plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · ii uji aktivitas antioksidan ekstrak daun...

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN SINGKONG

(Manihotis Folium) MENGGUNAKAN METODE

DIPHENYLPICRYL HYDRAZYL (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :Bernadeta Ardy Puspitarini

NIM : 068114074

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2010

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN SINGKONG

(Manihotis Folium) MENGGUNAKAN METODE

DIPHENYLPICRYL HYDRAZYL (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :Bernadeta Ardy Puspitarini

NIM : 068114074

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2010


iii


iv


v

Tuhan tidak meminta kita untuk sukses;

DIA hanya meminta kita untuk mencoba..

(Mother Teresa)

Karya ini kupersembahkan untuk..

Tuhan serta orang-orang yang kukasihi,

Ibu, Bapak, & kakak-kakakku

Sahabat & Almamaterku


vi


vii

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan atas semua berkat dan penyertaan-Nya kepada

penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan akhir ini dengan baik.

Laporan akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan utnuk

memperoleh gelar Sarjana Strata 1 Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).

Penulis banyak mengalami kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan

laporan ini. Tetapi dengan adanya bantuan dari berbagai pihak, akhirnya penulis

dapat menyelesaikan laporan akhir ini. Oleh karena itu dengan segala kerendahan

hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah

diberikan kepada:

1. Rita Suhadi M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

2. Yohanes Dwiatmaka M.Si., selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bimbingan dan pengarahan kepada penulis dengan penuh

pengertian.

3. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. dan Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen

penguji, yang telah menguji sekaligus memberi arahan, kritik, dan saran yang

membangun bagi penulis.

4. Agatha Budi Susiana Lestari, M.Si., Apt., selaku dosen penanggung jawab

proyek “Optimasi Formula dan Kontrol Kualitas Sediaan Tablet Effervescent

Ekstrak Centellae asiatica Herba dan Manihotis Folium”.


viii

5. Keluarga (Ibu, Bapak, dan kakak-kakak penulis) atas kasih sayang dan

dukungan yang telah diberikan kepada penulis, baik itu secara moral maupun

materiil.

6. Agustinus Agus Kurniawan, yang telah setia menemani penulis, terima kasih

karena telah membuat hidupku menjadi lebih berwarna dan semakin hidup.

7. Teman-teman proyek (Uut, Nika, dan Rudi) atas kerja sama, suka, dan duka

yang telah dilalui bersama selama terlibat dalam pengerjaan proyek ini

8. Mas Wagiran, Mas Bimo, Mas Sigit, Mas Sarwanto, Mas Andri, Mas Otok,

Mas Agung, serta laboran-laboran lain, atas bantuan yang telah diberikan

selama ini.

9. Sahabat-sahabatku (Choey, Ange, Ulan, Nisha, Chiby, Sita, Mas Wisnu, dan

Mas Dedy), atas persabatan kita selama ini.

10. Teman-temanku di kost (Atik, Odi, dan Martha) atas segala kerelaannya

membantu penulis.

11. Teman-teman FST angkatan 2006, untuk kebersamaannya selama ini.

12. Pihak-pihak lain yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu, atas bantuan

dan dukungan yang telah diberikan selama ini.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan laporan akhir ini banyak

kesalahan dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan

penulis. Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari

semua pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.

Penulis


ix


x

INTISARI

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang berperan dalam menghambatoksidasi yang diperantarai oksigen. Salah satu senyawa alam yang diketahuimempunyai aktivitas antioksidan adalah flavonoid. Daun singkong (ManihotisFolium) dari tanaman singkong (Manihot utilissima Pohl.) telah diketahuimempunyai kandungan rutin yang merupakan salah satu jenis senyawa flavonoid.

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidanekstrak daun singkong menggunakan metode diphenylpicryl hydrazyl (DPPH).Besarnya aktivitas antioksidan ekstrak dinyatakan sebagai EC50.

Prinsip metode DPPH adalah kemampuan suatu senyawa untukmenangkap radikal DPPH. DPPH memberikan warna violet pada panjanggelombang 517 nm yang merupakan panjang gelombang serapan maksimumDPPH. Penangkapan radikal bebas oleh senyawa antioksidan menyebabkanelektron bebas pada DPPH menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkanberkurangnya intensitas warna violet dari DPPH. Pengurangan intensitas warnaviolet ini sebanding dengan jumlah DPPH yang mampu ditangkap oleh senyawaantioksidan.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun singkong mempunyaiaktivitas antioksidan dengan nilai EC50 sebesar 4,6170 ± 0,2570 mg/mL. Nilai inimenunjukkan konsentrasi ekstrak daun singkong yang diperlukan untukmenghilangkan 50% aktivitas DPPH.

Kata kunci : daun singkong, Manihot utilissima Pohl., antioksidan, rutin, DPPH,EC50


xi

ABSTRACT

Antioxidant is a substrate which has a role to impede oxidation which ismediated by oxygen. One of natural substrates which is known as havingantioxidant activity is flavonoid. Cassava leaves (Manihotis Folium) of cassavaplants (Manihot utilissima Pohl.) have been known to contain rutin which isincluded in flavonoid.

The aim of this research is to figure out the antioxidant activity of cassavaleaves extract by applying diphenylpicryl hydrazyl (DPPH) method. The rate ofantioxidant activity extract is called EC50.

The principal of DPPH method is on the ability of a substrate to catch theDPPH radical. DPPH produces violet colour on 517 nm wavelength which is themaximum absorbance wavelength of DPPH. The catch of free radicals by theantioxidant substrates will cause the unbound electrons on DPPH moleculebecome pairs which reduces the violet colour intensity of DPPH. The reducing ofviolet colour intensity is comparable with the amount of DPPH which could becaught by the antioxidant.

The result of this research shows that cassava leaves extract hasantioxidant activity with the EC50’s value 4,6170 ± 0,2570 mg/mL. This valueshows the concentration of cassava leaves extract which is needed to reduce 50%of DPPH activity.

Key words : cassava leaves, Manihot utilissima Pohl., antioxidant, rutin,DPPH,EC50.


xii

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL………………………………………………………....i

HALAMAN JUDUL ………………………………………………………….ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……………………….....iii

HALAMAN PENGESAHAN ………………………………………….iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ………………………………………......v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .................vi

PRAKATA ………………………………………………………………….vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………………………………......ix

INTISARI …………………………………………………………………...x

ABSTRACT ………………………………………………………………......xi

DAFTAR ISI ………………………………………………………………….xii

DAFTAR TABEL …………………………………………………………xvi

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………..xviii

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………….....ixx

BAB I PENDAHULUAN ……………………………………………………1

A. Latar Belakang ……………………………………………………1

B. Tujuan ……………………………………………………………3

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ……………………………………………4

A. Tanaman Singkong ……………………………………………4

1. Keterangan botani tanaman singkong ……………………4

2. Morfologi tanaman singkong ……………………………4


xiii

3. Kandungan daun singkong ……………………………4

B. Flavonoid ……………………………………………………4

C. Radikal Bebas ……………………………………………………6

D. Antioksidan …………………………………………………….7

1. Definisi dan aktivitas senyawa antioksidan …………….7

2. Penggolongan antioksidan …………………………….7

3. Metode pengujian aktivitas antioksidan …………………….7

E. Diphenylpicryl Hydrazyl (DPPH)…………………………………….9

F. Metode Penyarian ……………………………………………………10

G. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ……………………………………12

H. Standarisasi Ekstrak ……………………………………………13

I. Validasi Metode Analisis ……………………………………………14

J. Spektrofotometri Visibel ……………………………………………16

K. Landasan Teori ……………………………………………………19

L. Hipotesis ……………………………………………………20

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ……………………………………21

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ……………………………………21

B. Variabel dan Definisi Operasional ……………………………21

1. Klasifikasi Variabel ……………………………………21

2. Definisi Operasional ……………………………………21

C. Bahan Penelitian ……………………………………………………22

D. Alat Penelitian ……………………………………………………22

E. Tata Cara Penelitian ……………………………………………22


xiv

1. Determinasi tanaman ……………………………………22

2. Pengumpulan bahan ……………………………………22

3. Pembuatan serbuk simplisia daun singkong ……………23

4. Pembuatan ekstrak daun singkong secara maserasi ……23

5. Uji kualitas ekstrak daun singkong ……………………23

6. Analisis kualitatif kandungan rutin dengan metode KLT……24

7. Pembuatan larutan DPPH ……………………………………25

8. Pembuatan larutan stok rutin ……………………………25

9. Pembuatan larutan standar rutin ……………………………25

10. Pembuatan larutan uji ……………………………………25

11. Optimasi metode ……………………………………………25

a. Penentuan panjang gelombang serapan

maksimum ……………………………………25

b. Penentuan reaction time ……………………………26

12. Validasi metode DPPH ……………………………………26

13. Uji DPPH ……………………………………………………26

14. Analisis Hasil …………………………………………....27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN …………………………………....28

A. Hasil Determinasi Tanaman ……………………………………28

B. Hasil Pengumpulan Bahan ……………………………………28

C. Pembuatan Serbuk Daun Tanaman Singkong ……………………29

D. Pembuatan Ekstrak Daun Singkong ……………………………31

E. Hasil Uji Kualitatif Senyawa Rutin dengan Metode KLT ……34


xv

F. Standarisasi Ekstrak Daun Singkong ……………………………38

G. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum ……………39

H. Penentuan Reaction Time ……………………………………………41

I. Validasi Metode Analisis ……………………………………………42

J. Hasil Uji Penangkapan Radikal Bebas dengan Metode DPPH ..…..45

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………………51

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………52

LAMPIRAN .......................................................................................................55

BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………....70


xvi

DAFTAR TABEL

Tabel I Kriteria Nilai Akurasi yang Masih dapat Diterima Menurut

APVMA (2004) ……………………………………………14

Tabel II Kriteria Nilai Presisi yang Masih dapat Diterima Menurut

APVMA (2004) ……………………………………………15

Tabel III Keterangan gambar untuk penotolan baku pada uji kualitatif

Rutin ……………………………………………………………36

Tabel IV Keterangan gambar untuk penotolan sampel pada uji kualitatif

rutin ……………………………………………………………37

Tabel V Hasil uji kualitatif keberadaan rutin dengan metode KLT ……38

Tabel VI Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum

di sekitar peak ……………………………………40

Tabel VII Nilai perolehan kembali (% recovery) validasi metode

analisis ……………………………………………………43

Tabel VIII Nilai CV hasil validasi metode analisis ……………………44

Tabel IX Aktivitas Penghambatan Radikal Bebas oleh Ekstrak Daun

Singkong (EC50) ....................................................................49

Tabel X Hasil Penentuan Reaction Time ……………………………58

Tabel XI Data penimbangan DPPH untuk Validasi Metode Analisis……...59

Tabel XII Data absorbansi untuk pengerjaan I validasi metode

analisis ……………………………………………………59

Tabel XIIII Data absorbansi untuk pengerjaan II validasi metode

analisis ……………………………………………..……..60


xvii

Tabel XIV Data absorbansi untuk pengerjaan III validasi metode

analisis …………………………………………....………60

Tabel XV Data Penimbangan Ekstrak Daun Singkong ……………………63


xviii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid ……………………….……………5

Gambar 2. Stuktur Rutin ………………………………………………….....5

Gambar 3. Diphenylpicryl hydrazyl (radikal bebas) ……………………………10

Gambar 4. Diphenylpicryl hydrazyl (non radikal) ……………………………10

Gambar 5. Tingkat energi elektronik ……………………………………………17

Gambar 6. Serbuk simplisia daun singkong kering ……………………………30

Gambar 7. Reaksi pembentukan kompleks antara ion Ca2+ yang terdapat

pada plat silika dengan senyawa rutin ............................................35

Gambar 8. Kromatogram hasil uji kualitatif flavonoid dalam ekstrak daun

singkong dengan fase diam selulosa dan fase gerak campuran

n-butanol : asam asetat : air (5:1:4 (v/v)), deteksi dengan diuapi

NH3 ……………………………………….. ……………….…36

Gambar 9. Foto grafik hasil scanning panjang gelombang serapan

maksimum ……………………………………………………41

Gambar 10. Mekanisme penghambatan radikal bebas DPPH (·R) oleh senyawa

rutin. …………………………………………………………....47

Gambar 11. Foto grafik absorbansi DPPH saat penentuan Reaction Time............58


xix

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman Singkong ……………………………56

Lampiran 2. Perhitungan Rendemen Ekstrak Daun Singkong…………………...57

Lampiran 3. Penentuan Reaction Time ……………………………………58

Lampiran 4. Contoh Perhitungan Validasi Metode Analisis ……………………59

Lampiran 5. Contoh Perhitungan Recovery kadar DPPH ……………………61

Lampiran 6. Contoh Perhitungan CV untuk Validasi Metode Analisis ……62

Lampiran 7. Contoh perhitungan EC50 Ekstrak Daun Singkong ……………63

Lampiran 8. Hasil penentuan susut pengeringan ekstrak daun singkong ……66

Lampiran 9. Hasil penentuan kadar abu ekstrak daun singkong ……………67

Lampiran 10. Foto-foto penelitian ……………………………………………69


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Radikal bebas merupakan faktor yang dapat menginduksi timbulnya

penyakit degeneratif, karena dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lemak,

dan bahkan DNA sel (Amrun dan Umiyah, 2005). Oksidasi molekul dapat

dihambat oleh suatu senyawa yang disebut antioksidan (Sunarni, Pramono, dan

Asmah, 2007).

Tubuh memerlukan antioksidan eksogen karena tidak mempunyai sistem

pertahanan oksidatif yang memadai terhadap paparan radikal yang berlebihan.

Antioksidan alami menjadi alternatif karena terdapat kekhawatiran terhadap efek

samping antioksidan sintetik (Rohdiana, 2001). Antioksidan alami dapat diperoleh

dari asupan bahan makanan, seperti vitamin C, E, A, flavonoid, dan juga β-

karoten.

Sejumlah flavonoid, termasuk rutin, kuersetin, morin, gossipetin, krisin,

mirisetin, katekin dan derivatnya, serta proantosianidin oligomerik telah terbukti

dalam studi in vitro dapat menghambat oksidasi dari low density lipoprotein

(LDL) (Miller, 1996).

Salah satu bahan alam yang diduga memiliki aktivitas antioksidan adalah

Manihotis Folium, yaitu simplisia berupa daun yang berasal dari tanaman

singkong (Manihot utilissima Pohl.). Bahruddin, Sirait, dan Moesdarsono (2007)

mengemukakan bahwa daun singkong mengandung rutin sebesar 0,71%(b/b) pada

daun yang muda, daun tua 0,35%(b/b) dan daun kuning 0,16%(b/b). Menurut


2

Miller (1996), rutin mempunyai aktivitas antioksidan karena telah terbukti

dalam studi in vitro dapat menghambat oksidasi LDL. Oleh karena itu dalam

penelitian ini ingin diketahui berapa besar aktivitas antioksidan ekstrak daun

singkong. Untuk mengetahui berapa besar aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh

ekstrak daun singkong, maka dilakukan uji daya antioksidan menggunakan

metode diphenylpicryl hydrazyl (DPPH). Metode ini digunakan karena secara

teknik pengerjaan, kelarutan ekstrak daun singkong rendah dalam air, sehingga

dipakai metode yang menggunakan pelarut yang sesuai untuk ekstrak. Selain itu,

metode DPPH juga sederhana untuk dikerjakan (Karadag, Ozcelik, dan Saner,

2009). Aktivitas antioksidan dari suatu senyawa dapat diketahui dari adanya

penurunan absorbansi DPPH yang terjadi akibat penambahan senyawa tersebut

(Sunarni, dkk., 2007). Konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari

konsentrasi DPPH awal didefinisikan sebagai EC50 (Efficient Concentration 50)

(Karadag, dkk., 2009). Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai EC50

yang dihasilkan, bahwa semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu senyawa, maka

semakin rendah nilai EC50 yang dihasilkan (Molyneux, 2003).

Berdasarkan hal-hal di atas, maka penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui aktivitas ekstrak daun singkong sebagai antioksidan dan mengukur

nilai aktivitas antioksidan ekstrak tersebut menggunakan metode DPPH.

1. Perumusan Masalah

Berapa nilai aktivitas antioksidan ekstrak daun singkong yang dinyatakan

sebagai EC50 melalui pengujian menggunakan metode DPPH?


3

2. Keaslian Penelitian

Sejauh penelusuran pustaka oleh penulis, penelitian tentang uji

antioksidan ekstrak daun singkong menggunakan metode diphenylpicryl

hydrazyl (DPPH) belum pernah dilakukan.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi bagi penelitian

lebih lanjut maupun masyarakat luas mengenai potensi ekstrak daun

singkong sebagai antioksidan alami.

b. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan pada

perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi, khususnya

tentang penggunaan metode DPPH dalam menguji aktivitas antioksidan

bahan alam.

B. Tujuan

Mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak daun singkong yang

dinyatakan sebagai EC50 melalui pengujian menggunakan metode DPPH.


4

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Singkong

1. Keterangan botani tanaman singkong

Tanaman singkong (Manihot utilissima Pohl.) termasuk dalam famili

Euphorbiaceae dan lebih dikenal dengan nama ubi kayu ( Steenis, 1992).

2. Morfologi tanaman singkong

Tanaman singkong merupakan perdu tidak bercabang atau bercabang sedikit,

tinggi 2-7 m. batang dengan tanda berkas daun yang bertonjolan. Umbi akar besar,

memanjang, dengan kulit berwarna coklat suram. Tangkai daun 6-35 cm; helaian

daun sampai dekat pangkal berbagi menjari 3-9. Di Indonesia banyak ditanam

sebagai tanaman pangan, dan dapat hidup pada ketinggian 5-1.300 m ( Steenis,

1992).

3. Kandungan daun singkong

Daun singkong mengandung flavonoid, alkaloid, tanin, antrakuinon,

saponin, gula pereduksi dan antrosianida, tetapi tidak mengandung glikosida

jantung (Ebuehi, Babalola, dan Ahmed, 2005).

Daun singkong mengandung rutin sebesar 0,71%(b/b) pada daun yang

muda, 0,35%(b/b) pada daun tua dan 0,16%(b/b) pada daun kuning

(Bahruddin, dkk., 2007).

B. Flavonoid

Flavonoid (Gambar 1) merupakan senyawa polifenol yang strukturnya

merupakan turunan dari inti aromatik flavon atau 2-fenilbenzopiren (Robinson,


5

21

1995). Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan

adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. (Cuvelier, Richards,

dan Besset, 1991).

CC

C

Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid

Sejumlah flavonoid, termasuk rutin (Gambar 2), kuersetin, morin,

gossipetin, krisin, mirisetin, katekin dan derivatnya, serta proantosianidin

oligomerik telah terbukti dalam studi in vitro dapat menghambat oksidasi dari

LDL (Miller, 1996).

Gambar 2. Stuktur Rutin (Nuengchamnong, Lokkerbol, dan Ingkaninan,2004)

Dalam beberapa studi, flavonoid telah terbukti mempunyai potensi

antioksidan, dapat menghambat radikal hidroksil, anion superoksida, dan radikal

lipidperoksida. Flavonoid juga mempunyai kemampuan sebagai antibakteri,

antiinflamasi, antialergi, antimutagenik, antiviral, antineoplastik, antitrombotik,

dan aktivitas vasodilatasi (Miller, 1996).


6

Penyarian flavonoid dari dalam simplisia tumbuhan dapat dilakukan

dengan menggunakan pelarut polar, semi polar, maupun nonpolar sesuai dengan

kelarutan flavonoid yang diekstraksi. Kelarutan flavonoid berbeda-beda sesuai

golongan dan substitusinya (Robinson, 1995). Pelarut yang kurang polar

digunakan untuk mengekstraksi aglikon flavonoid, sedangkan pelarut yang lebih

polar digunakan untuk glikosida flavonoid maupun antosianin. Flavonoid

merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi yang tidak

tersubstitusi. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar

seperti etanol, metanol, butanol, aseton, etil asetat, dimetilsulfoksida,

dimetilformida, dan air (Markham, 1988).

Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenolik, oleh karena itu dapat

memberikan reaksi dengan pereaksi untuk fenol antara lain membentuk warna

khas dengan FeCl3, AlCl3, larutan asam sulfanilat terdiasotasi, sitroborat, vanillin

HCl dan senyawa asam sulfat pekat (Harborne, 1987). Flavonoid dapat dideteksi

dengan ammonia, jika tidak bercampur dengan pigmen lain.

C. Radikal Bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak

stabil karena mempunyai satu elektron atau lebih yang tidak berpasangan,

sehingga untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan

merusak jaringan. Radikal bebas yang terbentuk cenderung untuk mengadakan

reaksi berantai yang bila terjadi dalam tubuh dapat menimbulkan kerusakan-

kerusakan yang serius (Percival, 1998). Untuk mencapai kestabilan atom atau

molekul, radikal bebas akan bereaksi dengan molekul di sekitarnya untuk


7

memperoleh pasangan elektron. Reaksi seperti ini berlangsung terus menerus

dalam tubuh dan bila tidak dihentikan maka akan menimbulkan penyakit seperti

kanker, jantung, katarak, penuaan dini, serta penyakit degeneratif lainnya

(Andayani, Lisawati, dan Maemunah, 2008).

D. Antioksidan

1. Definisi dan aktivitas senyawa antioksidan

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang berperan dalam menghambat

oksidasi yang diperantarai oksigen. Senyawa antioksidan memegang peranan

penting dalam pertahanan tubuh terhadap penyakit. Hal tersebut disebabkan

senyawa antioksidan dapat mencegah pengaruh buruk yang disebabkan oleh

senyawa radikal bebas (Percival, 1998).

2. Penggolongan antioksidan

Sistem antioksidan dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok

enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari superoxide

dismutase (SOD), katalase dan glutathione peroxidase. Antioksidan non-

enzimatik terdiri dari vitamin E, vitamin A, provitamin A (beta karoten), dan

vitamin C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh

sedangkan antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005).

3. Metode pengujian aktivitas antioksidan

Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara

kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui apakah

suatu senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode

kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas.


8

Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara spektrofotometri.

Beberapa uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan antara

lain:

a. pengujian penangkapan radikal (radical scavenging test)

dilakukan dengan cara mengukur penangkapan radikal sintetik dalam

pelarut organik polar seperti metanol atau etanol pada suhu kamar.

Radikal sintetik yang sering digunakan adalah DPPH (2,2’ -difenil-1-

pikril hidrazil) dan ABTS (2,2’ -azinobis (3-etil benzotiazolin-asam

sulfonat)).

Dasarnya adalah kemampuan suatu senyawa untuk menangkap radikal

DPPH. DPPH memberikan warna violet pada panjang gelombang 517

nm. Penangkapan radikal bebas menyebabkan elektron menjadi

berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang

sebanding dengan jumlah elektron yang diambil. Reaksi yang terjadi:

b. pengujian aktivitas antioksidan

dasar: pengukuran intensitas warna kompleks feritiosianat yang

terbentuk dari reaksi ion feri dengan ammonium tiosianat. Ion feri

terbentuk dari oksidasi ion fero oleh peroksida yang berasal dari

oksidasi asam linoleat. Kompleks feritiosianat yang berwarna merah

diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490 nm. Semakin

tinggi absorbansinya (warna merah yang terbentuk semakin pekat)

menunjukkan semakin banyak peroksida yang terbentuk. Dengan


9

adanya senyawa yang berperan sebagai antioksidan intensitas warna

yang terbentuk semakin rendah.

c. Pengujian dengan asam tiobarbiturat

Dasar uji ini adalah reaksi malondealdehid dengan asam tiobarbiturat

menghasilkan kromogen warna merah muda yang dapat diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm. Malondialdehid

terbentuk dari asam lemak bebas tidak jenuh dengan paling sedikit

mempunyai tiga ikatan rangkap. Adanya senyawa yang bersifat

antioksidan akan menghambat terbentuknya malondialdehid dari asam

lemak bebas tidak jenuh.

d. pengujian dengan system β-karoten-linoleat

pengujian dilakukan dengan mengamati kecepatan pemucatan warna β-

karoten karotenoid dapat meredam oksigen yang reaktif menghasilkan

oksigen yang lebih stabil.

E. Diphenylpicryl Hydrazyl (DPPH)

Molekul 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) merupakan suatu radikal

bebas yang stabil dengan adanya delokalisasi elektron bebas pada molekul

tersebut. Delokalisasi ini menyebabkan peningkatan warna violet, yang

ditunjukkan dengan pita absorpsi dalam larutan etanol pada panjang gelombang

520 nm (Molyneux, 2003).

Saat larutan DPPH dicampurkan dengan substansi yang dapat memberikan

hidrogen radikal, akan menyebabkan terjadinya bentuk tereduksi dengan

pemudaran warna violet (Molyneux, 2003).


10

Gambar 3. Diphenylpicryl hydrazyl (radikal bebas)

Gambar 4. Diphenylpicryl hydrazyl (non radikal)

Salah satu parameter yang telah diketahui sebagai interpretasi hasil dari

metode DPPH yang dilakukan adalah “efficient concentration 50” atau nilai EC50.

Nilai ini didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang menyebabkan 50%

hilangnya aktivitas DPPH. Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai EC50

yang dihasilkan, bahwa semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu senyawa, maka

semakin rendah nilai EC50 yang dihasilkan (Molyneux, 2003).

F. Metode Penyarian

Penyarian merupakan peristiwa perpindahan massa aktif yang semula

berada dalam sel, ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif

dalam cairan penyari tersebut (Anonim, 1995).

Metode penyarian ada beberapa macam:

1. Maserasi dan remaserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, dilakukan dengan

cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Pada saat proses


11

maserasi, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam

rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya

perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar

sel, maka larutan yang pekat didesak keluar. Peristiwa tersebut berulang

sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di

dalam sel. Maserasi umumnya digunakan untuk simplisia yang tidak keras,

dan tidak kompak (Anonim, 1986).

Remaserasi adalah modifikasi cara penyarian maserasi. Pada proses

remaserasi cairan penyari dibagi dua. Seluruh serbuk simplisia dimaserasi

dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas, ampas

dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua (Anonim, 1986).

2. Perkolasi

Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Aliran cairan

penyari memyebabkan adanya pergantian larutan yang mempunyai

konsentrasi tinggi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah sehingga

akan meningkatkan derajat konsentrasi. Perkolasi umumnya digunakan untuk

menyari simplisia keras dan kompak (Anonim, 1986).

3. Infudasi

Infudasi adalah metode penyarian yang menggunakan penyari air

dengan pemanasan pada suhu 900C selama 15 menit. Metode ini digunakan

untuk menyari simplisia yang larut dalam air dan tahan terhadap pemanasan

(Anonim, 1986).


12

4. Penyarian berkesinambungan

Pada metode penyarian ini cairan penyari dididihkan sehingga akan

menguap dan mengembun karena adanya pendingin. Cairan penyari yang

mengembun akan turun membasahi simplisia, demikian seterusnya. Metode

penyarian ini sesuai untuk simplisia yang bahan aktifnya tahan terhadap

pemanasan (Anonim, 1986).

Menurut Markham (1988), cara menyari kebanyakan flavonoid adalah

dengan cara merendam simplisia menggunakan pelarut metanol, kemudian

dilanjutkan dengan remaserasi dan penguapan pelarut sampai didapat ekstrak

kering.

G. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis merupakan pemisahan pada lapisan tipis dengan

suatu penyangga. Lapisan yang memisahkan terdiri atas partikel-partikel sebagai

fase diam yang ditempatkan pada penyangga yang berupa lempeng gelas, logam,

pelat polimer, atau lapisan lain yang cocok. Lapisan melekat pada permukaan

dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum. Lapisan ini

berfungsi sebagai permukaan padat yang menyerap (Gritter, Bobbit, dan

Schwarting, 1991).

Kromatografi lapis tipis adalah metode kromatografi cair yang paling

sederhana. Dalam KLT, pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan adsorpsi atau

partisi solut antara fase diam dengan fase gerak yang terjadi secara kompetitif.

Kemampuan fase diam mengadsorpsi sangat bergantung pada topografi gugus

aktif yang terdapat pada masing-masing komponen. Senyawa yang terikat kuat


13

pada fase diam akan dielusi paling lama dan mempunyai nilai Rf (Retardation

factor) yang kecil, sedangkan senyawa yang tidak terikat kuat pada fase diam

akan terelusi lebih dahulu dan mempunyai nilai Rf yang besar. Bercak yang

mempunyai nilai Rf yang sama kemungkinan merupakan senyawa yang sama.

Bilangan Rf didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dibagi

dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan fase pengembang (Markham, 1988).

Hasil elusi sampel oleh fase gerak menghasilkan bercak yang dapat

diamati dan digunakan untuk analisis senyawa. Akan tetapi, terkadang bercak

yang dihasilkan pada lempeng fase diam masih sulit untuk dideteksi. Masalah

tersebut dapat diatasi dengan menambahkan pereaksi yang mampu memperjelas

bercak, sehingga memudahkan dalam pendeteksian. Senyawa-senyawa yang

sering digunakan untuk pereaksi pendeteksi dalam KLT antara lain ammonia,

AlCl3, FeCl3, sitroborat, dan berbagai pereaksi lain yang cukup banyak macamnya

(Mabry, Markham, dan Thomas, 1970).

Menurut Markham (1988), kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk

identifikasi flavonoid dan isolasi flavonoid skala kecil.

H. Standarisasi Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan (Anonim, 2000).


14

Standarisasi ekstrak mempunyai pengertian bahwa ekstrak yang akan

digunakan untuk obat sebagai bahan baku harus memenuhi persyaratan yang

tercantum dalam monografi terbitan resmi Departemen Kesehatan (Materia

Medika Indonesia), selain itu juga diperlukan persyaratan parameter standar

umum dan spesifik yang tertera dalam buku monografi ekstrak.

I. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam penggunaannya (Harmita,

2004). Parameter-parameter yang digunakan untuk validasi diantaranya adalah

sebagai berikut:

1. Akurasi

Akurasi atau kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan

hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan

sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan

(Harmita, 2004).

Tabel I. Kriteria Nilai Akurasi yang Masih dapat DiterimaMenurut APVMA (2004)

Kadar zat aktif(%)

Nilai Recovery yang Masih dapat Diterima(%)

≥10 98-1021-10 90-1100,1-1 80-120<0,1 75-125


15

2. Presisi

Presisi atau keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian

antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari

rata–rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel – sampel yang

diambil dari campuran yang homogen. Presisi biasanya dinyatakan dalam

koefisien variasi (KV).

Tabel II. Kriteria Nilai Presisi yang Masih dapat DiterimaMenurut APVMA (2004)

Kadar zat aktif(%)

Nilai KV yang Masih dapat Diterima(%)

≥10 ≤21-10 ≤50,1-1 ≤10<0,1 ≤20

3. Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode (pada rentang tertentu)

untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan

konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel (Anonim, 2007).

4. Spesifisitas

Spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur

zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain

yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas metode ditentukan

dengan membandingkan hasil analisis sampel yang mengandung cemaran,

hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo

dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi.


16

Penyimpangan hasil merupakan selisih dari hasil uji keduanya (Harmita,

2004).

5. LOD (limit of detection) dan LOQ (limit of quantitation)

Limit of detection (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang

dapat dideteksi dan masih memberikan respon signifikan dibandingkan

dengan blanko. Limit of quantitation (LOQ) merupakan kuantitas terkecil

analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurasi dan

presisi. LOD dan LOQ dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi

linier dari kurva kalibrasi (Harmita, 2004).

J. Spekrofotometri Visibel

Spektrofotometri visibel adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang

mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik

pada panjang gelombang 380-780 nm (Mulja dan Suharman, 1995). Menurut

Molyneux (2003), absorbansi DPPH terjadi dengan baik pada daerah cahaya

tampak (visible), oleh sebab itu digunakan spektrofotometri visibel untuk

pengukuran absorbansinya.

Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi

eleektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) akan menghasilkan transisi

elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik. Jumlah radiasi

elektromagnetik yang diserap akan sebanding dengan jumlah molekul

penyerapnya, sehingga spektra absorbansi dapat digunakan untuk analisis

kuantitatif (Fessenden dan Fessenden, 1995).


17

Bila suatu molekul senyawa organik menyerap sinar UV atau tampak,

maka di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan (transisi elektron) dari

berbagai jenis tingkat energi orbital dari molekul tersebut (Sastromihardjojo,

2001). Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi

antara gelombang cahaya (foton) dan atom atau molekul. Proses absorbsi cahaya

UV-Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan

tingkat energi elektronik tertentu ke orbital lain dengan tingkat energi elektronik

yang lebih tinggi.

Secara umum, ada tiga macam distribusi elektron dalam suatu senyawa

organik yaitu orbital pi (π), sigma (σ) dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila

radiasi elektromagnetik mengenai molekul, maka akan terjadi eksitasi elektron ke

tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron antibonding

(Mulja dan Suharman, 1995).

Gambar 5. Tingkat energi elektronik

Macam-macam transisi elektron yang terjadi adalah sebagai berikut:

a. Transisi σ σ*. Transisi jenis ini terjadi pada orbital ikatan sigma. Energi

yang dibutuhkan untuk transisi ini sangat besar, sesuai dengan sinar yang

mempunyai frekuensi pada daerah UV vakum (<180 nm).


18

b. Transisi n σ*. Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang

mengandung atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (ikatan n).

Sinar yang diserap memiliki panjang gelombang lebih besar dari 200 nm,

sehingga energi yang diperlukan untuk transisi ini lebih kecil dari 200 nm.

c. Transisi n π* dan π π*. Untuk memungkinkan terjadinya jenis transisi

ini, maka molekul organik harus mempunyai gugus fungsional yang tidak

jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital

ikatan π yang diperlukan. Jenis transisi ini merupakan jenis yang paling

sesuai untuk analisis karena memiliki absorbansi pada 200-700 nm dan

panjang gelombang ini secara teknis dapat diaplikasikan pada

spektrofotometer (Sastromihardjo, 2001).

Analisis spektrofotometer UV-Vis melibatkan pembacaan absorban radiasi

elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan.

Keduanya dikenal sebagai absorban (A) tanpa satuan dan transmitan dengan

satuan persen. Hubungan antara intensitas radiasi elektromagnetik yang diserap

oleh system (I0) dengan intensitas radiasi yang ditransmisikan (It) dapat dijelaskan

dengan hukum Lambert-Beer, sebagai berikut:

10 .. cb

IoItT

cbT

A ..1log

Keterangan:

T = persen transmitan

I0 = intensitas radiasi yang datang


19

It = intensitas radiasi yang diteruskan

ε = daya serap molar (L.mol-1.cm-1)

c = konsentrasi (mol/L)

b = panjang sel (cm)

A = serapan

Jika konsentrasi ( c ) dalam mol/L dan panjang sel dalam cm,

persamaannya menjadi

A = ε.b.c........………………………………….. (1)

Jika konsentrasi ( c ) dalam g/L, persamaan (1) menjadi

A = a.b.c…………………………………………(2)

Jika a adalah daya serap, hubungan dengan daya serap molar ditunjukkan

dengan persamaan

Ε = a.M

Dimana M adalah bobot molekul.

(Silverstein, 1991)

K. Landasan Teori

Senyawa flavonoid (termasuk rutin) diketahui memiliki aktivitas

antioksidan. Adanya gugus –OH fenolik dalam senyawa flavonoid bertanggung

jawab terhadap aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh senyawa tersebut. Daun

singkong (Manihotis Folium) mengandung senyawa rutin. Cara ekstraksi

menggunakan pelarut etanol akan menghasilkan ekstrak daun singkong yang

mengandung senyawa rutin. Senyawa rutin ini mempunyai gugus –OH fenolik,

sehingga senyawa ini mempunyai aktivitas antioksidan.


20

Metode diphenylpicryl hydrazyl (DPPH) merupakan salah satu metode

yang digunakan untuk menentukan besar aktivitas antioksidan suatu senyawa.

Metode ini digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan ekstrak daun

singkong. Dari hasil pengujian itu akan didapatkan nilai EC50 yang menunjukkan

besar aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh ekstrak daun singkong.

L. Hipotesis

Ekstrak daun singkong memiliki nilai EC50 yang mencerminkan besar

aktivitas antioksidan yang dimilikinya.


21

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental karena adanya

intervensi atau perlakuan terhadap senyawa uji.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Klasifikasi Variabel

a. Variabel Bebas

Lima macam konsentrasi ekstrak daun singkong mulai dari 0,3273

mg/mL sampai 2,2914 mg/mL.

b. Variabel Tergantung

Absorbansi larutan DPPH.

c. Variabel Pengacau Terkendali

Tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur daun yang dipanen,

cara panen, cara pengeringan dan pembuatan simplisia, dan jumlah (g)

simplisia yang digunakan.

d. Variabel Pengacau Tak Terkendali

Cahaya matahari, cuaca/musim, dan curah hujan, kelembaban ruangan,

komposisi senyawa penyusun ekstrak.

2. Definisi Operasional

a. Daun singkong adalah daun (folium) dari tanaman singkong yang dipetik

dari daerah Wonosari, Gunungkidul.


22

b. Ekstrak daun singkong adalah ekstrak kental yang diperoleh dari hasil

maserasi dengan etanol 96% : air (75:25(v/v)) serbuk simplisia daun

Manihot utilissima Pohl. dan telah mengalami tahap uji kualitas ekstrak.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: simplisia daun singkong

yang berasal dari daerah Wonosari, Gunungkidul. Bahan kima kualitas farmasetis

(CV. General Labora) berupa etanol 96% dan akuades. Bahan kimia kualitas pro

analitik (E.Merck) meliputi Selulosa GF 254, n-butanol, asam asetat glacial,

ammonia 25%, metanol. Bahan kualitas pro analitik (Sigma) meliputi rutin dan

DPPH, serta DMSO.

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa spektrofotometer UV-Vis

(OPTIMA), grinder, Shaker Incubator (Zhicheng ZHWY-100C), TLC set, neraca

elektrik (Mettler Toledo GB 3002), vaccum rotary evaporator (Janke & Kunkel

Kika Labortechnik RV 05-ST), alat-alat gelas, oven, waterbath, dan furnace.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan

Daun singkong diperoleh dari daerah Wonosari, Gunungkidul pada bulan

Mei 2009. Daun singkong yang dipetik merupakan daun singkong yang berada

4 ruas dari pucuk tanaman sampai 5 ruas di bawahnya.


23

3. Pembuatan serbuk simplisia daun singkong

a. Sortasi basah

Sortasi basah dilakukan dengan cara memisahkan daun singkong dari

pengotor lain. Sortasi dilakukan pada bulan Mei 2009 oleh penulis.

b. Pembuatan serbuk

Simplisia daun singkong hasil sortasi basah dikeringkan di bawah

pengaruh sinar matahari secara tidak langsung dengan ditutup kain hitam.

Setelah bahan kering, diserbuk menggunakan grinder (mesin penyerbuk).

4. Pembuatan ekstrak daun singkong secara maserasi

Satu bagian serbuk simplisia ditambah 10 bagian campuran pelarut yaitu

etanol 96% : akuades (75:25(v/v)), diaduk terus selama 24 jam. Suhu yang

digunakan saat maserasi adalah 300C. Setelah 24 jam, maserat kemudian

dipisahkan dan proses maserasi diulang sekali lagi, dengan prosedur yang

sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan penguap vakum

hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental kemudian dimasukkan ke

dalam oven sampai didapatkan ekstrak kering. Ekstrak kering ini didapat jika

sudah tercapai bobot tetap.

5. Uji kualitas ekstrak daun singkong

a. Pemeriksaan organoleptis

Pemeriksaan organoleptis meliputi warna, bau, dan konsistensi

ekstrak.

b. Penentuan susut pengeringan


24

Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1,0 g dan dimasukkan

ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah

dipanaskan pada suhu 1050C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum

ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan bantuan

pengaduk karena berupa ekstrak kental. Kemudian ekstrak tadi

dimasukkan ke dalam ruang pengering dengan botol timbang dalam

keadaan terbuka dan pengeringan dilakukan pada suhu 1050C hingga

bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, botol dalam keadaan tertutup

dibiarkan mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Anonim, 2000).

Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

c. Uji kadar abu

Lebih kurang 2 g sampai 3 g ekstrak yang telah ditimbang seksama,

dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara,

kemudian diratakan. Ekstrak tadi dipijarkan perlahan-lahan, didinginkan,

kemudian ditimbang. Proses dilakukan hingga dicapai bobot tetap. Kadar

abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Anonim,

2000). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

6. Analisis kualitatif kandungan rutin dengan metode KLT

Disiapkan larutan ekstrak daun singkong (konsentrasi 1 mg/mL) dalam

metanol. Sebanyak 2,0 µL larutan tersebut ditotolkan pada lempeng selulosa

berdampingan dengan 2,0 µL totolan larutan standar rutin dengan pelarut

metanol (konsentrasi 4 mg/mL). Pelat KLT sebelumnya telah dipanaskan

dalam oven bersuhu 600C selama 30 menit. Pelat KLT tersebut dielusi dengan


25

fase gerak n-butanol : asam asetat glasial : aquades (5 : 1 : 4 (v/v)). Deteksi

dilakukan dengan uap ammonia 25% untuk memperjelas bercak.

7. Pembuatan larutan DPPH

Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a dan sedikit DMSO

sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 19,6 mg/L. Larutan

tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

8. Pembuatan larutan stok rutin

Sebanyak 10,0 mg rutin dicampurkan dengan 1,0 mL DMSO, lalu

ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL.

9. Pembuatan larutan standar rutin

Diambil sebanyak 0,1 mL stok rutin, kemudian ditambah metanol sampai

5,0 mL.

10. Pembuatan larutan uji

Sejumlah 0,16367 g ekstrak ditimbang, lalu ditambah 1,0 mL DMSO dan

di ad metanol sampai 10,0 mL. Dari larutan tersebut kemudian diambil 0,1

mL; 0,2 mL; 0,3 mL; 0,5 mL dan 0,7 mL untuk kemudian dilarutkan dalam

5,0 mL metanol.

11. Optimasi metode

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Larutan DPPH dimasukkan ke dalam kuvet yang sesuai kemudian

dilakukan scanning panjang gelombang mulai 400-600 nm. Panjang

gelombang dimana terjadi serapan maksimum ditetapkan sebagai panjang


26

gelombang serapan maksimum yang akan digunakan dalam pengukuran

selanjutnya.

a. Penentuan reaction time

Sebanyak 3,8 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi

bertutup kemudian ditambah dengan 0,2 mL larutan standar rutin.

Campuran larutan tadi kemudian dikocok kuat. Larutan tadi dibaca

absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang

maksimum hasil scanning panjang gelombang selama 45 menit sampai

diketahui waktu dimana didapat penurunan absorbansi yang paling besar

(reaksi terjadi secara optimal).

12. Validasi metode DPPH

Larutan standar dibuat dengan mengambil 6,0 mL dan 8,0 mL dari

larutan DPPH 19,6 mg/L, kemudian masing-masing ditambah metanol p.a

sampai 10,0 mL. Setelah itu kemudian 3,8 mL larutan DPPH dimasukkan

ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan 0,2 mL larutan standar rutin

20,02 mg/mL. Campuran larutan tadi kemudian dikocok kuat dan

didiamkan selama reaction time. Larutan dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil

scanning panjang gelombang (517 nm). Pengerjaan dilakukan sebanyak 3

kali, kemudian perhitungan validasi menggunakan data dari ketiga

pengerjaan yang paling baik hasilnya.

13. Uji DPPH

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)


27

Sebanyak 4 mL larutan DPPH 19,6 mg/L diukur absorbansinya pada

panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

b. Pengukuran absorbansi larutan uji

Sebanyak 3,8 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi

bertutup kemudian ditambah dengan 0,2 mL larutan uji pada berbagai

macam konsentrasi larutan uji yang telah dibuat. Campuran larutan tadi

kemudian dikocok kuat dan didiamkan selama waktu reaksi (reaction

time) yang telah ditetapkan sebelumnya. Larutan dibaca absorbansinya

dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil

optimasi (517 nm). Pengujian dilakukan dengan 5 kali replikasi.

14. Analisis hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus :

Keterangan:

A = absorbansi

Data aktivitas (%) dianalisis dan dihitung nilai EC50 melalui analisis

probit. EC50 merupakan konsentrasi yang mampu menghambat 50% aktivitas

DPPH.


28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Langkah awal yang dilakukan dalam suatu penelitian adalah melakukan

determinasi tanaman. Determinasi tanaman ini bertujuan untuk mengetahui dan

memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan digunakan dalam penelitian

serta untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel untuk

analisis fitokimia. Dari hasil determinasi, telah dibuktikan bahwa tanaman yang

digunakan untuk penelitian adalah tanaman singkong (Manihot utilissima Pohl.).

Pembuktian dikuatkan dengan surat determinasi tanaman (Lampiran 1) yang

dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Daun singkong yang dipetik adalah daun singkong yang berada 4 ruas dari

pucuk tanaman sampai 5 ruas di bawahnya. Memetik dengan cara seperti ini

merupakan prosedur baku dalam peneltian ini, hal ini dilakukan dalam usaha

untuk menyamakan kondisi daun singkong yang dipetik, sehingga bisa

mengurangi variabel pengacau (umur daun yang dipetik) yang mungkin terjadi

dalam hal pengambilan bahan. Daun yang dipetik merupakan daun yang tidak

terlalu muda, namun juga belum terlalu tua serta berwarna hijau (tidak berwarna

kuning atau coklat), karena daun yang kuning atau coklat kandungan kimianya

banyak yang sudah hilang (berkurang). Daun singkong yang dipilih juga


29

merupakan daun singkong yang mempunyai warna tangkai daun hijau. Dipilih

yang berwarna tangkai hijau bukan warna tangkai merah karena pigmen warna

merah (antosianin) termasuk dalam golongan flavonoid, sehingga kadar rutin

dalam daun singkong bertangkai merah diduga lebih sedikit. Umumnya

kandungan flavonoid belum terbentuk maksimal ketika masih muda dan akan

berkurang ketika sudah tua. Seleksi juga dilakukan pada saat pemetikan, daun

singkong yang akan digunakan harus dalam kondisi baik, tidak terdapat bekas

ulat, tidak berjamur ataupun busuk. Kondisi yang kurang baik dari daun singkong

yang dipetik akan mempengaruhi mutu simplisia maupun ekstrak yang dibuat,

karena kemungkinan sudah terjadi perubahan atau biotransformasi pada

kandungan kimia daun singkong yang sudah tidak baik kondisinya. Adanya jamur

pada daun singkong dapat menjadi sumber kontaminasi pada simplisia yang

dibuat. Proses pemanenan dan preparasi simplisia merupakan proses yang dapat

menentukan mutu simplisia, sehingga diperlukan prosedur baku dalam proses

tersebut.

C. Pembuatan Serbuk Daun Singkong

Pembuatan serbuk daun singkong diawali dengan melakukan sortasi basah

terhadap daun singkong yang sudah dipetik sebelumnya. Sortasi basah ini

dilakukan guna membebaskan bahan baku daun singkong yang akan digunakan

dari pengotor-pengotor seperti tanah dan debu.

Setelah dilakukan sortasi basah, kemudian dilakukan pengeringan

simplisia di bawah sinar matahari secara tidak langsung (ditutup dengan kain

hitam). Jika dijemur di bawah terik matahari secara langsung, simplisia hasil


30

pengeringan akan berwarna coklat karena terbakar oleh sinar matahari. Adanya

perubahan warna ini mengindikasikan sudah terjadi perubahan dalam kandungan

kimia simplisia daun singkong. Perubahan kandungan kimia dalam daun singkong

tidak diharapkan dalam penelitian ini, karena dapat mempengaruhi hasil

penelitian. Proses pengeringan dihentikan saat daun singkong hasil pengeringan

sudah rapuh dan mudah dipatahkan.

Pembuatan serbuk simplisia daun singkong yang sudah kering dilakukan

dengan menggunakan mesin grinder. Tujuan dari dilakukannya penyerbukan ini

adalah untuk memperbesar luas permukaan simplisia yang bersentuhan dengan

cairan penyari. Luas permukaan yang besar akan mengoptimalkan pembasahan

serbuk simplisia oleh cairan penyari sehingga hasil penyariannya juga akan

optimal.

Proses ekstraksi akan makin efektif dengan makin halusnya serbuk

simplisia, namun hal ini akan semakin memperumit dalam hal filtrasi hasil

penyarian karena serbuk yang makin halus akan cenderung membentuk suspensi

yang sulit dipisahkan dari hasil penyarian.

Dalam penelitian ini diperoleh serbuk simplisia daun singkong kering

(Gambar 6) yang berwarna hijau dan berupa butiran-butiran yang tidak kompak

dan tidak keras.

Gambar 6. Serbuk simplisia daun singkong kering


31

D. Pembuatan Ekstrak Daun Singkong

Ekstrak daun singkong diperoleh dari hasil penyarian simplisia daun

singkong yang telah berupa serbuk kering. Penyarian menggunakan maserasi

karena cara penyariannya yang sederhana dan sesuai digunakan untuk simplisia

yang tidak keras dan tidak kompak. Maserasi dilakukan dua kali untuk

mengoptimalkan penyarian (remaserasi).

Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan dari penelitian yang telah

dilakukan sebelumnya. Dalam penelitian tersebut diketahui bahwa terdapat

kandungan senyawa rutin dalam ekstrak daun singkong yaitu bahwa dalam tiap 1

µg ekstrak daun singkong mengandung rutin sebanyak 0,0611 µg (Sari, 2010)

Berdasarkan penelusuran pustaka, diketahui bahwa senyawa rutin mempunyai

kemampuan dalam menghambat oksidasi LDL. Selain itu, struktur kimia dari

rutin (Gambar 2) menunjukkan potensinya sebagai antioksidan karena terdapat

gugus –OH fenolik dalam struktur kimianya. Maserasi ini bertujuan untuk

menarik senyawa flavonoid agar terlarut ke dalam cairan penyari, karena senyawa

rutin merupakan senyawa yang termasuk golongan flavonoid.

Kandungan kimia dalam daun singkong ( per 100 gram ) meliputi: -

Vitamin A 11000 SI - Vitamin C 275 mg - Vitamin B1 0,12 mg - Kalsium 165 mg

- Kalori 73 kal - Fosfor 54 mg - Protein 6,8 gram - Lemak 1,2 gram - Hidrat arang

13 gram - Zat besi 2 mg (Putra, 2009). Selain flavonoid dan klorofil, senyawa-

senyawa tersebut kemungkinan ikut tersari karena mineral-mineral dalam

tanaman pada umumnya larut dalam air. Vitamin C masih mungkin ada dalam

maserat walaupun sebenarnya vitamin C telah rusak karena mudah teroksidasi


32

oleh adanya cahaya. Flavonoid yang tersari meliputi rutin dan jenis flavonoid lain

yang penulis belum ketahui. Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan, maka

senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antioksidan dalam ekstrak daun singkong

yang nantinya dihasilkan dari hasil maserasi ini adalah senyawa flavonoid dan

vitamin C.

Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan

penyari yang sesuai. Dalam penyarian ini digunakan campuran etanol (96%) :

akuades (75:25 (v/v)) sebagai cairan penyarinya (Sari, 2010). Digunakan pelarut

etanol 96% sebagai komponen terbesar penyari karena etanol merupakan pelarut

yang baik untuk senyawa rutin. Rutin merupakan merupakan senyawa yang

cenderung bersifat polar dan mudah larut dalam pelarut etanol, metanol, butanol,

aseton, air, dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoid menyebabkan

flavonoid akan lebih mudah larut dalam campuran pelarut air dan pelarut polar

lainnya yang telah disebutkan di atas. Penyarian dilakukan pada suhu 300C

(Sari,2010), sehingga penyarian yang dilakukan tidak menggunakan panas yang

terlalu tinggi. Suhu yang digunakan saat maserasi tidak terlalu tinggi sehingga

kandungan senyawa yang tidak tahan panas tidak akan rusak.

Selama proses maserasi, zat aktif dalam serbuk simplisia daun singkong

akan berdifusi keluar dari sel. Difusi ini terjadi karena adanya perbedaan

konsentrasi zat aktif antara di dalam dan di luar sel. Kejadian ini akan berlangsung

terus sampai tercapai keseimbangan konsentrasi zat aktif antara di dalam dan luar

sel. Pengambilan flavonoid oleh cairan penyari dilakukan secara bertahap untuk


33

mengoptimalkan jumlah flavonoid yang tersari yaitu dengan cara maserasi

berulang (remaserasi).

Maserat yang diperoleh kemudian dipekatkan agar menjadi ekstrak kental.

Pemekatan berarti peningkatan jumlah senyawa terlarut dengan cara menguapkan

pelarut sampai ekstrak menjadi kental (sukar mengalir). Alat yang digunakan

yaitu rotary vapour dan waterbath. Pemekatan ekstrak merupakan tahapan yang

dilakukan sebelum pengeringan ekstrak. Pengeringan ekstrak yang dilakukan

dalam penelitian ini dilakukan dengan cara memasukkan ekstrak kental ke dalam

oven sampai didapat bobot yang konstan. Persyaratan bobot konstan

menggunakan persyaratan yang terdapat dalam Farmakope Indonesia IV, yaitu

penimbangan dilakukan setiap jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan

berturut-turut tidak lebih dari 0,25% (Anonim, 1995). Hasil yang didapat dari

proses ini bukan berupa ekstrak kering, tetapi ekstrak kental yang agak kaku

(seperti aspal). Secara organoleptis, ekstrak ini berwarna hitam, berbau khas

ekstrak, berbentuk kental, agak kaku, dan lengket. Dari hasil ekstraksi serbuk

simplisia daun singkong kering dengan bobot 45,0065 gram diperoleh ekstrak

kering dengan bobot 28,3412 gram dan angka rendemen ekstrak sebesar

37,1125% (Lampiran 2).

Parameter standar untuk ekstrak daun singkong belum ada, sehingga

kualitas ekstrak yang seperti ini sekaligus menjadi parameter standar ekstrak daun

singkong yang baik, terbatas dalam penelitian ini saja, dimana kualitas ekstrak

secara visual tidak mengalami perubahan selama proses penelitian berlangsung


34

E. Hasil Uji Kualitatif Senyawa Rutin dengan Metode KLT

Dalam penelitian yang sudah dilakukan oleh Sari (2010), telah dilakukan

uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan rutin dalam ekstrak daun singkong.

Sehingga dalam penelitian yang penulis lakukan sudah tidak dilakukan uji

kualitatif lagi. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa terdapat

kandungan senyawa rutin dalam ekstrak daun singkong sebanyak 0,0611 µg

dalam tiap 1 µg ekstrak daun singkong. Hasil dari penelitian Sari (2010) dapat

digunakan dalam penelitian lanjutan ini karena sampel simplisia serbuk daun

singkong yang digunakan sama dan metode ekstraksi yang dilakukan juga sama .

Uji kualitatif dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak daun singkong

mengandung senyawa rutin. Sebagai senyawa pembanding digunakan senyawa

rutin standar. Rutin atau kuersetin 3-rutinosida merupakan glikosida kuersetin.

Glikosida flavonoid termasuk rutin merupakan salah satu metabolit sekunder yang

cenderung bersifat polar, sehingga larutan standar untuk rutin dibuat dengan

melarutkan senyawa rutin standar ke dalam metanol, dimana metanol merupakan

pelarut polar, sehingga sesuai untuk melarutkan rutin.

Digunakan metode KLT untuk uji kualitatif keberadaan rutin, dengan fase

diam selulosa dan sebagai fase gerak digunakan campuran n-butanol : asam asetat

: air (5:1:4 v/v). Digunakan fase gerak tersebut karena pemeriksaan awal

keberadaan flavonoid menyarankan penggunaan campuran n-butanol : asam asetat

: air (5:1:4 v/v) sebagai fase gerak. Selain itu, pemilihan fase gerak juga

disesuaikan dengan kepolaran senyawa yang diinginkan juga kepolaran fase


35

diamnya. Fase gerak yang digunakan cenderung bersifat polar dan fase diam

cenderung bersifat nonpolar.

OHO

OH O

O

OH

OH

Rha Glu

CaSO4

OHO

O O

O

OH

OH

Rha Glu

Ca

O

O O

HO

OH

ORhaGlu

Rutin

2+

Gambar 7. Reaksi pembentukan kompleks antara ion Ca2+ yang terdapatpada plat silika dengan senyawa rutin

Tidak digunakan fase diam silica gel GF 254, karena dapat menghambat

elusi dari flavonoid akibat adanya Ca2+ (ion kalsium) yang berasal dari ionisasi

CaSO4 pada gipsum yang terdapat dalam plat silika. Elusi terhambat karena dapat

terjadi ikatan antara Ca2+ dengan senyawa rutin membentuk suatu kompleks

(Gambar 7). Terbentuknya kompleks ini akan menghambat elusi senyawa rutin,

sehingga digunakan plat selulosa untuk KLT senyawa rutin.


36

Gambar 8. Kromatogram hasil uji kualitatif flavonoid dalam ekstrak daunsingkong dengan fase diam selulosa, fase gerak campuran n-butanol : asam

asetat : air (5:1:4 (v/v)), deteksi dengan diuapi NH3 (Sari, 2010)

Keterangan gambar :Totolan baku = larutan standar rutin dengan konsentrasi 1 mg/mLTotolan sampel = larutan sampel dari 5 macam komposisi penyari (etanol:air),masing-masing dengan konsentrasi 1 mg/mL

Tabel III. Keterangan gambar untuk penotolan baku pada uji kualitatifrutin

Baku Volume totolan (µL)1 0,52 1,53 2,54 3,55 4,56 5,57 7


37

Tabel IV. Keterangan gambar untuk penotolan sampel pada uji kualitatifrutin

Sampel Keterangan komposisi pelarutuntuk sampel (etanol:air) Volume totolan (µL)

1 0 : 100 12 25 : 75 13 50 : 50 0,54 75 : 25 0,55 100 : 0 0,5

Kertas saring digunakan untuk penjenuhan chamber yang akan digunakan

untuk elusi. Chamber harus jenuh oleh fase gerak. Penjenuhan chamber ini

bertujuan untuk mempercepat elusi dan meratakan elusi yang terjadi, karena

adanya penjenuhan yang kurang merata dalam chamber akan mengganggu elusi

yang terjadi.

Dilakukan 7 kali penotolan larutan baku dengan perbedaan volume totolan

dalam masing-masing totolan, sedangkan penotolan sampel dilakukan masing-

masing satu kali untuk masing-masing komposisi pelarut yang berbeda. Hasil uji

kualitatif yang digunakan dalam penelitian ini merupakan hasil dari uji optimasi

komposisi pelarut dalam ekstraksi rutin dari daun singkong. Dalam penelitian

tersebut ketujuh larutan baku yang ditotolkan bertujuan untuk mendapatkan kurva

baku.

Deteksi bercak menggunakan uap ammonia (NH3). Bercak glikosida

flavon dan glikosida flavonoid yang khas tampak berwarna lembayung tua dengan

sinar UV dan menjadi kuning bila diuapi NH3 (ammonia). Flavonoid mengandung

sistem terkonjugasi dan karena itu menunjukkan pita serapan kuat pada spektrum

visibel.


38

Hasil penelitian menunjukkan bahwa setelah diuapi dengan amonia,

tampak sebuah bercak yang berwarna kuning dari setiap penotolan. Bercak ini

terlihat baik pada baku maupun pada sampel ekstrak daun singkong. Kesamaan

warna bercak dan harga Rf yang berdekatan (Tabel V) antara standar dan sampel

menunjukkan bahwa terdapat senyawa rutin dalam ekstrak daun singkong yang

diteliti.

Tabel V. Hasil uji kualitatif keberadaan rutin dengan metode KLTHarga rf Warna Bercak

Baku 1 0,66

kuning

Baku 2 0,64Baku 3 0,65Baku 4 0,65Baku 5 0,64Baku 6 0,63Baku 7 0,63

Sampel 1 0,62Sampel 2 0,63Sampel 3 0,63Sampel 4 0,63Sampel 5 0,63

F. Standarisasi Ekstrak Daun Singkong

Standarisasi ekstrak bertujuan untuk menjaga keamanan, mutu, dan

manfaat dari suatu senyawa obat. Untuk itu, suatu ekstrak harus memenuhi

persyaratan monografinya. Dalam penelitian ini dilakukan standarisasi ekstrak

yang meliputi uji susut pengeringan, uji kadar abu, serta uji kualitatif flavonoid

dalam ekstrak daun singkong. Sebenarnya ada banyak uji yang perlu dilakukan

untuk standarisasi simplisia maupun ekstrak, namun dalam penelitian ini hanya


39

digunakan 3 macam uji karena uji-uji tersebut memberikan pengaruh terhadap

bobot ekstrak yang akan digunakan untuk tahapan analisis selanjutnya.

Uji susut pengeringan dan uji kadar abu dilakukan menurut prosedur yang

tertera dalam buku Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat (Anonim,

2000). Uji susut pengeringan ini identik dengan uji kadar air. Tujuan dari uji ini

adalah untuk memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa

yang hilang pada proses pengeringan. Dalam penelitian ini, didapat nilai susut

pengeringan dari tiga replikasi yaitu 15,6246 ± 0,1385 %.

Prinsip dari uji penetapan kadar abu adalah memanaskan bahan pada

temperatur dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap,

sehingga nantinya yang tertinggal hanyalah unsur mineral saja. Tujuan dari uji ini

adalah untuk memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal

yang berasal dari proses awal sampai terbentuk ekstrak, terkait dengan kemurnian

dan kontaminan. Kadar abu yang didapat dalam penelitian ini adalah sebesar

16,5410 ± 2.5051 %. Nilai ini merupakan rata-rata yang diperoleh dari 3 replikasi.

Parameter standar untuk ekstrak daun singkong belum ada dalam

monografi, sehingga ekstrak yang dihasilkan dalam penelitian ini sudah dapat

dikatakan baik, terbatas untuk penelitian ini saja. Hal ini dikuatkan dengan kondisi

ekstrak yang secara visual tidak mengalami perubahan selama penyimpanan.

G. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini bertujuan untuk

menentukan panjang gelombang dimana senyawa yang ingin diukur memberikan

absorbansi yang paling optimum. Dalam penelitian ini yang diukur adalah


40

absorbansi dari DPPH. DPPH mampu memberi serapan karena mempunyai gugus

kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya, adanya delokalisasi elektron

pada DPPH akan menghasilkan warna violet. Menurut Molyneux (2004), panjang

gelombang teoritis untuk pengukuran DPPH berkisar antara 515 nm-520 nm.

Namun dalam prakteknya, panjang gelombang dapat diatur agar memberi

absorbansi maksimum, tergantung instumen pengukuran yang digunakan. Dengan

begitu maka dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan

kontrol yaitu larutan DPPH yang dilarutkan dalam metanol. Digunakan larutan

kontrol, yaitu larutan tanpa penambahan sampel dengan tujuan untuk

mendapatkan serapan DPPH saja tanpa gangguan serapan dari senyawa-senyawa

dalam sampel.

Tabel VI. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum di sekitarpeak

λ (nm) Absorbansi515 0,707516 0,708517 0,708518 0,708519 0,707

Scanning panjang gelombang serapan maksimum dilakukan pada 400-600

nm (Gambar 9). Hasil scanning di sekitar peak (Tabel VI) menunjukkan

absorbansi maksimum terjadi pada panjang gelombang 517 nm yaitu sebesar

0,708 (Gambar 9). Hasil ini sesuai dengan panjang gelombang teoritis yang telah

banyak digunakan dalam penelitian lain yang dilakukan sebelumnya (Molyneux,

2003)


41

.Gambar 9. Foto grafik hasil scanning panjang gelombang serapan

maksimum

Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang

gelombang serapan maksimum karena perubahan absorbansi untuk setiap satuan

konsentrasi adalah yang paling besar pada panjang gelombang tersebut, sehingga

akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum. Selain itu, kurva serapan di

sekitar panjang gelombang serapan maksimum tersebut relatif lebih datar sehinga

jika dilakukan pengukuran ulang atau replikasi, kemungkinan kesalahan akan

lebih kecil (Mulja dan Suharman, 1995).

H. Penentuan Waktu Reaksi (Reaction Time)

Pengukuran reaction time bertujuan untuk mengetahui waktu yang tepat

untuk pengukuran suatu senyawa, dimana reaksi terjadi secara optimal. Pada

rentang waktu tersebut senyawa berada dalam keadaan reaksi sempurna.

Pengukuran pada saat reaction time ditujukan untuk meminimalkan kesalahan

dalam hal pengukuran. Hasil penentuan waktu reaksi menunjukkan reaksi terjadi

secara optimal dalam rentang waktu 3-4 menit setelah pencampuran larutan rutin


42

standar dengan larutan kontrol, yaitu sebesar 0,411 (Lampiran 3), sedangkan

grafik hasil penentuan waktu reaksi ditunjukkan pada Gambar 11.

I. Validasi Metode Analisis

Tujuan dilakukan validasi metode analisis adalah untuk membuktikan

bahwa metode yang digunakan dapat memberikan hasil seperti yang diharapkan.

Validasi metode analisis ini menggunakan 3 macam seri konsentrasi larutan

DPPH yaitu konsentrasi rendah, konsentrasi sedang, dan konsentrasi tinggi.

Digunakan ketiga macam seri larutan baku ini supaya dapat mewakili seluruh

konsentrasi larutan sampel.

Dalam penelitian ini, dilakukan analisis hasil untuk linearitas, akurasi, dan

presisi dari metode ini. Validasi analisis ini dilakukan melalui 3 kali pengerjaan.

Untuk analisis validasinya, digunakan data dari ketiga pengerjaan yang paling

baik. Data ini digunakan untuk menghitung akurasi dan presisi. Analisis presisi

dan akurasi menggunakan persamaan linear regresi yang dihasilkan dari

pengerjaan I karena nilai r yang dihasilkan merupakan yang paling baik dari

ketiga pengerjaan yang telah dilakukan. Dari hasil penelitian, didapatkan

persamaan regresi linear sebagai berikut : y = 23,1670X + 0,0164.

a) Linearitas

Linearitas menunjukkan kemampuan metode untuk menghasilkan hasil uji

yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel.

Dari 3 pengerjaan yang dilakukan untuk validasi metode analisis, didapatkan

bahwa hasil dari pengerjaan I mempunyai harga koefisien korelasi yang paling

baik, dimana r = 0,9999. Nilai r yang memenuhi persyaratan linearitas yang

baik menurut Mulja dan Hanwar (2003) adalah lebih besar dari 0,999,


43

sehingga nilai r yang dihasilkan dalam penelitian ini masih dapat diterima

karena masih berada di atas nilai r yang dipersyaratkan. Hal ini menunjukkan

bahwa metode yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai linearitas

yang baik untuk pengukuran DPPH.

b) Akurasi

Akurasi merupakan analisis kedekatan hasil analisis yang diperoleh

dengan menggunakan metode analisis tertentu, dengan nilai yang sebenarnya.

Penentuan akurasi metode analisis dapat dilakukan dengan membandingkan

kadar terukur dengan kadar teoritisnya. Hasil perbandingan tersebut disebut %

perolehan kembali (recovery) (Anonim, 1995). Suatu metode analisis

dikatakan mempunyai akurasi yang baik apabila memberikan hasil recovery

antara 75-125% untuk analit dengan konsentrasi kurang dari 0,1%(b/v)

(Anonim, 2004).

Tabel VII. Nilai perolehan kembali (% recovery)

KonsentrasiRecovery (%)

PengerjaanI

PengerjaanII

PengerjaanIII

Rata-rata

Tinggi 100 99,4898 94,4162 97,9687Sedang 100,6370 97,4522 100,6329 99,5740Rendah 100 99,1525 98,3051 99,1525

Berdasarkan tabel VII, ketiga macam konsentrasi yang diuji dalam validasi

metode ini mempunyai rata-rata nilai recovery 97,9687%, 99,5740%, dan

99,1525% berturut-turut untuk konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah,

sehingga semua seri konsentrasi DPPH yang diuji mempunyai nilai rata-rata

perolehan kembali yang masuk dalam rentang nilai recovery yang


44

dipersyaratkan (antara 75-125%). Hal ini berarti bahwa metode DPPH yang

digunakan sudah mempunyai akurasi yang baik untuk penelitian ini.

c) Presisi

Presisi merupakan simpangan baku dari beberapa kali penentuan

kuantitatif terhadap sampel yang dianalisis dengan metode terpilih. Makin

kecil simpangan relatif yang dihasilkan oleh suatu metode maka validitas

metode tersebut semakin terjamin. Harga simpangan relatif tergantung dari

besar kecilnya kadar zat yang dianalisis, panjang tahapan prosedur analisis,

jenis zat yang dianalisis dan kecanggihan alat yang digunakan. Presisi

dinyatakan dalam harga % Coefficient of Variation (CV). Menurut Anonim

(2004), CV yang baik adalah CV ≤ 20% untuk konsentrasi analit <0,1%b/v.

Tabel VIII. Nilai CV hasil validasi metode analisisKonsentrasi (mg/mL) SD CV (%)

Tinggi 0,0193 0,0006 3,1088Sedang 0,0156 0,0003 1,9231Rendah 0,0117 0,0001 0,8547

Berdasarkan tabel VIII, ketiga macam konsentrasi yang diuji dalam

validasi metode ini mempunyai nilai CV 3,1088%, 1,9231%, dan 0,8547%

berturut turut untuk konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah, sehingga semua

seri konsentrasi DPPH yang diuji mempunyai nilai CV yang masuk dalam

rentang nilai CV yang dipersyaratkan untuk konsentrasi analit <0,1%(b/v),

yaitu CV ≤ 20%. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan

mempunyai presisi yang baik.

Hasil dari validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa

metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh rutin sebagai antioksidan


45

terbukti sudah baik dalam presisi dan akurasi, maupun linearitasnya, sehingga

hasil yang diperoleh dapat dipercaya keakuratannya.

J. Hasil Uji Penangkapan Radikal Bebas dengan Metode DPPH

Uji antioksidan yang biasa dilakukan adalah uji menggunakan metode

deoksiribosa dan metode DPPH. Dalam metode deoksiribosa, yang berperan

sebagai radikal bebas adalah radikal hidroksil, radikal ini diketahui merupakan

radikal yang lebih reaktif jika dibandingkan dengan radikal nitrogen yang dimiliki

oleh DPPH. Walaupun metode deoksiribosa mempunyai kelebihan dalam hal

kereaktifan senyawanya, namun tidak digunakan metode deoksiribosa untuk

penelitian ini karena dalam metode deoksiribosa, senyawa yang diuji harus larut

air, padahal sampel ekstrak daun singkong yang akan diteliti mempunyai

kelarutan yang rendah dalam air, oleh karena itu maka digunakan metode DPPH

dalam penelitian ini. Metode DPPH digunakan dalam penelitian ini juga karena

dapat digunakan secara luas untuk pengujian aktivitas antioksidan serta

merupakan teknik pengujian yang sederhana dan cepat dalam pelaksanaannya

(Karadag, dkk., 2009).

Prinsip dari metode ini adalah kemampuan suatu senyawa untuk menangkap

radikal DPPH. DPPH memberikan warna violet pada panjang gelombang 517 nm.

Penangkapan radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang

kemudian menyebabkan penghilangan warna. Penghilangan warna ini sebanding

dengan jumlah radikal DPPH yang berhasil ditangkap oleh senyawa antioksidan.

DPPH adalah radikal bebas yang stabil karena adanya delokalisasi elektron

yang terjadi di dalam molekulnya. DPPH akan memberikan warna violet oleh


46

karena adanya kromofor dan auksokrom dalam struktur kimianya. Molyneux

(2003) mengatakan bahwa adanya delokalisasi elektron dalam molekul DPPH

akan memberikan warna violet dari DPPH.

DPPH merupakan suatu radikal stabil dalam larutan air atau metanol dan

mampu menerima sebuah elektron atau radikal hidrogen untuk menjadi molekul

yang stabil (Sunarni, 2007). DPPH pada penelitian ini ditangkap oleh antioksidan

yang kemudian akan melepaskan radikal hidrogen, sehingga membentuk senyawa

DPPH-H. Terjadi perubahan warna dari violet menjadi kuning, serta diikuti

penurunan serapan pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan

diketahui dari adanya penurunan serapan DPPH. Absorbansi DPPH akan

mengalami penurunan seiring dengan peningkatan konsentrasi sampel yang

ditambahkan.

Dalam penelitian ini, ekstrak daun singkong memiliki aktivitas

antioksidan, hal ini disebabkan adanya kandungan flavonoid dan vitamin C dalam

daun singkong. Vitamin C dalam ekstrak daun singkong hanya akan sedikit

mempengaruhi kemampuan antioksidan yang dimiliki oleh daun singkong karena

konsentrasinya yang kecil akibat vitamin C banyak yang sudah hilang pada saat

proses ekstraksi. Vitamin C sudah banyak yang hilang saat ekstraksi karena sifat

vitamin C yang agak sukar larut dalam etanol (penyari yang digunakan saat

ekstraksi daun singkong), serta sifatnya yang mudah rusak oleh adanya cahaya.

Struktur kimia yang dimiliki oleh rutin menunjukan bahwa rutin mempunyai

aktivitas antioksidan karena adanya gugus –OH fenolik dalam strukturnya. Gugus


47

–OH fenolik ini yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan yang

dimiliki oleh rutin.

HO

OH O

O

O

O

OH

Rha Glu

H

HO

OH O

O

O

OH

Rha Glu

O

HO

OH O

O

O

OH

Rha Glu

O

R

HO

OH O

O

O

OH

Rha Glu

O

HO

OH O

O

O

OH

Rha Glu

O

RH

Rutin

HO

OH O

O

O

OH

Rha Glu

O

Gambar 10. Mekanisme penghambatan radikal bebas DPPH (·R) olehsenyawa rutin


48

Reaksi penghambatan radikal bebas DPPH oleh karena adanya rutin

ditunjukkan pada Gambar 10, dimana radikal bebas DPPH digambarkan sebagai

·R. Pada saat penambahan senyawa yang bersifat antioksidan, satu elektron bebas

yang terdapat pada DPPH akan mengikat ·H yang berasal dari senyawa

antioksidan, sehingga sifat radikal bebas yang dimiliki oleh DPPH akan hilang.

Hilangnya sifat radikal bebas ini menyebabkan tidak terjadinya delokalisasi

elektron dalam molekul DPPH, sehingga warna violet lama-kelamaan akan

berkurang intensitasnya. Pengurangan intensitas warna ini sebanding dengan

jumlah radikal bebas DPPH yang ditangkap oleh senyawa antioksidan.

Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Efficient Concentration 50

(EC50). Nilai EC50 menyatakan konsentrasi substrat yang bisa menyebabkan

hilangnya 50% dari aktivitas DPPH. Hilangya aktivitas DPPH ini dapat dilihat

dari adanya pengurangan intensitas warna violet dari larutan DPPH.

Larutan uji merupakan ekstrak daun singkong yang dilarutkan dalam

metanol dan sedikit dimetil sulfoksida (DMSO). Penambahan DMSO

dimaksudkan untuk meningkatkan kelarutan ekstrak dalam metanol. DMSO dapat

meningkatkan kelarutan ekstrak dalam metanol karena DMSO ini cenderung

bersifat sebagai surfaktan. Sejauh penelusuran pustaka, DMSO dan metanol tidak

mempunyai aktivitas antioksidan, sehingga adanya DMSO dan metanol tidak

dikhawatirkan mempengaruhi hasil penelitian ini.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa larutan uji yang ditambahkan ke

dalam larutan DPPH mampu mengurangi intensitas warna violet yang dimiliki

DPPH. Terjadi pengurangan nilai absorbansi DPPH setelah larutan DPPH


49

mengalami penambahan sampel ekstrak daun singkong. Dengan demikian dapat

disimpulkan bahwa ekstrak daun singkong mempunyai aktivitas antioksidan.

Tabel IX. Aktivitas Penghambatan Radikal Bebas oleh Ekstrak DaunSingkong (EC50)

Replikasi Nilai r Meannilai r

EC50(mg/mL) (mg/mL) SD CV

I 0,9770

0,9791

4,57704,6170

±0,2570

0,2570 5,5664%II 0,9749 4,8776III 0,9729 4,5413IV 0,9929 4,8432V 0,9777 4,2458

CV yang dihasilkan dari hasil pengukuran sampel yaitu sebesar 5,5664%,

sehingga CV dikatakan memenuhi persyaratan analisis, yaitu ≤20%, hal ini berarti

bahwa uji antioksidan yang dilakukan mempunyai presisi yang bagus dan cukup

reprodusibel. Nilai r yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah 0,9791, dimana

nilai ini berada di bawah nilai r yang dipersyaratkan (0,999), sehingga uji

antioksidan yang dilakukan dalam penelitian ini kurang baik linearitasnya.

Linearitas yang kurang baik dalam penelitian ini dapat disebabkan karena sampel

yang diuji masih berupa ekstrak yang terdiri dari campuran senyawa yang

kompleks, sehingga mempengaruhi hasil penelitian.

Berdasarkan hasil penelitian, diketahui bahwa nilai EC50 rata-rata ekstrak

daun singkong sebesar 4,6170 ± 0,2570 mg/mL (Tabel IX). Nilai ini

menunjukkan bahwa dibutuhkan ekstrak daun singkong dengan konsentrasi

4,6170 ± 0,2570 mg/mL untuk menghasilkan penurunan 50% dari aktivitas

DPPH.

Selama ini asam askorbat atau yang lebih dikenal sebagai vitamin C

diketahui mempunyai aktivitas antioksidan. Prytula (2010) menyatakan EC50


50

vitamin C yaitu sebesar 0.5 µmol/L (= 0,0886 mg/mL). Berdasarkan hal ini, maka

dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh ekstrak daun

singkong masih lebih kecil jika dibandingkan dengan aktivitas antioksidan yang

dimiliki oleh vitamin C, namun demikian ekstrak daun singkong dapat dijadikan

alternatif antioksidan alami.


51

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

1. Kesimpulan

Nilai aktivitas antioksidan ekstrak daun singkong yang dinyatakan sebagai

nilai EC50 yaitu 4,6170 ± 0,2570 mg/mL.

2. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kemungkinan adanya

reaksi bolak-balik yang terjadi antara DPPH dengan senyawa rutin.


52

DAFTAR PUSTAKA

Andayani, R., Lisawati Y., dan Maimunah, 2008, Penentuan AktivitasAbtioksidan Kadar Fenolat Total dan Likopen Pada Buah Tomat(Solanum Lycopersicum L.), http://ffarmasi.unand.ac.id/pub/JSTF-Feb2009%20_regina_.pdf, diakses tanggal 2 Oktober 2009

Amarowicz, R., Naczk, M., dan Fereiodon, S., 2000, Antioxidant Activity ofCrude Tannins of Canola and Repessed Hulls, JAOCS, 77, 957-961

Amrun, M. dan Umiyah, 2005, Pengujian Antiradikal Bebas Difenilpikril Hidrazil(DPPH) Ekstrak Buah Kenitu (Chrysophyllum cainito L.,) Dari DaerahSekitar Jember, Jurnal ILMU DASAR, 6, 2, 110-114

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 10-13, , Departemen kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, 1061, 1036, 1061, DepartemenKesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, 13-17,Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2004, Guidelines for The Validation of Analytical mEthods for ActiveConstituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, APVMA,Kingston

Anonim, 2007, The United States Pharmacopeia 30th The National Formulary25th, United States Pharmacopeal Convention, Inc., New York

Bahruddin, Sirait M., Moesdarsono, 2007, Pemeriksaan Kadar Rutin pada daunSingkong (manihot utilissima Pohl.) Muda, Tua, dan Kuning,http://bahan-alam.fa.itb.ac.id, diakses tanggal 2 Oktober 2009

Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1991, Comparison of TheAntioxidative of Some Acid Phenols : Structure Activity Relationship,Biosci. Biotech. Biochem, 5(2), 324-325

Ebuehi, O.A.T., Babalola, O., Ahmed, Z., 2005, Phytochemical, Nutrititive andAnti-Nutritive Composition of Cassava (Manihot esculenta L) Tubersand Leaves, http://ajol.info/index.php/nifoj/article/view/33597, diaksestanggal 12 November 2009

Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, 119-220,diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., edisi ke 3, Penerbit Erlangga,Jakarta


http://ffarmasi.unand.ac.id/pub/JSTF-

http://bahan-alam.fa.itb.ac.id

http://ajol.info/index.php/

53

Fouad, T., 2005, Antioxidant, Nature, and Chemistry,http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant,diakses tanggal 4 November 2009

Gritter, R., Bobbit, J.M., dan Schwarting, A., 1991, Pengantar Kromatografi, 7-25, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan,Ed. 2, 47-109, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB,Bandung

Halliwel, B., dan Auroma O.I., 1993, DNA and Free Radicals in Biology andMedicine, 3rd ed, 1-231, 353-425, Oxford University Press Inc., NewYork

Harmita, 2004, Majalah Ilmu Kefarmasian Vol.I, No.3: Petunjuk PelaksanaanValidasi Metode dan Cara, 117-135, Departemen Farmasi FMIPA UI,Jakarta

Karadag A., Ozcelik B., Saner S., 2009, Review of Methods to determineAntioxidant Capacities,http://www.springerlink.com/content/70118r228210n6r8/fulltext.pdf,diakses tanggal 4 November 2009

Leru, B. and Calatayud, P.A., 1994, Interactions Between Cassava And ArthropodPests, African Crop Science Journal, Vol. 2. No.4, pp. 385-390, Uganda

Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The SystematicIdentification of Flavonoid, 1-343, Springe-Verlag, New York

Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, 16-33, Penerbit ITBBandung, Bandung

Miller A.L., 1996, Antioxidant Flavonoids: Structure, Function and ClinicalUsage, AMR, Volume 1, No.2, 104,http://pdfcast.org/cache/antioxidant-flavonoids-structure-function-and-clinical-usage, diakses tanggal 4 November 2009

Molyneux P., 2003, The Use of Stable Free Radical Diphenylpicryl Hydrazyl(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity,http://www.sjst.psu.ac.th/journal/26-2.pdf/07-DPPH.pdf, diaksestanggal 4 November 2009


http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant

http://www.springerlink.com/content/70118r228210n6r8/fulltext.pdf

http://pdfcast.org/cache/antioxidant-flavonoids-structure-function-and-

http://www.sjst.psu.ac.th/journal/26-2.pdf/

54

Mulja, M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga UniversityPress, Surabaya

Mulja, M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yangBaik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, vol. IIINo. 2, Agustus 2003, 71-76

Nuengchamnong, N., Lokkerbol, A.H., Ingkaninan, K., 2004, Separation andDetection of The Antioxidant Flavonoids Rutin and Quercetin, UsingHPLC Coupled on-line With Colorimetric Detection of AntioxidantActivity, NUJ, http://office.nu.ac.th/nu_journal/pdf/journal/12(2)25-37.pdf, diakses tanggal 4 November 2009

Putra R.Y., 2010, Laporan Praktikum Fitokimia “Manihot Esculenta”,http://rizkytrondol.blogspot.com/2009/04/laporan-praktikum-fitokimia-oleh-rizky_2158.html, diakses tanggal 5 Februari 2010

Percival, M., 1998, Antioxidant, Advanced Notrition Publication, Inc.

Prytula, M.A.N.D., 2010, Intravenous Vitamin C in Cancer Management,http://www.wellness-institute.ca/Intravenous-Vitamin-C-in-Cancer-Management.aspx, diakses tanggal 3 Februari 2010

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan olehPadmawinata, K., 191-213, Penerbit ITB, Bandung

Rohdiana, D., 2001, Radical Scavengers Activity of Tea Poliphenol, MajalahFarmasi Indonesia, 12(1) : 53-58

Sari, V.Y.C., 2010, Optimasi Komposisi Etanol dan Air dalam Proses MeserasiDaun Singkong (Manihotis Folium) dengan Aplikasi Simplex LatticeDesign, 44, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Sastromihardjojo, 2001, Spektroskopi, Edisi ke 2, 39-42, Liberty, Yogyakarta

Silverstein R.M dab Bassler, 1991, Spectrometric Identification of OrganicCompounds, John Willey and Sons, Inc., New York

Steenis, C.G.G.J.V., 1992, Flora Untuk Sekolah di Indonesia, 1-421, PT. PradnyaParamita, Jakarta

Sunarni T., Pramono S., Asmah R., 1997, Flavonoid Antioksidan PenangkapRadikal dari Daun Kepel (Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f. &Th.),http://www.akademik.unsri.ac.id/download/journal/files/gmfarmasi/1._18-3-2007-titik.pdf, diakses tanggal 4 November 2009


http://office.nu.ac.th/nu_journal/pdf/journal/12

http://rizkytrondol.blogspot.com/2009/04/laporan-praktikum-

http://www.wellness-institute.ca/Intravenous-Vitamin-C-in-Cancer-

http://www.akademik.unsri.ac.id/download/journal/files/gmfarmasi/1._

55

LAMPIRAN


56

Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman Singkong


57

Lampiran 2. Perhitungan Rendemen Ekstrak Daun Singkong

Data Penimbangan Serbuk Daun Singkong untuk Stok Ekstrak

Bobot Penimbangan ke-1 2 3 4 5 6 7 8 9

KertasKosong

(g)0,3670 0,3105 0,3650 0,3660 0,3997 0,3642 0,3688 0,3596 0,2760

Kertas+ zat(g)

5,3683 5,3165 5,3681 5,3670 5,400 5,3639 5,3653 5,3679 5,2785

Kertas+ sisa

(g)0,3683 0,3160 0,3651 0,3667 0,400 0,3626 0,3690 0,3673 0,2785

BobotZat(g)

5,0000 5,0050 5,0030 5,0003 5,000 5,0013 4,9963 5,0006 5,000

Keterangan: Penimbangan dilakukan 9 kali karena keterbatasan alat timbang.Bobot keseluruhan serbuk yang ditimbang = 45,0065 gBobot ekstrak kental hasil bobot konstan = 28,3412 g

%100Re serbukbobot

kentalekstrakbobotndemenPersen

%1000065,453412,28

gg

= 37,1125%


58

Lampiran 3. Penentuan Reaction TimeMenggunakan Panjang gelombang 517 nm, total scan time 45 menit

Tabel X. Hasil Penentuan Reaction TimeMenit

ke- Absorbansi Menitke- Absorbansi Menit

ke- Absorbansi Menitke- Absorbansi

0 0,412 12 0,414 24 0.418 36 0.4231 0,412 13 0,414 25 0.419 37 0.4242 0,411 14 0,414 26 0.419 38 0.4243 0,411 15 0,414 27 0.420 39 0.4244 0,412 16 0,415 28 0.420 40 0.4255 0,412 17 0,415 29 0.420 41 0.4256 0,412 18 0,416 30 0.421 42 0.4267 0,412 19 0.416 31 0.421 43 0.4268 0,412 20 0.417 32 0.422 44 0.4279 0,413 21 0.418 33 0.422 45 0.427

10 0,413 22 0.418 34 0.42311 0,413 23 0.419 35 0.423

Gambar 11. Foto grafik absorbansi DPPH saat penentuan Reaction Time


59

Lampiran 4. Contoh Perhitungan Validasi Metode Analisis

Ambil 3,8 mL DPPH ditambah 0,2 mL larutan standar rutin (0,002002%b/v) vortex ukur absorbansi sesuai Reaction TimeRutin yang harusnya ditimbang 0,01 gram

Data penimbangan rutin=Bobot arloji kosong = 13,64088 gramBobot arloji kosong + isi = 13,65089 gramBobot arloji kosong + sisa = 13,64088 gramBobot zat = 0,01001 gramRutin tadi tambah DMSO 1 mL ad 10 mL metanol

Konsentrasi stok larutan rutin = 0,1001% b/vDiambil 0,1 mL di ad 5 mL metanol

V1 x C1 = V2 x C20,1 mL x 0,1001% = 5 mL x C2C2 = 0,002002 %

Blanko adalah 1 mL DMSO di ad 10 mL metanolKonsentrasi DPPH yang digunakan harusnya: 0,00196% b/v =

0,0196 mLmg

Tabel XII. Data penimbangan DPPH untuk Validasi Metode AnalisisPengerjaan I Pengerjaan II Replikasi III

Bobot gelas arloji kosong(g) 13,62927 13,61926 13,64097

Bobot gelas arloji + zat(g) 13,63125 13,62122 13,64295

Bobot gelas arloji + sisa(g) 13,62928 13,61926 13,64098

Bobot DPPH(g) 0,00197 0,00196 0,00197

Konsentrasi DPPH dalam100 mL 0,0197 mg/mL 0,0196 mg/mL 0,0197mg/mL

o Replikasi ITabel XIII. Data absorbansi untuk pengerjaan I validasi metode analisis

KonsentrasiLarutan DPPH Abs Blanko Abs DPPH

terukurAbs DPPHTerhitung A = 0,0164

B = 23,1670r = 0,99990,0197 mg/mL 0,045 0,517 0,472

0,0158 mg/mL 0,045 0,439 0,3840,0118 mg/mL 0,045 0,284 0,289


60

Tabel XI. Data absorbansi untuk pengerjaan II validasi metode analisisKonsentrasi

Larutan DPPHAbs Blanko Abs DPPH

terukurAbs DPPHTerhitung A = 0,0134

B = 23,0769r = 0,9990

0,0196 mg/mL 0,044 0,512 0,4680,0157 mg/mL 0,044 0,415 0,3710,0118 mg/mL 0,044 0,332 0,288

Tabel XIV. Data absorbansi untuk pengerjaan III validasi metode analisisKonsentrasi

Larutan DPPHAbs Blanko Abs DPPH

terukurAbs DPPHTerhitung

A= 0,0507B= 20,3974r = 0,99310,0197 mg/mL 0,044 0,491 0,447

0,0158 mg/mL 0,044 0,428 0,3840,0118 mg/mL 0,043 0,329 0,286

Persamaan regresi linear yang dipakai untuk validasi metode analisis adalahpersamaan hasil pengerjaan I, karena mempunyai nilai r yang paling baik(r=0,9999)

Y = bX + a Y = 23,1670X + 0,0164


61

Lampiran 5. Contoh Perhitungan Recovery kadar DPPH

Konsentrasi AbsorbansiPengerjaan I Pengerjaan II Pengerjaan III

Tinggi 0,472 0,468 0,447Sedang 0,384 0,371 0,384Rendah 0,289 0,288 0,286

Kadar terukur rutin menggunakan persamaan regresi replikasi I Y = bX + a Y = 23,1670 X + 0,0164 0,472 = 23,1670 X + 0,0164

X = 0,0197 mg/mL

Konsentrasi Kadar terukurPengerjaan I Pengerjaan II Pengerjaan III

Tinggi 0,0197 mg/mL 0,0195 mg/mL 0,0186 mg/mLSedang 0,0157 mg/mL 0,0153 mg/mL 0,0159 mg/mL

Rendah 0,0118 mg/mL 0,0117 mg/mL 0,0116 mg/mL

Contoh Perhitungan Recovery kadar rutin

%100%0197,0%0197,0

%100

KonsentrasiRecovery (%)

PengerjaanI

PengerjaanII

PengerjaanIII

Rata-rata

Tinggi 100 99,4898 94,4162 97,9687Sedang 100,6370 97,4522 100,6329 99,5740Rendah 100 99,1525 98,3051 99,1525


62

Lampiran 6. Contoh Perhitungan CV untuk Validasi Metode Analisis

Konsentrasi (mg/mL) SD CV (%)Tinggi 0,0193 0,0006 3,1088Sedang 0,0156 0,0003 1,9231Rendah 0,0117 0,0001 0,8547

%1088,3

%1000193,00006,0


63

Lampiran 7. Contoh perhitungan EC50 Ekstrak Daun Singkong

Rata-rata kadar rutin dalam ekstrak singkong Formula 2 suhu 300

ggg 0611,03

1834,03

)0436,01377,00021,0(

/1 µg ekstrak

Bobot ekstrak yang setara dengan 10 mg baku rutin adalah

Xg 1

100611,0

X = 163,66612 mg = 0,16367 gram

Jadi, timbang 0,16367 gram sampel

Tabel XV. Data Penimbangan Ekstrak Daun SingkongReplikasi

I II III IV VBobot gelas arloji

kosong (g) 13,62918 13,64101 14,22942 14,74833 13,62942

Bobot gelas arloji +zat (g) 13,79285 13,80471 14,39309 14,91199 13,79309

Bobot gelas arloji +sisa (g) 13,62919 13,64104 14,22942 14,74833 13,62942

Bobot DPPH (g) 0,16366 0,16367 0,16367 0,16366 0,16367Konsentrasi

ekstrak dalammetanol 10 mL

(mg/mL)

16,3660 16,3670 16,3670 16,3660 16,3670

Sampel tadi ditambah DMSO 1 mL kemudian di ad metanol 10 mLDibuat 5 macam seri konsentrasi larutan uji

Diambil 0,1 mL; 0,2 mL; 0,3 mL; 0,5 mL dan 0,7 mL kemudian di ad 5 mLmethanol

%100%tan

tantan

kontrollaru

sampellarukontrollaru

A

AAabsorbansipenurunan

Tabel Persen Penurunan Absorbansi Replikasi I

KonsentrasiLarutan Uji Blanko DPPH Abs

terukurAbs

Terhitung

%penurunanabsorbansi

0,3273 mg/mL 0,036 0,564 0,510 0,474 15,9574%0,6546 mg/mL 0,036 0,565 0,489 0,453 19,8230%0,9820 mg/mL 0,036 0,565 0,463 0,427 24,4248%1,6366 mg/mL 0,036 0,566 0,445 0,409 27,7385%2,2912 mg/mL 0,036 0,567 0,424 0,388 31,5697%


64

A = 14,8546B = 7,6787R = 0,9770

Persamaan regresi yang didapat y = bX + a Y = 76,7860X + 14,8546

50% = 7,6787X + 14,8546X = 4,5770 mg/mL

EC50 = 4,5770 mg/mL

Tabel Persen Penurunan Absorbansi Replikasi II


terukurAbs

Terhitung

%Penurunanabsorbansi

0,3273 mg/mL 0,036 0,563 0,516 0,480 14,7424%0,6547 mg/mL 0,036 0,563 0,493 0,457 18,8277%0,9820 mg/mL 0,036 0,563 0,473 0,437 22,3801%1,6367 mg/mL 0,036 0,563 0,446 0,410 27,1758%2,2914 mg/mL 0,036 0,563 0,433 0,397 29,4849%

A = 13,7688B = 7,4281R = 0,9749

Persamaan regresi yang didapat adalah y = 7,4281X + 13,768850% = 7,4281X + 13,7688X = 4,8776 mg/mL

EC50 = 4,8776 mg/mL

Tabel Penurunan Absorbansi Replikasi III


terukurAbs

Terhitung


0,3273% 0,036 0,564 0,513 0,477 15,4255%0,6547% 0,036 0,565 0,493 0,457 19,1150%0,9820% 0,036 0,565 0,464 0,428 24,2478%1,6367% 0,036 0,566 0,445 0,409 27,7385%2,2914% 0,036 0,567 0,426 0,390 31,2169%

A = 14,2801B = 7,8653R = 0,9729

Persamaan regresi yang didapat adalah y = 7,8653X + 14,280150% = 7,8653X + 14,2811


65

X = 4,5413 mg/mLEC50 = 4,5413 mg/mL

Tabel Data Persen Penurunan Absorbansi Replikasi IV


terukurAbs

Terhitung


0,3273% 0,036 0,567 0,511 0,475 16,2257%0,6546% 0,036 0,568 0,495 0,459 19,1901%0,9820% 0,036 0,569 0,480 0,444 21,9684%1,6366% 0,036 0,570 0,450 0,414 27,3684%2,2912% 0,036 0,571 0,433 0,397 30,4728%

A = 14,3785B = 7,3549R = 0,9929

Persamaan regresi yang didapat y = 7,3549X+14,378550% = 7,3549X + 14,3785X = 4,8432 mg/mL

EC50 = 4,8432 mg/mL

Tabel Data Persen Penurunan Absorbansi Replikasi V


terukurAbs

Terhitung


0,3273% 0,036 0,572 0,512 0,476 16,7832%0,6547% 0,036 0,573 0,489 0,453 20,9424%0,9820% 0,036 0,574 0,470 0,434 24,3902%1,6367% 0,036 0,575 0,436 0,400 30,4348%2,2914% 0,036 0,576 0,424 0,388 32,6389%

A = 15,4480B = 8,1379R = 0,9777

Persamaan regresi yang didapat adalah y = 8,1379X + 15,448050% = 8,1379X + 15,4480X = 4,2458 mg/mL

EC50 = 4,2458 mg/mL


66

Lampiran 8. Hasil penentuan susut pengeringan ekstrak daun singkong

Replikasi Jamke-

Bobotbotol

timbang(g)

Bobotbotol

timbang&ekstrakawal (g)

Bobotekstrak

awal(g)

Bobotbotol

timbang&

ekstrakkering

(g)

Bobotekstrakkering

(g)

Susutpengeringan

(%)

Rata-ratasusut

pengeringan(%)

1

0 20.3558 21.4138 1.0580

15.4726

15.6246 ±0,1385

5 20.3558 21.4138 1.0580 21.2541 0.89836 20.3558 21.4138 1.0580 21.2516 0.89587 20.3558 21.4138 1.0580 21.2514 0.89568 20.3558 21.4138 1.0580 21.2501 0.8943

2

0 19.4327 20.4367 1.0040

15.65745 19.4327 20.4367 1.0040 20.2840 0.85136 19.4327 20.4367 1.0040 20.2812 0.84857 19.4327 20.4367 1.0040 20.2806 0.84798 19.4327 20.4367 1.0040 20.2795 0.8468

3

0 19.9344 20.9602 1.0258

15.74385 19.9344 20.9602 1.0258 20.8037 0.86936 19.9344 20.9602 1.0258 20.8007 0.86637 19.9344 20.9602 1.0258 20.7996 0.86528 19.9344 20.9602 1.0258 20.7987 0.8643


67

Lampiran 9. Hasil penentuan kadar abu ekstrak daun singkong

Replikasi Jamke-

Bobotkrus(g)

Bobotkrus

& ekstrakawal (g)

Bobotekstrakawal (g)

Bobotkrus

& abu(g)

Bobotabu(g)

Kadarabu(%)

Rata-rata kadarabu (%)

1

0 56.7999 58.9862 2.1863

17.3581

16.5410± 2.5051

5 56.7999 58.9862 2.1863 57.0679 0.26806 56.7999 58.9862 2.1863 57.0353 0.23547 56.7999 58.9862 2.1863 57.0277 0.22788 56.7999 58.9862 2.1863 57.1962 0.39639 56.7999 58.9862 2.1863 57.2455 0.445610 56.7999 58.9862 2.1863 57.2655 0.465611 56.7999 58.9862 2.1863 57.2549 0.455012 56.7999 58.9862 2.1863 57.2563 0.456413 56.7999 58.9862 2.1863 57.2359 0.436014 56.7999 58.9862 2.1863 57.2215 0.421615 56.7999 58.9862 2.1863 57.2342 0.434316 56.7999 58.9862 2.1863 57.2479 0.448017 56.7999 58.9862 2.1863 57.2216 0.421718 56.7999 58.9862 2.1863 57.2239 0.424019 56.7999 58.9862 2.1863 57.2405 0.440620 56.7999 58.9862 2.1863 57.2248 0.424921 56.7999 58.9862 2.1863 57.2252 0.425322 56.7999 58.9862 2.1863 57.2413 0.441123 56.7999 58.9862 2.1863 57.2223 0.422424 56.7999 58.9862 2.1863 57.2193 0.419425 56.7999 58.9862 2.1863 57.1873 0.387426 56.7999 58.9862 2.1863 57.1794 0.379527 56.7999 58.9862 2.1863 57.1794 0.3795

2

0 31.2927 33.3547 2.0620

13.7294

5 31.2927 33.3547 2.0620 31.4941 0.20146 31.2927 33.3547 2.0620 31.4924 0.19977 31.2927 33.3547 2.0620 31.4959 0.20328 31.2927 33.3547 2.0620 31.6007 0.30809 31.2927 33.3547 2.0620 31.6101 0.317410 31.2927 33.3547 2.0620 31.6269 0.334211 31.2927 33.3547 2.0620 31.6144 0.321712 31.2927 33.3547 2.0620 31.6180 0.325313 31.2927 33.3547 2.0620 31.6064 0.313714 31.2927 33.3547 2.0620 31.5922 0.299515 31.2927 33.3547 2.0620 31.5949 0.3022


68

16 31.2927 33.3547 2.0620 31.6105 0.317817 31.2927 33.3547 2.0620 31.5819 0.289218 31.2927 33.3547 2.0620 31.5847 0.292019 31.2927 33.3547 2.0620 31.5923 0.299620 31.2927 33.3547 2.0620 31.5836 0.290921 31.2927 33.3547 2.0620 31.5856 0.292922 31.2927 33.3547 2.0620 31.5961 0.303423 31.2927 33.3547 2.0620 31.5817 0.289024 31.2927 33.3547 2.0620 31.5785 0.285825 31.2927 33.3547 2.0620 31.5758 0.283126 31.2927 33.3547 2.0620 31.5758 0.283127 31.2927 33.3547 2.0620 31.5758 0.2831

3

0 46.9320 49.2033 2.2713

18.5356

5 46.9320 49.2033 2.2713 47.1767 0.24476 46.9320 49.2033 2.2713 47.1691 0.23717 46.9320 49.2033 2.2713 47.1832 0.25128 46.9320 49.2033 2.2713 47.3830 0.45109 46.9320 49.2033 2.2713 47.3673 0.435310 46.9320 49.2033 2.2713 47.3853 0.453311 46.9320 49.2033 2.2713 47.3705 0.438512 46.9320 49.2033 2.2713 47.3763 0.444313 46.9320 49.2033 2.2713 47.3781 0.446114 46.9320 49.2033 2.2713 47.372 0.440015 46.9320 49.2033 2.2713 47.3766 0.444616 46.9320 49.2033 2.2713 47.3868 0.454817 46.9320 49.2033 2.2713 47.3619 0.429918 46.9320 49.2033 2.2713 47.4643 0.532319 46.9320 49.2033 2.2713 47.3797 0.447720 46.9320 49.2033 2.2713 47.3654 0.433421 46.9320 49.2033 2.2713 47.3647 0.432722 46.9320 49.2033 2.2713 47.3774 0.445423 46.9320 49.2033 2.2713 47.3602 0.428224 46.9320 49.2033 2.2713 47.3576 0.425625 46.9320 49.2033 2.2713 47.353 0.42126 46.9320 49.2033 2.2713 47.353 0.421


69

Lampiran 10. Foto-foto penelitian

Tanaman singkong Spektrofotometer UV-Vis

Ekstrak daun singkong


70

BIOGRAFI PENULIS

Bernadeta Ardy Puspitarini, penulis skripsi berjudul UJI

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN

SINGKONG (Manihotis Folium) MENGGUNAKAN

METODE DIPHENYLPICRYL HYDRAZYL (DPPH),

dilahirkan di Wonosari, pada tanggal 11 Januari 1988

dari pasangan Bapak Yoseph Kardjimin dan Ibu Maria

Magdalena Sumini. Penulis telah menyelesaikan

pendidikan di TK Kanisius Baleharjo pada tahun 1994

lalu melanjutkan pendidikan di SD Kanisius Wonosari III dari tahun 1994 sampai

dengan tahun 2000. Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMP 1

Wonosari pada tahun 2000 hingga tahun 2003 dan SMA 1 Wonosari pada tahun

2003 hingga tahun 2006. setamat dari SMA, penulis melanjutkan kuliah S1 di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2006 hingga

tahun 2010. Semasa kuliah, penulis pernah menjadi asisten dosen Praktikum FTS

Cair Semi Padat pada tahun 2009 dan Praktikum Analisis Sediaan Obat

Tradisional pada tahun yang sama. Penulis juga pernah terlibat dalam beberapa

kegiatan yang diadakan baik itu di lingkup Fakultas maupun lingkup Universitas,

diantaranya yaitu Sie Keamanan dalam acara Pharmacy Performance (2007), Sie

Dekorasi dalam acara Pekan Budaya (2007), Pendamping Kelompok dalam

kegiatan TITRASI 2008, serta Co-Fasilitator dalam kegiatan PPKM 2009.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · ii uji aktivitas antioksidan ekstrak daun...

Documents