrophoresis method for the

simultaneous analysis of artificial sweeteners, preservatives and colours in soft

drinks”, Journal of Chromatography A, 876, page 213 – 220.

26. Natalia E. Llamas & Maria S. Di Nezio & Miriam E. Palomeque & Beatriz S.

Fernández Band (2008), “Direct Determination of Sacchrin and Acesulfame –

K in Sweeteners and Fruit Juices Powders”, Food Anal. Methods, 1:43-48.

27. Ion Trandafir, Violeta Nour, Mira Elena Ionică (2009), “Development and

validation of an HPLC method for simultaneous quantification of acesulfame-

K, saccharin, aspartam, caffeine and benzoic acid in cola soft drinks”,

Scientific study & research, Vol. X (2), ISSN 1582-540X, page 185 – 194.

28. Fatma Turak, Mahmure Üstün Özgür, and Abdürrezzak Bozdogan (2009),

“PLS-UV Spectrophotometric Method for the Simultaneous Determination of

Ternary Mixture of Sweeteners (Aspartam, Acesulfame – K and Saccharin) in

Commercial Products”, Innovations in Chemical Biology, page 305 – 311.

29. http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharin

30. http://en.wikipedia.org/wiki/Aspartam

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00219673

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00219673

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00219673/937/1

http://en.wikipedia.org/wiki/Saccharin

http://en.wikipedia.org/wiki/Aspartame


PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Độ lặp lại chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) [9]

TT Hàm lƣợng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)

1. 100 1 100% 1,3

2. 10 10-1

10% 1,8

3. 1 10-2

1% 2,7

4. 0,1 10-3

0,1 % 3,7

5. 0,01 10-4

100 ppm 5,3

6. 0,001 10-5

10 ppm 7,3

7. 0,0001 10-6

1 ppm 11

8. 0,00001 10-7

100 ppb 15

9. 0,000001 10-8

10 ppb 21

10. 0,0000001 10-9

1 ppb 30

Phụ lục 2.. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC [9]

TT Hàm lƣợng

[%] Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi [%]

1. 100 1 100% 98-102

2. 10 10-1

10% 98-102

3. 1 10-2

1% 97-103

4. 0,1 10-3

0,1 % 95-105

5. 0,01 10-4

100 ppm 90-107

6. 0,001 10-5

10 ppm 80-110

7. 0,0001 10-6

1 ppm 80-110

8. 0,00001 10-7

100 ppb 80-110

9. 0,000001 10-8

10 ppb 60-115

10. 0,0000001 10-9

1 ppb 40-120


Phụ lục 3: Bảng giới hạn tối đa hàm lƣợng acid benzoic trong thực phẩm [12]

NHÓM BENZOAT

INS Tên phụ gia

210 Acid benzoic

211 Natri benzoat

212 Kali benzoat

213 Calci benzoat

Mã nhóm

thực

phẩm

Nhóm thực phẩm ML

(mg/kg) Ghi chú

01.7 Đồ tráng miệng từ sữa (VD: bánh

putđinh, sữa chua quả hoặc có hƣơng

liệu...)

300 13

01.2.1 Sữa lên men (nguyên chất) 300 13&CS243

04.1.2.2 Quả khô 800 13

04.1.2.3 Quả ngâm dấm, dầu, hoặc nƣớc muối 1000 13

04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 1000 13

04.1.2.7 Quả ngâm đƣờng 1000 13

04.1.2.9 Đồ tráng miệng chế biến từ quả, bao

gồm thức ăn tráng miệng từ nƣớc

hƣơng liệu quả

1000 13

05.1.5 Các sản phẩm tƣơng tự sô cô la, sản

phẩm thay thế sô cô la

1500 13

05.2 Sản phẩm kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo

nuga…, khác với các sản phẩm thực

phẩm thuộc mã nhóm thực phẩm

050.1, 05.3 và 05.4

1500 13

05.3 Kẹo cao su 1500 13

07.0 Các loại bánh nƣớng 1000 13

08.3.1.2 Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú

xay nhỏ đã qua chế biến đƣợc xử lý

(VD nhƣ ƣớp muối) và làm khô không

xử lý nhiệt

1000 3&13


10.4 Đồ ăn tráng miệng từ trứng (VD: món

sữa trứng)

1000 13

11.4 Đƣờng và siro khác (VD: xyloza, siro

từ cây thích, đƣờng dùng phủ bánh)

1000 13

11.6 Chất tạo ngọt, bao gồm cả chất tạo

ngọt có độ ngọt cao

2000 13

Phụ lục 4: Bảng giới hạn tối đa hàm lƣợng acid sorbic trong thực phẩm [12]

NHÓM SORBAT

INS Tên phụ gia

200 Acid sorbic

201 Natri sorbat

202 Kali sorbat

203 Calci sorbat

Mã nhóm

thực phẩm Nhóm thực phẩm

ML

(mg/kg) Ghi chú

01.1.2 Đồ uống từ sữa, có hƣơng liệu và/hoặc lên

men (VD: sữa sô cô la, sữa cacao, bia

trứng, sữa chua uống, đồ uống từ whey…)

1000 42&220


04.1.2.2 Quả khô 500 305, 42, 347,

CS130


04.1.2.3 Quả ngâm dấm, dầu, hoặc nƣớc muối 1000 42&CS260

04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 1000 42

04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 1000 CS296

04.1.2.6 Các sản phẩm từ quả dạng nghiền (VD:

tƣơng ớt) ngoại trừ các sản phẩm của mã

thực phẩm 04.1.2.5

1000 42

04.1.2.7 Quả ngâm đƣờng 500 42

04.1.2.8 Sản phẩm chế biến từ quả, bao gồm: thịt

quả nghiền, nghiền nhuyễn, lớp tráng bề

mặt từ quả và sữa dừa

1000 42


04.1.2.9 Đồ tráng miệng chế biến từ quả, bao gồm

thức ăn tráng miệng từ nƣớc hƣơng liệu

quả

1000 42

04.1.2.10 Sản phẩm quả lên men 1000 42

04.1.2.11 Nhân từ quả trong bánh ngọt 1000 42

04.1.2.12 Sản phẩm quả nấu chín 1200 42

04.2.2.3 Rau, củ (bao gồm nấm, rễ, thực vật thân củ

và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) tảo biển ngâm

trong dấm, dầu, nƣớc muối hoặc nƣớc

tƣơng

1000 42

04.2.2.5 Rau, củ (bao gồm nấm, rễ, thực vật thân củ

và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội), tảo biển, quả

hạch và hạt, hạt nghiền và dạng phết nhuyễn

(VD: bơ lạc)

1000 42

05.2 Sản phẩm kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo

nuga…, khác với các sản phẩm thực phẩm

thuộc mã nhóm thực phẩm 050.1, 05.3

1500 42

07.0 Các loại bánh nƣớng 1000 42

09.2.5 Cá, sản phẩm thủy sản hun khói, sấy khô,

lên men hoặc ƣớp muối, kể cả nhuyễn thể,

giáp xác, da gai

200 305, 347,

349&CS167

09.3 Thủy sản, sản phẩm thủy sản sơ chế, kể cả

nhuyễn thể, giáp xác, da gai

1000 42

10.2.1 Sản phẩm trứng dạng lỏng 5000 42

10.2.3 Sản phẩm trứng sấy khô và/hoặc đông tụ

nhiệt

1000 42

10.4 Đồ ăn tráng miệng từ trứng (VD: món sữa

trứng)

1000 42

11.4 Đƣờng và siro khác (VD: xyloza, siro từ

cây thích, đƣờng dùng phủ bánh)

1000 42

11.6 Chất tạo ngọt, bao gồm cả chất tạo ngọt có

độ ngọt cao

1000 42&192

14.1.2.1 Nƣớc quả ép 1000 42,91&122


Phụ lục 5: Bảng giới hạn tối đa hàm lƣợng aspartam trong thực phẩm [12]

ASPARTAM

INS Tên phụ gia

951 Aspartam

Mã nhóm


ML

(mg/kg) Ghi chú


men (VD: sữa sô cô la, sữa cacao, bia trứng,

sữa chua uống, đồ uống từ whey…)

600 161&191

01.2.1 Sữa lên men (nguyên chất) 1000 161&191

03.0 Kem lạnh thực phẩm, bao gồm nƣớc hoa quả

ƣớp lạnh và kem trái cây

1000 161&191

04.1.2.1 Quả đông lạnh 2000 161&191

04.1.2.2 Quả khô 2000 161&191

04.1.2.4 Quả đóng hộp hoặc đóng chai (đã thanh

trùng)

1000 161&191

04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 1000 161&191

04.1.2.7 Quả ngâm đƣờng 2000 161&191

04.1.2.8 Sản phẩm chế biến từ quả, bao gồm: thịt quả

nghiền, nghiền nhuyễn, lớp tráng bề mặt từ

quả và sữa dừa

1000 161&191


thức ăn tráng miệng từ nƣớc hƣơng liệu quả

1000 161&191

04.2.2.4 Rau đóng hộp, đóng chai (đã thanh trùng)

hoặc đóng túi (bao gồm nấm, rễ, thực vật

thân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) và tảo

biển

1000 161&191

05.2.1 Kẹo cứng 3000 161&148

05.2.2 Kẹo mềm 3000 161&148

07.2 Bánh nƣớng nhỏ (ngọt, mặn, hƣơng vị mặn) 1700 165&191

09.2 Cá và sản phẩm thủy sản đã qua chế biến, kể 300 144&191


cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai

09.4 Cá, sản phẩm thủy sản lên men hoặc đóng

hộp, kể cả nhuyễn thể, giáp xác, da gai đóng

hộp đƣợc bảo quản hoàn toàn

300 144&191

10.4 Đồ ăn tráng miệng từ trứng (VD: món sữa

trứng)

1000 161&191

11.4 Đƣờng và siro khác (VD: xyloza, siro từ cây

thích, đƣờng dùng phủ bánh)

3000 159&191


độ ngọt cao

GMP 191

Phụ lục 6: Bảng giới hạn tối đa hàm lƣợng saccharin trong thực phẩm [12]

NHÓM SACCHARIN

INS Tên phụ gia

954(i) Saccharin

954(ii) Calci saccharin

954(iii) Kali saccharin

954(iv) Natri saccharin

Mã nhóm


ML

(mg/kg) Ghi chú


men (VD: sữa sô cô la, sữa cacao, bia trứng,

sữa chua uống, đồ uống từ whey…)

80 161


43

01.6.5 Các sản phẩm tƣơng tự pho mát 100 161

01.7 Đồ tráng miệng từ sữa (VD: bánh putđinh,

sữa chua quả hoặc có hƣơng liệu...)

100 161


04.1.2.3 Quả ngâm dấm, dầu, hoặc nƣớc muối 160 CS260


04.1.2.4 Quả đóng hộp hoặc đóng chai (đã thanh

trùng)

200 161

04.1.2.5 Mứt, thạch, mứt quả 200 161


thức ăn tráng miệng từ nƣớc hƣơng liệu quả

100 161

04.1.2.10 Sản phẩm quả lên men 160 161

04.2.2.4 Rau đóng hộp, đóng chai (đã thanh trùng)

hoặc đóng túi (bao gồm nấm, rễ, thực vật

thân củ và thân rễ, đậu, đỗ, lô hội) và tảo

biển

160 144&161

07.2 Bánh nƣớng nhỏ (ngọt, mặn, hƣơng vị mặn) 170 165

08.2.2 Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú

nguyên miếng hoặc cắt nhỏ đã xử lý nhiệt

500 161

08.3.2 Sản phẩm thịt, thịt gia cầm và thịt thú xay

nhỏ đã qua xử lý nhiệt

500 161


độ ngọt cao

GMP

12.2.2 Đồ gia vị 1500 161

12.3 Dấm 300

12.4 Mù tạt 320

14.1.4.1 Đồ uống hƣơng liệu có ga 300 161

14.1.4.3 Đồ uống hƣơng liệu cô đặc (dạng rắn hoặc

lỏng)

300 127&161

14.1.5 Cà phê, sản phẩm tƣơng tự cà phê, chè, đồ

uống thảo dƣợc và các loại đồ uống từ ngũ

cốc, trừ đồ uống từ cacao

200 160

15.0 Thực phẩm mặn ăn liền 100


Phụ lục 7. Lựa chọn pha động

7.1. Lựa chọn thành phần pha động

Thành phần pha động: 95% KH2PO4 – 5% CAN


Thành phần pha động: 90% KH2PO4 – 10% ACN




Thành phần pha động: 90% KH2PO4 – 10% MeOH




7.2. Khảo sát pH pha động (Chuẩn hỗn hợp 4 chất 5ppm)

Tại pH = 3


Tại pH = 4,3

Tại pH = 5

Phụ lục 8: Sắc đồ khảo sát các điều kiện tối ƣu xử lý mẫu

8.1. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian rung siêu âm (sử dụng mẫu thạch bách vị)


Mẫu đƣợc votex với nƣớc

Mẫu đƣợc votex và rung siêu âm 15 phút với nƣớc


8.2. Khảo sát lƣợng MeOH thêm vào (sử dụng mẫu thạch bách vị)

Mẫu đƣợc chiết bằng 2 ml MeOH




Phụ lục 9: Xác định giá trị sử dụng của phƣơng pháp

9.1. Đƣờng chuẩn

Nồng

độ Sac

(ppm)

Diện tích

pic Sac

(mAU)

Nồng

độ Asp

(ppm)

Diện tích

pic Asp

(mAU)

Nồng

độ BA

(ppm)

Diện tích

pic BA

(mAU)

Nồng

độ SA

(ppm)

Diện tích pic SA

(mAU)

0,0216 3,673 0,58 22,658 0,0843 6, 478 0,0166 2,578

0,259 46,6289 1,16 48,725 0,253 23,386 0,0222 3,614

0,518 90,641 5,802 244,39 0,505 48,186

44,18

1,036 186,252 11,603 504,736 1,011 98,14 0,531 92,853

5,18 887,27 23,206 992,39 5,054 472,305 1,062 190,526

10,36 1824,54 10,108 961,161 5,312 921,509

20,72 3601,97 20,216 1897,45 10,623 1896,98

21,246 3785,13


Bảng. Tƣơng quan nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích

9.2. Phân tích mẫu thực

Sắc đồ phân tích mẫu xúc xích

Sắc đồ phân tích mẫu dƣa chuột muối


Sắc đồ phân tích mẫu bánh đậu

Sắc đồ phân tích mẫu kẹo


Sắc đồ phân tích mẫu ô mai táo

Sắc đồ phân tích mẫu thạch bách vị

phân tích acid benzoicsorbic, muối của chúng và vài chỉ tiêu đường hóa học trong...

Documents