phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp hplc

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------

Nguyễn Thị Như Hoa

PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Thị Như Hoa

Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp HPLC

Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Văn Ri

Hà Nội – Năm 2012

MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN................................................................................................10

1.1 Giới thiệu về kháng sinh β -lactam ..........................................................................10 1.1.1 Lịch sử ra đời ..........................................................................................................10 1.1.2 Phân loại .................................................................................................................10 1.1.3 Đánh giá tác dụng ...................................................................................................10 1.2 Kháng sinh β-lactam..................................................................................................11 1.2.1 Định nghĩa...............................................................................................................11 1.2.2 Cấu trúc và phân loại .............................................................................................11 1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học .....................................................................................15 1.2.4. Tác dụng ................................................................................................................15 1.2.5. Điều chế ................................................................................................................16 1.2.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay.................17 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam.....................................................19 1.3.1. Phương pháp quang học.........................................................................................19 1.3.2. Phương pháp điện hóa ...........................................................................................20 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE).........................20 1.3.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)........................................................................................22 1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC) ......................................................................22

CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................25 2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ...........................................................25 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu.........................................................................25 2.1.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................25 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất........................................................................................26 2.2.1. Thiết bị ...................................................................................................................26 2.2.2. Dụng cụ..................................................................................................................26 2.2.3. Hóa chất .................................................................................................................26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................28 3.1. Khảo sát điều kiện xác định β – lactam bằng LC/MS/MS........................................28 3.1.1. Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ ...............................................28 3.1.2. Chọn pha tĩnh ........................................................................................................30 3.1.3. Chọn pha động .......................................................................................................30 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ..............................................................................32 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính ...................................................................................32 3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ..........................................37 3.3. Phân tích mẫu thực tế................................................................................................38 3.3.1. Phân tích mẫu nước tiểu ........................................................................................38 3.3.2. Phân tích mẫu dược phẩm......................................................................................49

3.4. Hướng phát triển của đề tài...........................................................................................58 KẾT LUẬN..........................................................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................60

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI Bảng 3.2 Kết quả khảo sát bắn phá các ion mẹ Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá và các ion con của beta-lactam Bảng 3.4 Chương trình chạy gradien tối ưu rửa giải các chất beta-lactam Bảng 3.5 Thời gian lưu tr của các kháng sinh nhóm beta-lactam Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ các beta-lactam Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các beta-lactam Bảng 3.8 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 1

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2 Bảng 3.10 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu

thêm chuẩn ở nồng độ 5 ppb

Bảng 3.11 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu


Bảng 3.12 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu


Bảng 3.13 Kết quả thực hiện trên mẫu nước tiểu thực Bảng 3.14 Thông tin mẫu thuốc phân tích Bảng 3.15 Bảng tính khối lượng trung bình viên của các mẫu thuốc Bảng 3.16 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thuốc Bảng 3.17 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn

ở nồng độ 5ppb Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn

ở nồng độ 100ppb Bảng 3.19 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn

ở nồng độ 200ppb Bảng 3.20 Kết quả phân tích mẫu thuốc thực

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp beta-lactam 100ppb

Hình 3.2 Đường chuẩn AMP

Hình 3.3 Đường chuẩn PEN G

Hình 3.4 Đường chuẩn PEN V

Hình 3.5 Đường chuẩn OXA

Hình 3.6 Đường chuẩn CLOX

Hình 3.7 Đường chuẩn CEP

Hình 3.8 Đường chuẩn CEF

Hình 3.9 Đường chuẩn AMO

Hình 3.10 Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 6h

Hình 3.11 Sắc đồ phân tích mẫu thuốc

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrile AMO Amoxicillin AMP Ampicillin APCI Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển CAD Áp suất khí mang trong tứ cực Q2 CE Thế áp vào tứ cực Q1

CEF Cefaclor CEP Cephalexin

CLOX Cloxacillin CUR Khí mang CXP Thế áp vào giữa tứ cực Q2 và Q3 DP Thế đầu vào áp vào màn chắn EP Thế áp vào nguồn ion mẹ ESI Ion hóa phun điện tử

GC – MS: Sắc kí khí khối phổ GS1 Áp suất khí hai bên đầu phun GS2 Áp suất của luồng khí nóng

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao IS Thế ion hóa

LC-MS Sắc kí lỏng khối phổ LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng

MeOH Methanol OXA Oxacillin

PEN G Penicillin G PEN V Penicillin V

R% Độ thu hồi RSD% Độ lệch chuẩn tương đối

SPE Chiết pha rắn TLC Sắc kí bản mỏng

tr Thời gian lưu

MỞ ĐẦU

Các kháng sinh là một trong những nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện

đại. Nhờ thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy

hiểm như dịch hạch, tả, cúm,..và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các

loại virus, vi khuẩn. Đối với các nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ một vị trí rất

quan trọng vì ở các nước này do điều kiện vệ sinh kém và mức sống còn thấp nên

thường xảy ra các dịch bệnh. Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000

kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện. Kể

từ khi penicillin được ALEXANDER FLEMING phát hiện năm 1929 và được

chứng minh có tác dụng chữa bệnh năm 1941 thì trong hơn nửa thế kỷ qua kháng

sinh đã trở thành dược phẩm không thể thiếu được trong việc điều trị các loại bệnh

do virus, vi khuẩn gây ra và nó có tác dụng hơn hẳn so với các thuốc kháng khuẩn

khác [1, 13].

β -Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người,

thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 và là loại kháng

sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không

đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn.

Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do virus không chữa

được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn

đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh

trong máu gây các bệnh về thận, đặc biệt là người cao tuổi. Vì vậy, kiểm soát và

phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao

hiệu quả sử dụng chúng.

Hai phương pháp thường dùng để phân tích các β -lactam là sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC) và phương pháp điện di mao quản (CE). Phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân

tích ngắn. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector hiện đại như huỳnh quang, MS

trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu

điểm nổi bật của nó về độ nhạy và độ chọn lọc ngày càng được áp dụng nhiều trong

các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Xuất phát từ những lý do đó nên tôi

đã chọn nghiên cứu đề tài: : "Phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh

học bằng phương pháp HPLC” sử dụng detector MS/MS.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh β -lactam [1, 2, 11]

1.1.1 Lịch sử ra đời

Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm

Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau đó là

hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác

dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác.

Giới y học định nghĩa : Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá sinh học,

có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được

sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh tự nhiên.

1.1.2 Phân loại

Kháng sinh phân lọai dựa vào cấu tạo hoá học gồm các nhóm sau:

- Kháng sinh β-lactam

- Kháng sinh Aminoglycosid

- Kháng sinh Tetracylin

- Cloramphenicol và dẫn xuất

- Kháng sinh Macrolid

- Kháng sinh Lincosamid

- Kháng sinh polypeptide

- Các kháng sinh khác: Rifamycin

1.1.3 Đánh giá tác dụng

- Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh thiên

nhiên, không nguyên chất.

- Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm

kháng sinh bán tổng hợp.

1.2 Kháng sinh β-lactam

1.2.1 Định nghĩa

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin,

cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn

nhất là penicillin và cephalosporin.

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và

Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm

Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic

(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.

1.2.2 Cấu trúc và phân loại

* Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng

thiazolidin, vòng β-Lactam

N

SCH3

CH3

NH

O

COR

COOM

2

3

4

1

56

7

Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R

3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,

5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau.

Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau.

Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin

Tên kháng sinh R Hoạt tính

Nhó

m p

enic

illin

tự n

hiên

PenicillinG

(PENG)

Benzathin

CH2-

Benzyl

Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn

chất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+).

Không kháng β-lactamase

Oxacillin

(OXA) N

C-

O

CH3

6-[(5-methyl-3-

phenyl-1,2-oxazole-4-

carbonyl)amino]

Nhó

m p

enic

illin

khá

ng p

enic

illiia

se

Cloxacillin

(CLO)

Cl NO

C-

CH3

6-{[3-(2-

chlorophenyl )-5-methyl-

oxazole-4-carbonyl]amino}

Là các Penicillin bán tổng hợp. Phổ

hẹp như nhóm I. Kháng penicilliiase,

không tác động vào vòng β –

Lactam được.

Ampicillin

(AMP)

CH-

NH2

6-([(2R)-2-amino-

2-phenylacetyl]amino)

Nhó

m p

enic

illin

phổ

rộn

g

Amoxicillin

(AMO) CH-

NH2

HO 6-{[(2R)-2-amino

2-(4-hydroxyphenyl)-

acetyl]amino}

Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram

(+) và (-). Không kháng β-lactamase

và penicilliiase

* Các cephalosporin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với

1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R

NH

O

C OR1

N

S

R3

R2

COOM

12

34

5

67

8

Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-

thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các

cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên

gram âm yếu hơn thế hệ sau.

Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin

Kháng sinh R1 R2 R3

Cephalexin

(CEP) CH-

NH2

H -CH3

Cephapirin SCH2-

H -CH2-OCOCH3

I: Tác dụng

mạnh nhất

trên vi khuẩn

gram (+), yếu

nhất trên

gram (-).

Không bền và

dễ bị β-

lactamase phá

hủy

CephazolinN

N NN CH2-

H N N

CH3S-CH2

Cefaclor

(CEF) CH-

NH2

H Cl II: tác dụng

yếu hơn trên

vi khuẩn

gram (+),

mạnh hơn trên

gram (-) so

với thế hệ I.

Bền với β-

lactamase.

Cefprozil CH-

NH2

OH

H -CH=CH-CH3

Cefixim S

N

N

NH2

HOOCCH2O

H -CH=CH2

III: tác dụng

yếu hơn trên

vi khuẩn

gram (+) so

với thế hệ I,

tác dụng

mạnh trên

gram (-). Bền

với β-

lactamase

Ceftazidim S

N

N

NH2

HOOCC(CH3)2O

H N+

-CH2

IV: hoạt phổ

tác dụng như

thế hệ III

nhưng tốt hơn

và kháng

nhiều β-

lactamase hơn

Cefepim S

N

N

NH2

CH3O

H N+

CH3

-H2C

1.2.3 Tính chất vật lí và hóa học [1]

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong

nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu

cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng

thời nhóm –COOH và –NH2.

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ

thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp

thụ).

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc

phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.

Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1

AMP 2,70 PEN G 2,74

AMO 2,80 CLO 2,70

CEP 2,60 OXA 2,72

CEF 2,75

1.2.4. Tác dụng[2, 12]

Cơ chế:

Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá

trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị

ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa

enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi

khuẩn bị tiêu diệt.

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu

kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ

rộng.

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam,

theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các

cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi

là kháng methicillin).

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị

ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc

phản vệ..

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ

định dị ứng với thành phần của thuốc.

Đánh giá tác dụng kháng sinh:

Theo đơn vị tác dụng: 1 IU là tác dụng của 0,6μ g penicillin G natri tinh

khiết trên một chủng mẫu tụ cầu. Hoạt lục của 1mg chất này là 1667 IU.

1 IU sẽ ứng với 0.672 μ g penicillin G kali tinh khiết, với 1mg chất này ứng

với 1585 IU.

1.2.5. Điều chế [ 1]

Sinh tổng hợp:

Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc

Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp. Chiết xuất dạng

kết tinh và muối natri hoặc kali. Để cho độ thu hồi cao thường gây đột biến bằng

mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời

thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình

sinh tổng hợp. Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào là acid

phenylacetic. Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình

nên men. Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid →

polypeptide. Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men.

Bán tổng hợp:

Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic

(A6AP).

Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, Khi đó môi trường dồi dào

A6AP, chiết lấy trực tiếp.

Tách phần phenylacetyl ( C6H5-CH2-CO-) khỏi phân tử penicillin G bằng

acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP. Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi

trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thụ HCl giải phóng ra trong phản ứng

được penicillin khác.

Tổng hợp hoá học:

Chưa được ứng dụng rộng rãi.

1.2.6. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Như đã trình bày ở trên ta thấy có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng

các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng

với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi

(virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng

sinh thích hợp. Việc lạm dụng thuốc kháng sinh hiện nay xảy ra phổ biến do cả

bệnh nhân và thầy thuốc cùng tham gia thực hiện để gây nên hiện tượng kháng

thuốc sớm. Điều này đã mang lại những hậu quả xấu, làm cho việc đáp ứng điều trị

kém hiệu quả, người bệnh không được chữa khỏi hoặc để bệnh kéo dài, ảnh hưởng

đến sức khỏe kể cả tính mạng của bệnh nhân. Bệnh nhân, người nhà bệnh nhân và

nhiều người khác trong cộng đồng người dân thường quan niệm rằng thuốc kháng

sinh có thể chữa được mọi thứ bệnh tật. Mỗi khi bị cảm cúm, đau đầu, sổ mũi ,sốt,

ho, viêm họng thông thường…đều đã dùng kháng sinh ngay để chữa trị. Mặc dù

kháng sinh đã được Bộ Y tế quy định là loại thuốc cần phải có đơn kê của thầy

thuốc, không ở trong các nhóm thuốc được bán không cần kê đơn (OTC) nhưng trên

thực tế hiện nay việc mua bán kháng sinh rất dễ dàng.[14]

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu

người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết. Theo R. Gonzales

[4,31], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong

khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không

điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở

nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin.

Theo báo cáo của A.W. McCormick [16] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng

penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus

sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ

thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao. Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một

địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến

khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [21] mỗi năm ở Hoa kỳ có

2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi

trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5

đến 10 tỉ đô-la.

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [7], năm 1997

tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh

nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).

Theo [7] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch

Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít

trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử

vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết

tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi

Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%

tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng

hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng

huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi

khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của

Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng

kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các

nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý”

(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm

chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát

triển.

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm

Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả

các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng

cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và

chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu.

Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các

thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo,

không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất.

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ

bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế

được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.

1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam

1.3.1. Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang

học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương

pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-

lactam, đặc biệt trong dược phẩm.

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng

tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều

trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy

khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các

β-lactam.

A. Fernández-González và cộng sự [15] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với

AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu

được 4.10-7M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho

hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống,

huyết thanh…

Theo [23], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống

bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của

kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra

phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và

giới hạn phát hiện của AMO là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l

Wei Liu và cộng sự [33], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ

luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích

một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao:

PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết

quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP

trong mẫu là 0.1 mg/l.

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các

phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và

trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc

xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy

phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.

1.3.2. Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng

không phổ biến nhiều. Theo [19], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện

thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm

axetat 0.1M pH=5.2

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu

quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng

dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác

nhau.

L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [27] sử dụng phương pháp điện di

mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện

di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di

10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng

sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích

trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27

mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến

4.15%. Độ thu hồi trên 96%.

Biyang Deng và cộng sự [18] đã sử dụng phương pháp điện di với detector

điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp

0.31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ

lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.

Attila Gaspar và cộng sự [17] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh

họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone

electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8.

Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện

14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,

cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim,

ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới

hạn phát hiện tương ứng 1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục

đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ

Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C). Kết quả cho

thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi

pha loãng.

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [29] sử dụng phương pháp CZE và detector UV

– DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ

thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP,

AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông,

nước thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l

cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.

1.3.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)

Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm

tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng

một lúc song song rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy

đo quang có thể phân tích định tính và định lượng. Tuy nhiên phương pháp này chỉ

dùng để định tính.

1.3.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng

quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất

thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các

chất.

Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh β -lactam bằng phương pháp HPLC

Theo [34], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích

penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện

chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –

(C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong

sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg.

J.M. Cha và cộng sự [26] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-

lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1

mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C =

Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút

A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột

450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin

có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l

với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý.

Tác giả Titus A.M. Msagati và cộng sự [32] đã sử dụng sắc ký lỏng khối phổ

(LC-MS/MS) xác định hàm lượng các Penicillin trong mô gan, thận và sữa. Các

giới hạn phát hiện (LOD) thu được được là 1 ng/kg đối với penicillin G, penicillin

V trong mô gan, thận và 0,7 µg/L trong sữa. Đối với ampicillin, giới hạn phát hiện

(LOD) là 1,4 µg/kg trong mô gan, thận và 1,7 µg/L trong sữa.

Theo [35], David N.Heller và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký

lỏng khối phổ (LC/MS/MS) để nghiên cứu phương pháp xác định nồng độ các

penicillin trong huyết tương bò, thận và nước tiểu. Phát hiện dựa trên sắc ký lỏng

hai lần khối phổ (LC/MS/MS). Phenethecillin được sử dụng làm chất nội chuẩn.

Mẫu huyết tương được chiết với Acetonitril là phương pháp có giới hạn định lượng

12 ng/ml. Mẫu thận được đồng nhất trong nước và Acetonitril sau đó được làm sạch

trên cột chiết pha rắn C18. Giới hạn định lượng của phương pháp này là 10 ng/ml.

Nước tiểu được pha loãng, lọc và phân tích trực tiếp. Giới hạn định lượng của

phương pháp phân tích này là 63 ng/ml. Độ chính xác cho mẫu huyết tương là

103% với hệ số biến thiên là 3 %, với mẫu thận là 96% và 11% tương ứng, mẫu

nước tiểu là 98 % và 4 % tương ứng. Những phương pháp này được áp dụng để

phân tích mẫu huyết tương , nước tiểu, thận, mẫu sinh tiết được lấy từ động vật đã

được định lượng với penicillin.

Trong [25, 24], Boison J.O. và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2

(250mm*4,6mm, 5μm)’; pha động : ACN –Na2S2O3 15,7mM trong đệm photphat

0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời

AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-5μ g/kg.

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ

dẫn… để phân tích các β-lactam.

Trong [20], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO,

OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt độ thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91%. Còn trong

[34], WJ Blanchflower và cộng sự dung diclometan và hexan để tách penịillin V,

PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, độ thu hồi đạt 89-117%.

Khi tách và làm giàu các β -lactam trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật SPE

thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là C18) và trao đổi ion

dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ.

K. Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C18 và dung môi rửa

giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt độ thu hồi

83-89%. Còn trong [26] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu

AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt độ thu hồi

77,1-95,9%.

Trong [22] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách

AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nước

thải cho độ thu hồi 76-100%.

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như

thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp

đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ. Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu

cao trong việc phân tích β -lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao.

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn đề

cấp thiết đang được quan tâm. Trong đó chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu

thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như chúng tôi

đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng

sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.

Trong đề tài này, chất phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là ampicillin

(AMP), cephalexin (CEP), cefaclor (CEF) và Amoxicillin (AMO), benzylpenicillin

sodium (PEN G), Penicillin V Kali ( PEN V), Oxacillin (OXA), Cloxacillin

(CLOX) là các kháng sinh β-Lactam được sử dụng phổ biến, rộng rãi hiện nay.

Mục tiêu của đề tài là xây dựng và phát triển phương pháp xác định đồng thời

các kháng sinh nhóm β-Lactam trong thuốc và trong nước tiểu bằng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector khối phổ ( LC-MS/MS).

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Tập trung nghiên cứu các vấn đề sau:

1. Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha

đảo sử dụng detector khối phổ

- Điều kiện vận hành máy LC-MS/MS

- Chọn pha tĩnh

- Tối ưu hoá pha động: Thành phần, tốc độ và các điều kiện khác,…

2. Điều kiện định lượng

- Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

(LOQ)

- Độ đúng và độ lặp lại của phép đo

3. Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp

- Phân tích mẫu thuốc

- Phân tích mẫu nước tiểu

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.2.1. Thiết bị

• Hệ thống sắc ký lỏng HPLC của Shimazu (Nhật Bản) gồm: Bộ phận bơm

dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt, cột sắc ký C18 của Dionex

(150mm × 2,1mm × 3μm) ghép nối với detector khối phổ MS/MS Triple

Quad 5500 của AB Sciex (Hoa Kì).

• Cân phân tích (độ đọc 0,1mg, 0,01mg).

• Cân kĩ thuật (độ đọc 0,01g).

2.2.2. Dụng cụ

• Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml.

• Bình định mức: 10, 50, 100, 200, 1000 ml.

• Ống li tâm 50ml, 10 ml.

• Vial loại 1,8ml.

• Ống đong, phễu, giấy lọc.

• Pipetman loại 200µl, 1000µl và đầu côn.

• Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45µm, bể siêu âm, tủ lạnh, tủ sấy, và

các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác.

2.2.3. Hóa chất

- Chất chuẩn β – lactam gồm các chất chuẩn: AMP,OXA, CEP, CEF, AMO, PEN

V, PEN G, CLOX do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48A Hai Bà Trưng – Hà Nội) sản

xuất và cung cấp.

- MeOH, ACN tinh khiết cho chạy HPLC Merck (Đức). Các hoá chất khác: Axit

acetic, nước cất hai lần.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 0,01g các chất chuẩn trên cân phân

tích (độ đọc 0,01mg) của từng β – lactam, hoà tan cho vào từng bình định mức 50

ml và định mức đến vạch bằng nước cất. Chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0

– 5°C, tránh ánh sáng trực tiếp. Hạn sử dụng trong 3 tháng.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1 ppm: lấy chính xác thể tích dung

dịch chuẩn gốc của mỗi chuẩn gốc β – lactam vào bình định mức 10ml và định mức

đến vạch bằng nước cất. Chuẩn trung gian được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C,

tránh ánh sáng trực tiếp, sử dụng trong ngày.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: lấy chính xác thể tích hỗn hợp dung môi ACN

: H2O (1 : 1) và thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian cho vào vial loại 1,5

ml thu được các chuẩn làm việc 1 ppb, 5 ppb, 10 ppb, 50 ppb, 100 ppb, 200 ppb,

300 ppb, 500 ppb. Chuẩn làm việc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 – 5°C, tránh ánh

sáng trực tiếp, sử dụng trong ngày.

Chuẩn bị dung môi pha động

- Kênh A: dung dịch acid acetic 0,1% trong nước: lấy chính xác 1 ml acid acetic

vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất. Dung dịch được

lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào cột sắc ký.

- Kênh B: ACN.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện xác định β – lactam bằng LC/MS/MS

3.1.1. Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ

Theo tài liệu tham khảo [9], tác giả Lê Ngọc Sơn đã tiến hành phân tích các kháng

sinh họ beta-lactam trên thiết bị LC/MS/MS tại phòng thí nghiệm của viện kiểm

nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 5

năm 2012. Do vẫn tiến hành trên cùng thiết bị đó nên để tiết kiệm thời gian phân

tích chúng tôi đã sử dụng một số kết quả khảo sát đã được trình bày trong đề tài

của tác giả Lê Ngọc Sơn [9] như sau:

1. Điều kiện tối ưu của thiết bị khối phổ

Các điều điện tối ưu của thiết bị khối phổ được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Curtain Gas (CUR) 35,0 psi Collision Gas (CAD) 7,0 psi IonSpray Voltage (IS) 5000 V Temperature (TEM) 300oC

IonSource (GS1) 30 psi IonSource (GS2) 20 psi

Ý nghĩa của các thông số

CUR: Luồng khí mang N2 tinh khiết thổi vào khe giữa 2 màn chắn của bộ phận ion

hóa và bộ phận phân tích phổ.

CAD: Kiểm soát áp suất khí N2 trong Q2 , tạo năng lượng để phân mảnh ion mẹ.

IS: Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phận phân tich

ion.

TEM: Nhiệt độ của luồng khí nóng thổi vào Gas 2

GS1: Áp suất hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho sự hình thành câc giọt được dễ

dàng hơn.

GS2: Áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay hơi dung môi.

2. Kết quả bắn phá các ion mẹ

Trong kĩ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ

thường ở dạng (M+1 ). Kết quả bắn phá các ion mẹ được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 .Kết quả khảo sát bắn phá các ion mẹ

β – lactam Khối lượng phân tử M Ion mẹ (M+1) Ampicillin 349,4 350,0

Penicillin G 334,4 335,0 Penicillin V 350,4 351,0

Oxacillin 401,4 402,0 Cloxacillin 435,8 436,0 Cephalexin 347,0 348,0

Cefaclor 367,5 368,0 Amoxicillin 365,0 366,0

3.Điều kiện bắn phá các ion con

Detector được sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện

đúng chất phân tích thì việc chọn được ion con là rất quan trọng. Ion con phải có tín

hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao thì

cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp. Qua một số tài liệu tham

khảo chúng tôi lựa chọn được kết quả tối ưu hóa mức năng lượng bắn phá ion mẹ để

tạo các ion con được trình bày trong bảng 3.3. Các ion con cho tín hiệu cao hơn

được dùng để định lượng, đối với các kháng sinh beta-lactam chúng tôi chọn mảnh

dùng để định lượng là các mảnh có khối lượng nhỏ.

Bảng 3.3. Năng lượng bắn phá và các ion con của β – lactam

B - lactam Ion mẹ Ion con DP (V) CE (V) CXP (V)

106 23 42 Ampicillin 350

192 71

23 20

Penicillin G 335 160 76 15 12

176 17 24

160 17 16 Penicillin V 351

192 66

15 32

160 19 20 Oxacillin 402

243 51

19 10

160 17 20 Cloxacillin 436

192 106

17 12

140 20 14 Cephalexin 348

158 70

15 14

174 15 16 Cefaclor 368

333 70

15 16

114 18 16 Amoxicillin 366

349 70

15 14

3.1.2. Chọn pha tĩnh [9]

Cột tách góp phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách chất. Các chất

nhóm β – lactam là các chất kém phân cực, do đó chúng tôi vẫn sử dụng cột tách là

cột tách pha đảo cho quá trình phân tích . Trong điều kiện phòng thí nghiệm cho

phép, chúng tôi chọn cột pha đảo C18 để tách các chất β – lactam. Để bảo vệ cột,

chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột:

- Cột Acclaim C18 của Dionex (150mm x 2,1mm x 3µm).

- Tiền cột Acclaim C18 của Dionex.

3.1.3. Chọn pha động

Theo tài liệu tham khảo [9] chúng tôi sử dụng pha động như sau:

- Kênh A: Axit acetic 0,1% trong nước

- Kênh B: ACN

Trong [9] sử dụng chương trình gradien chạy trong 12 phút với tốc độ dòng 0,4

ml/phút nhưng để tiết kiệm thời gian phân tích chúng tôi chọn chương trình gradien

chạy trong 10 phút như sau:

Bảng 3.4. Chương trình chạy gradient tối ưu rửa giải các chất β-lactam

Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) CH3COOH 0,1 % ACN

2,00 0,4 95 5

3,00 0,4 5 95

6,50 0,4 5 95

6,51 0,4 95 5

10,00 0,4 95 5

Như vậy các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký như sau:

- Cột Symestry C18 của Dionex (150mm x 2,1 mm x 3µm).

- Tiền cột C18 của Dionex.

- Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid acetic 0,1% trong

nước, kênh B là dung môi ACN.

- Chương trình chạy gradient ở bảng 3.4.

- Tốc độ dòng 0,4ml/phút.

- Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3.

Tiến hành chạy sắc kí đối với chuẩn hỗn hợp 8 kháng sinh β – lactam với các

điều kiện tối ưu thu được thời gian lưu tr theo bảng 3.5:

Bảng 3.5. Thời gian lưu tr của các kháng sinh nhóm β – lactam trong điều kiện tối ưu

Thông

số AMP PEN G PEN V OXA CLOX CEP CEF AMO

tr (phút) 5,27 6,31 6,44 6,55 6,63 5,30 5,26 1,54

Hình 3.1. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp 8 kháng sinh β - lactam ở nồng độ 100 ppb

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích

3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính

Từ các điều kiện đã tối ưu ở trên tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của

phép đo với các điều kiện sau:

- Khoảng nồng độ: 1ppb – 500 ppb

- Phương pháp đo diện tích S.

Kết quả thu được ở bảng 3.6. Từ kết quả đó, ta xây dựng đường chuẩn đối với từng

kháng sinh nhóm β – lactam.

Bảng 3.6. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ β – lactam

Diện tích pic Nồng

độ

(ppb) AMP PEN G PEN V OXA CLOX CEP CEF AMO

1 65700 72000 25700 14600 10800 23000 16000 19400

5 322000 343000 115000 73500 54100 114000 80200 94900

10 692000 726000 233000 155000 107000 228000 158000 192000

20 1330000 1470000 465000 308000 219000 458000 316000 388000

50 3440000 3640000 1180000 710000 515000 1130000 794000 940000

100 6870000 7270000 2350000 1340000 1080000 2370000 1580000 1850000

200 13900000 14500000 4660000 2700000 2170000 4580000 3170000 3720000

300 20600000 21800000 6990000 3990000 3210000 6850000 4730000 5610000

500 27000000 29000000 10000000 5600000 5800000 11900000 6900000 8000000

Từ bảng số liệu trên ta thấy nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích tuyến

tính trong khoảng 1ppb – 300 ppb.Sử dụng phần mềm origin 6.0 lập phương trình

đường chuẩn của các chất phân tích như sau:

0 50 100 150 200 250 3000

5000000

10000000

15000000

20000000

Y = A + B * X

Parameter Value Error------------------------------------------------------------A -9402.20483 27989.27006B 68943.02863 209.32884------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0.99997 60741.98549 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.2. Đường chuẩn của Ampicillin

0 50 100 150 200 250 3000

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

Y = A + B * X


R SD N P------------------------------------------------------------1 16459.34665 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.3. Đường chuẩn của Penicillin G

0 50 100 150 200 250 3000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Y = A + B * X

Parameter Value Error------------------------------------------------------------A 4635.19949 4125.31954B 23296.81983 30.85284------------------------------------------------------------

R SD N P------------------------------------------------------------0.99999 8952.72007 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.4. Đường chuẩn của Penicillin V

0 50 100 150 200 250 3000

1000000

2000000

3000000

4000000

Y = A + B * X


R SD N P------------------------------------------------------------0.99992 20320.51138 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.5. Đường chuẩn của Oxacillin

0 50 100 150 200 250 3000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

Y = A + B * X


R SD N P------------------------------------------------------------0.99994 13917.81329 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.6. Đường chuẩn của Cloxacillin

0 50 100 150 200 250 3000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

Y = A + B * X


R SD N P------------------------------------------------------------0.99992 33452.32418 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.7. Đường chuẩn của Cephalexin

0 50 100 150 200 250 3000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

Y = A + B * X


R SD N P------------------------------------------------------------1 5701.96435 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.8. Đường chuẩn của Cefaclor

0 50 100 150 200 250 3000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

Y = A + B * X


R SD N P------------------------------------------------------------0.99999 11638.75523 8 <0.0001------------------------------------------------------------

dien

tich

pic

nong do

Hình 3.9. Đường chuẩn của Amoxcillin

Áp dụng công thức:

Y = ( A ± t.SA) + ( B ± t.SB).X

Ta lập được phương trình hồi quy của các chất như sau:

Phương trình đường chuẩn của AMP: Y = (-9402,2 ± 68489,8) + (68943,0± 512,2).X

Phương trình đường chuẩn của PEN G : Y = ( -134,0 ± 18558,5) + ( 72626,9 ± 138,7).X

Phương trình đường chuẩn của PEN V: Y = ( 4635,2 ± 10094,6) + (23296,8 ± 75,6).X

Phương trình đường chuẩn của OXA: Y = (22948,9 ± 22912,5) + ( 13276,3 ± 171,3).X

Phương trình đường chuẩn của CLOX: Y= (-758,5± 15693,1) + ( 10746,3 ± 117,4)X

Phương trình đường chuẩn của CEP : Y = (7997,1 ± 37719,3) + (22870,3 ± 282,1).X

Phương trình đường chuẩn của CEF : Y = (1955,0 ± 6429,2) + (15785,1 ± 48,2).X

Phương trình đường chuẩn của AMO: Y = (2560,5 ± 13123,3) + (18649,9 ± 98,1).X

3.2.2. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Giới hạn phát hiện LOD được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu

trắng hay tín hiệu nền. [10]

Giới hạn định lượng LOQ được xem là nồng độ thấp nhất mà hệ thống phân

tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu

của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Theo lí thuyết thống kê hóa phân tích thì LOQ =

3,33 LOD. [10]

Để xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ, đối với mẫu

nước tiểu chúng tôi dùng chuẩn hỗn hợp 10 ppb rồi tiến hành pha loãng trên nền

mẫu thực không chứa chất phân tích cho tới khi thu được chiều cao chất phân tích

gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Đối với mẫu thuốc chúng tôi dùng mẫu thuốc chứa

chất phân tích pha loãng cho đến khi tín hiệu chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu

đường nền. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các β – lactam

Đối tượng AMP PEN G PEN V OXA CLOX CEP CEF AMO

Nước tiểu 0,1 0,1 0,5 0,1 0,2 0,1 0,4 0,5 LOD

(ppb) Thuốc 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1 0,2 0,3 0,3

Nước tiểu 0,3 0,3 1,5 0,3 0,6 0,3 1,2 1,5 LOQ

(ppb) Thuốc 0,6 0,9 0,6 0,3 0,3 0,6 0,9 0,9

3.3. Phân tích mẫu thực tế

3.3.1. Phân tích mẫu nước tiểu

3.3.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu

Nước tiểu có thành phần khá phức tạp, có chứa khoảng 95% là nước, phần

còn lại là muối, men, protein, vi khuẩn và cả thành phần axit uric. Vì protein và các

loại muối trong nước tiểu có ảnh hưởng nhiều tới chất phân tích do đó phải xử lý

mẫu nước tiểu để làm giảm ảnh hưởng của các yếu tố này đến chất phân tích đồng

thời làm sạch mẫu phân tích tránh tắc cột. Có nhiều cách để làm giảm ảnh hưởng

của các yếu tố này đến chất phân tích, theo một số tài liệu tham khảo có các quy

trình xử lý nước tiểu như sau:

Theo [6], tác giả Phạm Nho đã đưa ra quy trình xử lý mẫu nước tiểu như sau:

Mẫu nước tiểu được thêm chuẩn ở nồng độ 5ppm các kháng sinh, được axit hóa

bằng axit Sunfosalixylic. Sau đó lắc 5 phút rồi ly tâm 1000 vòng trên phút trong 5

phút.Dịch thu được cho qua cột chiết HLB, Sau đó đem đo trên máy điện di.

Theo [28], tác giả MILAP C. NAHATA đưa ra quy trình xử lý như sau:

Lấy khoảng 100μ l nước tiểu vào ống ly tâm sau đó thêm 200μ l MeOH (Chứa

Cephaloglyxin – IS) .Lắc vortex trong 5 giây, ly tâm trong 5 phút, lớp dịch trên

chuyển sang ống khác rồi thổi khô bằng khí N2. Cặn được hòa tan bằng 75μ l pha

động ( CH3COOH 0,5%, MeOH: H2O = 80:20). Sau đó tiếp tục lắc vortex trong

30s. Hút 50μ l bơm lên cột HPLC dùng detector UV ( 254nm)

Trong phương pháp pháp phân tích chúng tôi sử dụng thiết bị LC/MS/MS có độ

nhạy cao cỡ ppb. Mặt khác hàm lượng kháng sinh trong mẫu nước thường có nồng

độ lớn nên chúng tôi sử dụng phương pháp pha loãng để làm giảm ảnh hưởng của

nền mẫu theo 2 qui trình dưới đây. Mẫu nước tiểu trắng được thu thập từ người

không sử dụng thuốc kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh đang nghiên cứu trước đó

ít nhất 1 tháng. Các mẫu nước tiểu được thêm chuẩn ở mức nồng độ 20ppb

Ở bước (*) chúng tôi tiến hành khảo sát sự pha loãng bằng hỗn hợp ACN: H2O tỉ lệ

1: 1(v/v) theo các tỉ lệ như sau:

Thí nghiệm Tỉ lệ pha loãng Thí nghiệm Tỉ lệ pha loãng

1- QT1-1 Không pha loãng 3- QT1-3 Pha loãng 10 lần

2- QT1-2 Pha loãng 5 lần 4 - QT1-4 Pha loãng 20 lần

5 - QT1-5 Pha loãng 50 lần

Sau khi pha loãng các dung dịch được đem đo trực tiếp trên máy LC/MS/MS và thu

được kết quả được trình bày trong bảng 3.8.

5ml nước tiểu/ống li tâm 50ml

Lắc vortex

Li tâm 6000 vòng/phút, 10 phút

+ Thêm chuẩn hỗn hợp 8 kháng sinh beta-lactam

Quy trình xử lí mẫu nước tiểu 1

Lấy lớp dịch phía trên pha loãng (*)

LC/MS/MS

Thêm chuẩn hỗn hợp 8 kháng sinh beta - lactam

Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2 được trình bày trong bảng 3.9

Quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2

5 ml nước tiểu / ống ly tâm 50 ml

Pha loãng

Chạy trực tiếp

5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần

LC/MS/MS

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 1

*Nhận xét:

Từ kết quả trình bày trong bảng 3.8 ta thấy khi xử lý mẫu nước tiểu theo quy trình 1,khi không pha loãng tín hiệu chất phân

tích thấp, nhiễu đường nền cao. Khi pha loãng đến 50 lần thì tín hiệu chất phân tích tốt, độ thu hồi của các chất phân tích đều

đạt trên 80%. Như vậy ta thấy độ thu hồi của các chất phân tích tăng dần theo hệ số pha loãng, do khi pha loãng làm giảm

nồng độ của các yếu tố trong nền mẫu như các muối, protein,….đến chất phân tích.

Chất phân tích

AMP PEN G PEN V OXA CLOX CEP CEF AMO Thí

nghiệmC(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R%

1 6,12 30,6 5,90 29,5 5,67 28,4 4,07 20,4 5,03 25,2 5,90 29,5 6,70 33,5 6,80 34,0

2 14,2 71,0 8,86 44,3 10,1 50,5 11,5 57,5 13,9 69,5 11,3 56,5 12,0 60,0 10,2 51,0

3 16,1 80,5 11,1 55,5 12,3 61,5 14,1 70,5 16,4 82,0 13,5 67,5 12,2 61,0 14,5 72,5

4 17,9 89,5 14,8 74,0 15,8 79,0 17,0 85,0 17,0 80,0 15,5 77,5 14,5 72,5 15,0 75,0

5 18,0 90,0 17,0 85,0 18,0 90,0 17,4 87,0 17,6 88,0 16,4 82,0 18,2 91,0 18,0 90,0

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu nước tiểu 2

*Nhận xét:

Kết quả thu được từ bảng 3.9 cho thấy khi xử lý nước tiểu theo quy trình 2 thì ở mức pha loãng 100 lần đã cho tín hiệu chất

phân tích tốt và độ thu hồi của các chất cao đều trên 80% .

Như vậy cả hai quy trình xử lý trên đều có độ thu hồi cao và dễ tiến hành có thể áp dụng phân tích, nhưng để tiết kiệm thời

gian phân tích chúng tôi quyết định chọn quy trình 2 để phân tích .

Chất phân tích

AMP PEN G PEN V OXA CLOX CEP CEF AMO Thí

nghiệmC(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R% C(ppb) R%

1 14,4 72,0 10,0 50,0 10,4 52,0 12,8 64,0 13,9 69,5 11,6 58,0 12,4 62,0 9,80 49,0

2 16,2 81,0 14,9 74,5 15,7 78,5 16,5 82,5 15,0 75,0 14,3 71,5 13,4 67,0 12,0 60,0

3 17,3 86,5 15,0 75,0 16,8 84,0 17,0 85,0 16,6 83,0 16,0 80,0 14,4 72,0 15,7 78,5

4 17,8 89,0 15,8 79,0 17,6 88,0 17,5 87,5 16,9 84,5 16,4 82,0 15,5 77,5 17,6 88,0

5 18,0 90,0 16,0 80,0 19,2 96,0 18,2 91,0 17,5 87,5 16,6 83,0 16,0 80,0 18,0 90,0

6 19,8 99,0 19,0 95,0 19,4 97,0 19,8 99,0 19,0 95,0 19,3 96,5 19,7 98,5 19,6 98,0

Chúng tôi đưa ra sắc đồ của quy trình xử lý mẫu nước tiểu theo quy trình 2 tại điều

kiện tối ưu. Còn các sắc đồ còn lại chúng tôi đưa vào phần phụ lục.

Hình 3.10 Sắc đồ8 kháng sinh của quy trình xử lý mẫu nước tiểu tại điều kiện tối ưu

3.3.1.2 Độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu

Sau khi tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu nước tiểu, chúng tôi tiến

hành xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp này bằng cách thêm chuẩn

vào mẫu nước tiểu ở 3 mức nồng độ 5 ppb, 100ppb, 200ppb. Mỗi mức nồng độ tiến

hành lặp lại 6 lần. Kết quả thu được ở bảng 3.10, bảng 3.11, bảng 3.12 như sau:

Bảng 3.10. Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn

ở nồng độ 5 ppb

Chất Thông

số

Lần

1

Lần

2

Lần

3

Lần

4

Lần

5

Lần

6

Trung

bình SD

RSD

(%)

C

(ppb) 3,82 4,06 4,40 4,28 4,25 4,07 4,15 0,206 4,97

AMP

R (%) 76,3 81,3 88,0 85,7 85,0 81,4

C

(ppb) 4,60 4,50 4,57 4,77 4,49 4,82 4,63 0,139 3,00 PEN

G R (%) 92,0 90,0 91,4 95,4 89,8 96,4

C

(ppb) 3,78 3,94 4,10 4,05 4,17 3,84 3,98 0,153 3,84 PEN

V R (%) 75,5 78,8 82,0 81,0 83,4 76,8

C

(ppb) 4,87 4,80 4,72 4,69 4,68 4,69 4,74 0,0768 1,62

OXA

R (%) 97,3 96,1 94,4 93,9 93,7 93,9

C

(ppb) 4,61 4,69 4,80 4,64 4,54 4,53 4,64 0,101 2,18

CLOX

R (%) 92,2 93,7 96,0 92,7 90,9 90,6

C

(ppb) 4,25 4,40 4,33 4,10 3,80 4,15 4,17 0,213 5,11

CEP

R (%) 85,0 88,0 86,6 82,0 76,0 83,0

C

(ppb) 3,61 3,78 3,62 3,57 3,67 3,77 3,67 0,087 2,38

CEF

R (%) 71,2 75,6 72,3 71,4 73,4 75,3

C

(ppb) 4,01 3,99 4,52 4,55 4,15 3,75 4,16 0,318 7,63

AMO

R (%) 80,2 79,8 90,5 91,0 83,0 75,0

Bảng 3.11. Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn


Chất Thông số

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Lần 6

Trung bình SD RSD

(%) C

(ppb) 79,6 74,3 84,0 73,0 82,0 75,5 78,1 4,46 5,71 AMP

R (%) 79,6 74,3 84,0 73,0 82,0 75,5

C (ppb) 87,5 88,8 91,4 91,3 82,0 87,0 88 3,47 3,95

PEN G R (%) 87,5 88,8 91,4 91,3 82,0 87,0

C

(ppb) 76,1 75,6 79,8 76,6 87,0 78,4 78,9 4,23 5,40 PEN V

R (%) 76,1 75,6 79,8 76,6 87,0 78,4

C (ppb) 80,1 81,1 80,0 79,8 75,0 76,6 78,8 2,40 3,04

OXA R (%) 80,1 81,1 80,0 79,8 75,0 76,6

C

(ppb) 77,1 77,7 77,9 78,3 82,5 78,8 78,7 1,94 2,46 CLOX

R (%) 77,1 77,7 77,9 78,3 82,5 78,8

C (ppb) 75,1 77,9 79,4 79,4 73,7 80,2 77,1 2,59 3,36

CEP R (%) 75,1 77,9 79,4 79,4 73,7 80,2

C

(ppb) 73,5 76,1 72,6 74,6 80,5 77,2 75,8 2,87 3,78 CEF

R (%) 73,5 76,1 72,6 74,6 80,5 77,2

C (ppb) 70,4 77,2 72,0 80,0 84,0 87,0 78,4 6,55 8,34

AMO R (%) 70,4 77,2 72,0 80,0 84,0 87,0

Bảng 3.12 Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu nước tiểu thêm chuẩn


Chất Thông số

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Lần 6

Trung bình SD RSD

(%) C

(ppb) 166 174 184 156 166 160 168 10,1 6,01 AMP

R (%) 83,0 87,0 92,0 78,0 83,0 80,0

C (ppb) 147 172 159 152 176 148 159 12,4 7,81 PEN

G R (%) 73,6 86 79,6 76,0 87,9 73,9 C

(ppb) 163 171 151 158 147 148 156 9,46 6,05 PEN V R (%) 81,6 85,5 75,7 78,9 73,4 74,0

C

(ppb) 140 176 148 177 149 159 158 15,4 9,76 OXA

R (%) 70,0 88,2 73,8 88,6 74,4 79,4

C (ppb) 152 181 156 142 155 169 159,2 13,8 8,65

CLOX R (%) 76,0 90,5 78,0 70,9 77,6 84,5

C

(ppb) 166 185 176 170 160 174 172 8,64 5,03 CEP

R (%) 83,0 92,5 88,0 85,0 79,9 87,0

C (ppb) 154 186 178 170 173 180 174 11,0 6,35

CEF R (%) 77,0 93,0 89,0 85,0 86,7 89,8

C

(ppb) 156 164 166 152 158 168 161 6,28 3,91 AMO

R (%) 78,0 82,0 83,0 76,0 79,0 84,0

Nhận xét:

Qua 3 bảng số liệu trên ta thấy ở 3 mức nồng độ 5ppb, 100ppb, 200ppb ta thấy RSD

đều nhỏ hơn 10% nằm trong giới hạn cho phép.[2]

3.3.1.3 Phân tích mẫu nước tiểu thực

Sau khi khảo sát quy trình và thẩm định phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích

một số mẫu nước tiểu thu thập được từ một số tình nguyện viên có độ tuổi từ 20-25

tuổi, trước đó 2 tuần không dùng bất kì loại thuốc nào.Chúng tôi thu thập được

nước tiểu từ 4 người uống 4 loại thuốc sau:

- Cephalexin hàm lượng 500 mg

- Cefaclor hàm lượng 250 mg

- Ampicillin hàm lượng 500 mg

- Amoxicillin hàm lượng 500 mg

Mỗi người uống một viên thuốc có hàm lượng như trên. Lấy nước tiểu của các tình

nguyện viên sau uống thuốc 6h, 12h, 24h. Mẫu nước tiểu thu thập được đem xử lý

theo quy trình được tối ưu ở trên. Đối với mẫu nước tiểu sau 6h, 12h uống thuốc

tiếp tục được pha loãng 1000 lần, mẫu nước tiểu sau 24h uống thuốc tiếp tục được

pha loãng 500 lần rồi đem đo trên LC/MS/MS. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.13 Kết quả thực hiện trên mẫu thực

Mẫu nước tiểu Nồng độ sau 6h

(ppm)

Nồng độ sau 12h

(ppm)

Nồng độ sau 24h

(ppm)

AMP 1850 163 0,468

CEP 1840 154 0,87

CEF 161 10,2 0,043

AMO 264 33,6 KPH

Nhận xét:

Ta thấy nồng độ thuốc trong nước tiểu giảm dần theo thời gian. Sau 6h lượng

thuốc bài tiết qua nước tiểu là lớn nhất và với hàm lượng thuốc uống như vậy thì

sau 24h chỉ còn lại lượng rất ít, riêng AMO gần như không còn. Cũng qua bảng số

liệu trên ta thấy sự bài tiết của các thuốc qua nước tiểu là khác nhau và phụ thuộc

vào sự hấp thu của mỗi cơ thể.

Hình 3.11 Sắc đồ 4 chất kháng sinh beta-lactam trong mẫu nước tiểu sau 6h uống thuốc

3.3.2. Phân tích mẫu dược phẩm

3.3.2.1 Thu thập mẫu thuốc

Mẫu thuốc được thu nhập từ hiệu thuốc về ghi lại thông tin về mẫu bao gồm:

Nhà sản xuất, ngày sản xuất, số đăng ký kiểm soát, ngày hết hạn và thành phần của

thuốc (Bảng 3.14)

.

Bảng 3.14 Thông tin mẫu thuốc phân tích

Nhà sản xuất Công ty cổ phần dược phẩm trung ương 25

Ngày sản xuất 21/07/2012

Số đăng ký VD- 11201-10

Thành phần Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa

500mg cephalexin, tá dược vừa đủ.

Cephalexin

Hạn sử dụng 21/07/2014

Nhà sản xuất Công ty cổ phần hóa dược phẩm Mekophar

Ngày sản xuất 18-03-2012

Số đăng ký VD-2563 - 07

Thành phần Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa

250mg cefaclor, tá dược vừa đủ.

Cefaclor

Hạn sử dụng 18-03-2014

Nhà sản xuất Công ty CPDP trung ương 1 –PHARBACO


Số đăng ký Vd- 5967 - 08

Thành phần Viên con nang, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa

500mg ampicillin, tá dược vừa đủ

Ampicillin

Hạn sử dụng 14-06-2014

Nhà sản xuất Công ty cổ phần hóa – dược phẩm Mekophar


Số đăng ký VD – 4425- 07

Thành phần Mỗi viên nang chứa Amoxicillin trihydrat tương

đương 500 mg amoxicillin

Amoxicillin


Nhà sản xuất Công ty CPDP trung ương 1 –PHARBACO


Số đăng ký VD-5493-08

Thành phần Mỗi viên nang chứa 500mg oxacillin

OXacillin


PEN V Nhà sản xuất Công ty cổ phần hóa – dược phẩm Mekophar



Thành phần Viên nén, Penicillin Kali 1.000.000 IU


Nhà sản xuất Công ty cổ phần hóa – dược phẩm Mekophar



Thành phần Thuốc dạng bột đóng trong lọ. Mỗi lọ chứa 1000000

IU penicillin Natri.

PEN G


Các mẫu thuốc dưới dạng viên nén, mỗi loại lấy 10 viên đem cân, ghi lại chính xác

khối lượng, tính khối lượng trung bình viên rồi nghiền mịn và trộn đều. Các mẫu

được cân một lượng thích hợp để phân tích. Các mẫu thuốc còn lại được bảo quản

cất trong tủ lạnh, các mẫu đem khảo sát các điều kiện định lượng. Kết quả được so

sánh và đánh giá theo phương pháp thống kê để kiểm tra độ lặp và độ thu hồi.Cách

tính khối lượng trung bình viên như sau:

Khối lượng trung bình viên = (Khối lượng 10 viên- Khối lượng vỏ của 10 viên)/ 10

Bảng 3.15 Bảng tính khối lượng trung bình viên của các mẫu thuốc

Tên thuốc Khối lượng 10 viên

(g)

Khối lượng vỏ

(g)

Khối lượng trung

bình viên

(g)

AMP 7,0647 0,9950 0,6069

CEP 6,8815 0,9895 0,5892

CEF 4,3170 0,7742 0,3543

AMO 6,8412 1,0350 0,5806

OXA 7,1715 0,9623 0,6210

Pen V 8,1124 - 0,8112

PEN G 1g/lọ - -

3.3.2.3 Quy trình xử lý mẫu thuốc

Trong mẫu thuốc có thành phần chủ yếu là chất phân tích, các tá dược không

đáng kể và không ảnh hưởng đến chất phân tích. Vì vậy chúng tôi đưa ra quy trình

xử lý mẫu thuốc như sau:

Thêm 30 ml nước cất

Quy trình xử lý mẫu thuốc 0,05 g thuốc/ ống ly tâm 50ml

Lắc vortex

Rung siêu âm 15 phút

Chuyển vào bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất

LC/MS/MS

Chúng tôi sử dụng mẫu thuốc đóng dạng viên nang nhưng thành phần không

chứa chất phân tích sau đó thêm chuẩn ở mức nồng độ 20ppb và xử lý như quy trình

trên. Kết quả thu được như ở bảng 3.16

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu thuốc

Nhận xét:

Qua bảng 3.16 ta thấy khi xử lý mẫu thuốc theo quy trình đã đưa ra thì độ thu hồi

của các chất phân tích lớn, đều đạt trên 80%. Như vậy chúng tôi sử dụng quy trình

này để phân tích mẫu thực

3.3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu thuốc

Chúng tôi sử dụng mẫu thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 5ppb, 100ppb, 200ppb, mỗi

mức làm lặp lại 6 lần và thực hiện theo quy trình trên. Kết quả thu được ở bảng

3.17, bảng 3.18, bảng 3.19 .

Chất phân tích Nồng độ(ppb) Độ thu hồi (R%)

AMP 16,6 83,0

CEP 17,0 85,0

CEF 17,9 89,5

AMO 17,4 87,0

PEN G 19,0 95,0

PEN V 17,6 88,0

OXA 17,0 85,0

CLOX 17,0 85,0

Bảng 3.17. Khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu thuốc thêm chuẩn ở

nồng độ 5 ppb

Chất Thông số

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Lần 6

Trung bình SD RSD

(%) C

(ppb) 4,45 4,57 4,32 4,81 4,78 4,36 4,54 0,210 4,61 AMP

R (%) 89,1 91,4 86,3 96,1 95,6 87,3

C (ppb) 4,80 4,60 4,75 4,85 4,55 4,94 4,75 0,149 3,14 PEN

G R (%) 96,0 92,0 95,0 97,0 91,0 98,7

C (ppb) 3,79 3,70 3,91 3,63 3,96 3,72 3,79 0,128 3,38 PEN

V R (%) 75,8 74,0 78,2 72,5 79,2 74,4

C (ppb) 4,43 4,68 4,45 4,57 4,80 4,54 4,58 0,141 3,08

OXA R (%) 88,7 93,6 89,0 91,5 96,0 90,7

C

(ppb) 4,08 4,45 3,83 4,18 4,44 3,91 4,15 0,260 6,29 CLOX

R (%) 81,7 89,1 76,6 83,6 88,8 78,2

C (ppb) 3,90 4,15 4,50 4,20 3,75 4,45 4,16 0,296 7,11

CEP R (%) 78,0 83,0 90,0 84,0 75,0 89,0

C (ppb) 3,51 3,79 3,99 4,55 3,95 3,78 3,93 0,348 8,87

CEF R (%) 70,2 75,8 79,8 74,6 79,0 75,5

C (ppb) 4,50 4,45 4,43 4,40 4,51 4,42 4,45 0,044 0,999

AMO R (%) 90,0 89,0 88,6 88,0 90,2 88,4


nồng độ 100 ppb

Chất Thông số

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Lần 6

Trung bình SD RSD

(%) C

(ppb) 86,4 93,9 95,7 86,6 93,0 87,0 90,4 4,22 4,67 AMP

R (%) 86,4 93,9 95,7 86,6 93,0 87,0

C (ppb) 98,0 90,0 94,0 95,0 96,8 97,0 95,1 2,90 3,05 PEN

G R (%) 98,0 90,0 94,0 95,0 96,8 97,0

C (ppb) 80,1 82,5 85,1 77,4 73,2 79,3 79,6 4,12 5,17 PEN

V R (%) 80,1 82,5 85,1 77,4 73,2 79,3

C (ppb) 89,4 96,2 94,3 85,1 79,2 89,2 88,9 6,19 6,96

OXA R (%) 89,4 96,2 94,3 85,1 79,2 89,2

C

(ppb) 85,2 91,6 87,8 75,6 76,2 85,2 83,6 6,41 7,67 CLOX

R (%) 85,2 91,6 87,8 75,6 76,2 85,2

C (ppb)

97,0

94,0

91,0

99,0

92,0

92,0 94,2 3,19 3,39

CEP R (%) 97,0

94,0

91,0

99,0

92,0

92,0

C (ppb) 73,7 75,0 77,6 75,9 85,2 72,9 76,7 4,47 5,83

CEF R (%) 73,7 75,0 77,6 75,9 85,2 72,9

C (ppb) 83,5 99,2 94,0 81,7 93,7 95,0 91,2 6,96 7,63

AMO R (%) 83,5 99,2 94,0 81,7 93,7 95,0


nồng độ 200 ppb

Chất Thông số

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Lần 6

Trung bình SD RSD

(%) C

(ppb) 171 177 175 162 168 182 173 7,06 4,10AMP R (%) 85,4 88,3 87,7 80,8 83,9 90,8

C (ppb) 184 184 182 178 186 184 183 2,76 1,51PEN

G R (%) 92,0 92,0 91,0 89,0 93,0 92,0

C (ppb) 149 167 155 146 148 150 153 7,71 5,06PEN

V R (%) 74,6 83,6 77,3 73,0 73,8 75,1

C (ppb) 163 186 178 178 163 169 173 9,33 5,40OXA R (%) 81,6 93,0 88,9 89,0 81,4 84,7

C (ppb) 161 177 168 156 155 166 164 8,28 5,05CLOX R (%) 80,3 88,6 84,0 77,8 77,4 82,8

C (ppb) 184 186 182 198 192 184 188 6,12 3,26CEP R (%) 92,0 93,0 91,0 99,0 96,0 92,0

C (ppb) 152 140 146 157 147 141 147 6,49 4,41CEF R (%) 76,0 70,2 73,0 78,7 73,5 70,4

C (ppb) 177 198 192 176 183 188 186 8,64 4,65

AMO R (%) 88,7 93,9 96,1 88,0 91,5 93,8

Nhận xét:

Qua bảng số liệu trên ta thấy độ thu hồi của mẫu thuốc khá cao và RSD đều nhỏ

hơn 10% nằm trong giới hạn cho phép.

3.3.2.5 Phân tích mẫu thuốc

Các mẫu thuốc sau khi thu thập được xử lý theo quy trình đã khảo sát và tiếp tục

được pha loãng 2500 lần sau đó đem đo trên máy LC/MS/MS. Sau khi thu được kết

quả phân tích chúng tôi đánh giá hàm lượng thuốc so với hàm lượng ghi trên nhãn.

Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả in trên nhãn là:

C% = n

ni

mmm − .100%

Trong đó: mi là khối lượng xác định theo phương pháp phân tích

mn là khối lượng thuốc ghi trên nhãn thuốc

Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.20 Kết quả phân tích trên mẫu thuốc thực

Tên hợp chất và hàm lượng

Nồng độ(ppm)

mi (mg/viên) mn (mg/viên)

Sai lệch so với hàm lượng ghi trên nhãn

AMP (500mg/v) 40500 491 500 -1,80

PEN G (1000000IU/ lọ) 31000 620 625 -0,80

PEN V (1000000/v) 37500 608 625 -2,72

OXA (500mg/v) 39000 484 500 -3,20

CEP (500mg/v) 41500 489 500 -2,20

CEF (250mg/v) 35000 248 250 -0,80

AMO (500mg/v) 42800 497 500 -0,60

Nhận xét:

Qua bảng số liệu trên ta thấy nồng độ chất phân tích trong mẫu thuốc rất lớn. Hàm

lượng chất phân tích trong mẫu thuốc sai khác so với hàm lượng ghi trên nhãn

tương đối nhỏ, có thể do trong quá trình phân tích chất phân tích bị phân hủy một

lượng rất nhỏ.

Hình 3.12 .Sắc đồ 7 chất kháng sinh beta-lactam trong mẫu thuốc

3.4. Hướng phát triển của đề tài.

Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định

được hàm lượng của 8 chất thuộc họ β - Lactam bằng phương pháp LC-MS/MS

trong mẫu dược phẩm và mẫu nước tiểu. Phương pháp còn có thể được mở rộng

phân tích thêm nhiều chất khác thuộc họ beta-lactam và trong những dạng nền mẫu

khác nhau ví dụ như: mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu máu,dịch tế bào… hay các mẫu

môi trường như: nước thải bệnh viện, nước thải trại chăn nuôi gia súc...Vì vậy rất

cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển phương pháp áp dụng vào thực tiễn

hơn.

KẾT LUẬN

Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng

phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC – MS/MS để tách và xác định các kháng sinh

nhóm β – lactam: Ampicilliin, Penicillin G, Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin,

Cephalexin, Cephaclor, Amoxicillin trong mẫu dược phẩm, chúng tôi thu được kết

quả như sau:

1.Thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký:

- Detector: MS/MS

- Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI:

Curtain Gas (CUR) 35,0 psi

Collision Gas (CAD) 7,0 psi

IonSpray Voltage (IS) 5000 V

Temperature (TEM) 300oC

IonSource (GS1) 30 psi

IonSource (GS2) 20 si

- Pha tĩnh: Cột Acclaim C18 của Dionex (150mm x 2,1mm x 3µm) và tiền cột.

- Pha động:

* Kênh B: ACN, kênh A: acid acetic 0,1%.

* Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.

2.Đánh giá phương pháp phân tích:

- Khảo sát khoảng tuyến tính của các kháng sinh trong khoảng 1 – 300 ppb,

xây dựng đường chuẩn với hệ số tương quan các đường chuẩn R2 > 0,995.

- Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh từ 0,1 ppb đến 0,5 ppb. Giới

hạn định lượng LOQ từ 0,3 ppb đến 1,5 ppb.

- Hệ số biến động ở các nồng độ 1 ppb; 50 ppb; 300 ppb nằm trong khoảng 2,38% –

8,87 %

3.Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu dược phẩm và mẫu nước tiểu

- Với phương pháp phân tích mẫu thuốc: độ thu hồi đạt được từ 83% – 95%

- Với phương pháp phân tích mẫu nước tiểu: độ thu hồi từ 80% – 91 %

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1 Bộ Y Tế (1998), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội

2 Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ 3, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội

3 Trần Thị Dung (2011) “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β -

Lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm”, luận văn thạc sĩ, ĐH Quốc Gia Hà

Nội

4 Nguyễn Văn Đích (2005), "Không nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học và đời sống,

số 27

5 Nguyễn Minh Đức( 2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên

cứu, dược liệu và hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản y học chi nhánh thành phố Hồ Chí

Minh.

6 Phạm Nho (2011) “Nghiên cứu điều kiện phân tích beta-lactam bằng phương

pháp điện di mao quản”,luận văn thạc sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội.

7 Ngọc Phương ( 2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo laodong.com.vn,

10-10-2006. 8 Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH

KHTN - ĐHQG Hà Nội.

9 Lê Ngọc Sơn (2011), :" Xác định hàm lượng kháng sinh β – lactam trong thực phẩm

bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)”, khóa luận tốt nghiệp,

ĐH Quốc Gia Hà Nội. 10 PGS.TS Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình môn học thống kê trong hóa phân tích, ĐH

Quốc gia Hà Nội

11 Trường ĐH Dược Hà Nội (1999), Hóa Dược, Tài liệu lưu hành nội bộ cho sinh viên

trường ĐH Dược Hà Nội, NXB ĐH Dược Hà Nội

12 Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp

trong phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB Khoa học và Kĩ thuật.

13 http://updatebook.vn/nong-lam-ngu-186/nghien-cuu-qua-trinh-san-xuat-chat-khang-

sinh-penicillin-tu-vi-sinh-vat-11856/

14 http://www.impeqn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?area=58&cat=1104&ID=4

464

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

15 A. Fernandez-Gonzalez, R. Badia and M.E.Diaz-Gar (2003), “Micelle-mediated

spectrofluorinetric determination of ampicillin based on metal ion-catalysed

hydrolysis”, Analytica Chimica Acta, volume 484( isues 2), pages 239-246.

16 Althea W. McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of

antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States",

Journal Nature medicine, volume 9(issues 4), pages 424 – 430.

17 Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), “Application of capillary

zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of cephalosporins”,

Journal of Chromatography B, volume 775( isues 2), pages 239-246

18 Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008),

"Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled capillary

electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence detection", Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, volume 48(issues 4), pages 1249-

1253.

19 Daniela P. Santos, Marcio F. Bergamini and Maria Valnice B. Zanoni (2008),

“Voltammetric sensor for amoxicillin determination in human urine using

polyglutamic acid/glutaraldehyde film”, Sensors and Actuators B: Chemical,

volume 133( issues 2), pages 398-403.

20 D. Hurtaud, Deleeine B; Sanders P. (1994), “Particle beam liquid

chromatography-mas spectrometry method with negative ion chemical ionization

for the confirmation of oxacillin, cloxacillin and dicloxacillin residues in bovine

muscle”, Analyst, volume 199( issues 12), pages 2731-2736.

21 D.P. Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on

infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care Medicin,

volume 29( issues 6), pages 1101-1108

22 E. Benito-pena, A.I.Partal-Rodera, M.E.Leon-Gonzalez, M.C.Moreno-Bondi

(2005), “Evaluation of mixed mode solid phase extraction cartridges for the

preconcentration of beta-lactam antibiotics in wastewater using liquid

chromatography with UV-DAD detection”, Analytical Chimica Acta, volume

556( issues 2), pages 415-422.

23 F. Belal, M. M. El-Kerdawy, S. M. El-Ashry and D. R. El-Wasseef (2000),

"Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in

dosage forms", Il Farmaco, volume 55(issues 11-12), pages 680-686.

24 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y. (1998), “ Improvement in the Multiresidue liquid

chromatographic analysis of residues of mono and dibasic penicillins in bovine

muscle tissues”, Journal of AOAC International, volume 81( issues 6), pages

1267-1272.

25 J.O.Boison, and Keng, L.J.Y. (1998), “Multiresidue liquid chromatographic

method for determining resideues of mono and dibasic penicillins in bovine

muscle tissues”, Journal of AOAC International,volume 81( issues 6), pages

1113-1120.

26 J.M. Cha, S. Yang, K.H. Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam

antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography

combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of

Chromatography A, volume 1115(isues 1-2), pages 46-57.

27 L.Nozal,L.Arce1,A.R´ıos2,M.Valcárcel(2004),"Development of ascreening

method for analytical control of antibiotic residues by micellar electrokinetic

capillary chromatography", Journal of AnalyticaChimicaActa, volume 523

(issues 1 ), pages 21–28.

28 MILAP C. NAHATA, High performance liquid chromatographic determination

of cephalexin in human plasma, urine and saliva Journal of Chromatography,

volume 225 (issuse 2), pages 532-538

29 M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C. Cruces-Blanco, M. del Olmo Iruela

(2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental aqueous

samples using off-line and on-line preconcentration in capillary electrophoresis",

Journal of Chromatography A, volume 185(issuse 2), pages 273-280.

30 Nigel J.K Simpson (2000), Solid-phase extraction, Marcel Dekker, New York.

31 R. Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago. Press,

volume 23, pages 757-762.

32 Titus A.M. Msagati *, Mathew M. Nindi (2007), Determination of b-lactam

residues in foodstuffs of animal origin using supported liquid membrane

extraction and liquid chromatography–mass spectrometry, Food Chemistry,

volume 100 ( issues 2), pages 836 -844

33 Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam

antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line

solid phase extraction", Analytica Chimica Acta, volume 592( issues 2), pages

187–192.

34 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for the

simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using

liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, volume 119(

issues 12), pages 2595-2601.

35 David N. Heller, Michelle L. Smith, O. Alberto Chiesa (2006), LC/MS/MS

measurement of penicillin G in bovine plasma, urine, and biopsy samples taken

from kidneys of standing animals, Journal of Chromatography B, volume 830,

pages 91-99.

PHỤ LỤC Sắc đồ khảo sát nước tiểu theo quy trình 1

Sắc đồ chất phân tích khi không pha loãng ( QT1-1)

Pha loãng 5 lần( QT1-2)


Pha loãng 50 lần (QT1-5)

Sắc đồ tại điều kiện tối ưu xử lý nước tiểu theo quy trình 2

Chạy trực tiếp ( QT2-1)


Pha loãng 10 lần ( QT2-3)



Sắc đồ quy trình xử lý mẫu thuốc

Sắc đồ mẫu nước tiểu sau 12h uống thuốc

Sắc đồ mẫu nước tiểu sau khi uống thuốc 24h

phân tích beta-lactam trong mẫu dược phẩm và sinh học bằng phương pháp hplc

Documents