Phueng322

การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ

โดย นางสาวอรอษา เตยวตระกล

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชานตวทยาศาสตร แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต

วทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2559

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ

โดย นางสาวอรอษา เตยวตระกล

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชานตวทยาศาสตร แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต

วทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2559

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

DETERMINATION OF NITRITES AND NITRATES IN GUNSHOT RESIDUES BY A PAPER-BASED DEVICE

By

MISS Onusa TIAWTRAGUL

A Thesis Submitted in partial Fulfillment of Requirements for Master of Science (FORENSIC SCIENCE)

Science Silpakorn University Academic Year 2016

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

หวขอ การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ

โดย อรอษา เตยวตระกล สาขาวชา นตวทยาศาสตร แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต อาจารยทปรกษาหลก อาจารย ดร. ศรรตน ชสกลเกรยง

วทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ไดรบพจารณาอนมตใหเปนสวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต

คณบดบณฑตวทยาลย

(รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ)

พจารณาเหนชอบโดย

ประธานกรรมการ

(อาจารย ดร. ศภชย ศภลกษณนาร )

อาจารยทปรกษาหลก

(อาจารย ดร. ศรรตน ชสกลเกรยง )

ผทรงคณวฒภายนอก

(อาจารย ดร. ยภาพร สมนอย )

ง

บทคดยอภาษาไทย

57312331 : นตวทยาศาสตร แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต ค าส าคญ : ไนไตรท, ไนเตรท, เขมาดนปน, อปกรณแบบกระดาษ

นางสาว อรอษา เตยวตระกล: การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ อาจารยทปรกษาวทยานพนธ : อาจารย ดร. ศรรตน ชสกลเกรยง

งานวจยนไดสรางอปกรณแบบกระดาษและอาศยปฏกรยา Griess reaction ในการ

ตรวจวดปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปน ใชโปรแกรม ImageJ ในการอานคาสของจดทปรากฏบนอปกรณ น าขอมลคาสและปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรทและของไนเตรทมาสรางกราฟมาตรฐาน ในชวงปรมาณของไนไตรทเทากบ 0.15 - 1.80 nmol และของไนเตรทเทากบ 2.0 - 10.0 nmol เมอน าอปกรณแบบกระดาษมาใชในการวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนทเกบตวอยางจากมอผยงและจากดานในของปลอกกระสนปนทยงแลว พบวาปรมาณของไอออนไนไตรททวดไดจากอปกรณแบบกระดาษมความสมพนธกบปรมาณของไอออนไนไตรททวเคราะหไดโดยใชเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ โดยมคาสมประสทธสหสมพนธเทากบ 0.9264 ในขณะทปรมาณของไอออนไนเตรททวเคราะหไดจากทงสองวธมความสอดคลองกน ดวยคาสมประสทธสหสมพนธเทากบ 0.9490 วธการทใชอปกรณแบบกระดาษทพฒนาในงานวจยน อาจน าไปใชหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปน เพอวตถประสงคทางนตวทยาศาสตร

จ

บทคดยอภาษาองกฤษ

57312331 : Major (FORENSIC SCIENCE) Keyword : NITRITE, NITRATE, GUNSHOT RESIDUES, PAPER-BASED DEVICE

MISS Onusa TIAWTRAGUL : DETERMINATION OF NITRITES AND NITRATES IN GUNSHOT RESIDUES BY A PAPER-BASED DEVICE Thesis advisor : Sirirat Choosakoonkriang, Ph.D.

In this study, a paper-based device based on Griess reaction was fabricated and was

used to determine the amounts of nitrite and nitrate ions in gunshot residues. The ImageJ software was used to measure color values of the images of spots on the device. Calibration graphs were constructed for the color values and the amounts of standard nitrite and nitrate ions in the range of 0.15 - 1.80 nmol and 2.0 - 10.0 nmol respectively. The device was then used to analyse the nitrite and nitrate ions in gunshot residues collected from the hands of a shooter and from the inside of the fired cartridge cases. A correlation between the amounts of nitrite measured by using the paper-based device and those determined by an Ion chromatography technique was observed with a correlation coefficient of 0.9264 while the amounts of nitrate ions measured by the two methods were in good agreement with a correlation coefficient of 0.9490. The method of using the paper-based device developed in this work may be used to determine the amounts of nitrite and nitrate ions in gunshot residues for forensic purpose.

ฉ

กตตกรรมประกาศ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธ เรอง การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ ฉบบนส าเรจสมบรณไดดวยความกรณาจากอาจารย 2 ทาน ทานแรกคออาจารย ดร.ศรรตน ชสกลเกรยง อาจารยทปรกษาวทยานพนธ และอาจารย ดร.ศภชย ศภลกษณนาร ททานคอยใหความร และใหค าแนะน าตงแตการหาหวขอวทยานพนธ ตลอดจนแนวทางการแกไขปญหาในการท าการทดลอง ทงสองทานไดสละเวลาและชวยเหลออยางดยง จนกระทงวทยานพนธนมความสมบรณและส าเรจลลวงลงดวยด

นอกจากนผ วจยขอขอบคณ คณพอ คณแม ทคอยใหก าลงใจ และชวยเหลอ และขอขอบพระคณอาจารยประจ าคณะนตวทยาศาสตรทกทานทกรณาใหความรอนเปนประโยชน สดทายนขอขอบคณเพอนๆ และเจาหนาททกทานในภาควชานตวทยาศาสตร ส าหรบความชวยเหลอและความเออเฟอจนกระทงวทยานพนธนส าเรจลลวงไปดวยด

อรอษา เตยวตระกล

ช

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย ............................................................................................................................ ง

บทคดยอภาษาองกฤษ ...................................................................................................................... จ

กตตกรรมประกาศ ............................................................................................................................ ฉ

สารบญ ............................................................................................................................................. ช

สารบญตาราง .................................................................................................................................. ญ

สารบญภาพ ...................................................................................................................................... ฎ

บทท 1 บทน า .................................................................................................................................... 1

1.ความเปนมาและความส าคญของปญหา .................................................................................... 1

2.วตถประสงคของการวจย ........................................................................................................... 2

3.สมมตฐานของการวจย ............................................................................................................... 2

4.ขอบเขตของการวจย .................................................................................................................. 3

5.ความจ ากดของการวจย .............................................................................................................. 3

6. นยามศพทเฉพาะ ....................................................................................................................... 3

7. ประโยชนทจะไดรบ ................................................................................................................. 4

บทท 2 วรรณกรรมทเกยวของ ........................................................................................................... 5

1. อาวธปนและเครองกระสนปน .................................................................................................. 5

2. เขมาดนปน (Gunshot residue; GSR) ...................................................................................... 11

3. ไนไตรทและไนเตรท .............................................................................................................. 13

4. Griess assay ............................................................................................................................ 14

5. อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper-based device) .............................................................. 15

ซ

6.เทคนค Ion chromatography (IC) ............................................................................................ 16

7.งานวจยทเกยวของ ................................................................................................................... 17

บทท 3 วธด าเนนการวจย ................................................................................................................. 21

3.1 เครองมอและอปกรณทใชในการทดลอง .............................................................................. 21

3.2 สารเคมทใชในการทดลอง .................................................................................................... 26

3.3 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน ............................................................................................. 26

3.4 สารตวอยางในการทดลอง .................................................................................................... 27

3.5 การสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ................................................................................ 28

3.6 การเตรยมอปกรณแบบกระดาษเพอตรวจวด ........................................................................ 29

3.7 ศกษาการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทดวยอปกรณทไดสรางขน ................ 29

3.7.1 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเตรยมอปกรณเพอตรวจวดไนไตรทและไนเตรท ...... 29

3.7.2 ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท ......................... 31

3.7.3 ศกษาความสามารถในการท าซ า (Reproducibility) .................................................... 32

3.7.4 ศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด (Limit of detection, LOD) และขดจ ากดการหาปรมาณ (Limit of quantification, LOQ) ................................................................................. 32

3.7.5 ศกษาความเสถยรของอปกรณการตรวจวเคราะหแบบกระดาษ (Stability) ................ 32

3.8 การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยอปกรณแบบกระดาษ ............................................................................................................................... 33

3.9 การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ ........................................................................................................................... 33

3.10 ขนตอนการวเคราะหความเขมสดวยโปรแกรม ImageJ ...................................................... 34

3.11 แผนการด าเนนการวจย ....................................................................................................... 37

บทท 4 ผลการวจยและอภปราย ....................................................................................................... 38

4.1 ผลการศกษาการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทดวยอปกรณทไดสรางขน ..... 38

ฌ

4.1.1 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเตรยมอปกรณเพอตรวจวดไนไตรทและไนเตรท ...... 38

4.1.2 ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท ......................... 43

4.1.3 ศกษาความสามารถในการท าซ า (Reproducibility) .................................................... 46

4.1.4 ศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด (Limit of detection, LOD) และขดจ ากดการหาปรมาณ (Limit of quantification, LOQ) ................................................................................. 48

4.1.5 ศกษาความเสถยรของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทประดษฐขนเอง (Stability) ..... 49

4.2 ผลการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยอปกรณแบบกระดาษ ...... 52

4.3 ผลการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ ...................................................................................................................................... 54

4.4 ผลการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ ........................................................................ 60

บทท 5 สรป อภปรายผล และขอเสนอแนะ ..................................................................................... 66

5.1 สรป ...................................................................................................................................... 66

5.2 อภปรายผล ............................................................................................................................ 67

5.3 ขอเสนอแนะ ......................................................................................................................... 67

รายการอางอง .................................................................................................................................. 68

ภาคผนวก ........................................................................................................................................ 70

ภาคผนวก ก กราฟจากการศกษาการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทดวยอปกรณทไดสรางขน ........................................................................................................................... 71

ภาคผนวก ข Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนบนมอและในปลอกกระสนปน ........................................................................................................................... 74

ประวตผเขยน .................................................................................................................................. 80

ญ

สารบญตาราง หนา

ตารางท 1 เครองมอและอปกรณทใชในการทดลอง ........................................................................ 21

ตารางท 2 สารเคมทใชในการทดลอง .............................................................................................. 26

ตารางท 3 สภาวะของเครองโครมาโทกราฟ .................................................................................... 33

ตารางท 4 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของสารมาตรฐานไนไตรทบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ...................................................................................................................... 44

ตารางท 5 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของสารมาตรฐานไนเตรทบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ...................................................................................................................... 46

ตารางท 6 ผลการศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรท ........... 47

ตารางท 7 ผลการศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนเตรท ............ 47

ตารางท 8 ผลการศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด และขดจ ากดการหาปรมาณของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท ....................................................................................................... 48

ตารางท 9 ปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ .............. 53

ตารางท 10 แสดงคาเฉลยพนทใตพคของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท ................................ 55

ตารางท 11 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ .................................................................................................. 57

ตารางท 12 พนทใตพคของสารละลายมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM ......................... 58

ตารางท 13 ปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนทไดจากเครองโครมาโทกราฟ .... 59

ตารางท 14 ปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ .................................................................................................. 60

ตารางท 15 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของปรมาณไนไตรททไดจากการเปรยบเทยบทงสองวธ (9 ตวอยาง) .................................................................................................. 64

ตารางท 16 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของปรมาณไนเตรททไดจากการเปรยบเทยบทงสองวธ ..................................................................................................................... 65

ฎ

สารบญภาพ หนา

ภาพท 1 สวนประกอบของปน a.อาวธปนพกอตโนมต (Semiautomatic pistol) b.อาวธปนลกโม (Revolver) ......................................................................................................................................... 7

ภาพท 2 สวนประกอบของกระสนปน .............................................................................................. 8

ภาพท 3 ลกกระสนปนชนดตางๆ ...................................................................................................... 9

ภาพท 4 ปลอกกระสนปนชนดตางๆ ................................................................................................. 9

ภาพท 5 สวนส าคญของ Primer cap ................................................................................................ 11

ภาพท 6 โครงสรางทางเคมของไนไตรท ......................................................................................... 13

ภาพท 7 โครงสรางทางเคมของไนเตรท .......................................................................................... 14

ภาพท 8 Resonance structures ของไนเตรท .................................................................................... 14

ภาพท 9 ปฏกรยา Griess reaction .................................................................................................... 15

ภาพท 10 สวนประกอบของเครอง Ion chromatography ................................................................. 17

ภาพท 11 การเตรยมกระดาษกรองและแผนพลาสตกเคลอบบตร ................................................... 18

ภาพท 12 ขนตอนการสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ .............................................................. 19

ภาพท 13 a) แผนภาพแบบ 2 มต b) แผนภาพแบบ 3 มต ของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ .......... 20

ภาพท 14 ขนตอนการสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ .............................................................. 28

ภาพท 15 แสดงโปรแกรม ImageJ ................................................................................................... 34

ภาพท 16 แสดงการเลอกรปถายในโปรแกรม ImageJ ..................................................................... 35

ภาพท 17 แสดงการปรบเปนโหมด RGB ในโปรแกรม ImageJ ...................................................... 35

ภาพท 18 แสดงบรเวณทตรวจวดและการ Analyze measurement ในโปรแกรม ImageJ ................ 36

ภาพท 19 แผนผงขนตอนการท าวจย ............................................................................................... 37

ภาพท 20 อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ......................................................................................... 38

ฏ

ภาพท 21 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย NED เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนไตรทเขมขน 0 µM (B) สารละลาย Sulfanilamide ปรมาตร 10 µL (500 nmol) (C) สารละลาย Sulfanilamide ปรมาตร 11 µL (550 nmol) (D) สารละลาย Sulfanilamide ปรมาตร 12 µL (600 nmol) ................................................................................................................................. 39

ภาพท 22 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงปรมาตรสารละลาย NED เขมขน 10 mM (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนไตรทเขมขน 0 µM (B) สารละลาย NED ปรมาตร 10 µL (99.7 nmol) (C) สารละลาย NED ปรมาตร 11 µL (109.7 nmol) (D) สารละลาย NED ปรมาตร 12 µL (119.6 nmol) ................ 39

ภาพท 23 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลาย NED เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงปรมาตรสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนไตรทเขมขน 0 µM (B) สารละลายไนไตรท ปรมาตร 10 µL (1.50 nmol) (C) สารละลายไนไตรท ปรมาตร 11 µL (1.65 nmol) (D) สารละลายไนไตรท ปรมาตร 12 µL (1.80 nmol) ............................................................................................................................................... 40

ภาพท 24 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10 µL สารละลาย NED เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลายไนเตรทเขมขน 1000 µM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงความเขมขน Zinc suspension ปรมาตร 10 µL (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนเตรทเขมขน 0 µM (B) Zinc suspension เขมขน 0.075 g/mL (0.75 mg) (C) Zinc suspension เขมขน 0.1 g/mL (1 mg) (D) Zinc suspension เขมขน 0.125 g/mL (1.25 mg) ........................................................................ 41

ภาพท 25 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของ Zinc (mg) (n=4) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB ......................................................................................................................................................... 41

ภาพท 26 ความเขมสทปรากฏบนกระดาษทไดจากสารละลายไนเตรทท าปฏกรยากบ Griess reagent ทเวลาตางๆ ......................................................................................................................... 42

ฐ

ภาพท 27 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาทท าการถายภาพ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB ................................................................................................................................................ 42

ภาพท 28 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารมาตรฐานไนไตรททปรมาณ 0.15, 0.30, 0.60, 1.20 และ 1.80 nmol ลงไป ................................................................................... 43

ภาพท 29 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรท (n=3) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB............................................................................................................. 44

ภาพท 30 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารมาตรฐานไนเตรททปรมาณ 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 และ 10.0 nmol ลงไป ........................................................................................... 45

ภาพท 31 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของสารมาตรฐานไนเตรท (n=3) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB............................................................................................................. 45

ภาพท 32 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษทเกบไวทอณหภมหองโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB .... 50

ภาพท 33 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวทอณหภมหองโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB .... 50

ภาพท 34 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษทเกบไวในตเยนโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB .............. 51

ภาพท 35 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวในตเยนโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB .............. 52

ภาพท 36 Chromatogram ของสารละลายมาตรฐานผสมไนไตรทและไนเตรททความเขมขน 15 µM ......................................................................................................................................................... 55

ฑ

ภาพท 37 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาพนทใตพคกบปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรท (n=2) ................................................................................................................................................ 56

ภาพท 38 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาพนทใตพคกบปรมาณของสารมาตรฐานไนเตรท (n=2) ................................................................................................................................................ 56

ภาพท 39 Chromatogram ของสารละลายมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM .................... 57

ภาพท 40 Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ THAI ARM ขนาด 9 มม.................................................................................................................. 58

ภาพท 41 แผนภมแทงแสดงปรมาณไนไตรท ในหนวย nmol ของการวเคราะหตวอยางเขมาดนปน ดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ ............................................ 62

ภาพท 42 แผนภมแทงแสดงปรมาณไนเตรท ในหนวย nmol ของการวเคราะหตวอยางเขมาดนปน ดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ ............................................ 63

ภาพท 43 กราฟพลอตระหวางปรมาณของไนไตรททไดจากอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ กบคาจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ (9 ตวอยาง) ............................................................................... 64

ภาพท 44 กราฟพลอตระหวางปรมาณของไนเตรททไดจากอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ กบคาจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ ......................................................................................................... 65

1

บทท 1 บทน า

1.ความเปนมาและความส าคญของปญหา ปจจบนประเทศไทยไดมการน าเอาความรทางดานวทยาศาสตรและเทคโนโลยมา

พฒนาใชในการพสจนหลกฐานตางๆ ไมวาจะเปนการตรวจลายนวมอ การตรวจรหสพนธกรรม (DNA) เอกสาร ยาเสพตด หรออาวธปน รวมเขากบการบงคบใชกฎหมาย โดยศาลไดถอวาพยาน หลกฐานเหลานเปนพยานหลกฐานอยางหนงทจะน ามาใชในการพจารณาคดหรอน าความรทไดมาวนจฉยวาจ าเลยมความผดจรงหรอไม เนองจากสามารถใชพสจนความผดไดอยางชดเจนโดยมขอโตแยงนอยกวาพยานหลกฐานในลกษณะอน และมความนาเชอถอมาก

เขมาดนปน คอสงทเกดขนภายหลงจากการยงปน เปนสวนทหลงเหลอจากการเผาไหมของชนวนทายกระสนปนและดนสงกระสนปน ซงจะปลวไปเกาะอยทบรเวณมอ เสอผา เสนผม หรอพนผวอนๆทอยบรเวณใกลเคยง[1] สามารถแบงออกไดเปน 2 ประเภท คอ Inorganic residues ซงไดมาจาก Primer mixture ทถกเผาไหมเมอไดรบความรอนในระหวางการจดระเบดของชนวนทายกระสนปน และหลงเหลอเปนเขมาทประกอบไปดวยอนภาคของโลหะหนก ไดแก ตะกว (Pb) แอนตโมน (Sb) และแบเรยม (Ba) สามารถตรวจพสจนไดดวยเทคนค Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS)[2], Atomic absorption spectrophotometer (AAS)[3] หรอ Scanning electron microscopy (SEM) /EDX[4] และ Organic residues ทไดจากการเผาไหมของดนสงกระสนปน สามารถตรวจไดจากปรมาณไอออนไนไตรทและไนเตรท เนองจากไอออนทงสองชนดนเปนสวนประกอบทมอยในดนปน วธทใชหาปรมาณ ไดแก เทคนคทดสอบส (Color test)[5], Ion chromatography (IC)[6],[7], UV-Visible spectroscopy[8] เปนตน

อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper based device) ถกรเรมโดย Whitesides และคณะ เปนแนวทางการปฏวตส าหรบการวเคราะหทมราคาถกและรวดเรว[9] เปนอปกรณทใชวเคราะหรป แบบใหมทก าลงเปนทนยมมากในการวนจฉยทางการแพทย เนองจากเปนอปกรณทมตนทนในการผลตต า ประดษฐใชงานไดงาย อกทงกระดาษยงเปนวสดทหาซอไดทวไป นอกจากนการวเคราะหบนอปกรณกระดาษยงไมจ าเปนทจะตองใชผเชยวชาญในการวเคราะห พกพาไปใชในภาคสนามได อปกรณก าจดทงไดโดยการเผา ใชปรมาณสารตวอยางและรเอเจนตนอยในการวเคราะห สามารถสรางลวดลายบนกระดาษไดตามตองการ เหมาะส าหรบใชในประเทศก าลงพฒนาทอยหางไกลจากโรงพยาบาลหรอสถานพยาบาลและสถานทเกดภยพบตทางธรรมชาต[10] โดยเมอหยดสารละลายลงบนกระดาษ ซงเปนวสดทชอบน า (Hydrophilic) สารทหยดลงไปกจะซมและเคลอนทไปยง

2

บรเวณตรวจวด โดยสามารถควบคมทศทางการไหลของสารไดโดยการสรางบางสวนของกระดาษใหไมชอบน า (Hydrophobic) เพอเปนชองทางการไหลของสารลงบนกระดาษ[11]

ส าหรบเทคนคทใชในการสรางอปกรณการวเคราะหบนกระดาษมดวยกนหลากหลายวธแตละวธกมขอดขอเสยแตกตางกนออกไป เชน การตดกระดาษ (Paper cutting) การพมพสกรน (Screen printing) การพมพดวยขผง (Wax printing) การพมพดวยน าหมก (Inkjet printing) การพมพดวยแสง (Photolithography) การพมพดวยเครองพลอตเตอร (Plotter) การปรบสภาพดวยเลเซอร (Laser treatment) เปนตน สวนการตรวจวดอาจท าดวยการเทยบส ซงวธนเปนทนยมใชกนอยางมาก เนองจากเปนวธทงาย สามารถทจะมองไดดวยตาเปลา หรอใชกลองในการถายภาพ หรอใชเครองสแกนเนอร จากนนรปภาพจะถกวเคราะหดวยโปรแกรมตอไป[12]

จากทกลาวมาขางตน จะเหนไดวาอปกรณการวเคราะหบนกระดาษมขอดมากมายหลายขอ เปนอกทางเลอกหนงทจะน ามาประยกตใชงานในการสบสวนสอบสวนเพอหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนได เพราะเปนวธทงาย สะดวก และรวดเรว

ในงานวจยนผวจยสนใจวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปน โดยสรางอปกรณดวยวธการตดกระดาษ (Paper cutting) และตรวจวดโดยการเทยบสบนอปกรณกระดาษ แลวใชกลองมอถอในการถายภาพ กอนจะใชโปรแกรม ImageJ เพอวเคราะหหาความเขมสแลวแปลผลการทดลองตอไป 2.วตถประสงคของการวจย

2.1 เพอประดษฐอปกรณตรวจวเคราะหบนกระดาษทสามารถตรวจวดไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนเชงปรมาณได

2.2 เพอสามารถน าอปกรณตรวจวเคราะหบนกระดาษไปใชในการตรวจวดในภาค สนามได

2.3 เพอเปรยบเทยบประสทธภาพในการตรวจวดไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษกบวธมาตรฐาน 3.สมมตฐานของการวจย

3.1 อปกรณแบบกระดาษสามารถตรวจวดปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปน และใชงานในภาคสนามได

3.2 อปกรณแบบกระดาษมประสทธภาพใกลเคยงกบวธมาตรฐานในการตรวจวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรท

3

4.ขอบเขตของการวจย 4.1 ประดษฐอปกรณตรวจวเคราะหบนกระดาษเพอหาปรมาณไนไตรทและไนเตรท

ในตวอยางเขมาดนปน 4.2 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะหไตรทและไนเตรทดวย Griess assay บน

อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ สภาวะทศกษาไดแก ปรมาณ Griess reagent ปรมาณตวอยาง ปรมาณ Zinc และระยะเวลาทเหมะสมส าหรบการถายภาพ

4.3 ทดสอบประสทธภาพของวธ Griess assay บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทประดษฐขน โดยหาคาการวเคราะห ไดแก ความสามารถในการท าซ า (Reproducibility, %RSD) ขดจ ากดการตรวจวด (Limit of detection) ขดจ ากดการหาปรมาณ (Limit of quantification) และความเสถยรของอปกรณแบบกระดาษ (Stability) 5.ความจ ากดของการวจย

5.1 ใชกระดาษกรอง Whatman เบอร 1 ในการท าอปกรณแบบกระดาษ 5.2 ท าการถายภาพดวยกลองโทรศพทมอถอยหอ iPhone รน 5 ภายใตหลอดไฟฟลออ

เรสเซนตทต าแหนงเดมทกครง ใหระยะหางระหวางอปกรณกบกลองเทากบ 20 เซนตเมตร 6. นยามศพทเฉพาะ

6.1 Griss assay คอ การทดสอบทางเคมเชงวเคราะห โดยใช Sulfanilamide และ N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI (NED) ภายใตสภาวะกรด ตรวจจบไอออนไนไตรทในสาร ละลาย

6.2 เขมาดนปน คอ สงทเกดขนหลงจากยงปน เปนสวนทเหลอหลงการเผาไหมของดนสงกระสนปนหรอดนควนนอยทอยในปลอกกระสนปนออกมาสบรเวณรอบๆ ประกอบดวยไอออนของไนไตรทและไนเตรท

6.3 อปกรณตรวจวเคราะหบนกระดาษ คอ อปกรณทสรางชองไหลของสารบนกระดาษ โดยจะสรางสวนทชอบน า (Hydrophilic) จากการเจาะกระดาษกรอง Whatman เบอร 1 ใหมเสนผานศนยกลาง 5 mm และสวนทไมชอบน า (Hydrophobic) จากแผนพลาสตกใสทซอนทบกน 4 ชน โดยใชเทปกาวสองหนาเปนตวยด จากนนเจาะรใหมขนาดเสนผานศนยกลาง 5 mm ดานหลงของอปกรณจะถกปดทบดวยเทปใส สวนดานบนถกปดดวยสตกเกอรใสทเจาะชองไวส าหรบหยดตวอยางขนาดเสนผานศนยกลาง 3 mm

4

7. ประโยชนทจะไดรบ 7.1 อปกรณตรวจวเคราะหบนกระดาษสามารถหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทใน

เขมาดนปนได 7.2 สามารถน าเอาอปกรณตรวจวเคราะหบนกระดาษไปใชงานในภาคสนามได 7.3 เพอเปนแนวทางและทางเลอกหนง ใหเจาหนาทใชในการสบสวนสอบสวนคดท

เกยวของกบอาวธปน

5

บทท 2 วรรณกรรมทเกยวของ

ในการวจยครงนไดศกษาคนควาเอกสารและงานวจยตางๆ รวมทงทฤษฎทเกยวของ เพอใชประกอบการศกษางานวจยทเกยวของในหวขอ การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ ตามล าดบดงน

1. อาวธปนและเครองกระสนปน 2. เขมาดนปน (Gunshot residue; GSR) 3. ไนไตรทและไนเตรท 4. Griess assay 5. อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper based device) 6. เทคนค Ion chromatography 7. งานวจยทเกยวของ

1. อาวธปนและเครองกระสนปน 1.1. อาวธปน พนต ารวจโทหญงธรรมภรณ[13] ไดกลาวถงอาวธปนและเครองกระสนปนไวดงน ตามความในมาตรา 4 (1),(2) แหงพระราชบญญตอาวธปน เครองกระสนปน วตถ

ระเบด ดอกไมเพลง และสงทเทยมอาวธปน พ.ศ. 2490 แกไขเพมเตมโดยมาตรา 3 แหงพระราช บญญตอาวธปนฯ (ฉบบท 3) พ.ศ. 2501 ไดบญญตอาวธปนไวดงน

“อาวธปน” หมายความรวมตลอดถงอาวธทกชนดซงใชเครองสงกระสนโดยวธระเบดหรอก าลงแรงดนของแกสหรออดลม หรอเครองกลไกอยางใดซงตองอาศยอ านาจของพลงงานโดยสวนใดสวนหนงของอาวธนนๆ ซงรฐมนตรเหนวาส าคญและไดระบไวในกฎกระทรวง

“เครองกระสนปน” หมายความรวมตลอดถงกระสนโดด กระสนปลาย กระสนแตก ลกระเบด ตอรปโด ทนระเบด และจรวด ทงชนดทมและไมมกรดแกส เชอเพลง เชอโรค ไอพษ หมอก หรอควน หรอกระสน ลกระเบด ตอรปโด ทนระเบด และจรวด ทมคณสมบตคลายคลงกน หรอ เครอง หรอสงส าหรบอดหรอท า หรอใชประกอบเครองกระสนปน

ตามกฎกระทรวงฉบบท 3 (พ.ศ.2491) ออกตามความในพระราชบญญตอาวธปนฯ พ.ศ.2490 ไดก าหนดในกฎขอ 1 ไววา สวนของอาวธปนทมความส าคญใหถอเปนอาวธปน ตามความในมาตรา 4(1) คอ

6

1. ล ากลอง 2. เครองลกเลอน หรอสวนประกอบส าคญของเครองลกเลอน 3. เครองลนไก หรอสวนประกอบส าคญของเครองลนไก 4. เครองสงกระสน ซองกระสนปน หรอสวนประกอบส าคญของสงเหลาน

1.2 ประเภทของอาวธปน ปนสน หรอ ปนพก (Pistol) แบงเปน 2 ชนด ไดแก 1.2.1 อาวธปนลกโม (Revolver) เปนอาวธปนพกแบบ Multiple chambers มกลไกการ

ใชรงเพลงแบบหมน (Cylinder) โดยการหมนมทศทางทงตามหรอทวนเขมนาฬกาขนอยกบผผลต มรงเพลงอย 5-10 ชอง ในแตละชองบรรจกระสนไดเพยงหนงนด ซงรงเพลงชองบนสดทใชสงกระสนปนอยในต าแหนงตรงกบทายล ากลองปนและเขมแทงชนวน ล ากลองสนสะดวกตอการพกพา แตมน าหนกมากและการใชงานไมสะดวก

กลไกการท างานของปนลกโม (Revolver) สามารถยงไดทงทขนนกกอน (Single action) หรอไมขนนกกอน (Double action) การขนนกจะหมนลกโมน ากระสนลกใหมมาเตรยมพรอมในรงเพลง เมอเหนยวไก นกจะสบลงมาททายปลอกกระสน การยงลกษณะนจะเบาและมความแมนย ากวาการเหนยวไกโดยไมขนนก รองรอยทนกสบลงททายกระสนปนจะมลกษณะแตกตางกนไปแตละกระบอกของปน จงใชเปรยบเทยบหาอาวธทใชยงได สวนการเหนยวไกโดยไมขนนกกอนนน จงหวะแรกของการเหนยวไกจะเปนการขนนกและหมนลกโม จงหวะทสองจงจะเปนการสบไก ถาลกโมปนไมหมน นกจะไมสามารถถกงางได

ปนลกโมเวลายงปนนกสบจะท างานสองจงหวะคอ จงหวะแรกนกสบทอยชดโครงปนตองงางถอยหลงออกมาจนสด จงหวะทสองคอ นกสบดดกลบไปชดโครงปน ท าใหเขมแทงชนวนชนกบจานทายกระสนเพอจดระเบดดนปนสงผลใหกระสนถกสงออกไป ปน Single action หมายถงตองงางนกสบถอยหลงกอนจงจะเหนยวไก เพอปลอยใหนกสบดดกลบไปชนจานทายกระสน ถาไมงางนกสบกอนกจะยงไมได สวนปน Double action สามารถเหนยวไกไดในขณะทนกสบอยชดโครงปน ชวงทเหนยวไกอยนนนกสบจะท างานทงสองจงหวะ โดยถอยหลงออกมาจนถงระยะหนงกจะดดตวกลบไปชนจานทายกระสน ท าใหลกปนถกสงออกไป ปนลกโมสมยใหมสวนใหญสามารถยงไดทงสองแบบ แตปนกงอตโนมตสวนใหญเปน Single action

1.2.2 อาวธปนพกอตโนมต (Semiautomatic pistol) เปนอาวธปนแบบ Auto-loader หรอ Self-loader ทบรรจลกกระสนปนไดหลายนดตอครง และมกลไกส าหรบขนล ากระสนไวในรงเพลงและคดปลอกกระสนปนเองได โดยยงไดทละนด หลายครงตอการยงหนงชดดวยล ากลองเดยว (Multiple-shot) มลกษณะตางไปจากอาวธปนลกโม คอ ใชรงเพลงเดยวแบบ (Single fixed firing

7

chamber) โดยวางกลไกและล ากลองปนไวภายในตวอาวธปน มซองกระสนปน (Magazine) ทถอดได (Detachable magazine) ส าหรบบรรจและสงกระสนปนเพอขนล าในรงเพลง โดยดามปน (Grip) มลกษณะกลวงเปนสวนในการยดจบซองกระสนปนไว

กลไกการท างานของปนพกกงอตโนมต กระสนของปนพกอตโนมตจะถกจดเรยงไวในซองกระสนปน (Magazine) ซงจะสงลกปนเขารงเพลงหลงการยง และปลอกกระสนทยงแลวตองถกผลกดนออกไปนอกรงเพลงทกครงหลงการยง ซงจะท าการคดปลอกกระสนและสงกระสนลกตอไปเขาสรงเพลงนจะเปนไปโดยอตโนมต และสามารถยงตอไปไดแตตองเหนยวไกซ า ยงไมมผผลตปนพกกงอตโนมตใหเปนอตโนมตเตมตวคอเหนยวไกครงเดยวสามารถปลอยกระสนตอ เนองจนหมดซองกระสนปน การคดปลอกกระสนโดยการเกยวและดดออกไปนจะท าใหเกดรอง รอยบนปลอกกระสน สามารถตรวจหาล ากลองปนไดดวย แตในการยงนดแรกผใชตองขนล าโดยเลอนครอบล ากลองไปดานหลง เพอใหกระสนปนลกแรกเขาไปอยในรงเพลงและเปนการขนนกไปดวย เมอกระสนอยในรงเพลงแลวกสามารถยงและมการคดปลอกกระสนตามมา เมอขนล าในนดแรก แลวผใชอาวธอาจจะลดนกโดยไมใหมการกระแทกกบทายปลอกกระสน ท าใหพรอมทจะยงไดโดยไมตองขนล าอก และการยงกสามารถท าแบบขนนกกอน (Single action) และไมขนนกกอน (Double action) กได

ภาพท 1 สวนประกอบของปน a.อาวธปนพกอตโนมต (Semiautomatic pistol) b.อาวธปนลกโม (Revolver) ทมา : NATIONAL RIFLE ASSOCIATION. NRA Pistol Courses Offered 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: http://www.bigtexastraining.com/nra-pistol-training.html

a.

b.

8

1.3 ประเภทของกระสนปน แบงได 3 ประเภท คอ 1.3.1 Pin fire cartridge ปลอกกระสนปนท าดวยกระดาษสวนทายเปนทองเหลองและม

เขมแทงชนวนโผลออกมาดานขางปลอกกระสน สวนปลายอกดานหนงวางอยบนแกปปน 1.3.2 Rim fire cartridge กระสนประเภทนจะมแกปอยบรเวณทขอบจานทายกระสน

ปน เมอยงเขมแทงชนวนของปนจะตองตบรเวณดานขางของปลอก จงจะเกดการระเบดขน 1.3.3 Center fire cartridge เปนกระสนทปจจบนนยมใช จะมแกปปนอยตรงบรเวณ

กงกลางจานทายกระสนปน มความปลอดภยสงและกระสนปนมอายการเกบรกษาไดนาน 1.4 สวนประกอบของกระสนปน โดยทวไปมสวนประกอบทส าคญ 4 สวน คอ

1. ลกกระสนปน (Bullet) 2. ปลอกกระสนปน (Cartridge case) 3. ดนสงกระสนปน (Gun powder) 4. แกป (Primer cap)

ภาพท 2 สวนประกอบของกระสนปน ทมา : Sittidet Chooduang. สวนประกอบของกระสนปน. 2554 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: http://sittinfo.blogspot.com/2011/12/blog-post.html.

9

1.4.1 ลกกระสนปน (Bullet) คอ สวนโลหะทรงกระบอกทอยปลายสดของกระสนปน เปนสวนทจะวงไปกระแทกกบเปาหมาย มหลากหลายแบบตามการใชงาน

ภาพท 3 ลกกระสนปนชนดตางๆ ทมา : Keyword Suggest Encyclopedia. Image Gallery: Handgun 38 Vs 380. 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: http://keywordsuggest.org/gallery/1327789.html.

1.4.2 ปลอกกระสนปน (Cartridge case) ในกระสนปน 1 นดจะรวมเอาลกกระสนปน ดนปน และแกปปนไวดวยกน และในการท าปลอกกระสนปนนยมใชทองเหลอง เพราะมราคาถก น ากลบมาใชใหมไดโดยน าไปอดกระสนปนยงใหมไดอกประมาณ 3-4 ครง และขนาดของปลอกกระสนสามารถใชคาดคะเนความแรงของกระสนปนได

ภาพท 4 ปลอกกระสนปนชนดตางๆ ทมา : เวบบอรดสนทนาภาษาปน. กระสน reload 2011 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: http://www.gunsandgames.com/smf/index.php?topic=96000.0.

9mm .40SW .45ACP

10

1.4.3 ดนสงกระสนปน (Gun powder) มลกษณะเปนผงสด า ซงเมอเกดการลกไหมในชวงเวลาอนสนจะใหแกสออกมาปรมาณมาก ปจจบนม 3 แบบ คอ

1.4.3.1 ดนด า (Black powder) เปนดนปนชนดแรกทชาวยโรปพบในประเทศจน ซงในขณะนนชาวจนใชดนด าท าประทดและพลเพอจดในงานฉลองตาง ๆ โดยสวนประกอบของดนด า ประกอบดวย ดนประสว (Potassiam nitrate) ถานไม (Charcoal) และก ามะถน (Sulphur) ซงเมอเรมแรกนน อตราสวนผสมของสาร 3 ชนดน มหลายแบบ แตอตราสวนมาตรฐานของดนด าในปจจบนทถอวาเปนอตราสวนโดยน าหนกทใหแรงระเบดสงสด คอ ดนประสว 75% ถานไม 15% และก ามะถน 10% ซงดนด านนไวตอประกายไฟมาก

1.4.3.2 ดนด าแบบใหม (Pyrodex) ดนปนชนดนมสวนผสมหลกเหมอนกบดนด า คอ มดนประสว ถานไม และก ามะถน แตมอตราสวนแตกตางกบดนด า นอกจากนยงมสวนผสมอนเขามาอก คอ Sodiumbenzoate, Potassiumpercholrate, Dicyandiamide (1-Cyanoguani- dine) และยงม Dextrine, Wax และ Graphite จ านวนเลกนอยผสมอย Pyrodex ทยงไมไดใชยงจะเหนความแตกตางจากดนด าอยางชดเจน เพราะ Pyrodex เปนเมดสเทา และมบางสวนโปรงแสง นอกจากนยงตดไฟยากกวาดนด า ส าหรบ Pyrodex ทยงแลว สามารถตรวจหาสารประกอบทนอกเหนอจากดนด าไดหลายวธ

1.4.3.3 ดนควนนอย (Smokeless powder) การพฒนาดนควนนอยนน เกดขนพรอมๆ กบการคนพบ Nitroglycerine, Guncotton และ Dynamite โดยในป ค.ศ.1846 Ascaio Sobrero ชาวอตาล ไดคนพบ Nitroglycerine หรอ Glyceryl nitrate ในป ค.ศ. 1845 Christian Schoenbein ชาวสวสเปนผคนพบ Guncotton ตอมาในป ค.ศ.1867 Alfred Nobel ชาวสวเดน ไดคนพบ Dynamite แตทง 3 ตวนลวนเปนวตถระเบดไมสามารถน ามาใชเปนดนปนไดท าใหมการศกษาหาวธท าดนปนแบบใหมขนมา เพอใหมประสทธภาพดกวาดนด าและสามารถควบคมอตราการเผาไหมได

1.4.4 แกปปน (Primer cap) ท าหนาทเปนตวจดระเบดใหเกดประกายไฟไปตดกบดนปน เพอผลกดนลกกระสนปนใหออกจากล ากลอง อยตรงบรเวณจานทายของปลอกกระสน เมอเวลายงปนเขมแทงชนวนจะไปชนตรงจานทายของปลอกกระสน ท าใหแกปเกดการระเบด และจดระเบดใหเกดเปลวไฟลกไหมไปยงดนปนทอยภายในปลอกกระสน เมอดนปนเกดการลกไหมกจะขบดนหวกระสนใหหลดออกจากล ากลองปน ซงกระสนปนแบบ Center fire ยกเวนของกระสนปนลกซอง จะม Primer cap อย 2 แบบ คอ

1.4.4.1 Standard ใชกบกระสนปนพกขนาดเลก ตว Primer cap มขนาดเสนผานศนยกลาง 0.175 นว

11

1.4.4.2 Magnum ใชกบกระสนปนพกขนาดใหญ และกระสนปนไรเฟล ตว Primer cap มขนาดเสนผานศนยกลาง 0.210 นว

Primer cap จะมสวนประกอบส าคญอย 3 สวน คอ ก. Primer cap ท าดวยโลหะทองแดง ทองเหลอง หรอทองเหลองชบนเกล ท าหนาท

เปนตวบรรจ Primimg mixture ข. Primimg mixture เปนวตถระเบดประเภทกระทบแตก ท าหนาทเปนตวใหประกาย

ไฟจดดนปน ค. Anvil เปนโลหะแขง ท าหนาทเปนตวรบการกระแทกของเขมแทงชนวน เพอท าให

Primimg mixture ทอยระหวางกลางเกดการระเบดขน

ภาพท 5 สวนส าคญของ Primer cap ทมา : Martin Kavanagh. PRIMERS .. Small Rifle & 'Small Pistol Magnum' - What's the Diff? 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: https://flicense.blogspot.com/2016/08/.

2. เขมาดนปน (Gunshot residue; GSR) พนต ารวจโทหญงธรรมภรณ[13] ไดกลาวถงเขมาดนปนไวดงน 2.1 ความหมายของเขมาดนปน เขมาดนปน คอ สงทเกดขนหลงจากยงปน เปนสวนทเหลอหลงการเผาไหมของดนสง

กระสนปนทอยในปลอกกระสนปนออกมาสบรเวณรอบๆ

12

2.2 การเกดเขมาดนปน เขมาดนปนเกดจาก เมอมการลนไกปนเกดขน เขมแทงชนวนจะไปชนทชนวนทาย

กระสนปน(Primer cap) ซงจะท าใหแกปปนทอยตรงชนวนทายกระสนปนนน เกดการจดชนวนมประกายไฟเกดขนแลวไปเผาไหมดนสงกระสนปนซงเปนดนควนนอย (Smokeless powder) ทบรรจอยขางในปลอกกระสนปน เกดการลกไหมและใหแกสปรมาณมากออกมาอยางทนท ในชวงเวลาอนรวดเรว แกสทเกดขนนนจะขยายตวท าใหเกดความดนสง หรอทเรยกวาเกดการจดระเบด ท าใหลกกระสนปนสามารถพงออกไปจากปากล ากลองปนเพอชนกบเปาหมายได นอกจากนแรงระเบดทเกดขนจะผลกดนใหไอของอนภาคสารตาง ๆ ทถกความรอนเผาไหมนน กระจายออกจากภายในอาวธปนออกมาสบรเวณรอบๆ ตามบรเวณชองวางตาง ๆ ของอาวธปน ซงไออนภาคสารเหลานเมอออกมาสบรเวณภายนอกทมความรอนนอยกวากจะควบแนนลงมา แลวปลวไปเกาะตดอยทบรเวณมอ เสอผา เสนผม และพนผวอน ๆ ทอยบรเวณใกลเคยง ซงปรมาณความมากนอยของอนภาคทจะปลวมาเกาะนน ขนอยกบปจจยหลายอยาง เชน ประเภท ขนาด และลกษณะของอาวธปนและกระสนปนทใช และสภาพแวดลอมในขณะยงปน เชน ยงปนภายในพนทปด หรอพนทโลงแจง กจะท าใหทศทางการกระจายตวของไออนภาคสารมความแตกตางกนอกดวย เปนตน

ในการยงปนนน เขมาทเกดขนจากการเผาไหมของชนวนทายกระสนปน (Primer cap) จะกอใหเกดอนภาคในปรมาณทแตกตางกนทประกอบไปดวย ตะกว (Pb) แบเรยม (Ba) และแอนตโมน (Sb) นอกจากอนภาคเหลานแลวกจะมอนภาคอนอกหลายชนดทเปนสวนผสมอยขางในกระ สนปนดวย เมอเขมแทงชนวนกระทบทชนวนทายกระสนปน (Primer cap) จะท าใหเกดการระเบดและเผาไหมขนอยางฉบพลน จากอณหภมนจะท าใหโลหะทเปนสวนประกอบของแกปปนกลาย เปนไอ เมออณหภมลดลงไอของแตละธาตจะแขงตวเปนอนภาค จากการทมความดนสงขนนนในกรณปนพกรวอลเวอร จะมชองวาง (Physical gap) ระหวางผวหนาของรงเพลงและสวนทายของล ากลอง (ไมเชนนนลกโมปนจะหมนไมสะดวก) ดงนนกจะมการรวของ Propellant gas ทจดนเมอมการยงชองวางนจะแคบทสดถง 0.0015 นว และกวางทสดถง 0.006 นว สวนกรณปนพกออโตเมตก เขมาปนจะออกมาทาง Ejection port และเมอ Slide ถอยหลงกจะน าเขมาปนออกมาดวย ท าใหตดบรเวณระหวางนวหวแมมอกบนวชเปนจ านวนมาก สวนเขมาปนทพนออกมาทางปากกระบอกปนนน กมผลทจะปลวไปตดทมอไดอยแลว

สวนสารประกอบไนไตรทนนจะเกดขนเมอสวนประกอบส าคญของดนปนไมวาจะเปนดนด า ดนควนนอย หรอดนระเบดบางตว เกดการเผาไหม (Decomposition) แลวสงทเหลอบางสวนคอสารประกอบไนไตรทและไนเตรท ซงจะยงคงอยทล ากลองปนและตดทเสอผาของผเสยหายและผตองสงสย

13

2.3 ประเภทของเขมาปน แบงตามคณสมบตของเขมาปนได 2 ประเภท คอ 2.3.1 Organic gunshot residues (O-GSR) เปนเขมาปนทเกดจากการเผาไหมของดนสงกระสนปน (Propellant discharge residue)

เทคนคการตรวจวเคราะหอนทรยสารจากเขมาปน มพฒนาการเรอยๆ โดยเดมใชการตรวจหาไนไตรทและไนเตรททเกดจากการเผาไหมของดนสงกระสนปนชนดดนปน โดยใช Dermal nitrate test แตในปจจบนนยมใชดนสงกระสนปนชนดดนควนนอย

2.3.2 Inorganic gunshot residues (I-GSR) เปนเขมาปนประเภทอนนทรยสารทเปนผลจากการลกไหมของ Primer mixture

ระหวางการจดระเบดของชนวนทายกระสนปน (Primer discharge residue) เกดเปนการตกคางของเขมาทประกอบไปดวยอนภาคของโลหะตะกว (Pb) แอนตโมน (Sb) และแบเรยม (Ba)

3. ไนไตรทและไนเตรท

3.1 ไนไตรท

ภาพท 6 โครงสรางทางเคมของไนไตรท ทมา : Wikipedia. Nitrite. 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/ Nitrite.

ไนไตรท มสตรเอมไพรกลป ดงน NO2- เปนวตถเจอปนอาหาร (Food additive) นยมใช

ในรปของเกลอโซเดยมไนไตรท(Sodium nitrite) และโพแทสเซยมไนไตรท ไนไตรทจะถกรดวซมาจาก เกลอไนเตรท (Nitrate, NO3

-) เชน เกลอโซเดยมไนเตรท และโพแทสเซยมไนเตรท (ดนประสว) และเปนเขมาปนชนดอนทรยสาร ทเกดจากการเผาไหมของดนสงกระสนปนชนดดนควนนอย

14

3.2 ไนเตรท

ภาพท 7 โครงสรางทางเคมของไนเตรท ทมา : Wikipedia. Nitrate. 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/ Nitrate.

ไนเตรท เปนพอลอะตอมกไอออน (Polyatomic ion) ซงมสตรเอมไพรกลป ดงน NO3−

มโครงสรางเปนสามเหลยมแบนราบ (Trigonal planar-โดยแตละออรบทลท ามมกน 120 องศา) และสามารถแทนดวยลกผสม (Hybrid) ดงภาพท 8 และเปนไอออนทเกดจากดนสงกระสนปนชนดดนควนนอยทมการเผาไหมเกดขน จดเปนเขมาปนชนดอนทรยสาร

ภาพท 8 Resonance structures ของไนเตรท ทมา : Wikipedia. Nitrate. 20 พฤษภาคม 2560]; Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/ Nitrate..

4. Griess assay ปฏกรยา Griess reaction เปนปฏกรยาทใชกนมาตงแตป 1879 เปนปฏกรยาการเกดสท

ไดรบความนยมมาก เนองจากเปนปฏกรยาทงาย จงถกน ามาใชกนอยางกวางขวาง ในการวเคราะหตวอยางทางชววทยามากมาย เชน พลาสมา (ซรม) ปสสาวะ น าในไขสนหลง และน าลาย[14] เปนปฏกรยาส าหรบใชตรวจจบไอออนไนไตรท โดย Sulfanilamide จะท าปฏกรยาไดอะโซไทเทชนกบไอออนไนไตรทในสารละลายกรด กลายเปน Diazonium salt จากนนเกดปฏกรยารวมตวกบ N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI ไดสารประกอบ Azo dye สแดงมวง สามารถดดกลนแสงไดทความยาวคลน 540 nm สวนไอออนไนเตรทไมสามารถตรวจวดไดโดยวธ Griess assay จะตองถก

15

รดวซใหกลายเปนไอออนไนไตรทกอน โดยใช Zinc หรอ Copperized Cd กอนเกดปฏกรยาดงกลาว[9]

ภาพท 9 ปฏกรยา Griess reaction ทมา : SIGMA – ALDRICH, Nitrite/Nitrate Assay Kit, colorimetric.

5. อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper-based device) กระดาษกรอง (Filter paper) คอ กระดาษทมคณสมบตในการคดเลอกอนภาคหรอ

สงเจอปนออกจากสารละลายหรออากาศโดยการวางแบบตงฉากกบทศทางการไหลของสารละลายทตองการกรอง กระดาษกรองจะมขนาดของชองวางแตกตางกนไปหลายขนาดดวยกน การเลอกใชขนอยกบลกษณะงานแตละชนด คณสมบตทส าคญของกระดาษกรองประกอบดวย ความคงทนเมอเปยก ขนาดของชองวาง ความสามารถในการกรองอนภาค อตราการไหลของสารทตองการกรอง ประสทธภาพและความจ กลไกทส าคญในการกรองดวยกระดาษกรองจะมอย 2 ลกษณะ คอ ปรมาตร(Volume) และผว(Surface) โดยแบบปรมาตร อนภาคจะถกดกไวชนในหรอในตวของกระดาษกรอง สวนแบบผว อนภาคจะถกดกไวทผวของกระดาษกรอง ดวยคณสมบตเหลาน จงไดมผน ามาใชท าเปนอปกรณส าหรบตรวจวด

อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper based device) เปนอปกรณทใชวเคราะหรปแบบใหมทก าลงเปนทนยมมากในการวนจฉยทางการแพทย เนองจากเปนอปกรณทมตนทนในการผลตต า ประดษฐใชงานไดงาย อกทงกระดาษยงเปนวสดทหาซอไดทวไป นอกจากนการวเคราะหบนอปกรณกระดาษยงไมจ าเปนทจะตองใชผเชยวชาญในการวเคราะห พกพาไปใชในภาคสนามได อปกรณก าจดทงไดโดยการเผา สามารถสรางลวดลายบนกระดาษไดตามตองการ เหมาะส าหรบใชในประเทศก าลงพฒนาทอยหางไกลจากโรงพยาบาลหรอสถานพยาบาล และสถานทเกดภยพบตทางธรรมชาต[10]

16

อปกรณตรวจวดแบบกระดาษถกรเรมโดย Whitesides และคณะ เปนแนวทางการปฏวตส าหรบการวเคราะหทไมแพงและรวดเรว[9] โดยเมอหยดสารละลายลงบนกระดาษ ซงเปนวสดทชอบน า (Hydrophilic) สารทหยดลงไปกจะซมและเคลอนทไปยงบรเวณตรวจวด โดยสามารถควบคมทศทางการไหลของสารไดโดยการสรางบางสวนของกระดาษใหไมชอบน า (Hydrophobic) เพอเปนชองทางการไหลของสารลงบนกระดาษ[11]

ปจจบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถสรางสวนทไมชอบน าใหมลวดลายไดดวยเทคนคตาง ๆ เชนการตดกระดาษ (Paper cutting) การพมพสกรน (Screen printing) การพมพดวยขผง (Wax printing) การพมพดวยน าหมก (Inkjet printing) การพมพดวยแสง (Photolitho- graphy) การพมพดวยเครองพลอตเตอร (Plotter) การปรบสภาพดวยเลเซอร (Laser treatment) เปนตน สวนการตรวจวดอาจท าดวยการเทยบส ซงวธนเปนทนยมใชกนอยางมาก เนองจากเปนวธทงาย สามารถทจะมองไดดวยตาเปลา หรอใชกลองในการถายภาพ หรอใชเครองสแกนเนอร จากนนรปภาพจะถกวเคราะหดวยโปรแกรมตอไป[12]

6.เทคนค Ion chromatography (IC) เทคนคของการท างานของเครอง IC อาศยการแลกเปลยนไอออน (Ion exchange) โดย

สมบตของสารทอยภายในคอลมน (Stationary phase) สามารถจบกบไอออนของสารทมประจตรง กนขามโดยอาศยการท าปฏกรยายดเหนยวระหวางประจทแตกตางกน (Ionic interaction) สารทไมมประจหรอมประจเหมอนกบสารทเปนตวแลกเปลยนประจทอยภายในคอลมน (Ion-exchanger) จะเคลอนทออกมากอน สวนสารทถกยดเหนยวอยภายในคอลมน จะถกชะออกมาเมอมการเปลยนสภาวะของคา pH หรอ ถกแทนทดวยไอออนทมความแรงมากกวา (Ionic strength) การวเคราะหหาปรมาณของไอออนทงประจบวก หรอ ประจลบ โดยใชเครอง IC นน ตองพจารณาถงการเลอกสารทชะละลาย (Eluent) ประเภทของคอลมน (Column) อปกรณส าหรบแยกชนดประจ (Suppressor) และอปกรณตรวจวดสญญาณ (Detector) ใหเหมาะสม ใชส าหรบวเคราะหไอออนประจบวก (Cation) เชน Ca2+, Mg2+, Na+ และไอออนประจลบ (Anion) เชน F-, Cl-, Br-, NO3

2- และ SO42- เปน

ตน[15]

17

ภาพท 10 สวนประกอบของเครอง Ion chromatography ทมา : Moustafa, M.Y. and E.R. Morsi. Ion Exchange Chromatography - An Overview. 5 กรกฎาคม 2560]; Available from: https://www.intechopen.com/books/column-chromatography/ion-exchange-chromatography-an-overview. 7.งานวจยทเกยวของ

รอยต ารวจเอกปยะชย มนคง[16] ไดศกษาการวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไน เตรทบนมอของผยงปน โดยท าการเกบตวอยางบรเวณหลงมอขวาและบรเวณหลงมอซาย ตรวจวเคราะหดวยเทคนค Ion chromatography พบวาปรมาณไนไตรททพบจากการยงปนนนเกดจากการยงอาวธปน เพราะหากมอนนไมไดผานการยงมากอนจะพบจ านวนไนไตรททคอนขางต า ผลการศกษาหาระยะเวลาการคงอยของปรมาณไนไตรทและไนเตรทภายหลงการยงปนจ านวน 3 นด/ครง ในแตละชนดของปน โดยท าการเกบ 2 ครง คอ เกบทนทหลงการยงและเกบภายใน 6 ชวโมง หลงจากยงปน พบวาปนรวอลเวอรจะมคาเฉลยไนไตรทและไนเตรทระหวางหลงมอขวาและซายในปรมาณใกลเคยงกน สวนอาวธปนกงอตโนมตจะมคาเฉลยปรมาณไนไตรทและไนเตรทขางขวามากกวาขางซายอยางชดเจน โดยปรมาณไนไตรทและไนเตรทจะลดลงตามระยะเวลาทเพมขน

นายนเรศ โกฏทอง[17] ศกษาหาระยะเวลาการคงอยของอนภาคเขมาปนทสะสมตดอยบรเวณเสนผมของผยงและเสนผมทตดอยบนเปายง (เสมอนเปนเสนผมของผถกยง) ภายในหองปด ท าการยงดวยอาวธปนกงอตโนมต จากนนท าการวเคราะหหาปรมาณไนเตรทและไนไตรทโดยอาศยปฏกรยา Griess reaction การวเคราะหหาปรมาณไนเตรทในงานวจยนจะใชวธ Cadmium reduction ซงจะท าการเปลยนรปไนเตรทไปอยในรปของไนไตรทดวยการถกรดวซเมอผานคอลมนทมแคดเมยมเปนตวกลาง กอนจะท าปฏกรยากบ Griess reagent จงจะสามารถทราบปรมาณไน เตรททอยในรปไนไตรทได ส าหรบการวเคราะหหาปรมาณไนไตรทจะท าปฏกรยากบ Griess reagent ไดโดยตรงเลย หลงจากนนจงท าการตรวจวดดวยเทคนค UV-Visible spectroscopy

18

Peter S. Ellis และคณะ[18] ไดท าการตรวจวดแบบภาคสนามเพอหาปรมาณไนเตรทในน าทะเลและน ากรอยดวยระบบการไหลแบบ On-line zinc reduction โดยใช Zinc reduction column เพอเปลยนใหไนเตรทอยในรปของไนไตรท กอนจะท าปฏกรยากบ Griess reagent และหาปรมาณดวยเทคนค Spectrophotometry ทดดกลนแสงทความยาวคลน 520 nm

Samir A. Bhakta และคณะ[19] ไดใชอปกรณตรวจวดของไหลจลภาคแบบกระดาษหาปรมาณไนไตรทในน าลายโดยวธ Griess assay ตรวจวดโดยใชเครองสแกนเนอร และน าไปประมวลผลดวยโปรแกรม Adobe photoshop CS6 ค านวณหาปรมาณไนไตรทจากการอานคาความเขมสจากสมวงแดงในโปรแกรม (เมอตงคาเปนรปแบบ CMYK)

Nuria Lopez-Ruiz และคณะ[20] ใชกลองจากโทรศพทมอถอในการถายภาพเพอตรวจ วด pH และไนไตรทในน าดมพรอมๆกนบนอปกรณตรวจวดของไหลจลภาคแบบกระดาษ และถกประมวลผลโดยแอปพลเคชนจากระบบปฏบตการ Android ทตดตงลงบนโทรศพทมอถอ เพอหาคา pH และปรมาณของไนไตรททเกดขน

วมล แสงนาค[21] ท าการสรางอปกรณแบบกระดาษเพอวเคราะหฤทธตานอนมลอสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาต โดยการตดกระดาษกรอง แลวเคลอบดวยพลาสตกเคลอบบตรทมการเจาะรขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 cmไวส าหรบในการวเคราะหสาร ขอดของอปกรณนไดแก บรเวณทวเคราะหมลกษณะเปนแบบหลมท าใหสามารถกนไมใหสารละลายออกนอกพนทตรวจวดได มราคาถก วเคราะหไดพรอมๆกนทละหลายตวอยาง อปกรณมขนาดเลกและน าหนกเบาสามารถพกพาไปตรวจวดภาคสนามได

ภาพท 11 การเตรยมกระดาษกรองและแผนพลาสตกเคลอบบตร ทมา : ดดแปลงจาก วมล แสงนาค, การพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณแบบกระดาษเพอการวเคราะหแบบรผลรวดเรวของฤทธตานนอนมลอสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาต, in สาขาวชาเคมศกษา. 2558, มหาวทยาลยบรพา.

19

ภาพท 12 ขนตอนการสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ทมา : ดดแปลงจาก วมล แสงนาค, การพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณแบบกระดาษเพอการวเคราะหแบบรผลรวดเรวของฤทธตานนอนมลอสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาต, in สาขาวชาเคมศกษา. 2558, มหาวทยาลยบรพา.

Manori B. Jayawardane และคณะ[9] ไดท าการวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไน เตรทในตวอยางน าธรรมชาตและน าทผานการสงเคราะหมาแลว โดยอาศยปฏกรยา Griess reaction วเคราะหหาปรมาณไนไตรท สวนการวเคราะหหาปรมาณไนเตรทจะตองท าการรดวซดวย Zinc เพอเปลยนใหอยในรปของไนไตรทกอนจะท าปฏกรยาดงกลาว ท าการเตรยมอปกรณดวยเทคนคการพมพดวยน าหมกฉด (Inkjet printing) เพอสรางเปนชองทางการไหลของสารตวอยางไปยงบรเวณทตรวจวด จากนนตรวจวดความเขมสทเวลา 5 นาท โดยใชเครองสแกนเนอร น ารปทไดไปอานคาความเขมสดวยโปรแกรม ImageJ และเลอกใชความเขมสของสเขยวในการอานคา จากนนหาคาเฉลยของความเขมสของสเขยวทบรเวณตรวจวด แลวแปลงคาทไดเปนคา Absorbance พบวากราฟมาตรฐานของไนไตรทมความเปนเสนตรงในชวงความเขมขน 10 – 150 µM มคา R2 เทากบ 0.999 และไนเตรททความเขมขน 50 – 1000 µM มคา R2 เทากบ 1.000 ม %RSD ของไนไตรทและไนเตรท นอยวา 2.9% และ 5.6% (n ≤ 8) ตามล าดบ มขดจ ากดการตรวจวดและขดจ ากดการหาปรมาณของไนไตรท เทากบ 1.0 และ 7.8 µM ตามล าดบ สวนไนเตรท เทากบ 19 และ 48 µM ตามล าดบ จากนนศกษาความเสถยรของอปกรณโดยเกบอปกรณแบบกระดาษไวทอณหภมหอง (สมผสแสง และไมสมผสแสง) และเกบไวในตเยนอณหภม ≤ 4 °C และชองแชแขงอณหภม ≤ -20 °C โดยใสอปกรณแบบกระดาษไวในถงซปและไมใสในถงซป พบวาสามารถเกบไวไดนาน 7 วนเมอเกบไวในชองแชแขง 5 วนเมอเกบไวในตเยน 2 วนเมอเกบไวในทมดอณหภม หอง 1 วนเมอสมผสแสงทอณหภมหอง และถาเกบอปกรณใสในถงซปไวในตเยนจะสามารถเกบไดนานขนเปนสองเทา จากนนน าอปกรณแบบกระดาษมาตรวจวดไนไตรทและไนเตรททท าการ Spiked ไนไตรทและไนเตรทลงในตวอยางน าธรรมชาตและน าทผานการสงเคราะหมาแลว เทยบกบผลทไดจากเครองโครมาโทกราฟ พบวาคาทไดมคาใกลเคยงกน

20

ภาพท 13 a) แผนภาพแบบ 2 มต b) แผนภาพแบบ 3 มต ของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ทมา : ดดแปลงจาก Jayawardane, B.M., et al., Microfluidic Paper-Based Analytical Device for the Determination of Nitrite and Nitrate. ANALYTICAL CHEMISTRY, 2014. 86(15): p. 7274-7279.

21

บทท 3 วธด าเนนการวจย 3.1 เครองมอและอปกรณทใชในการทดลอง ตารางท 1 เครองมอและอปกรณทใชในการทดลอง

รปภาพ ค าอธบาย

3.1.1 เครอง Ion chromatography (IC) รน DIONEX MODEL ICS-1000 บรษท อารมกา อนเตอรเนชนแนล จ ากด

3.1.2 เครอง Ultrasonic water bath ยหอ CREST

3.1.3 เครองชง 4 ต าแหนง รน DRAGON 204 ยหอ METTLER TOLEDO

22

รปภาพ ค าอธบาย

3.1.4 ไมโครปเปต ขนาด 100 และ 200 µL ยหอ GILSON

3.1.5 ขวดเกบตวอยาง (Vial) ขนาด 3 mL

3.1.6 Beaker ขนาด 50 และ 100 mL ยหอ BOMEX

3.1.7 Volumetric flask 10, 25, 50 และ 100 mL ยหอ HERKA

23

รปภาพ ค าอธบาย

3.1.8 Graduated pipette 1 mL ยหอ DERMAGOLD และ Volumetric pipette 5 mL ยหอ WITEG

3.1.9 โทรศพทมอถอ ยหอ iPhone รน 5

3.1.10 กระบอกฉดยา (Syrlinge) ขนาด 1 cc/mL ยหอ NIPRO และ Nylon membrane filter 0.45µm ยหอ VETICLEAN

3.1.11 ส าล ตรารถพยาบาล ซอจาก 7-ELEVEN

24

รปภาพ ค าอธบาย

3.1.12 ไดรเปาผม ยหอ PHILIPS

3.1.13 นาฬกาจบเวลา ยหอ CASIO

3.1.14 ทเจาะกระดาษแบบรเดยว ขนาดเสน ผานศนยกลาง 3 mm ยหอ TENWIN และ 5 mm ยหอ TOTO

3.1.15 กระดาษกรอง Whatman เบอร 1

25

รปภาพ ค าอธบาย

3.1.16 มดคตเตอร และ กรรไกร ซอจากรานเกรยงไกร

3.1.17 ถงมอยาง ซอจากรานแกวเภสช

3.1.18 แผนพลาสตกใส ขนาด A4 ยหอ ORCA และ สตกเกอร PVC ใส ขนาด A4 ยหอ N&P ซอจากรานเกรยงไกร

3.1.19 เทปเยอกาว 2 หนา ยหอ SCOTCH และเทปใส ยหอ LOUIS TAPE ซอจากรานเกรยงไกร

26

รปภาพ ค าอธบาย

3.1.20 ถงซป ซอจากรานโจ

3.2 สารเคมทใชในการทดลอง ตารางท 2 สารเคมทใชในการทดลอง

ชอสารเคม แหลงทมา Citric acid Carlo

Potassium nitrate Carlo Sodium nitrite Carlo

Zinc dust (10 µm) Aldrich Sulphanilamide Carlo

N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI (NED) ACROS

3.3 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน 3.3.1 สารละลาย Citric acid เขมขน 330 mM ชง Citric acid 3.4673 g จากนนละลายดวย Deionize water แลวปรบปรมาตรเปน 50

mL ในขวดปรมาตร จะไดสารละลาย Citric acid เขมขน 330 mM 3.3.2 สารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ชง Sulfanilamide 0.2153 g จากนนละลายดวย Citric acid แลวปรบปรมาตรเปน 25

mL ในขวดปรมาตร จะไดสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM 3.3.3 สารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI (NED) เขมขน 10 mM ชง N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI 0.0648 g จากนนละลายดวย Deionize

water แลวปรบปรมาตรเปน 25 mL ในขวดปรมาตร จะไดสารละลาย NED เขมขน 10 mM

27

3.3.4 สารละลายมาตรฐาน Nitrite เขมขน 10 mM ชง Sodium nitrite 0.069 g จากนนละลายดวย Deionize water แลวปรบปรมาตรเปน

100 mL ในขวดปรมาตร จะไดสารละลาย Sodium nitrite เขมขน 10 mM 3.3.5 สารละลายมาตรฐาน Nitrate เขมขน 10 mM ชง Potassium nitrate 0.1011 g จากนนละลายดวย Deionize water แลวปรบปรมาตร

เปน 100 mL ในขวดปรมาตร จะไดสารละลาย Potassium nitrate เขมขน 10 mM 3.3.6 Zinc suspension เขมขน 0.1 g/mL ชง Zinc dust 0.0500 g ใสในบกเกอรขนาด 50 mL จากนนปเปต Deionize water

จ านวน 0.5 mL ใสลงไป จะได Zinc suspension เขมขน 0.1 g/mL 3.3.7 สารละลายมาตรฐานของ Nitrite เขมขน 15, 30, 60, 120 และ 180 µM ปเปตสารละลายมาตรฐาน Nitrite เขมขน 10 mM จ านวน 15, 30, 60, 120 และ 180 µL

ลงในขวดปรมาตรขนาด 10 mL แลวปรบปรมาตรดวย Deionize water จะไดสารละลาย Sodium nitrite เขมขน 15, 30, 60, 120 และ 180 µM

3.3.8 สารละลายมาตรฐานของ Nitrate เขมขน 200, 400, 600, 800 และ 1000 µM ปเปตสารละลายมาตรฐาน Nitrate เขมขน 10 mM จ านวน 200, 400, 600, 800 และ

1000 µL ลงในขวดปรมาตรขนาด 10 mL แลวปรบปรมาตรดวย Deionize water จะไดสารละลาย Potassium nitrate เขมขน 200, 400, 600, 800 และ 1000 µM

3.4 สารตวอยางในการทดลอง 3.4.1 ขนตอนการเกบตวอยางเขมาดนปนจากมอผยง ผยงจบปนดวยมอทงสองขางยงในลกษณะทายนโดยอาวธปนขนานกบพนดวยอาวธ

ปนรวอลเวอร ยหอ Smith & Wesson ขนาด .38 special กบกระสนปน ยหอ AP ยงจ านวน 4 นด น ากานส าลชบ Deionize water เชดบรเวณหนามอและหลงมอ บรเวณละ 1 กาน โดยเกบทงมอซายและมอขวา แลวใสในขวดเกบตวอยาง (Vial) ทง 2 ขวด คอมอซาย 1 ขวด และมอขวา 1 ขวด

3.4.2 ขนตอนการเกบตวอยางปลอกกระสนปน ผยงจบปนดวยมอทงสองขางยงในลกษณะทายนโดยอาวธปนขนานกบพนดวยอาวธ

ปนพกรวอลเวอร ยหอ Glock ขนาด .38 และอาวธปนพกกงอตโนมต ยหอ Smith & Wesson ขนาด 9 มม. กบกระสนปนยหอตางๆ ยงครงละ 3 นด แลวท าการเกบตวอยางปลอกกระสนปนใสซองพลาสตกใสแบบมซป

28

3.4.3 การเตรยมตวอยาง 3.4.3.1 น าตวอยางส าลทเชดเขมาดนปนแลวมาตดกานออก ปเปต Deionize water 1.00

mL ใสในขวดเกบตวอยาง (Vial) ปดฝาขวด จากนนน าไป Sonicate เปนเวลา 30 นาท เพอสกดเขมา 3.4.3.2 น าตวอยางปลอกกระสนปนวางในแนวตงฉากลงในบกเกอรขนาด 50 mL ใส

น า Deionize water ลงในปลอกกระสน โดยตวอยางปลอกกระสนปนขนาด 9 มม. ใสน า 0.9 mL และปลอกกระสนปนขนาด .38 ใสน า 1.5 mL จากนน Sonicate เปนเวลา 30 นาท เพอสกดเขมา

3.4.3.3 น าตวอยางขอท 3.4.3.1 และ 3.4.3.2 มากรองผาน Membrane filtered 0.45 µm 3.5 การสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

การสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษจะสรางบรเวณสวนกนทไมชอบน า (Hydrophobic barrier) ดวยการน าแผนพลาสตกใสกวาง 2 cm ยาว 21 cm มาซอนทบกน 4 ชน โดยใชเทปกาวสองหนาเปนตวยด จากนนใชทเจาะกระดาษแบบรเดยวขนาดเสนผานศนยกลาง 5 mm มาเจาะเปนชอง แตละชองหางกนประมาณ 5 mm จะไดชองทงหมด 20 ชองตอ 1 ชนงาน สวนทชอบน าเตรยมโดยเจาะกระดาษกรอง Whatman เบอร 1ใหมขนาดเสนผานศนยกลาง 5 mm หลงจากนนน ากระดาษกรองทเตรยมไว มาวางลงในชองทเจาะบนอปกรณ โดยดานหลงของอปกรณถกปดทบดวยเทปใส สวนดานบนถกปดดวยสตกเกอรใสทเจาะชองไวส าหรบหยดตวอยางขนาดเสนผานศนยกลาง 3 mm

ภาพท 14 ขนตอนการสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

29

3.6 การเตรยมอปกรณแบบกระดาษเพอตรวจวด 3.6.1 ตรวจวดไนไตรท วางกระดาษกรองทมเสนผานศนยกลาง 5 mm 2 แผน ซอนทบกนลงในชองทเจาะบน

อปกรณ แลวปเปตสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง จากนนปเปตสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง แลววางกระดาษกรองอก 1 แผนปดทบลงไป เมอตองการวเคราะหไนไตรทใหหยดสารตวอยางลงบนชองทเจาะไวส าหรบหยดตวอยาง

3.6.2 ตรวจวดไนเตรท วางกระดาษกรองทมเสนผานศนยกลาง 5 mm 1 แผน ลงในชองทเจาะบนอปกรณ

แลวปเปตสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง จากนนปเปตสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง วางกระดาษกรองอก 1 แผน ซอนทบกนลงในชอง ปเปต Zinc suspension เขมขน 0.1 g/mL ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง วางกระดาษกรองอก 1 แผนปดทบลงไป เมอตองการวเคราะหไนเตรทใหหยดสารตวอยางลงบนชองทเจาะไวส าหรบหยดตวอยาง 3.7 ศกษาการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทดวยอปกรณทไดสรางขน

3.7.1 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเตรยมอปกรณเพอตรวจวดไนไตรทและไนเตรท 3.7.1.1 ศกษาปรมาณของ Griess reagent ทเหมาะสม

3.7.1.1.1 ศกษาปรมาณทเหมาะสมของสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM เตรยมสาระลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM สารละลาย N-(1-Naphthyl)-

ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM และเตรยมสารละลายไนไตรท เขมขน 150 µM ท าการทดสอบ โดยปเปตสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10, 11 และ 12 µL (n=3) ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ และปเปตสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL ลงไป จากนนปเปตสารละลายไนไตรท เขมขน 150 µM ปรมาตร 10 µL ลงในแตละหลม ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางปรมาณของสารละลาย Sulfanilamide และคาความเขมส แลวเลอกปรมาณทเหมาะสมส าหรบใชในการทดสอบบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

3.7.1.1.2 ศกษาปรมาณทเหมาะสมของสารละลาย N-(1-Naphthyl)-Ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM

30

เตรยมสาระลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM สารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM และเตรยมสารละลายไนไตรท เขมขน 150 µM ท าการทดสอบโดยปเปตสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ และปเปตสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM ปรมาตร 10, 11 และ 12 µL (n=3) ลงไป จากนนปเปตสารละลายไนไตรท เขมขน 150 µM ปรมาตร 10 µL ลงในแตละหลม ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางปรมาณของสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI และคาความเขมส แลวเลอกปรมาณทเหมาะสมส าหรบใชในการทดสอบบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

3.7.1.2 ศกษาปรมาณทเหมาะสมของสารมาตรฐานและตวอยาง เตรยมสาระลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM สารละลาย N-(1-Naphthyl)-

ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM และเตรยมสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM ท าการทดสอบโดยปเปตสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ และปเปตสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL ลงไป จากนนปเปตสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM ปรมาตร 10, 11 และ 12 µL (n=3) ลงในแตละหลม ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางปรมาณของสารละลายไนไตรท และคาความเขมส แลวเลอกปรมาณทเหมาะสมส าหรบใชในการทดสอบบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

3.7.1.3 ศกษาปรมาณทเหมาะสมของ Zinc suspension เตรยมสาระลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM สารละลาย N-(1-Naphthyl)-

ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM สารละลายไนเตรท เขมขน 1000 µM และ Zinc suspension เขมขน 0.075, 0.1 และ 0.125 g/mL ท าการทดสอบโดยปเปตสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ และปเปตสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL ลงไป จากนนปเปต Zinc suspension ความเขมขนตางๆปรมาตร 10 µL (0.75, 1.0, และ 1.25 mg) ลงในแตละหลม (n=4) สดทายปเปตสารละลายไนเตรท เขมขน 1000 µM ปรมาตร 10 µL ลงไป ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางปรมาณของ

31

Zinc suspension และคาความเขมส แลวเลอกปรมาณทเหมาะสมส าหรบใชในการทดสอบบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

3.7.1.4 ศกษาชวงเวลาทเหมาะสมทใชในการถายภาพการเกดปฏกรยาระหวาง Griess reagent และสารละลายไนเตรท

เตรยมสาระลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM สารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM Zinc suspension เขมขน 0.1 g/mL และสารละลายไนเตรท เขมขน 900 µM ท าการทดสอบโดยปเปตสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ และปเปตสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL จากนนปเปต Zinc suspension ความเขมขน 0.1 g/mL ปรมาตร 10 µL (1.0 mg) สดทายปเปตสารละลายไนเตรท เขมขน 900 µM ปรมาตร 10 µL ลงในแตละหลม (n=5) ท าการถายภาพทกๆ 1นาท ตงแตนาทท 3-15 นาทแรก หลงจากนนถายทกๆ 5 นาท แลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางเวลาท าการถายภาพภายหลงการหยดสารและคาความเขมส แลวเลอกเวลาทเหมาะสมส าหรบใชในการถายภาพเพอทดสอบบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

3.7.2 ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท 3.7.2.1 ความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนไตรท เตรยมสารละลายไนไตรท เขมขน 15, 30, 60, 120 และ 180 µM ท าการทดสอบโดยป

เปตความเขมขนตางๆ ปรมาตร10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (n=3) ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางปรมาณของไนไตรทแตละความเขมขนทปรมาตร10 µL และคาความเขมส

3.7.2.2 ความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนเตรท เตรยมสารละลายไนเตรท เขมขน 200, 400, 600, 800 และ 1000 µM ท าการทดสอบ

โดยปเปตความเขมขนตางๆ ปรมาตร10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (n=3) ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอต กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางปรมาณของไนเตรทแตละความเขมขนทปรมาตร 10 µL และคาความเขมส

32

3.7.3 ศกษาความสามารถในการท าซ า (Reproducibility) 3.7.3.1 การศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรท เตรยมสารละลายไนไตรท เขมขน 15, 60 และ 180 µM ท าการทดสอบโดยปเปต

สารละลายไนไตรท ปรมาตร 10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (n=11) ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส หลงจากนนค านวณคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (Percentage of relative standard deviation, %RSD)

3.7.3.1 การศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนเตรท เตรยมสารละลายไนเตรท เขมขน 200, 600 และ 1000 µM ท าการทดสอบโดยปเปต

สารละลายไนเตรท ปรมาตร 10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (n=14) ทงไว 5 นาท ท าการถายภาพแลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส หลงจากนนค านวณคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (Percentage of relative standard deviation, %RSD)

3.7.4 ศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด (Limit of detection, LOD) และขดจ ากดการหาปรมาณ (Limit of quantification, LOQ)

ปเปตสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรททความเขมขน 0 µM ลงบนอปกรณตรวจวดไนไตรทและไนเตรทแบบกระดาษปรมาตร 10 µL ท าทงหมด 10 ซ า โดยท าการถายภาพพรอมกบกราฟมาตรฐานแลวหาคาสวนเบยงเบนมาตรฐาน (S.D.)

การค านวณหาขดจ ากดการตรวจวดโดยใชสตร LOD = 3S.D. น าคาทค านวณไดจากสตรหารดวยคาความชนในสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐานเพอหาคาขดจ ากดการตรวจวด

การค านวณหาขดจ ากดการหาปรมาณโดยใชสตร LOQ = 10S.D. น าคาทค านวณไดจากสตรหารดวยคาความชนในสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐานเพอหาคาขดจ ากดการหาปรมาณ

3.7.5 ศกษาความเสถยรของอปกรณการตรวจวเคราะหแบบกระดาษ (Stability) เตรยมอปกรณตรวจวดไนไตรทและไนเตรทแบบกระดาษ โดยศกษาภายใตอณหภม

หอง (ไมสมผสแสงและใสถงซป) และเกบในตเยนอณหภม ≤ 4 °C (ไมสมผสแสงและใสถงซป) มาทดสอบดวยสารละลายมาตรฐานไนไตรท 60 µM และสารละลายมาตรฐานไนเตรท 600 µM ท าการวเคราะหความเขมสเปนระยะเวลาตอเนองนาน 30 วน แลวน าไปพลอตกราฟระหวางระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนไตรทและไนเตรทแบบกระดาษ กบคาความเขมสของแตละวนทได

33

3.8 การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยอปกรณแบบกระดาษ งานวจยชนนไดใชอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทใน

ตวอยางเขมาดนปน โดยเตรยมสารละลายตวอยางเขมาดนปนตามขอ 3.4.3 และท าการทดสอบโดยปเปตสารละลายตวอยางเขมาดนปนลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 10 µL (n=6) ทงไว 5 นาท โดยท าการถายภาพพรอมกบกราฟมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท แลววเคราะหดวยโปรแกรม ImageJ หาคาความเขมสของตวอยางเทยบกบกราฟมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท และค านวณปรมาณไนไตรทและไนเตรทในรปของคา nmol 3.9 การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

3.9.1 ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท เตรยมสารละลายมาตรฐานผสมไนไตรทและไนเตรทความเขมขน 15, 30, 60, 120,

240, 480 และ 960 µM เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท วดดวยเครองโครมาโทกราฟ โดยมสภาวะของเครอง ดงน

ตารางท 3 สภาวะของเครองโครมาโทกราฟ Ion chromatography (IC) Donex ICS -1000

Program Dionex CM Dongle Chromeleon 680 SPI build 2238 Reagent-free controller RFC-30 Dionex Column Guard column Analytical column

DionexIonPac AG17 Guard column (4×50mm) DionexIonPac AS17-C Analytical column (4×250 mm)

Eluent Potassium Hydroxide Detector Conductivity Run time 10 min Eluting flow rate 1.0 mL/min

34

3.9.2 ศกษาขดจ ากดการตรวจวดและขดจ ากดการหาปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท

เตรยมสารมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM แลวฉดเขาเครองโครมาโทกราฟ ท าทงหมด 7 ซ า หาคาสวนเบยงเบนมาตรฐาน (S.D.)

การค านวณหาขดจ ากดการตรวจวดโดยใชสตร LOD = 3S.D. น าคาทค านวณไดจากสตรหารดวยคาความชนในสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐานเพอหาคาขดจ ากดการตรวจวด

การค านวณหาขดจ ากดการหาปรมาณโดยใชสตร LOQ = 10S.D. น าคาทค านวณไดจากสตรหารดวยคาความชนในสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐานเพอหาคาขดจ ากดการหาปรมาณ

3.9.3 การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปน น าสารตวอยางทไดจากมอผยงปนและในปลอกกระสนปนมาท าการสกดเอาเขมาออก

มา กอนจะฉดเขาเครองโครมาโทกราฟ เพอหาปรมาณไนไตรทและไนเตรต และรายงานคาในรปแบบ nmol

3.10 ขนตอนการวเคราะหความเขมสดวยโปรแกรม ImageJ 3.10.1 ถายภาพอปกรณทไดท าการทดลองดวยกลองโทรศพทมอถอยหอ iPhone รน 5

ภายใตหลอดไฟฟลออเรสเซนตทต าแหนงเดยวกนทกครง ใหระยะหางระหวางอปกรณกบกลองเทากบ 20 เซนตเมตร

3.10.2 เปดโปรแกรม ImageJ

ภาพท 15 แสดงโปรแกรม ImageJ

35

3.10.3 เลอก Open เลอกรปทตองการประมวลผล

ภาพท 16 แสดงการเลอกรปถายในโปรแกรม ImageJ 3.10.4 เลอก Image ไปท Color ไปท Split channels เพอวดคาความเขมสในโหมด

RGB

ภาพท 17 แสดงการปรบเปนโหมด RGB ในโปรแกรม ImageJ

36

3.10.5 เลอกบรเวณทตองการตรวจวด โดยเลอก Shortcut ตามทตองการ จากนนลากคลมบรเวณทตองการวด เมอไดบรเวณแลวใหไปท Analyze ไปท Measurement คา Mean ทปรากฏคอคา Mean intensity ของโหมดสทวเคราะห ทไดจากการประมวลภาพ

ภาพท 18 แสดงบรเวณทตรวจวดและการ Analyze measurement ในโปรแกรม ImageJ

37

3.11 แผนการด าเนนการวจย

ภาพท 19 แผนผงขนตอนการท าวจย

สรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

วธตรวจวดไนไตรทและไนเตรทดวยอปกรณทไดสรางขน

ศกษาพารามเตอรตางๆ ไดแก ปรมาณของ Griess reagent ปรมาณของสารตวอยาง

ปรมาณของ Zinc suspension และระยะเวลาในการถายภาพ

- ศกษาชวงความเปนเสนตรง

- ศกษาความสามารถในการท าซ า (Reproducibility) - ศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด (LOD) และขดจ ากดการหาปรมาณ (LOQ) - ศกษาความเสถยรของอปกรณการตรวจวเคราะหแบบกระดาษ (Stability)

วเคราะหสารตวอยางเขมาดนปน (บนมอ และ ในปลอกกระสนปน)

วธ Griess assay บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ เทคนค Ion chromatography

38

บทท 4 ผลการวจยและอภปราย

ในงานวจยนไดศกษาการวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปน โดยใชอปกรณแบบกระดาษทสรางขนเอง การสรางอปกรณกระดาษท าโดยใชแผนพลาสตกใสทซอนกนอยางนอย 4 ชน โดยมเทปกาวสองหนาเปนตวยด และเจาะรใหมขนาดเสนผานศนยกลาง 5 mm จากนนวางกระดาษกรอง Whatman เบอร 1 ทมเสนผานศนยกลาง 5 mm ลงในชองวาง ดานหลงของอปกรณจะถกปดทบดวยเทปใส สวนดานบนถกปดดวยสตกเกอรใสทเจาะชองไวส าหรบหยดตวอยางขนาดเสนผานศนยกลาง 3 mm ดงภาพท 20

ภาพท 20 อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ การเตรยมอปกรณเพอตรวจวดไนไตรท ท าโดยวางกระดาษกรอง 2 แผน ซอนทบ

กนลงในชองทเจาะบนอปกรณ จากนนปเปต Griess reagent ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง แลววางกระดาษกรองอก 1 แผนปดทบลงไป สวนไนเตรท จะวางกระดาษกรองลงในชองทเจาะบนอปกรณ 1 แผน ปเปต Griess reagent ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง วางกระดาษกรองอก 1 แผน ซอนทบกนลงในชอง ปเปต Zinc suspension ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง จากนนวางกระดาษกรองอก 1 แผนปดทบลงไป

4.1 ผลการศกษาการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทดวยอปกรณทไดสรางขน 4.1.1 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเตรยมอปกรณเพอตรวจวดไนไตรทและไนเตรท

4.1.1.1 ศกษาปรมาณของ Griess reagent และสารตวอยางทเหมาะสมกบอปกรณ การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรท นนอาศยหลกการเปลยนแปลงสของ

Griess reagent ซงเปนสารละลายใสไมมส โดย Sulfanilamide จะท าปฏกรยากบไอออนไนไตรทในสารละลายกรด กลายเปน Diazonium salt จากนนเกดปฏกรยารวมตวกบ N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI ไดสารประกอบ Azo dye ทมสแดงมวง สวนไอออนไนเตรทจะถกรดวซ กลายเปนไนไตรท ดวย Zinc กอนเกดปฏกรยาดงกลาว ความเขมสทเกดขนจะแปรผนตรงกบ

สวนทชอบน า (กระดาษกรอง)

สวนทไมชอบน า (แผนพลาสตกใส)

ชองหยดตวอยาง

39

ไนไตรทและไนเตรททถกรดวซกลายเปนไนไตรทของสารตวอยาง จากนนท าการศกษาปรมาณทเหมาะสมของสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM สารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM และสารมาตรฐานไนไตรทเขมขน 150 µM ท าการเตรยมอปกรณโดยปเปตสารละลาย Sulfanilamide และสารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine .2HCI ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษปรมาตร 10, 11 และ 12 µL ใชไดรเปาผมเปาใหแหง จากนนจงปเปตสารมาตรฐานไนไตรทปรมาตร 10, 11 และ 12 µL ลงไป ท า Blank เปรยบเทยบในทกปรมาณทศกษา ปลอยใหเกดปฏกรยา 5 นาท แลวน าอปกรณทไดไปถายรป น าเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมของสทเกดขน ไดภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษดงภาพท 21-23

ภาพท 21 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย NED เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนไตรทเขมขน 0 µM (B) สารละลาย Sulfanilamide ปรมาตร 10 µL (500 nmol) (C) สารละลาย Sulfanilamide ปรมาตร 11 µL (550 nmol) (D) สารละลาย Sulfanilamide ปรมาตร 12 µL (600 nmol)

ภาพท 22 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงปรมาตรสารละลาย NED เขมขน 10 mM (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนไตรทเขมขน 0 µM (B) สารละลาย NED ปรมาตร 10 µL (99.7 nmol) (C) สารละลาย NED ปรมาตร 11 µL (109.7 nmol) (D) สารละลาย NED ปรมาตร 12 µL (119.6 nmol)

A B C D

A B C D

Blank 500 550 600 nmol Sulfanilamide

Blank 99.7 109.7 119.6 nmol NED

40

ภาพท 23 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลาย NED เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงปรมาตรสารละลายไนไตรทเขมขน 150 µM (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนไตรทเขมขน 0 µM (B) สารละลายไนไตรท ปรมาตร 10 µL (1.50 nmol) (C) สารละลายไนไตรท ปรมาตร 11 µL (1.65 nmol) (D) สารละลายไนไตรท ปรมาตร 12 µL (1.80 nmol)

จากรปท 21-23 พบวาปรมาณของสารละลายทศกษาแตละตว เมอน าไปอานคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และรวมทกส (RGB) เมอปรมาณสารละลาย Sulfanilamide, NED และไนไตรทเพมขน คาความเขมสในทกๆสไมไดเพมขนตามไปดวย ดงนนในการทดลองนจงเลอกใชปรมาตร 10 µL ซงเปนปรมาตรทเหมาะสมส าหรบอปกรณน

4.1.1.2 ศกษาปรมาณของ Zinc suspension ท าการศกษาปรมาณของ Zinc suspension โดยท าการเตรยมสารละลาย Sulfanilamide

เขมขน 50 mM สารละลาย N-(1-Naphthyl)-ethylenediamine.2HCI เขมขน 10 mM Zinc suspension ทความเขมขน 0.075, 0.1 และ 0.125 g/mL และสารมาตรฐานไนเตรทเขมขน 1000 µM ท าการเตรยมอปกรณโดยปเปต Griess reagent ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษปรมาตร10 µL ใชไดรเปาผมเปาใหแหง จากนนปเปต Zinc suspension ความเขมขน 0.075-0.125 g/mL ปรมาตร 10 µL ลงไป ใชไดรเปาผมเปาใหแหง สดทายจงปเปตสารมาตรฐานไนเตรท ปรมาตร10 µL ลงไป ท า Blank เปรยบเทยบในทกปรมาณทศกษา ปลอยใหเกดปฏกรยา 5 นาท แลวน าอปกรณทไดไปถายรป ไดภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษดงภาพท 24 จากนนน าไปประมวลผลดวยโปรแกรม ImageJ ไดกราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของ Zinc ดงภาพท 25

A B C D

Blank 1.50 1.65 1.80 nmol Standard

41

ภาพท 24 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารละลาย โดยควบคมปรมาตรสารละลาย Sulfanilamide เขมขน 50 mM ปรมาตร 10 µL สารละลาย NED เขมขน 10 mM ปรมาตร 10 µL และสารละลายไนเตรทเขมขน 1000 µM ปรมาตร 10 µL และเปลยนแปลงความเขมขน Zinc suspension ปรมาตร 10 µL (A) คอ Blank โดยหยดสารละลายไนเตรทเขมขน 0 µM (B) Zinc suspension เขมขน 0.075 g/mL (0.75 mg) (C) Zinc suspension เขมขน 0.1 g/mL (1 mg) (D) Zinc suspension เขมขน 0.125 g/mL (1.25 mg)

ภาพท 25 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของ Zinc (mg) (n=4) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

จากการศกษาหาปรมาณทเหมาะสมของ Zinc ทปรมาณ 0.75-1.25 mg พบวาเมอน าไป

อานคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และ RGB เมอปรมาณของ Zinc เพมขน คาความเขมสทไดมคาใกลเคยงกน ดงนนในการทดลองน จงเลอกใช Zinc ทปรมาณ 1 mg ในการตรวจวดบนอปกรณแบบกระดาษ เนองจากหากมปรมาณ Zinc ทมากเกนไป สของ Zinc ซงมสด า อาจรบกวนตอการตรวจวดได

A B C D

Blank 0.75 1.0 1.25 mg Zinc

42

4.1.1.3 ศกษาชวงเวลาทเหมาะสมทใชในการถายภาพการเกดปฏกรยาระหวาง Griess reagent และสารละลายไนเตรท

จากการศกษาชวงเวลาทเหมาะสมในการถายภาพภายหลงการหยดสาร โดยใชปรมาณของ Griess reagent สารตวอยาง และ Zinc suspension ดงทศกษาในขางตน และใชสารมาตรฐานไนเตรททความเขมขน 900 µM ปรมาตร 10 µL ในการตรวจวด โดยถายภาพภายหลงจากการหยดสารทเวลาตางๆ ไดผลดงภาพท 26 จากนนน าไปอานคาความเขมสโดยใชโปรแกรม ImageJ ท าการพลอตกราฟระหวางคาความเขมสกบเวลาท าการถายภาพภายหลงการหยดสาร ไดผลดงภาพท 27

ภาพท 26 ความเขมสทปรากฏบนกระดาษทไดจากสารละลายไนเตรทท าปฏกรยากบ Griess reagent ทเวลาตางๆ

ภาพท 27 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาทท าการถายภาพ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

ถายภาพทเวลา

ถายภาพทเวลา

ถายภาพทเวลา

43

จากการศกษาเวลาทใชถายภาพภายหลงการหยดสารของปฏกรยา Griess reagent กบไนเตรท โดยใชสารมาตรฐานไนเตรททความเขมขน 900 µM พบวาจากภาพท 26 เมอเตรยมอปกรณแบบกระดาษเพอตรวจวดไนเตรทแลว จากนนจงหยดสารมาตรฐานไนเตรทลงไป หลงการหยดไนเตรทจะถกรดวซกลายเปนไนไตรทดวย Zinc แลวท าปฏกรยากบ Griess reagent ปรากฏสแดงมวงขนบนกระดาษ เมอเวลาผานไปสจะคอยๆซดจางลง และจากภาพท 27 เมอน ามาอานคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และ RGB พบวาในชวงเวลาท 3-20 นาท คาความเขมสแตละสทไดมคาใกลเคยงกน และคอยๆลดลงเมอเวลาเพมขน แสดงวาระยะเวลา 3-20 นาทเปนระยะเวลาทเหมาะสมส าหรบการถายภาพ ดงนนจงไดเลอกใชเวลาในการถายภาพท 5 นาท เพอความรวดเรวในการวเคราะห

4.1.2 ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท 4.1.2.1 ความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนไตรท จากการศกษาความเปนเสนตรงของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรท โดยใช

ปรมาณของ Griess reagent และสารตวอยางดงทศกษาในขางตน และเตรยมสารมาตรฐานไนไตรทชวงความเขมขน 15 – 180 µM ท าการทดสอบโดยหยดสารละลายไนไตรทความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษหลมละ 10 µL (0.15 – 1.80 nmol) (n=3) วางทงไว 5 นาท ท าการถายภาพ ไดภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษดงภาพท 28 และเมอน ารปภาพไปอานคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และ RGB แลวพลอตกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของไนไตรท จะไดกราฟมาตรฐานของไนไตรทดงภาพท 29 และตารางแสดงสมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของกราฟมาตรฐานไนไตรทดงตารางท 4

ภาพท 28 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารมาตรฐานไนไตรททปรมาณ 0.15, 0.30, 0.60, 1.20 และ 1.80 nmol ลงไป

0 0.15 0.30 0.60 1.20 1.80 nmol

44

ภาพท 29 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรท (n=3) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB ตารางท 4 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของสารมาตรฐานไนไตรทบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

Color Equations r Red y = 8.1946x + 2.6613 0.9968

Green y = 33.164x + 8.6521 0.9968 Blue y = 9.1862x + 0.4748 0.9982 RGB y = 50.545x + 11.788 0.9985

จากการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทดวยวธ Griess assay บนอปกรณตรวจวดแบบ

กระดาษ ไดผลดงแสดงในภาพท 28 ซงจะเหนวา เมอปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรทเพมขน ความเขมสจะเพมขน เนองจาก Griess reagent จะท าปฏกรยากบสารมาตรฐานไนไตรท ท าใหมสแดงมวงทเขมขน เมอพลอตกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และ RGB กบปรมาณของไนไตรท จะไดกราฟมาตรฐานทมความเปนเสนตรงในชวงปรมาณ 0.15 – 1.80 nmol โดยมคาสมประสทธสหสมพนธอยในชวง 0.9968 - 0.9985

45

4.1.2.2 ความเปนเสนตรงของสารมาตรฐานไนเตรท จากการศกษาความเปนเสนตรงของการวเคราะหสารมาตรฐานไนเตรท โดยใชปรมาณ

ของ Griess reagent สารตวอยาง และ Zinc suspension ดงทศกษาในขางตน และเตรยมสารมาตรฐานไนเตรทชวงความเขมขน 200 – 1000 µM ท าการทดสอบโดยหยดสารละลายไนเตรทความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษหลมละ 10 µL (2.0 – 10.0 nmol) (n=3) วางทงไว 5 นาท ท าการถายภาพ ไดภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษดงภาพท 30 และเมอน ารปภาพไปอานคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และ RGB แลวพลอตกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของไนเตรท จะไดกราฟมาตรฐานของไนเตรทดงภาพท 31 และตารางแสดงสมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของกราฟมาตรฐานไนเตรทดงตารางท 5

ภาพท 30 ภาพถายอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเมอท าการหยดสารมาตรฐานไนเตรททปรมาณ 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 และ 10.0 nmol ลงไป

ภาพท 31 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของสารมาตรฐานไนเตรท (n=3) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 nmol

46

ตารางท 5 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของสารมาตรฐานไนเตรทบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

Color Equations r Red y = 0.4401x + 1.533 0.9347

Green y = 2.4941x - 0.7368 0.9953 Blue y = 0.8955x - 0.0617 0.9658 RGB y = 3.8296x + 0.7344 0.9964

จากการวเคราะหสารมาตรฐานไนเตรทดวยวธ Griess assay บนอปกรณตรวจวดแบบ

กระดาษ ไดผลดงแสดงในภาพท 30 ซงจะเหนวา เมอปรมาณของสารมาตรฐานไนเตรทเพมขนความเขมสจะเพมขน เนองจาก Griess reagent จะท าปฏกรยากบไนเตรททถกรดวซกลายเปนไนไตรท ท าใหมสแดงมวงทเขมขน เมอพลอตกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และ RGB กบปรมาณของไนเตรท จะไดกราฟมาตรฐานทมความเปนเสนตรงในชวงปรมาณ 2.0 – 10.0 nmol โดยมคาสมประสทธสหสมพนธ อยในชวง 0.9347 - 0.9964

4.1.3 ศกษาความสามารถในการท าซ า (Reproducibility) ศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรททปรมาณ

0.15, 0.60 และ 1.80 nmol (15, 60, 180 µM) และสารมาตรฐานไนเตรททปรมาณ 2.0, 6.0 และ 10.0 nmol (200, 600, 1000 µM) ทดสอบโดยหยดสารละลายไนไตรทและไนเตรททความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดไนไตรทและไนเตรทแบบกระดาษหลมละ 10 µL วางทงไว 5 นาท ท าการถายภาพ แลวน ารปภาพไปหาคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และ RGB ไดผลการทดลองดงตารางแสดงผลการศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทตารางท 6 และ 7

47

ตารางท 6 ผลการศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรท Amounts (nmol)

Color intensity (Mean, n=11)

SD %RSD

0.15 (15 µM)

R 149.91 3.968 2.65 G 147.16 5.41 3.67 B 140.37 5.81 4.14

RGB 437.44 15.06 3.44

0.60 (60 µM)

R 156.48 3.74 2.39 G 137.05 3.82 2.79 B 143.89 5.11 3.55

RGB 437.42 12.47 2.85

1.80 (180 µM)

R 144.23 4.29 2.97 G 102.30 7.15 6.99 B 131.99 6.05 4.58

RGB 378.51 17.16 4.53 ตารางท 7 ผลการศกษาความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหสารมาตรฐานไนเตรท

Amounts (nmol)

Color intensity (Mean, n=14)

SD %RSD

2.0 (200 µM)

R 136.47 4.20 3.07 G 140.38 4.22 3.01 B 133.63 3.91 2.92

RGB 410.48 11.95 2.91

6.0 (600 µM)

R 141.87 3.96 2.79 G 136.38 5.16 3.79 B 132.66 5.37 4.05

RGB 410.91 13.90 3.38

48

Amounts (nmol)

Color intensity (Mean, n=14)

SD %RSD

10.0 (1000 µM)

R 135.18 4.00 2.96 G 120.65 5.75 4.76 B 119.49 4.99 4.17

RGB 375.33 13.84 3.69

ผลการศกษาความสามารถในการท าซ าจากการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและ ไนเตรท โดยศกษาทปรมาณทอยในชวงความเปนเสนตรง พบวาการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทใหคา %RSD อยในชวง 2.39-6.99 (n=11) และการวเคราะหสารมาตรฐานไนเตรทใหคา %RSD อยในชวง 2.79-4.76 (n=14) แสดงใหเหนวาวธ Griess assay บนอปกรณแบบกระดาษทประดษฐขนเองมความเทยงสงในการวเคราะหไนไตรทและไนเตรท

4.1.4 ศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด (Limit of detection, LOD) และขดจ ากดการหาปรมาณ (Limit of quantification, LOQ)

ศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด และขดจ ากดการหาปรมาณ โดยน าคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และRGB ของการวเคราะหไนไตรทและไนเตรท 0 nmol (0 µM) (Blank) ดวยวธ Griess assay มาค านวณหาคาขดจ ากดการตรวจวดไนไตรทและไนเตรท ไดผลการทดลองดงตารางแสดงผลการศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด และขดจ ากดการหาปรมาณของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทตารางท 8

ตารางท 8 ผลการศกษาคาขดจ ากดการตรวจวด และขดจ ากดการหาปรมาณของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท

Standards Color LOD (nmol) LOQ (nmol)

ไนไตรท

R 0.294 0.980 G 0.063 0.211 B 0.199 0.664

RGB 0.074 0.246

ไนเตรท G 0.840 2.801 B 0.752 2.507

RGB 1.283 4.277

49

ผลการศกษาคาขดจ ากดการตรวจวดและขดจ ากดการหาปรมาณของการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท 0 µM โดยอานคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และRGB พบวาคาขดจ ากดการตรวจวดไนไตรทและไนเตรทอยในชวง 0.063-0.294 และ 0.752-1.283 nmol ตามล าดบ และคาขดจ ากดการหาปรมาณของไนไตรทและไนเตรทอยในชวง 0.211-0.980 และ 2.507-4.277 nmol ตามล าดบ

4.1.5 ศกษาความเสถยรของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทประดษฐขนเอง (Stability) เมอน าอปกรณตรวจวดไนไตรทและไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวทอณหภมหอง โดย

ไมใหถกแสงแดดและอากาศ มาทดสอบดวยสารละลายมาตรฐานไนไตรท 60 µM และสารละลายมาตรฐานไนเตรท 600 µM ท าการวเคราะหหาความเขมส เปนระยะเวลาตอเนองนาน 30 วน เมอน าคาทไดมาพลอตคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และRGB ของแตละวนเปรยบเทยบกนได พบวาอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษ มผลการวเคราะหความเขมสในแตละสชวงวนท 1 - 6 มคาใกลเคยงกน และหลงจากนนคอยๆลดต าลง แสดงวาอปกรณทประดษฐขนนไมเสถยร เมอเกบรกษาไวทอณหภมหองมากกวา 6 วน ซงอาจมสาเหตมาจากรเอเจนตทหยดลงบนอปกรณไดรบความรอนแลวเกดการสลายตวไป ท าใหความสามารถในการท าปฏกรยาลดลง ผลการวเคราะหความเขมสจงมคาลดลงเมอเวลาผานไป ดงแสดงในภาพกราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะ เวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษทเกบไวทอณหภมหองภาพท 32 และอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษมผลการวเคราะหความเขมสในแตละสชวงวนท 1 - 5 มคาใกลเคยงกน แตเนองจากวนท 3 เปนตนไปนน ไดมสน าตาลปรากฏขนบนกระดาษกอนท าการหยดสารมาตรฐาน ซงอาจมสาเหตมาจากรเอเจนตทหยดลงบนอปกรณไดรบความรอนแลวเกดการเสอม สภาพ แสดงวาอปกรณทประดษฐขนนไมเสถยร เมอเกบรกษาไวทอณหภมหองมากกวา 2 วน ดงนนจงควรเกบอปกรณไวใชงานไดนาน 2 วน ดงแสดงในภาพกราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวทอณหภมหองภาพท 33

50

ภาพท 32 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษทเกบไวทอณหภมหองโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

ภาพท 33 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวทอณหภมหองโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

51

ส าหรบอปกรณตรวจวดไนไตรทและไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวในตเยน พบวาอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษมผลการวเคราะหความเขมสในแตละสชวงวนท 1 - 11 มคาใกลเคยงกน และเมอเวลาผานไปคาความเขมสจะลดลง แสดงวาอปกรณทประดษฐขนนไมเสถยร เมอเกบรกษาไวในตเยนมากกวา 11 วน ดงแสดงในภาพกราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะ เวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษทเกบไวในตเยนภาพท 34 และอปกรณตรวจ วดไนเตรทแบบกระดาษมผลการวเคราะหความเขมสในแตละสชวงวนท 1 - 7 มคาใกลเคยงกน แตเนองจากวนท 6 เปนตนไปนน ไดมสน าตาลปรากฏขนบนกระดาษกอนท าการหยดสารมาตรฐาน ซงอาจมสาเหตมาจากรเอเจนตเกดการเสอมสภาพ แสดงวาอปกรณทประดษฐขนนไมเสถยร เมอเกบรกษาไวในตเยนมากกวา 5 วน ดงนนจงควรเกบอปกรณไวใชงานไดนาน 5 วน ซงมากกวาเมอเกบไวทอณหภมหอง อาจมสาเหตมาจากความชนและอณหภมทเยนชวยใหรเอเจนตมความเสถยรท าใหเกดปฏกรยาไดด ดงแสดงในภาพกราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวในตเยนภาพท 35

ภาพท 34 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนไตรทแบบกระดาษทเกบไวในตเยนโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

52

ภาพท 35 กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบระยะเวลาในการเกบอปกรณตรวจวดไนเตรทแบบกระดาษทเกบไวในตเยนโดยไมใหถกแสงแดดและอากาศ (n=5) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB 4.2 ผลการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยอปกรณแบบกระดาษ

จากการทดลองหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทบนมอของผยง โดยท าการยงดวยอาวธปนรวอลเวอร ยหอ Smith & Wesson ขนาด .38 special กบกระสนปน ยหอ AP ยงจ านวน 4 นด และในปลอกกระสนปนทยงดวยอาวธปนพกรวอลเวอร ยหอ Glock ขนาด .38 และอาวธปนพกกงอตโนมต ยหอ Smith & Wesson ขนาด 9 มม. กบกระสนปนยหอตางๆ ยงครงละ 3 นด โดยท าการเกบตวอยางทนท น ามาสกดเอาเขมาออก หลงจากนนท าการปเปตสารตวอยางปรมาตร 10 µL (n=6) ลงบนอปกรณตรวจวดไนไตรและไนเตรทแบบกระดาษ วางทงไว 5 นาท ท าการถายภาพ พรอมกบกราฟมาตรฐาน น าไปอานคาความเขมสของสแดง สเขยว สน าเงน และRGB แลวน าคาความเขมสทไดไปเทยบกบกราฟมาตรฐานของไนไตรทและไนเตรท และค านวณหาปรมาณไนไตรทและไนเตรททมอยในตวอยาง ไดผลการทดลองดงตารางแสดงปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษตารางท 9

53

ตารางท 9 ปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณแบบกระดาษ

No. Sample Color ปรมาณไนไตรท

(NO2-/nmol)

SD ปรมาณไนเตรท

(NO3-/nmol)

SD

1 THAI ARM

9 มม.

R 454.47 43.95 - - G 348.48 33.77 2159.95 525.30 B 358.20 33.77 3308.24 539.70

RGB 345.38 53.01 2953.45 437.97

2 AP .38

R 527.24 103.52 - - G 347.89 29.33 4275.46 9.69 B 324.69 63.49 6330.74 868.80

RGB 347.33 45.51 5319.15 522.88

3 มอซาย

R 72.47 4.43 - - G 20.92 3.22 259.95 31.94 B 53.53 6.78 244.57 33.18

RGB 33.42 5.67 257.78 20.94

4 มอขวา

R 107.10 2.71 - - G 85.82 3.40 338.95 49.15 B 70.71 3.82 295.48 46.73

RGB 87.11 2.40 649.14 22.30

5 AP 9 มม.

R 265.54 40.20 - - G 230.16 24.63 2437.16 48.99 B 251.92 62.64 2028.73 168.23

RGB 244.07 30.39 2596.20 405.90

6 WIN .38

R 576.41 44.64 - - G 324.55 26.87 1436.53 134.92 B 327.64 71.09 1273.02 200.30

RGB 359.98 38.63 1743.74 503.62

54

No. Sample Color ปรมาณไนไตรท

(NO2-/nmol)

SD ปรมาณไนเตรท

(NO3-/nmol)

SD

7 PMC .38

R 612.64 35.24 - - G 476.88 41.59 6381.44 558.45 B 317.92 43.75 4835.38 553.04

RGB 478.17 17.25 5617.91 693.03

8 RP 9 มม.

R 422.31 69.60 - - G 516.21 28.85 2208.27 95.72 B 594.93 52.47 1255.75 230.05

RGB 530.22 45.37 1432.59 320.62

9 SPEER 9 มม.

R 246.65 126.61 - - G 287.37 32.70 1853.10 118.35 B 130.15 36.37 1466.34 135.84

RGB 222.46 48.73 1831.36 171.12

10 RAI 9 มม.

R 91.55 1.92 - - G 3.91 1.34 513.83 36.73 B 12.04 5.09 463.21 93.24

RGB 18.91 0.93 437.09 73.25 หมายเหตเครองหมาย – หมายถงหาคาไมได

ในตารางท 9 เนองจากคาความเขมสของสแดงของสารมาตรฐานไนเตรททชวงปรมาณ 2.0 – 10.0 nmol ไมสามารถท าการพลอตกราฟมาตรฐานของความเขมสของสแดงเทยบกบปรมาณของไนเตรทได ดงนนจงหาปรมาณไนเตรททความเขมสของสแดงไมได และพบวาในตวอยางเขมาดนปนบนมอและในปลอกกระสนปนมปรมาณของไนเตรทมากกวาปรมาณของไนไตรท 4.3 ผลการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

จากการเตรยมสารละลายมาตรฐานผสมไนไตรทและไนเตรททความเขมขน 15 µM จากนนตรวจวดดวยเครองโครมาโทกราฟ (n=2) พบวาได Chromatogram ของสารละลายมาตร ฐานผสมไนไตรทและไนเตรททความเขมขน 15 µM ดงภาพท 36

55

ภาพท 36 Chromatogram ของสารละลายมาตรฐานผสมไนไตรทและไนเตรททความเขมขน 15 µM

จากภาพท 36 พบวาพคของไนไตรทสามารถแยกจากพคของไนเตรทไดอยางชดเจน และจาก Chromatogram ของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทพบวา Retention time ของไนไตรท เทากบ 3.11 min และ Retention time ของไนเตรท เทากบ 4.99 min จากนนท าการสรางกราฟมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท โดยเตรยมสารละลายมาตรฐานผสมไนไตรทและไนเตรททความเขมขน 15 - 960 µM ฉดเขาเครองโครมาโทกราฟ ปรมาตร 25 µL (0.38-24.00 nmol) (n=2) จากนนน ามาหาคาเฉลยพนทใตพคของสารมาตรฐานทปรมาณตางๆ ไดผลการทดลองดงตารางแสดงคาเฉลยพนทใตพคของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทตารางท 10 ตารางท 10 แสดงคาเฉลยพนทใตพคของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรท

ปรมาณของ สารมาตรฐาน

(nmol)

คาเฉลยพนทใตพค

สารมาตรฐานไนไตรท SD สารมาตรฐานไนเตรท SD

0.38 0.146 0.0007 0.142 0 0.75 0.288 0.0021 0.280 0.0057 1.50 0.554 0.0007 0.572 0.0042 3.00 1.262 0.0007 1.238 0.0092 6.00 2.471 0.0212 2.581 0.0007 12.00 4.613 0 5.341 0.0163 24.00 8.681 0 10.820 0.0028

56

จากตารางท 10 พบวาเมอใชสารมาตรฐานผสมไนไตรทและไนเตรททปรมาณ 0.38 - 24.00 nmol ไดคาเฉลยพนทใตพคของสารมาตรฐานไนไตรทอยในชวง 0.146-8.681 µS*min และของสารมาตรฐานไนเตรทอยในชวง 0.142- 10.820 µS*min และเมอน าขอมลทไดมาพลอตกราฟมาตรฐาน (Calibration curve) ไดภาพกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาพนทใตพคกบปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรท ดงภาพท 37 และภาพกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาพนทใตพคกบปรมาณของสารมาตรฐานไนเตรทดงภาพท 38 และตารางแสดงสมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟตารางท 11

ภาพท 37 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาพนทใตพคกบปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรท (n=2)

ภาพท 38 กราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาพนทใตพคกบปรมาณของสารมาตรฐานไนเตรท (n=2)

0

2

4

6

8

10

0 5 10 15 20 25 30

Are

a(µ

S*m

in)

nmol

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30

Are

a(µ

S*m

in)

nmol

57

ตารางท 11 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

Standards Equations r ไนไตรท y = 0.3651x + 0.0896 0.9992 ไนเตรท y = 0.4513x - 0.0865 0.9999

จากภาพท 37 และ 38 และตารางท 11 พบวากราฟมาตรฐานของไนไตรทและไนเตรท

ไดความสมพนธเปนเสนตรงทด มคาสมประสทธสหสมพนธของไนไตรทและไนเตรท คอ 0.9992 และ 0.9999 ตามล าดบ

จากการหาคาขดจ ากดการตรวจวดและขดจ ากดการหาปรมาณ โดยใชสารมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM เปน Blank มาฉดเขาเครองโครมาโทกราฟ พบวาได Chromatogram ของสารละลายมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM ดงภาพท 39

ภาพท 39 Chromatogram ของสารละลายมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM จากภาพท 39 พบวาพคของไนไตรทม Retention time เทากบ 3.00 min และเนองจาก

ไนเตรททความเขมขน 0 µM พบพคของน า DI ทม Retention time เทากบ 4.44 min ซงอยในต าแหนงเดยวกบพคของไนเตรท จงไดใชพคของน าทเวลา 4.44 min มาท าการวเคราะห จากนนท าการฉดซ า 7 ครง ไดคาพนทใตพคของสารละลายมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM ดงตารางท 12

58

ตารางท 12 พนทใตพคของสารละลายมาตรฐานไนไตรททความเขมขน 0.06 µM

ครงท ไนไตรท

Area (µS*min) ไนเตรท

Area (µS*min) 1 0.001 0.024 2 0.001 0.023 3 0.001 0.020 4 0.001 0.020 5 0.001 0.020 6 0.001 0.021 7 0.001 0.022

จากตารางท 12 เมอน าคาทไดค านวณหาคา LOD และ LOQ โดย LOD = 3S.D. และ LOQ = 10S.D. น าคาทไดไปหารดวยคาความชน (Slope) ของสมการเสนตรง ผลการค านวณไดคา LOD = 0 nmol, LOQ = 0 nmol ส าหรบไนไตรท และ LOD = 0.011 nmol, LOQ = 0.036 nmol ส าหรบไนเตรท

จาการน าตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนทท าการสกดและกรองแลวมาฉดเขาเครองโครมาโทกราฟ (n=2) พบวาได Chromatogram ของตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ THAI ARM ขนาด 9 มม. ดงภาพท 40 (Chromatogram ของตวอยางเขมาดนปนทวเคราะหโดยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟแสดงในภาคผนวก)

ภาพท 40 Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ THAI ARM ขนาด 9 มม.

59

จากภาพท 40 เมอน า Chromatogram ของตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ THAI ARM ขนาด 9 มม. ไปเปรยบเทยบกบของสารมาตรฐาน จะไดวาตวอยางม Retention time ของไนไตรท เทากบ 3.08 min และ Retention time ของไนเตรท เทากบ 4.76 min จากนนน าตวอยางทเหลอมาวเคราะหตอดวยเทคนคโครมาโทกราฟ

จากการทดลองหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทบนมอของผยง โดยท าการยงดวยอาวธปนรวอลเวอร ยหอ Smith & Wesson ขนาด .38 special กบกระสนปน ยหอ AP ยงจ านวน 4 นด และในปลอกกระสนปนทยงดวยอาวธปนพกรวอลเวอร ยหอ Glock ขนาด .38 และอาวธปนพกกงอตโนมต ยหอ Smith & Wesson ขนาด 9 มม. กบกระสนปนยหอตางๆ ยงครงละ 3 นด ท าการเกบตวอยางทนท น ามาสกดเอาเขมาออก หลงจากนนฉดเขาเครองโครมาโทกราฟ จะไดคาพนทใตพคมาค านวณหาปรมาณของไนไตรทและไนเตรท โดยน ามาแทนคา y ในกราฟมาตรฐาน ซง พลอตระหวางคาพนทใตพคกบปรมาณของไนไตรทและไนเตรทในชวงปรมาณท 0.38 – 24.00 nmol ไดผลการทดลองดงตารางแสดงปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนทไดจากเครองโครมาโทกราฟตารางท 13

ตารางท 13 ปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนทไดจากเครองโครมาโทกราฟ

No. Sample ปรมาณไนไตรท

(NO2-/nmol)

SD ปรมาณไนเตรท

(NO3-/nmol)

SD

1 THAI ARM 9 มม. 229.20 0.0007 1957.74 0.0042 2 AP .38 303.53 0.0085 2890.98 0.0686 3 มอซาย 22.17 - 140.79 - 4 มอขวา 83.42 - 117.48 - 5 AP 9 มม. 118.27 0.0092 1472.35 0.1018 6 WIN .38 144.90 0.0318 557.59 0.1195 7 PMC .38 353.66 0.0099 6470.31 0.2432 8 RP 9 มม. 314.99 0.0219 988.34 0.0742 9 SPEER 9 มม. 170.29 0.0057 703.17 0.0007 10 RAI 9 มม. - - 819.59 -

หมายเหตเครองหมาย – หมายถงหาคาไมได ในตารางท 13 จากการวเคราะหดวยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ พบวาในตวอยาง

เขมาดนปนบนมอและในปลอกกระสนปนมปรมาณของไนเตรทมากกวาปรมาณของไนไตรท

60

4.4 ผลการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

จากการศกษาการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปน พบวาสามารถท าไดโดยปเปตตวอยางปรมาตร 10 µL ลงบนอปกรณตรวจวดไนไตรทและไนเตรทแบบกระดาษ ท าปฏกรยากนใชระยะเวลา 5 นาท ใหคาการวเคราะหทมความเทยงสง แสดงใหเหนวาวธ Griess assay บนอปกรณทประดษฐขนสามารถใชวเคราะหไดจรง ขนตอนตอไปจงท าการเปรยบเทยบระหวางการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper-based assay) และเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ โดยใชตวอยางเขมาดนปนบนมอและในปลอกกระสนปนทงหมด 10 ตวอยาง แสดงปรมาณในหนวย nmol ไดผลการทดลองดงตารางแสดงปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟตารางท 14 ตารางท 14 ปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

No. Sample Color ปรมาณไนไตรท (NO2

-/nmol) SD

ปรมาณไนเตรท (NO3

-/nmol) SD

1 THAI ARM

9 มม.

G 348.48 33.77 2159.95 525.30

RGB 345.38 53.01 2953.45 437.97

IC 229.2 0.0007 1957.74 0.0042

2 AP .38

G 347.89 29.33 4275.46 9.69

RGB 347.33 45.51 5319.15 522.88

IC 303.533 0.0085 2890.98 0.0686

3 มอซาย

G 20.92 3.22 259.95 31.94

RGB 33.42 5.67 257.78 20.94

IC 22.17 - 140.79 -

61

No. Sample Color ปรมาณไนไตรท (NO2

-/nmol) SD ปรมาณไนเตรท (NO3

-/nmol) SD

4 มอขวา

G 85.82 3.40 338.95 49.15

RGB 87.11 2.40 649.14 22.30

IC 83.42 - 117.48 -

5 AP 9 มม.

G 230.16 24.63 2437.16 48.99

RGB 244.07 30.39 2596.20 405.90

IC 118.27 0.0092 1472.35 0.1018

6 WIN .38

G 324.55 26.87 1436.53 134.92

RGB 359.98 38.63 1743.74 503.62

IC 144.9 0.0318 557.59 0.1195

7 PMC .38

G 476.88 41.59 6381.44 558.45

RGB 478.17 17.25 5617.91 693.03

IC 353.66 0.0099 6470.31 0.2432

8 RP 9 มม.

G 516.21 28.85 2208.27 95.72

RGB 530.22 45.37 1432.59 320.62

IC 314.99 0.0219 988.34 0.0742

9 SPEER 9 มม.

G 287.37 32.70 1853.10 118.35

RGB 222.46 48.73 1831.36 171.12

IC 170.29 0.0057 703.17 0.0007

10 RAI 9 มม.

G 3.91 1.34 513.83 36.73

RGB 18.91 0.93 437.09 73.25

IC - - 819.59 -

หมายเหตเครองหมาย – หมายถงหาคาไมได

62

จากตารางท 14 เนองจากในกราฟมาตรฐานซงพลอตระหวางคาความเขมสและปรมาณของไนไตรทและไนเตรท พบวาจากการอานคาความเขมสของสเขยว และ RGB ใหคาความชน(Slope) ของกราฟมากกวาจากการอานคาความเขมสของสแดง และสน าเงน แสดงวาจากการอานคาความเขมสของสเขยว และ RGB มความไวของสญญาณในการตรวจวดไนไตรทและไนเตรททมาก กวาจากการอานคาความเขมสของสแดง และสน าเงน จงไดเลอกใชความเขมสของสเขยว และ RGB ในการอานคาเพอใชในการหาปรมาณไนไตรทและไนเตรททมอยในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ และเมอน าปรมาณไนไตรททหาไดจากอปกรณตรวจวดแบบกระ ดาษเทยบกบปรมาณไนไตรททหาดวยวธมาตรฐาน (เทคนค IC ) มคาใกลเคยงกนมากกวาปรมาณของไนเตรททหาไดจากทงสองวธ อาจเนองมาจากการรดวซไนเตรทดวย Zinc บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษนนเปลยนเปนไนไตรทไดไมหมด จงท าใหปรมาณไนเตรททหาไดจากทงสองวธมคาใกลเคยงกนนอยกวาปรมาณของไนไตรททหาไดจากทงสองวธ และเมอน าคาทไดจากการอานคาความเขมสของสเขยว และ RGB และคาทไดจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟไปพลอตแผนภมแทง ไดผลการทดลองดงภาพแผนภมแทงแสดงปรมาณไนไตรทและไนเตรท ในหนวย nmol ของการวเคราะหตวอยางเขมาดนปน ดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโท กราฟดงภาพท 41 และ 42

ภาพท 41 แผนภมแทงแสดงปรมาณไนไตรท ในหนวย nmol ของการวเคราะหตวอยางเขมาดนปน ดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

0

100

200

300

400

500

600

700

ปรมาณไ

นไตรท (nm

ol)

ปรมาณทวดไดจากคาสเขยว ปรมาณทวดไดจากคาส RGB ปรมาณทหาไดจากเครอง IC

63

ภาพท 42 แผนภมแทงแสดงปรมาณไนเตรท ในหนวย nmol ของการวเคราะหตวอยางเขมาดนปน ดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

จากแผนภมแทงในภาพท 41 และ 42 เมอเปรยบเทยบปรมาณของไนไตรทและไน เตรทบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษและจากเครองโครมาโทกราฟ พบวาสวนใหญแลวปรมาณของไนไตรทและไนเตรททตรวจวดบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ มคาทใกลเคยงกบเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ และเมอน าปรมาณของไนไตรทและไนเตรททหาไดจากทงสองวธมาท าการพลอตกราฟ correlation เพอเปรยบเทยบกน ไดผลการทดลองดงกราฟพลอตระหวางปรมาณของไนไตรทและไนเตรททไดจากอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ กบคาจากเทคนคไอออนโครมาโท กราฟภาพท 43 และ 44 และตารางแสดงสมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของปรมาณไนไตรทและไนเตรททไดจากการเปรยบเทยบทงสองวธตารางท 15 และ 16

010002000300040005000600070008000

ปรมาณไ

นเตรท (nm

ol)

ปรมาณทวดไดจากคาสเขยว ปรมาณทวดไดจากคาส RGB ปรมาณทหาไดจากเครอง IC

64

ภาพท 43 กราฟพลอตระหวางปรมาณของไนไตรททไดจากอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ กบคาจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ (9 ตวอยาง) ตารางท 15 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของปรมาณไนไตรททไดจากการเปรยบเทยบทงสองวธ (9 ตวอยาง)

Color Equations r Green y = 1.3228x + 37.346 0.9264 RGB y = 1.3053x + 41.81 0.9011

0

100

200

300

400

500

600

0 100 200 300 400 500 600

Pap

er-

bas

ed

ass

ay (

nm

ol)

Ion Chromatography (nmol)

ปรมาณทวดไดจากคาสเขยว ปรมาณทวดไดจากคาส RGB

65

ภาพท 44 กราฟพลอตระหวางปรมาณของไนเตรททไดจากอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ กบคาจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ ตารางท 16 สมการเสนตรงและคาสมประสทธสหสมพนธของปรมาณไนเตรททไดจากการเปรยบเทยบทงสองวธ

Color Equations r Green y = 0.9474x + 659.41 0.9490 RGB y = 0.8758x + 872.14 0.8819

จากภาพท 43 และ 44 และตารางท 15 และ 16 พบวากราฟพลอตระหวางปรมาณของ

ไนไตรทและไนเตรททไดจากการอานคาความเขมสของสเขยว และ RGB บนอปกรณแบบกระดาษ และปรมาณของไนไตรทและไนเตรททไดจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟมคาความชน (Slope) และคาสมประสทธสหสมพนธทใกลเคยงเทากบ 1 แสดงใหเหนวาปรมาณของไนไตรทและไน เตรททวเคราะหไดระหวางบนอปกรณแบบกระดาษกบเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ มคาไมแตก ตางกน เปนการยนยนวาวธตรวจวดบนอปกรณแบบกระดาษสามารถวเคราะหหาปรมาณของไนไตรทและไนเตรทไดถกตองและแมนย าเทยบเทากบการหาปรมาณของไนไตรทและไนเตรทดวยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

Pap

er-

bas

ed

ass

ay (

nm

ol)

Ion Chromatography (nmol)

ปรมาณทวดไดจากคาสเขยว ปรมาณทวดไดจากคาส RGB

66

บทท 5 สรป อภปรายผล และขอเสนอแนะ

5.1 สรป ในงานวจยนไดประดษฐอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอวเคราะหหาปรมาณไน

ไตรทและไนไตรทในตวอยางเขมาดนปน โดยอปกรณทประดษฐขนมคณสมบต ไดแก วสดทใชในการประดษฐหาซอไดทวไป ราคาไมแพง ใชสารตวอยางและรเอเจนตในปรมาณนอย ใชเวลาในการวเคราะหรวดเรว และใชเครองมอการตรวจวดสญญาณทไมแพง

จากการศกษาสภาวะทเหมาะสมในการตรวจวดไนไตรทโดยใชอปกรณแบบกระดาษ ดวยวธ Griess assay จากนนตรวจวดดวยการถายภาพทเวลา 5 นาท เลอกอานคาความเขมสของสเขยวโดยใชโปรแกรม ImageJ พบวากราฟมาตรฐานไนไตรท มความเปนเสนตรงในชวงปรมาณ 0.15 – 1.80 nmol มคาสมประสทธสหสมพนธเทากบ 0.9968 มความสามารถในการท าซ าทปรมาณ 0.15, 0.60 และ 1.80 nmol ทมรอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธเทากบ 3.67, 2.79 และ 6.99 (n = 11) ตามล าดบ มขดจ ากดการตรวจวดและขดจ ากดการหาปรมาณ เทากบ 0.063 และ 0.211 nmol ตามล าดบ และสามารถเกบอปกรณตรวจวดไวทอณหภมหองไดนาน 6 วน ในตเยนนาน 11 วน

ส าหรบการตรวจวดไนเตรทในสภาวะทเหมาะสมบนอปกรณแบบกระดาษ โดยใช Zinc ในการรดวซเพอเปลยนใหอยในรปของไนไตรท กอนท าปฏกรยากบ Griess reagent จากนนตรวจวดทเวลา 5 นาทโดยการถายภาพ เลอกความเขมสของสเขยวในการอานคาโดยใชโปรแกรม ImageJ พบวากราฟมาตรฐานทชวงปรมาณ 2.0 – 10.0 nmol มความเปนเสนตรง มคาสมประสทธสหสมพนธเทากบ 0.9953 ทปรมาณ 2.0, 6.0 และ 10.0 nmol มความสามารถในการท าซ าของการวเคราะหทมรอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธเทากบ 3.01, 3.79 และ 4.76 (n = 14) ตามล าดบ มขดจ ากดการตรวจวดและขดจ ากดการหาปรมาณ เทากบ 0.840 และ 2.801 nmol ตามล าดบ และเกบอปกรณตรวจวดไดนาน 2 วนทอณหภมหอง และนาน 5 วนในตเยน

จากผลการทดลองขางตนจะเหนไดวาสอดคลองกบผลการวจยของ Manori B. Jayawardane และคณะ[9] ทท าการวเคราะหหาไนไตรทและไนเตรท โดยอาศยปฏกรยา Griess reaction ในตวอยางน าธรรมชาตและน าทผานการสงเคราะหมาแลว บนอปกรณตรวจวดแบบกระ ดาษ จากนนน าไปอานคาความเขมสของสเขยวโดยใชโปรแกรม ImageJ พบวาความเขมสทอานไดสามารถหาปรมาณของไนไตรทและไนเตรทไดใกลเคยงกบคาทหาไดจากเทคนคไอออนโครมาโท กราฟ และถาเกบอปกรณใสในถงซปไวในตเยนอณหภม ≤ 4 °C จะมความเสถยร สามารถเกบไวใชงานไดนานกวาเมอเกบไวทอณหภมหอง นอกจากนยงสอดคลองกบงานวจยของ Samir A. Bhakta และคณะ[19] และ Nuria Lopez-Ruiz และคณะ[20] ทท าการหาปรมาณไนไตรท ดวยวธ

67

Griess assay บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ และเมอน าความเขมสทไดมาอานคา พบวาสามารถหาปรมาณของไนไตรทได

เมอน าปรมาณของไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปนทไดจากมอผยงและในปลอกกระสนปนทตรวจวดบนอปกรณแบบกระดาษมาพลอตกราฟเทยบกบปรมาณทหาไดจากเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ พบวาทปรมาณของไนไตรท มคาสมประสทธสหสมพนธเทากบ 0.9264 และทปรมาณของไนเตรท มคาสมประสทธสหสมพนธเทากบ 0.9490 ซงคาทไดมคาใกลเคยงเทากบ 1 แสดงวาอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทสรางขนสามารถน าไปใชงานในภาค สนามเพอหาปรมาณของไนไตรทและไนเตรทได 5.2 อภปรายผล

งานวจยนเปนงานวจยทตองการประดษฐอปกรณแบบกระดาษเพอหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในตวอยางเขมาดนปน ซงเปนพยานหลกฐานทส าคญทใชบงบอกถงผทกระท าความ ผดทเกยวของกบอาวธปนได ใหมความแมนย าและถกตอง สามารถน าไปประยกตใชในกระบวน การสบสวนสอบสวนในภาคสนามได จากการทดลอง พบวาสามารถหาปรมาณไนไตรทและไน เตรทในตวอยางเขมาดนปนบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษได โดยการถายภาพ แลวน าไปอานคาความเขมสของสเขยวโดยใชโปรแกรม ImageJ ซงปรมาณทหาไดนนมคาใกลเคยงกบเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ และหากตองการเกบอปกรณตรวจวดแบบกระดาษไวใชงานไดนานควรเกบไวในถงซปใสไวในตเยน ซงจากผลการทดลองดงกลาว อาจมหลายปจจยทสงผลตอการทดลองได เชน เทคนคการสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ วธการตรวจวด และคาไนไตรทและไนเตรทในแตละตวอยาง เปนตน 5.3 ขอเสนอแนะ

1. งานวจยนไดวเคราะหเขมาดนปนบนมอและในปลอกกระสนปน จงควรท าการทดลองเขมาดนปนจากแหลงอนบาง

2. ศกษาผลของตวรบกวน (Interferences) ทอาจมผลตอการวเคราะหไนไตรทและไนเตรทบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพมเตม

68

รายการอางอง

รายการอางอง

1. Tarifa, A. and J.R. Almirall, Fast detection and characterization of organic and inorganic gunshot residues on the hands of suspects by CMV-GC–MS and LIBS. Science & Justice, 2015. 55: p. 168-175.

2. Costa, R.A., et al., Gunshot residues (GSR) analysis of clean range ammunition using SEM/EDX, colorimetric test and ICP-MS: A comparative approach between the analytical techniques. Microchemical Journal, 2016. 129: p. 339-347.

3. Aliste, M. and L.G. Chavez, Analysis of gunshot residues as trace in nasal mucus by GFAAS. Forensic Science International, 2016: p. 14.

4. Brozek-Mucha, Z., Distribution and properties of gunshot residue originating from a Luger 9mm ammunition in the vicinity of the shooting gun. Forensic Science International, 2009. 183: p. 33-44.

5. Conrad, E.C., Evidential implications of the dermal nitrate test for gunpowder residues. Marquette Law Review, 1961. 44: p. 500-517.

6. เบญจ พฒนล and ศภชย ศภลกษณนาร, การวเคราะหหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทในเขมาดนปนดวยไอออนโครมาโทกราฟ. Veridian E-Journal, 2555. 5: p. 730-741.

7. ยทธพงศ เศรษฐสมบต and ศรรตน ชสกลเกรยง, การหาปรมาณไนเตรทและไนไตรทในเขมาปนทตดบนผวรถยนต โดยเทคนคไอออนโครมาโตกราฟ. Veridian E-Journal, 2557. 1: p. 64-75.

8. Petraco, N., M. Yander, and J. Sardone, A method for the quantitative determination of nitrites in gunshot residue cases. 1981, The Lancet Publishing Group, a division of Elsevier Science Ltd. p. 85.

9. Jayawardane, B.M., et al., Microfluidic Paper-Based Analytical Device for the Determination of Nitrite and Nitrate. ANALYTICAL CHEMISTRY, 2014. 86(15): p. 7274-7279.

10. Ravgiala, R.R., et al., Using Paper-Based Diagnostics with High School Students To Model Forensic Investigation and Colorimetric Analysis. JOURNAL OF CHEMICAL EDUCATION, 2014. 91(1): p. 107-111.

11. Martinez, A.W., et al., Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION, 2007. 46(8): p. 1318-

69

1320.

12. Cate, D.M., et al., Recent Developments in Paper-Based Microfluidic Devices. ANALYTICAL CHEMISTRY, 2015. 87(1): p. 19-41.

13. ธรรมภรณ ธนวฒนวงศธร, เอกสารประกอบการสอนวชานตวทยาศาสตร 2. ภาควชาวทยาการต ารวจ กลมงานวชาการสบสวนและสอบสวน กองบงคบการวชาการ โรงเรยนนายรอยต ารวจ.

14. Harry, F., et al., Measurement of Nitric Oxide Production in Biological Systems by Using Griess Reaction Assay. Sensors, Vol 3, Iss 8, Pp 276-284 (2003), 2003(8): p. 276.

15. ภาควชาวศวกรรมสงแวดลอม จฬาลงกรณมหาวทยาลย. เทคนค Ion chromatography. 5 กรกฎาคม 2560]; Available from: http://www.env.eng.chula.ac.th/?q=content/ion-chromatography-ic.

16. มนคง, ป., การหาปรมาณไนไตรทและไนเตรทบนมอของผยงปนโดยเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ / โดย ปยะชย มนคง. 2555, นครปฐม :: สาขาวชานตวทยาศาสตร บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร. ง-ฎ, 72 หนา : ภาพประกอบส, ตาราง.

17. โกฏทอง., น., การตรวจพสจนเขมาปนบนเสนผมโดยเทคนค UV-Visible Spectroscopy / โดย นเรศ โกฏทอง. 2556, นครปฐม :: สาขาวชานตวทยาศาสตร บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร. ง-ญ, 58 แผน : ภาพประกอบส, ตาราง.

18. Ellis, P.S., et al., Field measurement of nitrate in marine and estuarine waters with a flow analysis system utilizing on-line zinc reduction. Talanta, 2011. 84: p. 98-103.

19. Bhakta, S.A., et al., Determination of nitrite in saliva using microfluidic paper-based analytical devices. Analytica Chimica Acta, 2014. 809: p. 117-122.

20. Lopez-Ruiz, N., et al., Smartphone-Based Simultaneous pH and Nitrite Colorimetric Determination for Paper Microfluidic Devices. ANALYTICAL CHEMISTRY, 2014. 86(19): p. 9554-9562.

21. วมล แสงนาค, การพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณแบบกระดาษเพอการวเคราะหแบบรผลรวดเรวของฤทธตานนอนมลอสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาต, in สาขาวชาเคมศกษา. 2558, มหาวทยาลยบรพา.

70

ภาคผนวก

71

ภาคผนวก ก กราฟจากการศกษาการวเคราะหสารมาตรฐานไนไตรทและไนเตรทดวยอปกรณทไดสรางขน

72

กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของสารละลาย Sulfanilamide (n=3) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของสารละลาย NED (n=3) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

73

กราฟพลอตระหวางคาความเขมสกบปรมาณของสารมาตรฐานไนไตรท (n=3) โดย (A) คาความเขมสของสแดง (B) คาความเขมสของสเขยว (C) คาความเขมสของสน าเงน (D) คาความเขมสของ RGB

74

ภาคผนวก ข Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนบนมอและในปลอกกระสนปน

75

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ AP ขนาด .38

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนบนมอขางซาย

76

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนบนมอขางขวา

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ AP ขนาด 9 มม.

77

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ WIN ขนาด .38

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ PMC ขนาด .38

78

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ RP ขนาด 9 มม.

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ SPEER ขนาด 9 มม.

79

Chromatogram ของไอออนทสกดจากตวอยางเขมาดนปนในปลอกกระสนปนยหอ RAI ขนาด 9 มม.

80

ประวตผ เขยน

ประวตผเขยน

ชอ-สกล อรอษา เตยวตระกล

วน เดอน ป เกด 22 มนาคม 2534 สถานทเกด นครปฐม

วฒการศกษา ปรญญาตรวทยาศาสตรบณฑต (เคม) ทอยปจจบน บานเลขท 22 หมท 6 ต าบลวดแกว อ าเภอบางแพ จงหวดราชบร