physikalische chemie die geschichte mit dem rostigen · pdf filekorrelation zwischen der...
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Die Geschichte mit dem rostigen Nagel
und der Blutvergiftung…
Lipopolysaccharide und das endotoxische Prinzip
Patrick Garidel
und
Klaus Brandenburg
Martin-Luther-Universität
Halle/Wittenberg
Physikalische Chemie
Forschungszentrum Borstel, Leibniz-
Zentrum für Medizin und Biowissenschaften
Biophysik
Erregerspektrum bei Sepsis
• Bakterien: gram + und gram -
• Pilze
• Viren
• Protozoen
Drei gefürchtete Sepsis-Erreger. Von links: Pseudomonas
aeroginosa, ein Gram-negatives Bakterium; Streptococcus
pneumoniae, ein Gram-positives Bakterium; Aspergillus
fumigatus, ein Pilz
Bakterielle Endotoxine und LPS
Gram-negativ
Bakterien
Bakterielles Lipopolysaccharid (LPS)
In der äusseren Zellwand von Gram-negativen Bakterien (Enterobacteriaceae und Pseudomonadaceae)
Endotoxische Prinzip
LPS: Salmonella minnesota
HOHO
O
O
O
OH
OO
O
O
O
P
OHOHO
HO
NH
O
O O
O
O
O
O
O
14 14 14 12 16
O
O O
O OP P
O
HO
NH
O
OO
OH
14 14
O
O-
HOHO
O
OH
O- O-
HO
O
OO-
O-
NH3
+
NH3
+
LPS: Salmonella minnesota
HOHO
O
O
O
OH
OO
O
O
O
P
OHOHO
HO
NH
O
O O
O
O
O
O
O
14 14 14 12 16
O
O O
O OP P
O
HO
NH
O
OO
OH
14 14
O
O-
HOHO
O
OH
O- O-
HO
O
OO-
O-
NH3
+
NH3
+
Polar =
Wasserliebend
Apolar =
Wasserabweisend
Aggregatbildung
Beziehung zwischen Molekülgeometrie und Supra-
molekularer Struktur
Packungskonzept nach Israelachvili
lamellar (L)
cubic (Q)
hexagonal(HII)
I
I
I
s
s
s
GlcNacGlcN
GlcN
KdoHepGal
Glc Glc KdoHepHepGal
P
P
P
C
C
LPS Re / R595
LPS Ra / R60
LPS S-form / wild-type
LPS Rd2 / R4
Lipid A
Zusätzliche Variationen:
- Anzahl an KW-ketten
- Länge der KW-ketten
- Sättigungsgrad
- Verknüpfung
- Ladung (Phosphat-
gruppen)
Beziehung Struktur versus Bioaktivität
Biophysikalische
Untersuchungen
Biologische Assays
(TNF-a, IL, Hämolyse,
LAL etc)
Aggregatbildung und biologische Aktivität
Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga
Biophysikalsiche Charakterisierung
Beziehung zwischen Molekülgeometrie und Bio-Aktivität
Biophysikalische Untersuchungen an LPS
Spektroskopie
(FTIR, CD, Fluoreszenz)
Kalorimetrie
(DSC, ITC)
Filmwaagetechniken
(FW, BAMS, Patch-Clamp)
Morphologie
(AFM, FF-EM)
X-ray
(SAXS, WAXS) Streuung
(RALS, PCS)
Ladung
(Zeta-Potential)
MALDI-TOF
Brandenburg, Hawkins, Garidel, Andrä et al. (2004) Biochem 43: 4039
Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga
Verschiedene Spacerlänge
Verschiedene Stereochemie
X-Ray (SAXS) und Supramolekulare Struktur
lamellar (L)
cubic (Q)
hexagonal(HII)
I
I
I
s
s
s
Verhältnisse
der
Reflexpositionen
1, 2, 3, 4, 5, …
1, 2, 3, 2, 5 …
1, 3, 2, 7, 3 …
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
5.99 nm 4.27 nm
3.22 nm
8.70 nm
803022
s / nm-1
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
2.76 nm
5.58 nm3.76 nm
11.38 nm
ER805259
s / nm-1
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
3.95 nm
ER805046
s / nm-1
Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga
SAXS
0.2 0.4 0.6 0.8
20 °C
70 °C
1.03 nm1.39 nm1.87 nm
2.08 nm
3.75 nm
3.89 nm
1.95 nm
4.15 nm
ER805046
s / nm-1
0.2 0.4 0.6 0.8
20 °C
50 °C
2.29 nm1.14 nm
4.59 nm ER805259
s / nm-1
0.2 0.4 0.6 0.8
5.55 nm
3.20 nm4.39 nm
6.91 nm
20 °C
50 °C
4.98 nm
2.76 nm
ER803022
s / nm-1
Brandenburg, Hawkins, Garidel, Andrä et al. (2004) Biochem 43: 4039
0
100
200
300
400
500
600
700
TN
F-a
pro
du
ctio
n (
pg
/ml)
ER803732 ER805256 ER803022 ER805259 ER804044 ER805046
EISAI compounds
10000
1000
100
10
1
0.1
0.01
Concentration
in ng/ml
n=0
R,S,S,R
n=0
R,R,S,S
n=0
R,R,R,R
n=4
R,R,R,R
n=0
S,S,S,S
n=8
R,R,R,R
Untersuchungen an synthetischen Lipid A Analoga
ELISA
Endotoxin: Signalerkennung und -transduktion
Cohen, 2002
TLR4 =
Toll-Like-Rezeptor 4
LBP =
LPS BindeProtein
NFB =
Transkriptionsfaktor
Endotoxin: Signalerkennung und -transduktion
Cohen, 2002
TLR4 =
Toll-Like-Rezeptor 4
LBP =
LPS BindeProtein
NFB =
Transkriptionsfaktor
TLR-4 & LPS
Dr. med A. Koch
Endotoxin: Signalerkennung und -transduktion
Cohen, 2002
TLR4 =
Toll-Like-Rezeptor 4
LBP =
LPS BindeProtein
NFB =
Transkriptionsfaktor
Korrelation zwischen der supramolekularen Struktur
und der Bio-Aktivität
Lipid A
Supramolekulare
Struktur
Molekulare
Konformation
Endotoxizität
Rb. capsulatus Rs. fulvum
C. violaceum Rp. viridis
C. jejuni S. minnesota
Mono- phosphoryl
E. coli S. minnesota
Bisphosphoryl
Rc. gelatinosus
Lamellar Invertiert
L L / Q Q HII
Inaktiv Aktiv
Nicht-toxisch keine Zytokin-
induktion
Moderat toxisch Zytokin-
indukction
Hochtoxisch Starke Zytokin-
Induktion
Peptid Wechselwirkung mit Endotoxinen
Bindungseigenschaften von Polypetid-Antibiotika
an Endotoxinen
Bindungsmechanismus
Peptid Optimierungsstrategien abzuleiten
Polymyxin B / Nonapeptide
Brandenburg, David, Howe, Koch, Andrä, Garidel (2005) Biophys. J. 88: 1845
Polymyxine (5+): Wichtigste Vertreter
der Polypeptid-Antibiotika, deren
charakterist. Bausteine L-2,4-Diamino-
buttersäure (DAB), L-Threonin (Thr), D-
Phenylalanin (Phe) sowie L- u. D-Leucin
(Leu) sind.
PMB/PMBN: Neutralisierungsagentien
Bei höheren Konzentrationen: toxisch
Isothermal Titration Calorimetry
Garidel, Hildebrand, Blume (2004) MicroCal Application Note
PMB:LPS Re - Bindung
Brandenburg, David, Howe, Koch, Andrä, Garidel (2005) Biophys. J. 88: 1845
PMB: 5+
LPS Re: 4-
70
75
80
85
90
95
100
105
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000
Hea
t F
low
/ µ
J·s
-1
T = 20 °CLPS Re + PMB
Time / s
PMB LPS Re
Sättigung
Ladungskompensation
ITC
LPS
Polymyxin B
David (2001) J Mol Recog 14: 370
Bhattacharjya et al. (1997) Biopolymers 41: 251
Lösungs-struktur und
Sequenz von PMB
Polymyxin B - Lipid A Bindung
David (2001) J Mol Recog 14: 370
Bindungsaffinität mM
PMP/PMBN Bindung an Endotoxine
Bindungsmechanismus:
• Schritt 1: Elektrostatische Wechselwirkung zwischen Peptid und
Endotoxin
• Schritt 2: Peptid Penetration/Einbau (hydrophobe KW-kette) in die
Endotoxin Membran
PMB > PMBN
Peptide von Interesse: BPI (Bactericidal/Permeability Increasing
protein), CAP37 (Cationic Antimicrobial Protein), LALF (Limulus
Anti-LPS Factor), lactoferrin/lactoferricin, NK (Natural Killer), ….
Neue Strategieansätze zur Entwicklung von
Therapeutischen Wirkstoffen zwecks Reduktion der Sepsis