plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk fileflavonoid total fraksi etil asetat buah...

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE

SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL MENGGUNAKAN DEOKSIRIBOSA

DAN PENENTUAN KADAR FLAVONOID TOTAL

FRAKSI ETIL ASETAT BUAH KETAPANG (Terminalia catappa L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Diajukan oleh :

Yovita Dwi Arini

NIM : 038114128

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

\ i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Persetujuan Skripsi

UJI AKTIVITAS AF{TIOKSIDAF{ DENGAI{ METODESPEKTROFOTOMETRI WSIBEL MENGGT]NAKAIY DEOKSIRIBOSA

DAN PEIIENTUAII KADAR F'LAVONOID TOTALF'RAKSI ETIL ASETAT BUAH KETAPANG (Terminalia catappaL)

Disusun oleh:

YovitaDwi ariniN IM:038114128

Telah disetujui oleh

Dr. C.J. Soegihardjo, Apt.Tanggal : 7O fanuor\ Z@B

U

11

,)

Pembimbing Utama


Pengesahan Skripsi

UJI AKTIYITAS ANTIOKSIDAN Df,NGAI{ METODESPEKTROFOTOMETRI WSIBEL MENGGT]NAKAN DEOKSIRIBOSA

DAN PEIIENTUAN KADAR FLAVONOID TOTALFRAKSI ETIL ASETAT BUAH KETAPAI\EC (Terminalia catappaL)

""",,111,,*',NIM:038114128

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji SkripsiFakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharmapadatanggal:

25 Januari 2008

Mengetahui,Fakultas Farmasi

Pembimbing Utama:

Dr. C.J. Soegihardjo, Apt.

Panitia Penguji :

1. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt.

2. Drs. Sulasmono, Apt.

3. Ema Tri Wulandari, M.Si., Apt..\

\\/ . . ./ 111

.&g",J,nu


\ iv


LEMBAR PERI{YATAA 1 N PIRSSTUJUANPUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAFI AIftI}EMTS

Yary bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanaa Dharma :

Nmra : Yovita Dwi Arini

Homorlvlahasiswa : 038114128

Demi pengembangan iknu pengetahuan, saya meurberil€n kepada Perpusbkaan

Universitas Sanata Dbamn karya ikniah saya ymg berjudul :

"UJT AKTIVITAS AF{TIOKSIDAN DSNGAIIi METODESTEKTROFOTOMETRI WSISEL MENGCT}NAKAITI I'EOKSIRIB$SADA}T PENENTUAN KANDTJNGAN F'LAVONOID TOTAL FRAI{SI ETILASITAT BUAH KETAPANG {Terminalia eunppaL}!

be$saa perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikim saya mernberikan

k€pada Perpustakaan Universitas Sanata Dhama hak untuk meryinrpan, me-

ngalit*an dalam bert* media lain, mengelolanya dalam bsrtuk pffigtielafl dst4

mendi$ribusikan secara terbatas, dan merrpublikasika*rya di Internet dau media

lais untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya rnaupul

memb€nkan royalti ke,pada saya selama tetap mencantumkm trama saya #gai

penulis. Demikiar pemyataan ini yang saya buat de,ngan sebewnya.

Dibuatdi Yogyakara

Padatanggal : 30 Januari 2008

Ymgmenyatakan

l


PRAKATA

Puji dan Syukur Penulis panjatkan kepada Allah Bapa yang senantiasa

mendampingi, membimbing, memberikan berkat, anugerah, kasih dan

pertolonganNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik.

Skripsi dengan judul Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

Spektrofotometri Visibel Menggunakan Deoksiribosa Dan Penentuan Kadar

Flavonoid Total Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang (Terminalia catappa L.)

disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari

bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis ingin

mengucapkan terima kasih kepada :

1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2. Bapak Dr. C.J. Soegihardjo, Apt selaku Dosen Pembimbing yang dengan

sabar telah bersedia membimbing, mengoreksi, memberi masukan,

bantuan dan saran mulai dari awal persiapan hingga akhir penyusunan

skripsi ini. Bahan-bahan yang bapak berikan sungguh berguna.

3. Bapak Drs. Sulasmono, Apt., selaku Dosen Penguji yang bersedia

berdiskusi, menguji, memberikan saran, kritik selama penyusunan skripsi.

4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang bersedia

berdiskusi, menguji, memberikan saran, masukan, kritik selama

penyusunan skripsi. Terima kasih untuk kesabarannya.

\ v


5. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku Dosen Pembimbing Akademik

yang telah mendukung, memotivasi, membantu dan memberikan

pengarahan selama kuliah.

6. Seluruh staf pengajar dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta. Terima kasih atas pengalaman, ilmu, dan

pengetahuannya.

7. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Sarwanto, Mas Kunto, Mas Parlan, terima

kasih atas kerja sama, bantuan, dan pendampingan selama penulis

“ngelab” di lantai tiga dan empat. Untuk Mas Andri, Mas Heru, Mas

Parjiman, Mas Kayat, Mas Yuwono, Pak Musrifin, Pak Iswandi dan Mas

Ottok, terima kasih atas peminjaman alat, kerja sama dan sapa ramahnya.

8. My sisters and brothers yang selalu menanyakan ’kapan selesai, kapan

wisuda?’, yang merupakan motivator untuk maju dan terus berusaha.

9. Teman-teman seperjalan hidup empat tahun ini, yanti ’nduke’, rachel

’ndut’, nopha ’nyet2’, tatik ’item’, mbak dias, mbak pepi, mbak sisca,

mbak estri, rita, tutu, vira. Cerita, tawa, kebersamaan dan kekompakan

yang akan selalu kurindukan.

10. Kelas C angkatan 2003 (kami menyebutnya Che_mistry), rasanya tak

habis-habis aku bercerita tentang semua yang kita lakukan empat tahun ini.

Canda, cerita, tugas, praktikum, ”dolan”, dan lainnya, pasti akan buat aku

kangen. Terima kasih buat persahabatan, kebersamaan, perhatian, doa,

semangat, kekompakkan dan kegilaannya. Tetap jadi sahabatku.

\ vi


11. Anggara Eka Nugraha, yang selalu memberi motivasi, bantuan, kritik,

saran, semangat ketika penulis sedang putus asa. Terima kasih buat

sayang, perhatian, doa, waktu, dukungan, dan pendampingannya serta

karya-karyanya yang sungguh ’cantik’.

12. Adik-adik angkatan baik yang menemani penulis saat ”ngelab”, sehingga

suasana di laboratorium lebih hidup dan ramai maupun yang selalu

menyapa penulis sehingga penulis termotivasi dan bersemangat kembali.

13. Mas Prasojo, yang mau memberikan ilmu tentang mekanisme reaksi dan

mas Ardian yang membantu memastikan metode yang digunakan.

14. Pak Yahya di UGM yang memberi ijin dan bersedia memetik ketapang

untuk penulis.

Serta untuk semua pribadi yang membantu penulis dalam banyak hal untuk

menyelesaikan skripsi ini, dan terima kasih untuk semuanya.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan

skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari berbagai

pihak. Akhirnya besar harapan penulis semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi

perkembangan ilmu farmasi

Yogyakarta, Januari 2008

Yovita Dwi Arini

\ vii


PERNYATAAT{ KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengnn sesungguhnya bahwa slsip$i ya$g saya tulis ini

tidak menouat lffiya dau bagian kar,,a orang lain, kwuali yaog telah disejbutkffi

datron kutipm dm daftar pustaka, sebagaimma layaknya karya ilmiah.

Yoryakarh, Januari2008

Ylll


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL........................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... iv

PRAKATA....................................................................................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... viii

DAFTAR ISI.................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL............................................................................................ xii

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvi

INTISARI......................................................................................................... xvii

ABSTRACT ....................................................................................................... xviii

BAB I. PENGANTAR..................................................................................... 1

A. Latar Belakang ............................................................................................ 1

B. Permasalahan............................................................................................... 4

C. Manfaat Penelitian....................................................................................... 4

D. Keaslian Penelitian...................................................................................... 5

E. Tujuan Penelitian......................................................................................... 5

BAB II. PENELAHAAN PUSTAKA.............................................................. 6

A. Tanaman Ketapang..................................................................................... 6

\ ix


1. Nama tanaman ....................................................................................... 6

2. Sistematika tanaman .............................................................................. 7

3. Kandungan kimia .................................................................................. 7

4. Kegunaan dan khasiat ........................................................................... 7

B. Flavonoid..................................................................................................... 8

1. Kerangka dasar dan pengertian flavonoid ............................................. 8

2. Penyebaran flavonoid ............................................................................ 9

3. Penggolongan dan sifat flavonoid ........................................................ 10

4. Penyarian flavonoid .............................................................................. 12

5. Deteksi dan identifikasi flavonoid ........................................................ 16

6. Kegunaan flavonoid .............................................................................. 16

C. Antioksidan ................................................................................................ 16

1. Radikal bebas ........................................................................................ 16

2. Definisi dan aktivitas antioksidan ......................................................... 18

3. Penggolongan antioksidan .................................................................... 18

4. Metode pengujian daya antioksidan ...................................................... 22

D. Deoksiribosa ............................................................................................... 24

E. Metode Penyarian ....................................................................................... 26

F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................................ 29

G. Spektrofotometri UV-Vis ........................................................................... 32

H. Keterangan Empirik ................................................................................... 38

H. Keterangan Empirik Yang Diharapkan ....................................................... 39

\ x


BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ................................................. ..... 40

A. Jenis dan Rancangan Penelitian …………………………………….. ...... 40

B. Variabel - Variabel Penelitian …………………………………………40

1. Variabel bebas........................................................................................ 40

2. Variabel tergantung ............................................................................... 40

3. Variabel pengacau ................................................................................. 40

C. Definisi Operasional …………………………………………………... 41

1. Uji aktivitas antioksidan ........................................................................ 41

2. Fraksi etil asetat ..................................................................................... 41

3. Kadar senyawa flavonoid total .............................................................. 41

4. buah ketapang ........................................................................................ 41

D. Bahan Penelitian ......................................................................................... 42

E. Alat Penelitian ............................................................................................ 42

F. Tata Cara Penelitian .................................................................................... 43

1. Determinasi tanaman............................................................................ 43

2. Pengumpulan bahan ............................................................................ 43

3. Pembuatan ekstrak etanol buah ketapang ........................................... 43

4. Pembuatan fraksi etil asetat buah ketapang ........................................ 44

5. Uji kualitatif kandungan flavonoid dengan metode KLT .................... 44

6. Pembuatan buffer fosfat ...................................................................... 44

7. Pembuatan pereaksi ............................................................................. 45

8. Optimasi metode ................................................................................. 47

\ xi


9. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil

asetat buah ketapang ........................................................................... 48

10. Penentuan kadar flavonoid total .......................................................... 49

G. Analisis Hasil ............................................................................................. 50

BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ............................... 51

A. Hasil Determinasi Tanaman .............................................................. 51

B. Hasil Pengumpulan Bahan ........................................................................ 51

C. Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Ketapang................................................ 52

D. Hasil Pembuatan Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang.................................. 57

E. Hasil Uji Kualitaif Flavonoid dengan metode KLT .................................. 58

F. Optimasi Metode ....................................................................................... 61

1. Penentuan waktu operasi ..................................................................... 61

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ............................ 66

G. Hasil Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode

Deoksiribosa .............................................................................................. 68

H. Penentuan Kadar Senyawa Flavonoid Total ............................................. 74

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 79

A. Kesimpulan ............................................................................................... 79

B. Saran .......................................................................................................... 79

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 80

LAMPIRAN..................................................................................................... 85

BIOGRAFI PENULIS …………………………………………………… .... 101

\ xii


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Warna bercak beberapa flavonoid setelah disemprot dengan

pereaksi besi (III) klorida .............................................................. 13

Tabel II. Penafsiran warna bercak dari segi struktur flavonoid .................... 15

Tabel III. Beberapa macam ROS dan antioksidan yang menetralkan............ 17

Tabel IV. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil

asetat buah ketapang dengan berbagai konsentrasi........................ 69

Tabel V. Persen scavenging fraksi etil asetat buah ketapang ....................... 71

Tabel VI. Kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan dengan

aluminium klorida dalam suasana basa ......................................... 76

Tabel VII. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat dihitung sebagai %b/b

ekivalen kuersetin .......................................................................... 77

\ xiii


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid .......................................................... 9

Gambar 2. Kerangka tipe-tipe flavonoid ...................................................... 11

Gambar 3. Pembentukan struktur kuinoid flavonoid karena uap ammonia . 13

Gambar 4. Reaksi pembentukan kompleks flavonoid (flavon, 5-OH

flavon, flavonol) dengan pereaksi aluminium klorida ................ 14

Gambar 5. Senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan ............ 21

Gambar 6. Struktur kimia beberapa antioksidan sintetik ............................. 21

Gambar 7. Struktur deoksiribosa ................................................................. 24

Gambar 8. Tingkat energi elektronik ............................................................ 34

Gambar 9. Struktur rutin ............................................................................... 58

Ganbar 10. Kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat

dengan fase diam: selulosa, fase gerak: butanol-asam asetat-air

(4:1:5) v/v, deteksi: uap amonia ................................................. 59

Gambar 11. Kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat

dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-

air (4:1:5) v/v, deteksi: pereaksi semprot besi (III) klorida ...... 60

Gambar 12. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi

kromogen MDA-TBA................................................................. 62

Gambar 13. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA ................................ 63

Gambar 14. Reaksi pembentukan MDA......................................................... 64

Gambar 15. Mekanisme reaksi pembentukan MDA-TBA ............................. 65

\ xiv


Gambar 16. Struktur kromogen MDA-TBA .................................................. 66

Gambar 17. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi

kromogen MDA-TBA................................................................. 67

Gambar 18. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi fraksi etil

asetat buah ketapang dengan absorbansi kromogen MDA-TBA 70

Gambar 19. Kurva hubungan kenaikan konsentrasi fraksi etil asetat dengan

% Scavenging ............................................................................. 71

Gambar 20. Mekanisme penangkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dan

efek resonansi yang terjadi pada flavonoid................................. 73

Gambar 21. Reaksi kopling radikal fenoksil.................................................... 74 Gambar 22. Reaksi yang terjadi dalam penetapan kadar flavonoid ............... 75

Gambar 23. Kurva kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan

dengan aluminium klorida dalam suasana basa .......................... 76

Gambar 23. Pohon ketapang ........................................................................... 94

Gambar 24. Buah ketapang ............................................................................. 94

Gambar 25. Daun ketapang ............................................................................. 94

Gambar 26. Bunga ketapang ........................................................................... 94

Gambar 27. Ekstrak kental buah ketapang ...................................................... 95

Gambar 29. Fraksi etil asetat buah ketapang .................................................. 95

Gambar 30. Perkolator ..................................................................................... 95

\ xv


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Tabel nilai koefisien korelasi (r) ................................................. 85

Lampiran 2. Perhitungan rendemen ................................................................ 85

Lampiran 3. Gambar kromatogram uji kualitatif flavonoid............................. 86

Lampiran 4. Contoh perhitungan % scavenging fraksi etil asetat buah

ketapang ...................................................................................... 86

Lampiran 5. Perhitungan nilai ES50 fraksi etil asetat ...................................... 87

Lampiran 6. Contoh perhitungan kadar flavonoid fraksi etil asetat ................ 87

Lampiran 7.Perhitungan A (1%, 1 cm) ............................................................ 88

Lampiran 8. Foto-foto ...................................................................................... 94

Lampiran 9. Surat determinasi ......................................................................... 96

Lampiran 10. Sertifikat analisis deoksiribosa .................................................. 97

Lampiran 11. Sertifikat analisis rutin............................................................... 98

Lampiran 12. Sertifikat analisis kuersetin........................................................ 99

Lampiran 13. Asam urat sebagai antioksidan .................................................. 100

\ xvi


INTISARI

Antioksidan adalah senyawa yang menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh, akibatnya kerusakan sel dan jaringan dapat dicegah. Ketapang merupakan salah satu tanaman, dimana buahnya memiliki kadar senyawa fenolik dan flavonoid yang digunakan untuk obat sakit kepala, pencahar, rematik, dan lepra.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat buah ketapang serta menentukan kadar flavonoid total. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan dalam persen penangkapan (% scavenging) dan nilai penangkapan efektif (effective scavenging) radikal hidroksil sebesar 50% (ES50).

Metode penangkapan radikal hidroksil yang digunakan adalah metode spektrofotometri visibel menggunakan deoksiribosa. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil, membentuk malondialdehid (MDA) dalam suasana asam dan adanya asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen MDA-TBA berwarna merah muda yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 532 nm.

Data kromatografi berupa hRf dan warna bercak sebelum dan sesudah ditambah pereaksi (uap amonia dan besi (III) klorida), diamati dengan sinar tampak maupun dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm. Kadar flavonoid total dihitung menggunakan persamaan regresi linear kurva baku kuersetin.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat buah ketapang memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil dengan ES50 sebesar 69,39µg/mL. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang adalah 3,302 %b/b ekivalen kuersetin.

Kata kunci : buah ketapang (Terminalia catappa L.), fraksi etil asetat, flavonoid

total, antioksidan, metode deoksiribosa

\ xvii


ABSTRACT

Antioxidant is a compound which habbits free radical reaction inside the body, so it prevents body cells and tissues damage. Ketapang is one of plants, which its fruit contents phenolic and flavonoid compounds, used for treating headache, laksantia, gout, and leprosy.

This research aimed to find out the antioxidant activity of the ethyl acetate fraction of ketapang fruit, and also to determine the total consentrations of flavonoid. The activity value of hydroxyl radical scavenging activity is state in percent (%) scavenging and hydroxyl radical effective scavenging value is in 50% (ES50).

The hydroxyl radical scavenging method that is spectrophotometry visible method used deoxyribose. The principle of this method is the deoxyribose degradation by the hydroxyl radical, forms the malondialdehyde (MDA) in acid condition, and also by the existence of thiobarbituric acid (TBA) produces the pink chromogent which has 532 nm for the length of the maximum wave, after the absorbance is measured.

The chromatography data is the form of hRf and spots colour on before and after being added with reagent (ammonia vapor and iron (III) chloride), is being observed by the normal beam or even UV lights on 254 nm and 366 nm. The total contents of flavonoid is analyzed using the regretion linear equation quercetin.

The result of the research indicates that the ethyl acetate fraction of ketapang fruit has 93.39 % μg/ml for ES50 the activity of hydroxyl radical scavenging. The total flavonoid consentrations of ethyl acetate fraction from ketapang fruit is 3.302 % b/b equivalent quercetin. Key words : ketapang fruit (Terminalia catappa L.), ethyl acetate fraction, total

flavonoid, antioxidant, deoxyribose method

\ xviii


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Oksigen merupakan atom yang sangat reaktif dan dapat berubah menjadi

suatu molekul perusak yang sering disebut ‘radikal bebas’. Radikal bebas dapat

menyerang sel-sel tubuh yang sehat dan menyebabkan sel-sel tersebut kehilangan

fungsi dan strukturnya. Radikal bebas yang sangat reaktif ini akan mencuri

(menangkap atau mengambil) elektron dari senyawa lain seperti protein, lipid dan

DNA untuk menetralkan diri. Radikal bebas yang masuk dalam tubuh akan

menyerang selaput lipid yang melindungi sel, kemudian merusak protein, enzim

dan inti sel dimana DNA dibentuk (Kumalaningsih, 2007). Kerusakan sel yang

disebabkan radikal bebas menjadi kontributor utama dalam penuaan dan penyakit

degeneratif seperti kanker, penyakit kardiovaskular, katarak, penurunan sistem

imun dan kerusakan otak (Percival, 1998).

Reactive Oxygen Species (ROS) merupakan bentuk yang terdiri dari

radikal yang sangat reaktif, molekulnya mengandung oksigen dan merupakan

radikal bebas yang umum dihasilkan dalam sistem biologi. ROS juga dapat

dihasilkan oleh sumber eksogen seperti komponen makanan dan radiasi

ultraviolet. Beberapa macam ROS: radikal superoksid (O2•-), anion peroksid

(HOO-), radikal hidroksil (•OH), radikal peroksil (ROO•), radikal peroksinitrit

(O=NOO•-), radikal oksida nitrit (NO•), oksigen singlet (O•), radikal hipoklorid

(ClO4-), peroksida nitrit (Percival, 1998). Diantara ROS yang telah disebutkan,

yang paling reaktif adalah radikal hidroksil (Halliwell and Gutteridge, 1999).

1


2

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat reaksi

berantai radikal bebas dalam tubuh manusia dan dapat memberikan elektronnya

kepada molekul radikal bebas tanpa terganggu fungsinya (Kumalaningsih, 2007).

Antioksidan merupakan first line dalam pertahanan terhadap kerusakan yang

disebabkan oleh radikal bebas karena berfungsi menstabilkan atau mendeaktivasi

radikal bebas sebelum menyerang sel (Percival, 1998).

Ketapang merupakan tanaman pelindung yang biasa ditanam di daerah

pantai sebagai peneduh, memperindah pantai dan produsen edible nuts (kacang-

kacangan), karena bijinya dapat dimakan. Banyak tumbuh didaerah tropis dan

subtropis. Mudah beradaptasi dengan tanah tempat tumbuh dan kadar garam,

cepat tumbuh dan perawatannya minimal sehingga mudah dibudidayakan

(Thomson, 2006). Ketapang merupakan tanaman yang memiliki kandungan

fenolik, yaitu tanin dan flavonoid. Buahnya digunakan untuk obat sakit kepala,

leprosy (lepra), rematik, mual saat perjalanan, laksantia (pencahar) (Anonim,

2006a). Daun tanaman ketapang memiliki kegunaan sebagai antikanker dan

antioksidan sebaik sifat anticlastogenic (pencegah pemutusan ikatan) (Anonim,

2006b). Dalam beberapa penelitian buah ketapang mempunyai efek sebagai anti

HIV, anti asmathik, anti katarak, antidiabetik, xanthin oxidase inhibitor, aldose

reductase inhibitor. Kombinasi dari daun dan batang tanaman ketapang memiliki

aktivitas antikanker-antioksidan (Nagappa, Thakurdesai, Venkat Rao, Singh,

2006). Kemungkinan dalam buah ketapang memiliki aktivitas yang sama atau

mirip dengan daun yang merupakan bagian tanaman ketapang yang lain.


3

Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus

hidroksi yang tidak tersubstitusi atau suatu gula. Oleh karena itu, umumnya

flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton,

etil asetat, dimetilsulfoksida, dimetilformamid, dan air (Markham, 1988).

Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya

gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Beberapa tahun belakangan ini

diteliti kemampuan flavonoid sebagai antioksidan untuk merubah atau mereduksi

radikal bebas dan juga sebagai antiradikal bebas (Giorgio, 2000).

Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid

dan dianjurkan untuk digunakan dalam proses pemurnian (Robinson, 1995).

Glikosida dan beberapa aglikon flavonoid larut dalam etil asetat (Mabry,

Markham, and Thomas, 1970). Aktivitas antioksidan daun ketapang dalam fraksi

etil asetat lebih tinggi dibandingkan pentana atau diklorometana (Chyau, Tsai, Ko,

and Mau, 2002). Dalam penelitian tentang antioksidan herba ketul (Bidens pilosa

L.), didapatkan fraksi etil asetat memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang

paling tinggi dibandingkan rutin, fraksi klorofom dan ekstrak metanoliknya

(Nusarini, 2007; Wiyatsih, 2007).

Metode pengujian yang dipilih adalah metode deoksiribosa. Metode ini

menggunakan deoksiribosa sebagai model biomolekul dari gula DNA yang

terdapat dalam tubuh sehingga secara tidak langsung memberikan gambaran

reaksi radikal hidroksil dalam tubuh. Selain itu, metode ini relatif sederhana dan

mudah. Adanya aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah

ketapang diketahui dengan persen scavenging yang diperoleh dari selisih


4

absorbansi larutan kontrol (tanpa sampel) dan larutan dengan sampel dibagi

absorbansi kontrol dikalikan 100%. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil

dapat dinyatakan dalam aktivitas penangkapan efektif 50% radikal hidroksil atau

effective scavenging 50% (ES50). Semakin kecil nilai ES50 maka sampel tersebut

mempunyai nilai keefektifan sebagai penangkap radikal hidroksil (sebagai

antioksidan) yang lebih baik

B. Permasalahan

1. Apakah fraksi etil asetat buah ketapang mempunyai aktivitas antioksidan

melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa?

2. Berapa besar kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang?

C. Manfaat Penelitian

1. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi bagi penelitian

lebih lanjut maupun masyarakat luas mengenai potensi buah ketapang

sebagai antioksidan alami.

2. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan pada

perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi, khususnya tentang

penggunaan metode deoksiribosa dalam menguji aktivitas antioksidan.


5

D. Keaslian Penelitian

Penelitian terhadap buah ketapang sejauh ini belum banyak dilakukan

terutama penelitian terhadap kadar flavonoid total serta uji aktivitas antioksidan

dengan metode deoksiribosa. Adapun penelitian yang telah dilakukan adalah

aktivitas antidiabetes buah ketapang (Nagappa, et.al, 2006)

E. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan :

1. Mengetahui aktivitas antioksidan fraksi etil asetat buah ketapang melalui uji

penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa.

2. Mengetahui kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Ketapang

1. Nama tanaman

Nama latin : Terminalia catappa L.

Sinonim : Phytolacca javanica Osbeck.

Terminalia mauritiana Blanco.

Terminalia moluccana Lamk.

Terminalia procera Roxb. (Thomson and Evans, 2006)

Nama daerah: Sumatera: beowa, kilaulu, geutapang, ketapang, hatapang,

katapang, lahapang, katafa, ketapas, ketapieng. Jawa: katapang, ketapang.

Nusatenggara: katapang, klihi. Sulawesi: tarisei, salrise, talisei, kanaunggang,

katapang, atapang, lisa. Maluku: wewa, wew, sadina, sarina, saliha, sertalo,

kayane, sirisa, sarisa, sarisalo, lisa, tasi, klis, klais, kris, ngusu, id. Irian: ruge

(Anonim, 1989).

Common Name: Tropical Almond, India Almond, Umbrella Tree, Badam

Amandier De Cayenne, Wild Almond, Hulu Kwang, Sea Almond, Bengal Almond,

Singapore Almond, Malabar Almond, Tropical Almond, Alite, ‘Autara’a, ‘Aua,

‘Auari’iroa, Kamani Haole, Kamani‘ula, False Kamani, Kauariki, Kaukauariki,

Taraire, Ma’i’i, Koa’i’i, Ta’ie, Natapoa, Talie, Talise, Tavola, Tivi, Telie.

(Anonim, 2006a; Gilman and Watson, 2006; Thomson and Evans, 2006).

6


7

2. Sistematika tanaman

Klasifikasi tanaman ketapang dalam sistematika tumbuhan.

Regnum : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Classis : Magnoliopsida

Ordo : Myrtales

Familia : Combretaceae

Genus : Terminalia

Species : Terminalia catappa L.

(http://www.naturia.per.sg/buloh/plants/sea_almond.htm)

3. Kandungan kimia

Daun mengandung beberapa flavonoid (seperti kaemferol dan kuersetin),

beberapa tanin (seperti punicalin, punicalagin, atau tercatin), saponin, dan

fitosterol (Anonim, 2006b).

Buah mengandung cyanidin-3-glucoside, corilagin, ellagic-acid, asam

galat, pentosa, brevifolin-carboxyclic-acid eugenic acid, flavonoid, tanin, dan β-

karoten (Nagappa et al., 2006).

4. Kegunaan dan khasiat

a. Daun

Daun mengandung senyawa untuk mencegah kanker dan antioksidan

sebaik sifat anticlastogenic (Anonim, 2006b). Sebagai obat rematik, anti-

inflamasi, mengatasi masalah mata, luka baru, mencegah pendarahan setelah

cabut gigi, daun yang sudah gugur dan berwarna merah digunakan untuk


http://www.naturia.per.sg/buloh/plants/sea_almond.htm

8

mengobati penyakit hati (hepatitis), daun muda sebagai pencahar, obat penyakit

kulit (dermatitis), scabies (Anonim, 2006a; Lin, Hsu, Lin, and Hsu, 2001).

b. Buah

Buahnya digunakan untuk obat sakit kepala, leprosy (lepra), mual saat

perjalanan, laksantia (pencahar), rematik dan dapat juga dikonsumsi langsung

(Anonim, 2006a). Dalam beberapa penelitian buah ketapang mempunyai efek

sebagai anti HIV, anti asmathik, anti katarak, antidiabetik, Xanthin oxidase

inhibitor, aldose reductase inhibitor, berpotensi untuk treatment DB (Nagappa

et al., 2006).

c. Batang

Batangnya digunakan untuk obat mulut dan tenggorokan, sakit perut dan

diare, demam, disentri (Anonim, 2006a).

d. Kombinasi

Daun dan batang telah dilaporkan mempunyai aktivitas sebagai

antikanker-antioksidan, anti-HIV reverse transcriptase, hepatoprotektif,

antiinflamasi, hepatitis dan aphrodisiac (Nagappa et al., 2006). Buah, batang

dan daun untuk mengobati disentri (Asia Tenggara), rematik (Indonesia, India).

Buah dan batang untuk mengobati batuk (Samoa) dan asma (Mexico).

(http://www.naturia.per.sg/buloh/plants/sea_almond.htm

B. Flavonoid

1. Kerangka dasar dan pengertian flavonoid

Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang strukturnya merupakan

turunan dari inti aromatik flavon atau 2-fenilbenzopiren. Golongan flavonoid



9

dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3-C6. Artinya, kerangka karbon

terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzen tersubstitusi) disambungkan dengan

rantai alifatik tiga karbon (Robinson, 1995).

CC C

Gambar 1. Kerangka dasar flavonoid (Robinson, 1995)

Aktivitas antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan

adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Ketika senyawa-

senyawa ini bereaksi dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang

distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Dengan demikian fase propagasi

yang meliputi reaksi radikal berantai dapat dihambat (Cuvelier, Richards, and

Besset, 1991).

2. Penyebaran flavonoid

Flavonoid merupakan kandungan khas tumbuhan hijau, kecuali untuk

golongan algae. Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan

termasuk daun, akar, kulit, kayu, tepung sari, bunga, buah dan biji. Hanya sedikit

saja catatan yang melaporkan adanya flavonoid pada hewan (Harborne, 1987).

Penyebaran flavonoid pada golongan tumbuhan yang tersebar yaitu

Angiospermae (Markham, 1988). Penyebaran flavonoid sebagai salah satu

senyawa aktif tumbuhan sering diakibatkan oleh lingkungan tempat tumbuh yang

berbeda, karena pertumbuhan suatu tumbuhan sering diakibatkan oleh lingkungan


10

tempat tumbuh yang berbeda, karena pertumbuhan suatu tanaman dipengaruhi

oleh tinggi tempat, keadaan tanah dan cuaca. Senyawa ini dalam jaringan

tumbuhan lazimnya ditemukan sebagai campuran dari berbagai turunannya dan

jarang ditemukan sebagai senyawa tunggal (Harborne, 1987).

Flavonoid dalam tumbuhan terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon

flavonoid, mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk

kombinasi glikosida. Karena alasan itu maka dalam menganalisis flavonoid

biasanya lebih baik ekstrak tumbuhan dihidrolisis terlebih dahulu untuk

mendapatkan bentuk flavonoid sebagai aglikon sebelum memperhatikan

kerumitan glikosida yang mungkin terdapat dalam ekstrak asal (Harborne, 1987).

3. Penggolongan dan sifat flavonoid

Penggolongan flavonoid berdasarkan pada substituen cincin heterosiklik

yang mengandung oksigen dan perbedaan distribusi gugus hidroksil pada atom

C3. Perbedaan di bagian atom C3 menentukan sifat, khasiat dan golongan

flavonoid, yaitu flavon, flavanon, flavonol, flavanolnol, isoflavon, auron, dan

khalkon (Markham, 1988).

Flavonoid merupakan fitokimia tumbuhan yang tidak dapat disintesis oleh

manusia. Senyawa ini mempunyai efek positif terhadap kesehatan manusia.

Flavonoid sering merupakan senyawa pereduksi yang baik, karena menghambat

banyak reaksi oksidasi, baik secara enzimatis maupun non enzimatis. Flavonoid

bertindak sebagai penampung yang baik radikal hidroksil dan superoksida, dan

dengan demikian melindungi lipid membran terhadap reaksi yang merusak

(Robinson, 1995).


11

OH

O

Khalkon

O

OFlavanon

O

O

OH

Dihidroflavonol

O

O

OH

O

O

OH

O

Flavone flavon-3-ol

OH

Anthocyanidin

O

O

Isoflavon

O

Neoflavon

O

OH

flavan-3-ol

O8

7

6

5 4

3

6'

5'

4'

3'2'

A C

B

Flavonoid

Gambar 2. Kerangka tipe-tipe flavonoid

(Bors, Michel, and Stettmainer, 2005) 4. Penyarian flavonoid

Penyarian flavonoid dari dalam simplisia tumbuhan dapat dilakukan

dengan menggunakan pelarut polar, semi polar, maupun non polar sesuai dengan


12

kelarutan flavonoid yang diekstraksi. Kelarutan flavonoid berbeda-beda sesuai

golongan dan substitusinya (Robinson, 1995). Pelarut yang kurang polar

digunakan untuk mengekstraksi aglikon flavonoid, sedangkan pelarut yang lebih

polar digunakan untuk glikosida flavonoid atau antosianin. Flavonoid merupakan

senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi yang tidak

tersubstitusi atau suatu gula. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut

dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, etil asetat,

dimetilsulfoksida, dimetilformamid, dan air (Markham, 1988).

Penyarian flavonoid dari tumbuhan didasarkan polaritas kandungan yang

akan disari dan asal bahan (dari mana substansi tersebut berasal). Flavonoid yang

berasal dari vakuola sel umumnya bersifat hidrofilik sehingga penyarian dapat

dilakukan dengan air atau pelarut-pelarut alkoholik. Jika flavonoid terdapat pada

kloroplas, pelarut yang dipergunakan untuk penyarian adalah pelarut-pelarut non

polar sebelum dilakukan penyarian dengan alkohol. Bahan segar dapat diekstraksi

dengan alkohol 96%. Bahan kering dan berkayu dapat menggunakan campuran

alkohol dengan air, hal ini disesuaikan glikosida flavonoidnya (Harborne, 1987).

5. Deteksi dan identifikasi flavonoid

Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenolik, oleh karena itu dapat

memberikan reaksi dengan pereaksi untuk fenol antara lain membentuk warna

khas dengan besi (III) klorida (FeCl3), aluminium klorida (AlCl3), larutan asam

sulfanilat terdiasotasi, sitroborat, vanilin HCl dan senyawa asam sulfat pekat

(Harborne, 1987). Flavonoid dapat dideteksi dengan ammonia, jika tidak

bercampur dengan pigmen lain. Timbulnya warna ini disebabkan oleh


13

pembentukan garam dan struktur kuinoid pada cincin B. Reaksi ini memberi

warna spesifik untuk masing-masing golongan. Flavon dan flavonol akan

memberikan warna kuning, antosian berwarna lembayung biru. Flavanon tidak

berwarna namun akan menjadi merah bila dipanaskan. Flavanolol akan berwarna

coklat hingga jingga, dan adanya khalkon atau auron akan menimbulkan warna

merah mendadak dalam suasana asam (Robinson, 1995).

Tabel I. Warna bercak beberapa flavonoid setelah disemprot dengan pereaksi besi (III) klorida (Mabry, Markham, and Thomas, 1970)

Tipe Flavonoid Warna Bercak Naringenin Hesperitin

Merah-violet

Eriodictiol Dihidrokuersetin

Biru-violet

Dihidrofisetin Dihidrorobinetin

Abu-abu dan biru tua

Deodarin (Dihidroflavonol) Ungu intensif Dihidrokhalkon Merah Flavanon Hijau-coklat

Flavonoid akan membentuk kompleks jika direaksikan dengan pereaksi

sitroborat atau dengan pereaksi aluminium klorida. Kompleks yang terbentuk

berwarna kuning (Mabry, et.al., 1970).

O

O

OH O

OH

O

O

O

- H2OO

O

Gambar 3. Pembentukan struktur kuinoid flavonoid karena uap ammonia (Robinson, 1995)


14

O

O

HO

OH

OHO

O

HOO

O

Al Cl

AlCl3

HCl encer

O

OOH

HO

OH

OHO

OO

HOO

O

Al

AlCl Cl

Cl

O

OO

HO

OH

OH

AlCl Cl

AlCl3

HCl encer

5 - OH - Flavon

Berwarna kuning

O

O

HO

OH

OHO

O

HOO

O

Al Cl

O

O

HO

OH

OH

AlCl3

HCl encer

Berwarna kuning

OH O

O

Al

Al

Cl

Cl

Flavonolol

Gambar 4. Reaksi pembentukan kompleks flavonoid (flavon, 5-OH flavon, flavonol) dengan pereaksi AlCl3

(Mabry et al, 1970)


15

Tabel II. Penafsiran warna Bercak dari segi struktur flavonoid (Markham, 1988)

Warna Bercak Dengan Sinar UV Jenis Flavonoid yang mungkin Sinar UV tanpa

NH3

Sinar UV dengan NH3

Lembayung Gelap

Kuning, hijau-kuning atau hijau

a. Biasanya 5-OH flavon atau dihidroflavon (tersulih pada 3-H dan mempunyai 4’-OH)

b. Kadang-kadang 5-OH flavonon dan 4’-OH khalkon tanpa OH pada cincin B

Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan warna

a. Biasanya flavon atau flavonol tersulih pada 3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas

b.beberapa 6- tatau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH

c. Isoflavon, dihidroflavonol, biflavonil dan beberapa flavanon yang mengandung 5-OH

d. Khalkon yang mengandung 2’- dan atau 6’-OH tetapi tidak mengandung 2- atau 4-OH bebas

Biru muda Beberapa 5-OH flavanon

Merah atau jingga Khalkon yang mengandung 2- dan atau 4-OH bebas

Fluorosensi biru muda

Fluorosensi hijau-kuning atau kuning-biru

a. Flavon dan flavanon yang tak mengandung 5-OH, misal 5-OH glikosid

b. Flavonol tanpa 5-OH bebnas tetapi tersulih pada 3-OH


Isoflavon yang mengandung 5-OH bebas

Fluorosensi biru muda Isoflavon yang mengandung 5-OH bebas Tak Nampak Fluorosensi biru muda Isoflavon tanpa 5-OH bebas

Kuning redup dan kuning, atau fluorosensi jinga


Flavonol yang mengandung 3-OH bebas dan mempunyai atau tak mempunyai 5-OH bebas (kadang-kadang berasal dari dihidroflavon)

Fluorosensi kuning Merah atau jingga Auron yang mengandung 4’-OH bebas dan beberapa 2- atau 4-OH khalkon

Hijau-Kuning, Hijau-biru, atau hijau


a. Auron yang tak mengandung 4’-OH bebas dan flavanon tanpa 5-OH bebas

b. Flavonol yang mengandung 2-OH bebas dan disertai atau tanpa 5-OH bebas

Merah jingga redup atau merah senduduk Biru Antosianidin 3,5-diglikosid

Merah jambu atau fluorosensi kuning Biru Sebagian besar antosianidin 3,5-diglikosid


16

6. Kegunaan flavonoid

Flavonoid dalam tanaman bertindak sebagai tabir surya alami, melindungi

terhadap kerusakan sinar ultraviolet, karena berada pada permukaan atau sel

epidermis daun hijau (Bors et al., 2007). Cuvelier et al. (2005) menyatakan bahwa

ketika flavonoid bereaksi dengan radikal bebas, akan terbentuk radikal baru yang

distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik. Dengan demikian fase propagasi

yang meliputi reaksi berantai radikal dihambat. Aktivitas antioksidan yang

dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya gugus hidroksi fenolik

dalam struktur molekulnya. Selanjutnya, Hudson (dalam Achmad, 1990)

menyatakan bahwa aktivitas tersebut ditentukan oleh gugus –OH ganda (gugus

fenolik), terutama dengan gugus C=O pada posisi C-3 dengan gugus –OH pada

posisi C-2 atau pada posisi C-5. Sistem gugus fungsi demikian memungkinkan

terbentuknya kompleks dengan logam.

Flavonoid merupakan senyawa penangkap radikal superoksida yang kuat

dan dapat bereaksi dengan radikal peroksi menyebabkan terminasi reaksi berantai

pada autooksidasi lemak tak jenuh ganda. Selain itu dapat berfungsi sebagai

penangkap radikal –OH yang merupakan radikal bebas yang reaktif (Buhler and

Miranda, 2007).

C. Antioksidan

1. Radikal bebas

Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak

stabil (mempunyai satu elektron atau lebih yang tidak berpasangan), sehingga

untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak


17

jaringan. Radikal bebas yang terbentuk cenderung untuk mengadakan reaksi

berantai yang bila terjadi dalam tubuh dapat menimbulkan kerusakan-kerusakan

yang serius. Senyawa radikal tersebut timbul akibat berbagai proses kimia

kompleks dalam tubuh, berupa hasil sampingan dari proses oksidasi atau

pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernafas; metabolisme sel, 90%

ROS digunakan sel untuk transpor elektron oleh mitokondria; peradangan, terjadi

fagositosis oleh sel darah putih, karena mekanisme terbunuhnya virus dan bakteri

serta denaturasi protein asing (antigen); metabolisme xenobiotik (zat asing yang

berasal dari luar tubuh, seperti obat, toksikan); atau ketika tubuh terpapar polusi

lingkungan (Percival, 1998).

Tabel III. Beberapa macam ROS dan antioksidan yang menetralkan (Percival, 1998)

ROS Neutrazilizing Antioxidants

Radikal Hidroksil Vitamin C, gluthatione, flavonoid, liopic acid

Radikal Superoksid Vitamin C, gluthatione, flavonoid, SOD

Peroksida Hidrogen Vitamin C, gluthatione, flavonoid, beta

karoten, vitamin E, lipoic acid

Peroksida Lipid Vitamin E, beta karoten, ubiquinone,

flavonoid, gluthatione peroxidase

Radikal bebas dan oksidan mempunyai sifat yang mirip. Aktivitas kedua

senyawa ini sering menimbulkan akibat yang sama meskipun melalui proses yang

berbeda. Oksidan merupakan senyawa penerima elektron (elektron acceptor),

yaitu senyawa-senyawa yang dapat menarik elektron (Syahbana dan Bahalwan,

2002).


18

2. Definisi dan aktivitas antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat oksidasi yang

diperantarai oleh oksigen. Oksidasi memegang peranan penting dalam pertahanan

tubuh terhadap penyakit. Hal tersebut disebabkan senyawa antioksidan dapat

mencegah pengaruh buruk yang disebabkan oleh senyawa-senyawa radikal bebas.

(Percival, 1998).

Menurut Halliwel dan Auroma (1993) antioksidan memiliki aktivitas

dengan cara sebagai berikut.

(a). Menurunkan konsentrasi oksigen,

(b). mencegah inisisasi rantai pertama dengan menangkap radikal penyerang

yang pertama kali dalam reaksi seperti radikal hidroksil,

(c). mengikat ion logam dalam bentuk yang tidak akan menurunkan spesies

penginisiasi seperti radikal hidroksil dan tidak medekomposisi peroksida

lipid menjadi radikal peroksi atau alkoksi,

(d). mendekomposisi peroksida dengan mengubah menjadi produk non radikal

seperti alkohol, dan

(e). memecah rantai pada radikal intermediet seperti radikal peroksi dan

alkoksi yang ditangkap untuk mencegah abstraksi hidrogen selanjutnya.

3. Penggolongan antioksidan

Manusia mempunyai sistem antioksidan yang mampu melindungi tubuh

dari radikal bebas. Sistem antioksidan ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu

kelompok enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari

superoxide dismutase (SOD), katalase dan glutathione peroxidase. Antioksidan


19

non-enzimatik terdiri dari vitamin E, A, provitamin A (beta karoten), dan vitamin

C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan

antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005). Antioksidan

sintetik seperti BHA (butyl hydroxy anisol), PG (propil galat), TBHQ (tert-butyl

hydroquinone) dapat meningkatkan karsinogenisitas. Sebagai contoh BHA,

merupakan inhibitor lipid peroksidasi yang poten, tetapi ketika dikonsumsi

berlebihan menyebabkan kanker, karena terjadi kerusakan oksidatif pada DNA

sehingga memicu terjadinya mutasi. Hal ini menyebabkan penelitian eksplorasi

antioksidan yang berasal dari bahan alami seperti buah, sayuran dan tanaman

mengalami peningkatan (Amarowicz, Naczk, dan Fereiodon, 2000).

Sistem pertahanan internal tubuh terhadap radikal bebas adalah

antioksidan. Dari asal terbentuknya antioksidan dapat dibedakan menjadi dua

yaitu intraseluler dan ekstrasesuler. Dari sini antioksidan dapat dikelompokkan

menjadi tiga golongan sebagai berikut.

a. Antioksidan primer, yaitu antioksidan yang dapat menghalangi

pembentukan radikal bebas baru dan mengubah radikal bebas yang ada menjadi

molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum radikal bebas ini sempat

bereaksi. Contoh golongan ini adalah enzim SOD (Superoksid Dismutase),

Glutation Peroksidase, protein pengikat metal seperti ferritin dan ceruroplasmin.

b. Antioksidan sekunder atau penangkap radikal (radical scavenger)

adalah antioksidan yang menekan terjadinya reaksi rantai baik pada awal

pembentukan rantai maupun pada fase propagasi. Kelompok ini termasuk


20

antioksidan ekstraseluler yang kebanyakan berasal dari makanan seperti vitamin

E, vitamin C, β-karoten, asam urat, bilirubin, dan albumin.

c. Antioksidan tersier adalah antioksidan yang memperbaiki kerusakan-

kerusakan sel dan jaringan karena radikal bebas. Contoh: enzim yang

memperbaiki DNA pada inti sel yaitu metionin sulfoksidan reduktase yang

berguna untuk mencegah penyakit kanker (Niki et al. cit Ariyanto, 2006)

Menurut Percival (1998), proteksi antioksidan dapat berasal dari dalam

maupun luar tubuh dimana secara sinergis dan interaktif menetralkan radikal

bebas. Yang termasuk didalamnya antara lain:

a. nutrient-derived antioxidant biasa disebut dietary antioxidant, misalnya asam

askorbat (vitamin C), tokoferol (vitamin E) dan tokotrienol, karotenoid, dan

komponen lain yang membunyai bobot molekul rendah seperti glutation dan

lipoic acid (thiol dan biothiol). Vitamin C berfungsi dalam menetralkan ROS

dalam fase air sebelum reaksi peroksidasi awal. Vitamin E berfungsi dalam

memutus reaksi berantai karena melindungi membran asam lemak dari

peroksidasi lipid. β-karoten dan karotenoid lain berfungsi untuk memberikan

proteksi antioksidan pada jaringan yang kaya lipid;

b. antioxidant enzymes, seperti superoksid dismutase, gluthation peroksidase,

gluthation reductase, lipoic acid (thiol dan biothiol) yang mengkatalis reaksi

pemadaman (quenching) radikal bebas. Merupakan pertahanan endogen yang

membantu melindungi kerusakan sel dari radikal bebas. Aktivitas katalitiknya

akan meningkat jika ada mikronutrient seperti selenium, besi, tembaga, zinc

dan mangaan yang berfungsi sebagai kofaktor;


21

c. metal binding protein, seperti ferritin, laktoferin, albumin, ceruroplasmin yang

mengikat besi, tembaga dan logam pro-oksidan, yang berfungsi mengkatalisis

reaksi oksidasi;

d. beberapa phytonutrient antioksidan dalam berbagai makanan seperti senyawa

fenolik, flavonoid.

Gambar 6. Stuktur kimia beberapa antioksidan sintetik (Pokorni et al., 2001)

Gambar 5. Senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan

CH2

CH3

CH

C (CH2)3HC (CH2)3

HC (CH2)3

O

O

CH3CH3 CH3

HC CH3

CH3

Vitamin K

O

O

CH3

(CH2OCH3

OCH3

CH

C CH2)nH

CH3

Ubikuinon

CH3

CH3

O

CH3 O R

CH3

OH

R = CH2(CH2CH2CHCH2)2CH2CH(CH3)2

tokoferil-quinon

(Pokorni, Yanishilieva, and Gordon, 2001)

OHOH

OCH3

OH

OH

COOC3H2

OH

HO OH

4-metoksi-2-tert-butil fenol(2-BHA)

2,6-di-tert-butil-p-hidroksitoluen(BHT)

tert-butilhidrokuinon (TBHQ) propil galat (PG)


22

4. Metode pengujian daya antioksidan

Terdapat beberapa metode pengujian aktivitas antioksidan baik secara

kualitatif maupun secara kuantitatif. Uji kualitatif untuk mengetahui apakah suatu

senyawa memiliki aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode

kromatografi baik kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas. Metode ini

dapat untuk memisahkan campuran antioksidan yang kompleks sekalipun.

Pereaksi semprot yang digunakan untuk deteksi dapat dibedakan menjadi empat

kelompok, yaitu :

(a). senyawa-senyawa yang dapat membentuk warna ketika tereduksi (kalium

permanganat, ferri-sianida, ferri-dipiridil, dan asam fosfomolibdat);

(b). senyawa yang dapat berikatan dengan senyawa fenol, seperti senyawa

diazo, pereaksi diazo, magnesium sulfat, aldehid aromatik-anisaldehid,

vanillin dan pereaksi Gibbs yang membentuk indofenol (akan membentuk

garam berwarna dalam kondisi basa);

(c). radikal bebas stabil yang menerima radikal hidrogen dari antioksidan (1,1-

difenil-2-pikrilhidrazil);

(d). senyawa-senyawa yang membentuk senyawa adisi yang berwarna

(palladium klorida dan pentadium klorida) (Davidek, 1997).

Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara spektrofotometri.

Beberapa uji kuantitatif untuk mengetahui aktivitas suatu antioksidan antara lain:

(1). pengujian panangkapan radikal (radical scavenging test),

dilakukan dengan cara mengukur penangkapan radikal sintetik dalam

pelarut organik polar seperti metanol atau etanol pada suhu kamar. Radikal


23

sintetik yang sering digunakan adalah DPPH (2,2’- difenil-1-pikril

hidrazil) dan ABTS (2,2’-azinobis (3-etil benzotiazolin-asam sulfonat)).

Dasarnya adalah kemampuan suatu senyawa untuk menangkap radikal

DPPH. DPPH memberikan warna violet pada panjang gelombang 517 nm.

Penangkapan radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan

yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan

jumlah elektron yang diambil. Reaksi yang terjadi

DPPH• + AH DPPH-H + A•

DPPH• + R DPPH-R

(1). pengujian amtivitas antioksidan dengan system linoleat tiosianat,

dasar : pengukuran intensitas warna kompleks feritiosianat yang terbentuk

dari reaksi ion feri dengan amonium tiosianat. Ion feri terbentuk dari

oksidasi ion fero oleh peroksida ysng berasal dari oksidasi asam linoleat.

Kompleks feritiosianat yang berwarna merah diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 490 nm. Semakin tinggi absorbansinya (warna merah

yang terbentuk semakin pekat) menunjukkan semakin banyak peroksida

yang teerbentuk. Dengan adanya senyawa yang berperan sebagai

antioksidan intensitas warna ynag terbentuk semakin rendah.

(2). pengujian dengan asam thiobarbiturat,

dasar uji ini adalah reaksi malondialdehid dengan asam thiobarbiturat

menghasilkan kromogen merah muda yang dapat diukur absorbansinya

pada panjang gelombang 532 nm. Malondialdehid terbentuk dari asam

lemak bebas tidak jenuh dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan


24

rangkap. Adanya senyawa yang bersifat antioksidan akan menghambat

terbentuknya malondialdehid dari asam lemak bebas tidak jenuh.

(3). pengujian dengan sistem β-karoten-linoleat

pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan pemucatan warna β-

karoten. Karotenoid dapat meredam oksigen yang reaktif menghasilkan

oksigen yang lebih stabil. Energi dari oksigen tersebut dipindahkan ke

senyawa karotenoid. Energi tersebut dilepaskan melalui interaksi

rotasional dan vibrasional antara karotenoid dengan pelarut untuk

mengembalikan karotenoid ke ground state. Reaksi yang terjadi:

O2 reaktif + karotenoid O2 stabil + karotenoid*

karotenoid* karotenoid + energi termal

D. Deoksiribosa

Deoksiribosa (2-deoksi-D-ribosa) merupakan gula yang mempunyai lima

atom karbon yang merupakan turunan dari suatu gula pentosa, yaitu ribose. Gula

ini merupakan bagian dari DNA.

Gambar 7. Struktur deoksiribosa

HO

O

HH

HOH

H

OH

H

Beberapa produk degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada pH rendah

terdekomposisi menjadi malondialdehid (MDA), yang dapat terdeteksi dengan

penambahan asam thiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen MDA-TBA


25

yang berwarna merah muda. Pembentukan MDA dari deoksiribosa menjadi dasar

uji penangkapan radikal hidroksil (Halliwel dan Gutteridge, 1999).

Proses degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil terjadi melalui

beberapa tahap. Tahap-tahap ini terjadi pada saat campuran reaksi yang terdiri

dari pereaksi Fenton (FeCl3, EDTA, H2O2, vitamin C) dan deoksiribosa

diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Tahap-tahap reaksi tersebut adalah

reaksi pembentukan radikal hidroksil dari reaksi fenton dan degradasi

deoksiribosa oleh radikal hidroksil (Halliwel dan Gutteridge, 1999).

Tahap I. Reaksi pembentukan radikal hidroksil. Radikal hidroksil

dihasilkan melalui reaksi Fenton. Dalam reaksi Fenton, vitamin C berfungsi

sebagai reduktor yang mempercepat proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+. Fe2+ akan

bereaksi dengan H2O2 dan menghasilkan radikal hidroksil. Penambahan suatu

ligan (EDTA) pada besi dapat meningkatkan konstante kecepatan reaksi antara

Fe2+ dengan H2O2.

Tahap II. Degradasi Deoksiribosa. Radikal hidroksil akan menyerang

deoksiribosa dan mendegradasinya menjadi fragmen-fragmen. Semua posisi pada

struktur gula deoksiribosa memungkinkan untuk diserang oleh radikal hidroksil

membentuk radilkal deoksiribosa melalui reaksi abstraksi hidrogen yang dengan

adanya O2 akan diubah secara cepat menjadi radikal gula peroksil. Selanjutnya

terjadi serangkaian reaksi yaitu disproporsionasi, penataan ulang, eliminasi air,

dan pemecahan ikatan C-C menghasilkan produk karbonil yang bervariasi.

Konstante kecepatan reaksi orde dua dari reaksi antara radikal hidroksil dengan

gula deoksiribosa pada pH 7,4 adalah 3,1 x 109 M-1s-1. Beberapa produk


26

degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada pH rendah akan terdekomposisi

menjadi MDA (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Adanya MDA dapat dideteksi

dengan mereaksikan campuran tersebut dengan TBA dalam suasana asam.

Molekul MDA dengan TBA membentuk kromogen berwarna merah muda yamg

absorbansinya dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Reaksi kopling ini

terjadi antara dua molekul MDA dan satu molekul TBA (Halliwell, Gutteridge,

and Auroma, 1987).

E. Metode Penyarian

Penyarian merupakan peristiwa pemindahan massa zat aktif yang semula

berada dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga terjadi larutan zat aktif

dalam cairan penyari tersebut. Pada umumnya penyarian akan bertambah baik bila

permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari makin luas.

Dengan demikian, makin halus serbuk simplisia, seharusnya makin baik

penyariannya. Menurut Anonim (1995) serbuk harus dapat melewati ayakan 20.

Tetapi dalam pelaksanaannya tidak selalu demikian karena penyarian masih

tergantung juga pada sifat fisik dan kimia simplisia yang bersangkutan. Cara

penyarian dapat dibedakan menjadi: infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian

berkesinambungan (Anonim, 1986).

1. Infundasi

Merupakan proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat

kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Sari yang

dihasilkan tidak stabil dan mudah tercemari oleh kapang dan kuman. Oleh karena

itu, sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam.


27

Infundasi dibuat dengan cara menyari simplisia dengan air pada suhu 90oC selama

15 menit (Anonim, 1986).

2. Maserasi

Cara maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi

dilakukan dengnan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari

sehingga cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga

sel yang mengandung zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel

mengakibatkan pendesakan larutan terpekat dari dalam sel ke luar sel. Peristiwa

tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar

sel dan di dalam sel. Dapat dilakukan modifikasi terhadap teknik maserasi,

misalnya teknik remaserasi. Pada teknik ini, cairan dibagi menjadi dua kemudian

seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah

dienaptuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua

(Anonim, 1986).

3. Perkolasi

Merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan

penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Cairan penyari akan

mengalir dari atas ke bawah melalui serbuk kemudian cairan akan melarutkan zat

aktif di dalam sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Serbuk simplisia

yang akan diperkolasi dibasahi terlebih dahulu dengan cairan penyari kemudian

dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat perkolasi (perkolator) sambil tiap

kali ditekan. Serbuk kemudian ditutup dengan kertas saring dan cairan penyari

dialirkan hingga di atas permukaan serbuk masih terdapat lapisan cairan penyari.


28

Setelah 24 jam, keran dibuka dan diatur hingga kecepatan tetesannya adalah 1 ml

permenit. Akhir proses perkolasi ditentukan dengan pemeriksaan zat secara

kualitatif pada perkolat terakhir (Anonim, 1986).

4. Penyarian berkesinambungan

Proses ini merupakan gabungan antara proses untuk menghasilkan ekstrak

cair dan proses penguapan. Alat yang digunakan misalnya soxhlet. Pada penyarian

ini, cairan penyari dipanaskan hingga mendidih, kemudian uap penyari akan naik

ke atas kemudian akan menggembun karena didinginkan oleh pendingin balik.

Embun akan turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktif serbuk

simplisia (Anonim, 1986).

Cairan pelarut yang baik adalah pelarut yang dapat melarutkan zat aktif

dari ekstrak dengan demikian ekstrak bebas dari senyawa lain yang tidak

diinginkan. Faktor pertimbangan dalam pemilihan penyari adalah selektivitas,

kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah

lingkungan dan aman (Anonim, 2000). Menurut Anonim (1986) kriteria cairan

penyari yang baik adalah murah dan mudah didapat, stabil secara fisika dan kimia,

netral, tidak mudah menguap atau terbakar, selektif, tidak mempengaruhi zat

berkhasiat, dan diperbolehkan oleh peraturan.

Pelarut yang diperbolekan sesuai peraturan yang berlaku adalah air, etanol

dan campuran etanol air, metanol (dan yang segolongan), kloroform, eter, heksan,

aseton (Anonim, 2000). Etanol dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap,

glikosida kurkumin, antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak,


29

malam, tanin, dan saponin hanya sedikit larut dalam etanol. Campuran etanol dan

air dapat digunakan untuk meningkatkan penyarian (Anonim, 1986).

Separasi dan pemurnian bertujuan untuk menghilangkan senyawa yang

tidak dikehendaki seoptimal mungkin tanpa mempengaruhi kandungan senyawa

yang diinginkan, sehingga diperoleh ekstrak yang murni. Proses dari tahap ini

adalah pengendapan, pemisahan dua cairan yang tidak saling campur (ekstraksi),

sentrifugasi, dekantasi dan filtrasi (Anonim, 2000).

Ekstraksi adalah suatu metode pemisahan komponen dari suatu campuran

dengan menggunakan suatu pelarut. Dalam praktek digunakan untuk memisahkan

senyawa organik dari larutan air atau suspensi. Metode ini paling sering

digunakan untuk proses pemisahan. Alat yang digunakan tidak khusus dan rumit.

Jika tidak dinyatakan lain alat yang digunakan untuk pemisahan adalah corong

pisah (Khopkar, 1990).

F. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi merupakan suatu metode yang sering digunakan untuk

memisahkan dan mendeteksi suatu campuran senyawa berdasarkan proses fisika-

kimia. Salah satu sistem kromatografi yang digunakan adalah kromatografi lapis

tipis yang merupakan pemisahan pada lapisan tipis dengan suatu penyangga.

Lapisan yang memisahkan terdiri atas partikel-partikel- sebagai fase diam yang

ditempatkan pada penyangga yang berupa lempeng gelas, logam, pelat polimer

atau lapisan lain yang cocok. Lapisan melekat pada permukaan dengan bantuan


30

bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum. Lapisan ini berfungsi

sebagai permukaan padat yang menyerap (Grittter, Bobbit, and Schwarting, 1991).

Kromatografi lapis tipis adalah metode kromatografi cair yang paling

sederhana dan mempunyai beberapa kelebihan. Kelebihan KLT adalah sampel

yang digunakan sedikit, diperoleh pemisahan senyawa yang amat berbeda (seperti

senyawa organik alam, senyawa organik sintetik, komplek anorganik-organik dan

bahkan ion anorganik), waktu yang dibutuhkan singkat, serta jumlah pelarut yang

digunakan sangat sedikit. KLT dapat digunakan untuk dua tujuan. Pertama, untuk

hasil kuantitatif, kualitatif dan preparatif. Kedua, digunakan untuk menjajaki

sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi

kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Grittter et al., 1991).

Dalam KLT, pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan adsorpsi atau

partisi solut antara fase diam dengan fase gerak yang terjadi secara kompetitif.

Kemampuan fase diam mengadsorpsi sangat bergantung pada topografi gugus

aktif yang terdapat pada masing-masing komponen. Senyawa yang terikat kuat

pada fase diam akan dielusi paling lama dan mempunyai nilai Rf (Retention

factor) yang kecil, sedangkan senyawa yang tidak terikat kuat pada fase diam

akan terelusi lebih dahulu dan mempunyai nilai Rf yang besar. Bercak yang

mempunyai nilai Rf sama kemungkinan merupakan senyawa yang sama. Bilangan

Rf didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dibagi dengan jarak

yang ditempuh oleh garis depan fase pengembang (Markham, 1988).

Hasil elusi sampel oleh fase gerak menghasilkan bercak yang dapat

diamati dan digunakan untuk analisis senyawa. Akan tetapi, terkadang bercak


31

yang dihasilkan pada lempeng fase diam masih sulit untuk dideteksi. Masalah

tersebut dapat diatasi dengan menambahkan pereaksi yang mampu memperjelas

bercak, sehingga memudahkan dalam pendeteksian. Senyawa-senyawa yang

sering digunakan untuk pereaksi pendeteksi dalam KLT antara lain amonia,

AlCl3, FeCl3, sitroborat, dan berbagai pereaksi lain yang cukup banyak

macamnya (Mabry et al., 1970).

KLT Densitometri

Merupakan metode penetapan kadar suatu senyawa dengan mengukur

kerapatan bercak senyawa yang bersangkutan, yang terlebih dahulu dipisahkan

dengan cara KLT.

Untuk menetapkan kadar suatu senyawa dengan KLT densitometri, ada

dua cara. Pertama, penotolan dilakukan bersamaan antara senyawa baku dan

senyawa yang bersangkutan, kemudian dielusi. Kadar senyawa bersangkutan

ditentukan dengan membandingkan harga AUC (Area Under Curve) senyawa

dengan baku. Cara kedua yaitu dengan membuat kurva baku hubungan antara

jumlah zat baku dengan AUC (Wardani, 2003). Kurva baku diperoleh dengan

membuat totolan zat baku pada lempeng KLT dengan bermacam-macam

konsentrasi. Bercak yang diperoleh dicari nilai AUCnya, dari kurva baku

diperoleh persamaan Y= bX + a. Dimana Y adalah AUC dan X adalah banyaknya

zat yang ditotolkan (Supardjan, 1987).

Alat TLC scanner memiliki sumber sinar yang dapat digerakkan di atas

bercak-bercak pada lempeng KLT atau lempeng KLT dapat digerakkan menyusuri

berkas sinar yang berasal dari sumber sinar. Teknik pengukurannya dapat


32

didasarkan atas sinar yang diserap (absorbansi), sinar yang dipantulkan

(reflaktansi), atau sinar yang difluoresensikan. Sinar yang datang sebagian besar

diserap atau dipantulkan. Banyaknya sinar yang diserap sebanding dengan jumlah

zat pada bercak yang terkena sinar (Wardani, 2003).

G. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri visibel adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang

mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik

pada panjang gelombang 380-780 nm. Spektrofotometri UV-Vis lebih banyak

digunakan untuk analisis kuantitatif daripada kualitatif karena melibatkan energi

elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis (Mulja dan Suharman,

1995).

Bila cahaya jatuh pada suatu senyawa, maka sebagian dari cahaya tersebut

akan diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul. Setiap

senyawa memiliki tingkat energi yang spesifik. Bila cahaya yang mengenai

senyawa memiliki energi yang sama dengan perbedaan energi antara keadaan

tingkat dasar dan energi keadaan tereksitasi, maka elektron-elektron pada keadaan

dasar akan dieksitasi ke tingkat energi eksitasi dan sebagian energi cahaya yang

sesuai dengan panjang gelombang ini diserap. Frekuensi yang diserap setiap

senyawa sangat spesifik karena perbedaan energi antara tingkat dasar dan tingkat

eksitasi setiap senyawa juga spesifik (Sastrohamidjojo, 2001).

Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi

elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) akan menghasilkan transisi

elektromagnetik dan spectra absorbansi elektromagnetik. Jumlah radiasi


33

elektromagnetik yang diserap akan sebanding dengan jumlah molekul

penyerapnya, sehingga spectra absorbansi dapat digunakan untuk analisis

kuantitatif. Panjang gelombang cahaya UV-Vis lebih pendek daripada panjang

gelombang radiasi inframerah. Spectrum visibel atau tampak mempunyai

absorbansi antara 400-800 nm, sedangkan spectrum UV mempunyai absorbansi

antara 100-400 nm. Kuantitas energi yang diserap oleh suatu senyawa berbanding

terbalik dengan panjang gelombang radiasi (Fessenden dan Fessenden, 1995).

Bila suatu molekul senyawa organik menyerap sinar UV atau tampak,

maka di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan (transisi elektron) dari

berbagai jenis tingkat energi orbital dari molekul tersebut (Sastrohamidjojo,

2001). Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi

antara gelombang cahaya (foton) dan atom/molekul. Proses absorbsi cahaya UV-

Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan tingkat

energi elektronik tertentu ke orbital lain dengan tingkat energi elektronik yang

lebih tinggi.

Secara umum, ada tiga macam distribusi elektron dalam suatu senyawa

organik yaitu orbital pi (π), sigma (σ) dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila

radiasi elektromagnetik mengenai molekul, maka akan terjadi eksitasi elektron ke

tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron antibonding

(Mulja dan Suharman, 1995).


34

σ* (anti-bonding)

π* (anti-bonding)

n (non-bonding)

σ (bonding)

π (bonding)

energi

Gambar 8. Tingkat energi elektronik

Macam-macam transisi elektron yang terjadi adalah sebagai berikut.

a. Transisi σ → σ*. Transisi jenis ini terjadi pada orbital ikatan sigma.

Energi yang dibutuhkan untuk transisi ini sangat besar, sesuai dengan sinar yang

mempunyai frekuensi pada daerah ultraviolet vakum (<180 nm).

b. Transisi n → σ*. Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh

yang mengandung atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (ikatan n).

energi yang diperlukan untuk transisi ini lebih kecil dari transisi σ → σ*, sehingga

sinar yang diserap memiliki panjang gelombang lebih besar dari 200 nm.

Pengaruh pelarut pada transisi jenis ini adalah pergesaran puncak absorbansi pada

panjang gelombang yang lebih pendek dalam pelarut yang lebih polar. Pergesaran

ini disebut pergesaran biru atau hipsochromic shift.

c. Transisi n → π* dan π → π*. Untuk memungkinkan terjadinya jenis

transisi ini, maka molekul organik harus mempunyai gugus fungsional yang tidak

jenuh sehingga ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital ikatan π

yang diperlukan. Jenis transisi ini merupakan jenis yang paling sesuai untuk


35

analisis karena memiliki absorbansi pada 200-700 nm dan panjang gelombang ini

secara teknis dapat diaplikasikan pada spektofotometer (Sastrohamidjojo, 2001).

Secara sederhana, komponen-komponen spektrofotometer berkas ganda

dapat dijelaskan sebagai berikut.

a. Sumber radiasi

Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus menghasilkan

spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada keseluruhan kisaran

panjang gelombang. Sumber radiasi cahaya tampak biasanya menggunakan lampu

filament tungsten yang menghasilkan suatu sumber yang berpijar yang

memancarkan radiasi terlihat pada daerah cahaya tampak pada panjang

gelombang 400-700 nm. Sumber radiasi ultraviolet banyak menggunakan lampu

hidrogen dan lampu deuterium, kedua lampu ini menghasilkan radiasi kontinu

pada daerah panjang gelombang 180-350 nm (Sastrohamidjojo, 2001).

b. Monokromator

Ada dua alat untuk mengubah radiasi yang polikromatik menjadi

monokromatik yaitu penyaring dan monokromator. Penyaring dibuat dari benda

khusus yang hanya meneruskan radiasi pada daerah panjang gelombang tertentu

dan menyerap radiasi dari panjang gelombang yang lain. Monokromator

merupakan serangkaian alat optik yang menguraikan radiasi polikromatik menjadi

panjang gelombang tunggalnya dan memisahkan panjang gelombang tersebut

menjadi jalur yang sangat sempit (Sastrohamidjojo, 2001).


36

c. Tempat cuplikan

Tempat cuplikan biasa disebut sel atau kuvet. Untuk daerah ultraviolet

biasanya menggunakan Quartz atau kuvet dari silica yang dilebur

(Sastrohamidjojo, 2001), sedangkan untuk daerah cahaya tampak biasanya

menggunkan Quartz atau gelas silikat (Skoog, Holler, and Nieman, 1998).

d. Detektor

Fungsi detektor adalah untuk mengubah sinyal radiasi yang diterima

menjadi sinyal elektronik. Persyaratan-persyaratan penting untuk detektor adalah

sensitivitas tinggi, waktu respon pendek, stabilitas panjang dan sinyal elektronik

yang mudah diperjelas. Detektor yang digunakan dalam ultraviolet disebut

detektor fotolistrik (Sastrohamidjojo, 2001).

Analisis spektrofotometer UV-Vis melibatkan pembacaan absorban radiasi

elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan.

Keduanya dikenal sebagai absorban (A) tanpa satuan dan transmitan dengan

satuan persen. Hubungan antara intensitas radiasi elektromagnetik yang diserap

oleh sistem (I0) dengan intensitas radiasi yang ditransmisikan (It) dapat dijelaskan

dengan hukum Lambert-Beer, sebagai berikut :

Dengan T = persen transmitan; I0 = intensitas radiasi yang datang; It = intensitas

radiasi yang diteruskan; ε = daya serap molar (L.mol-1.cm-1); c = konsentrasi

(mol/L); b = panjang sel (cm); A = serapan.

cb

IoItT ..10 ε−==

cbT

A ..1log ε==


37

Jika konsentrasi (c) dalam mol/L dan panjang sel dalam cm, persamaannya

menjadi

A = ε.b.c

Jika konsentrasi (c) dalam g/L, persamaannya menjdi

A = a.b.c

Jika a adalah daya serap, hubungan dengan daya serap molar ditunjukkan

dengan persamaan

ε = a.M

Dimana M adalah bobot molekul.

(Silverstein, 1991)

Daya serap (L/g/cm) adalah absorbansi dari 1 g/L larutan dalam sel dengan

panjang 1 cm. Serapan jenis (A 1%, 1 cm) adalah serapan dari larutan 1 % zat

terlarut dalam sel dengan ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada panjang

gelombang tertentu dalam suatu pelarut merupakan sifat dari zat terlarut (Anonim,

1995). Hubungannya dengan daya serap ditunjukkan dengan persamaan

wtmol

cmAa ε==

10)1%,1(

(Clarke, 1986)

Kromofor merupakan group kovalen yang tidak jenuh (unsaturated) yang

bertanggung jawab atas serapan elektron, contoh: C=C, C=O, NO2. auksokrom

adalah saturated group yang mempunyai elektron bebas, ketika tertarik oleh

kromofor, panjang gelombang dan intensitas serapan dapat berubah, contoh: -OH,

-Cl, NH2. Pergeseran batokromik adalah pergeseran serapan ke panjang


38

gelombang yang lebih panjang karena penggantian (substitusi) atau efek pelarut

(pergeseran merah). Pergeseran hipokromik adalah pergeseran serapan ke apnjang

gelombang yang lebih pendek karena penggantian (substitusi) atau efek pelarut

(pergeseran biru). Efek hipokromik adalah peningkatan intensitas serapan. Efek

hipokromik adalah penurunan intensitas serapan (Silverstein, 1991).

H. Keterangan Empirik

Antioksidan sintetik seperti BHA, PG, TBHQ dapat meningkatkan

karsinogenisitas. Sebagai contoh BHA, merupakan inhibitor lipid peroksidasi

yang poten, tetapi ketika dikonsumsi berlebihan menyebabkan kanker, karena

terjadi kerusakan oksidatif pada DNA sehingga memicu terjadinya mutasi. Hal ini

menyebabkan penelitian eksplorasi antioksidan yang berasal dari bahan alami

seperti buah, sayuran dan tanaman mengalami peningkatan.

Secara umum, aktivitas flavonoid sebagai antioksidan disebabkan adanya

gugus hidroksi fenolik pada strukturnya. Gugus ini berperan besar dalam

mendonorkan atom hidrogennya ketika diserang oleh radikal hidroksil, flavonoid-

flavonoid tersebut akan membentuk radikal bebas baru yang lebih stabil yaitu

radikal fenoksil (FIO•) dan molekul air yang stabil. Radikal fenoksil tersebut akan

mengalami efek resonansi pada cincin aromatiknya, hal inilah yang menyebabkan

radikal fenoksil lebih stabil daripada radikal hidroksil.

Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid

dan dianjurkan untuk digunakan dalam proses pemurnian. Glikosida dan beberapa

aglikon flavonoid larut dalam etil asetat. Aktivitas antioksidan daun ketapang

dalam fraksi etil asetat lebih tinggi dibandingkan pentana atau diklorometana.


39

Diharapkan buah juga memiliki aktivitas yang sama dengan daun yang merupakan

bagian tanaman ketapang.

Gula deoksiribosa merupakan substrat yang ditargetkan akan diserang oleh

radikal hidroksil dalam metode deoksiribosa. Jika ada suatu senyawa yang dapat

berperan sebagai antioksidan dan mempunyai kemampuan untuk menangkap

radikal hidroksil (seperti flavonoid) dimasukkan ke dalam sistem, maka produk

degradasi deoksiribosa (MDA) akan berkurang. Hal ini dikarenakan senyawa

tersebut akan menangkap sebagian radikal hidroksil dalam sistem. Penurunan

intensitas warna dan absorbansi yang terjadi menunjukkan berkurangnya

kromogen MDA-TBA yang terbentuk. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil

dinyatakan % scavenging dan nilai aktivitas penangkapan efektif 50% radikal

hidroksil atau effective scavenging 50% (ES50).

Flavonoid dapat ditentukan kadarnya dengan menggunakan senyawa

pengompleks AlCl3. Sehingga flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat

dapat ditetapkan kadarnya dengan metode pengompleksan warna menggunakan

AlCl3.

I. KETERANGAN EMPIRIS YANG DIHARAPKAN

Fraksi etil asetat buah ketapang mempunyai aktivitas antioksidan

melalui uji penangkapan radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dapat

dijadikan sebagai sumber baru senyawa antioksidan alami. Kandungan senyawa

flavonoid buah ketapang mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan


40

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena ada subjek

uji yang dikenakan perlakuan.

B. Variabel - Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas adalah variabel yang direncanakan untuk diteliti

pengaruhnya terhadap variabel tergantung. Variabel bebas dalam penelitian ini

adalah konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung adalah pusat persoalan yang merupakan kriteria dari

penelitian ini. Variabel tergantung dari penilitian ini adalah aktivitas antioksidan

buah ketapang, dilihat dari persen scavenging.

3. Variabel pengacau

Variabel pengacau adalah variabel yang secara teoritis diketahui memiliki

pengaruh terhadap hasil dan tidak dikehendaki. Variabel pengacau terkendali

dalam penelitian ini adalah tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur

buah yang dipanen, cara panen, cara pengeringan dan pembuatan simplisia,

jumlah (g) simplisia yang digunakan, suhu dan waktu inkubasi larutan uji.

Variabel pengacau tak terkendali adalah cahaya matahari, cuaca/musim, curah

hujan.


41

C. Definisi Operasional

1. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan adalah uji untuk menentukan ada tidaknya

senyawa antioksidan dalam buah ketapang dan seberapa besar kemampuan buah

ketapang dalam menangkap radikal hidroksil, sehingga didapatkan nilai

penangkapan efektif (effective scavenging) radikal hidroksil sebesar 50% (ES50)

yang menggambarkan kekuatan antioksidan buah ketapang.

2. Fraksi etil asetat

Fraksi etil asetat adalah hasil dari fraksinasi ekstrak etanol buah ketapang

dengan menggunakan etil asetat.

3. Kandungan senyawa flavonoid total

Kandungan senyawa flavonoid total adalah jumlah keseluruhan senyawa

polifenol yang mempunyai kerangka karbon dengan dua gugus C6 disambungkan

oleh rantai alifatik 3 karbon yang diperoleh dari perbandingan antara besarnya

resapan yang terbaca pada spektrofotometer visibel dengan berat cuplikan,

dinyatakan sebagai gram ekivalen kuersetin dalam setiap 100 gram berat kering

ekstrak (g Ekivalen Kuersetin/100 g).

4. Buah ketapang

Buah ketapang adalah buah dari tanaman ketapang yang berbentuk oval

(seperti almond), berwarna hijau, panjangnya 3,5-7 cm dan lebar 2-5,5 cm, yang

memiliki eksokarpium berupa kulit buah yang berwarna hijau, mesokarpium

berupa serat-serat yang tersusun menjadi serabut yang tebal, berwarna kuning

gading, endokarpium berupa lapisan keras (seperti batok kelapa) yang melindungi


42

biji yang terdapat di dalamnya, berwarna coklat, dan yang paling dalam adalah

biji yang berwarna putih

D. Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan adalah: buah ketapang yang diambil dari

Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Bahan-bahan kualitas

p.a.(E.Merck): dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, asam

thiobarbiturat, asam trikloro asetat, ferri klorida heksahidrat,

etilendiamintetraasetat garam dinatrium dihidrat, hidrogen peroksida (Larutan

30% H2O2), L (+) asam askorbat (vitamin C), etil asetat, natrium nitrit, aluminium

klorida, natrium hidroksida, selulosa. Bahan-bahan kualitas p.a.(Sigma): 2-deoksi-

D-ribosa, kuersetin. Bahan-bahan farmasetis : etanol 96% (CV. General Labora)

dan aquades.

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: spektrofotometer UV-

Vis (Perkin Elmer Lamda 20), pH meter (Metrohm), Vacuum rotary evaporator

(Buchi rotavapor), waterbath (Labo-tech, Heraeus), hot plate, neraca analitik

(scaltec SBC 22, BP 160P), oven, vorteks (Janke & Kunkel), mikropipet 10-100

μL dan 100-1000μL (Acura 825), mikropipet 0,5-5,0 mL (Socorex), tabung reaksi

bertutup (Schott-Germany), alat ultrasonic (Retsch tipe T 460 No.V935922013

EY) alat-alat untuk KLT dan alat-alat gelas (Pyrex-Germany dan Iwaki).


43

F. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman ketapang dilakukan di Laboratorium Biologi

Farmasi, Fakultas Farmasi USD menurut buku Flora of Java (Backer and

Bakhuizen van den Brink, 1965).

2. Pengumpulan bahan

Buah ketapang diperoleh dari fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta pada bulan Mei 2007. Buah yang digunakan adalah buah yang masih

muda. Dikumpulkan pagi hari, pukul enam pagi.

3. Pembuatan ekstrak etanol buah ketapang

Ekstrak etanol disari dengan menggunakan cara perkolasi. Sebanyak 150 g

serbuk buah ketapang yang telah dihaluskan dan diayak dengan menggunakan

ayakan dengan derajat halus 8/24, direndam dalam cairan penyari yaitu etanol

70% (campuran etanol air (7:3)) dan didiamkan selama 24 jam dalam bejana

tertutup. Massa serbuk dan cairan penyari kemudian dimasukkan ke dalam

perkolator. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan tetesan 1 mL tiap menit.

Perkolat yang didapat ditampung, kemudian ampas diberi cairan penyari kembali

sampai perkolat yang keluar sudah jernih. Perkolat yang didapat dipekatkan

dengan vaccum rotaevaporator (rotavapor). Proses dilakukan sampai seluruh

etanol diperkirakan telah menguap. Ekstrak yang didapat, dikumpulkan dan

diuapkan di atas waterbath dengan suhu maksimum 50oC hingga diperoleh

ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapat, ditimbang untuk didapatkan

rendemen dan disimpan dalam eksikator.


44

4. Pembuatan fraksi etil asetat buah ketapang

Ekstrak kental yang didapat dilarutkan dalam 100 mL air panas. Larutan

ekstrak didinginkan kemudian dimasukkan dalam corong pisah. Ditambahkan etil

asetat sebanyak 100 mL, kemudian digojog selama 15 menit dan didiamkan 5

menit. Ekstraksi dilakukan selama 9 kali (berdasarkan optimasi). Didapatkan

fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat dipekatkan dengan rotavapor.

Proses dilakukan sampai seluruh etil asetat diperkirakan telah menguap. Fraksi

yang didapat, dikumpulkan dan diuapkan di atas waterbath dengan suhu

maksimum 50oC hingga diperoleh fraksi kental. Fraksi kental yang didapat,

ditimbang untuk mendapatkan rendemen dan disimpan dalam eksikator.

5. Uji kualitatif kandungan flavonoid dengan metode KLT

Disiapkan larutan fraksi etil asetat buah ketapang. Sebanyak 10 µL larutan

tersebut ditotolkan pada lempeng selulosa dengan rutin (konsentrasi 0,05%)

sebagai pembanding. Lempeng KLT tersebut dielusi dengan fase gerak N-

butanol-Asam Asetat-Air (BAA) dengan perbandingan 4:1:5. Setelah dielusi

bercak diamati pada cahaya tampak, UV 365 nm, dan UV 254 nm. Deteksi

dengan uap amonia dan pereaksi semprot FeCl3 dilakukan untuk memperjelas

bercak. Bercak juga diamati pada cahaya tampak, UV 365nm, dan UV 254 nm.

6. Pembuatan buffer fosfat

Buffer fosfat dibuat dengan bantuan pH meter

a. Pembuatan dinatrium hidrogen fosfat 20 mM

Timbang saksama 1,42 g Na2HPO4 dan larutkan dalam akuades hingga

500,0mL.


45

b. Pembuatan kalium dihidrogen fosfat 20mM

Timbang saksama 0,68g KH2PO4 dan larutkan dalam akuades hingga

250,0mL. Larutan KH2PO4 ditambahkan secara bertetes-tetes pada larutan

Na2HPO4 hingga tercapai pH 7,4.

7. Pembuatan pereaksi

a. Larutan FeCl3 1 mM

Sebanyak lebih kurang 13,52 mg FeCl3.6H2O ditimbang saksama dan

dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut

diambil sebanyak 2,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL

kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu

dibuat baru.

b. Larutan EDTA 1 mM

Sebanyak lebih kurang 18,61 mg Na2EDTA.2H2O ditimbang saksama dan



kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.

c. Larutan vitamin C 1mM

Sebanyak lebih kurang 17,61 mg vitamin C ditimbang saksama dan



kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu

dibuat baru.


46

d. Larutan H2O2 20 mM

Sebanyak 0,045 mL larutan H2O2 30% dimasukkan ke dalam labu ukur

10,0mL dan ditambahkan akuades hingga tanda. Dari larutan tersebut

diambil sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL

kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.

e. Larutan TCA 5%

Sebanyak 1,25 g TCA ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades

hingga 25,0 mL dalam labu ukur.

f. Larutan TBA 1%

Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam beaker

glass 100 mL, ditambahkan akuades secukupnya kemudian dipanaskan di

atas hot plate pada suhu 50-55oC hingga larut. Larutan dimasukkan ke

dalam labu ukur 25,0 mL dan ditambah akuades hingga tanda.

g. Pembuatan larutan kuersetin 8,16 mg/mL

Sebanyak 816,0 mg serbuk kuersetin dimasukkan dalam labu takar 100,0mL

dan ditambahkan metanol hingga batas tanda.

h. Pembuatan larutan natrium nitrit 10%.

Sebanyak 10,0g natrium nitrit dilarutkan dengan aquades secukupnya dalam

beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 100,0mL dan

ditambahkan aquades hingga batas tanda.


47

i. Pembuatan larutan aluminium klorida 10%

Sebanyak 5,0 g aluminium klorida dilarutkan dengan aquades secukupnya

dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 50,0mL

dan ditambahkan aquades hingga batas tanda.

j. Pembuatan larutan natrium hidroksida 10%

Sebanyak 10,0 g natrium hidroksida dilarutkan dengan aquades secukupnya

dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar

100,0mL dan ditambahkan aquades hingga batas tanda.

8. Optimasi Metode

a. Penentuan waktu operasi

Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600μL larutan

Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL

H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM.

Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit.

Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5 %, vorteks

campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30

menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air

mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang

gelombang maksimum teoritis 532 nm selama 30 menit.

b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan

Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL

H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM.


48

Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit.

Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5 %, vorteks

campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC selama 30

menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air

mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya dari panjang

gelombang 400-600 nm.

9. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah

ketapang

a. Pembuatan larutan kontrol

Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan 300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA

1mM, 300 μL H2O2 20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL

vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37oC

selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL TCA 5%,

vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80oC

selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah

air mengalir selama 5 menit.

b. Penentuan aktivitas penangkapan radikal hidroksil

Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan

Deoksiribosa 2,5mM dan fraksi etil asetat buah ketapang sebanyak 200, 400,

600, 800, dan 1000 μL, kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan

300 μL FeCl3 1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H2O2 20mM, buffer

fosfat pH 7,4 (penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume fraksi

etil asetat yang ditambahkan sehingga volume akhir larutan 6 mL), dan


49

300μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu

37oC selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 % dan 1 mL

TCA 5%, vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada

suhu 80oC selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran

didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca

absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

10. Penentuan kadar flavonoid total

a. Pembuatan kurva baku kuersetin

Dibuat larutan induk kuersetin dengan konsentrasi 8,16 mg/mL dalam

aquades. Sebanyak 100; 200; 300; 400; 500; 600; 750; dan 900 μL larutan

induk dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL, ditambahkan 4,0 mL

aquades dan 0,30 mL larutan NaNO2 10%, lalu dibiarkan selama 6 menit.

Kemudian ditambahkan dengan 4,0 mL NaOH 10% dan aquades sampai

volume 10,0 mL. Larutan dibiarkan selama 15 menit dan absorbansinya

dibaca pada panjang gelombang 510 nm.

b. Penentuan kadar flavonoid total dalam fraksi etil asetat

Ditimbang lebih kurang fraksi etil asetat sebanyak 25 mg kemudian

ditambahkan metanol dalam labu ukur sampai 100 mL, sehingga konsentrasi

awal 0,025 g/100 mL. Diambil 250 µL larutan fraksi, ditambahkan metanol

dalam labu ukur 10 mL sampai tanda, sehingga konsentrasinya menjadi

0,00625 g/100 mL = 6,25 mg/100 mL = 6,25 mg%. Larutan kedua yang

digunakan dalam penentuan kadar flavonoid total, yang selanjutnya

dinamakan sampel.


50

Diambil 250 μL sampel dan dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan

dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku. Kadar

flavonoid total dinyatakan sebagai gram ekuivalen kuersetin dalam setiap

100g berat kering ekstrak (g Ekivalen Kuersetin/100g).

G. Analisis Hasil

1. Data kromatografi berupa hRf dan warna bercak sebelum dan sesudah

ditambah pereaksi, diamati dengan sinar tampak maupun dengan sinar UV

254 nm dan 365 nm, lalu dianalisis berdasarkan kriteria yang terdapat

dalam pustaka untuk memperkirakan kandungan flavonoid.

2. Hasil absorbansi senyawa uji dengan absorbansi kontrol diolah

menggunakan analisis regresi linear antara konsentrasi senyawa uji (x)

dengan aktivitas antioksidan (y) untuk mendapatkan ES50.

3. Kadar senyawa flavonoid total dianalisis menggunakan persamaan regresi

linear dengan data kurva baku secara intrapolasi.


51

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman merupakan langkah awal yang dilakukan dalam

suatu penelitian yang menggunakan sampel berupa tumbuhan. Determinasi

bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang

akan digunakan dalam penelitian untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam

pengambilan sampel analis fitokimia. Determinasi tanaman ketapang dilakukan di

laboratorium biologi farmasi menurut buku Flora of Java (Backer and Bakhuizen

van den Brink, 1965).

Hasil determinasi tanaman ketapang sebagai berikut:

1b-2b-3b-4b-12b-13b-14b-17b-18b-19b-20b-21b-22b-23b-24b-25b-26b-27b-

799b-800b-801b-802b-806b-807b-809b-810b-811b-825b-826b-829b-830b-

831b-832b-833b-834b-983b-984b-986b-991b-992b-993b-994b-995b-1014a-

1017a-1018b-1026b-1027b-1028b…..87. Combretaceae

1b….. Terminalia

1b-3b….. T. catappa L.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Buah ketapang yang akan digunakan diperoleh dari Fakultas Farmasi,

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Buah dipetik pada pagi hari (pukul enam

pagi) ketika proses fotosíntesis belum terjadi. Pada saat dipetik, dipilih buah yang

tua tetapi belum matang dan masih berwarna hijau (tidak berwarna kuning atau

51


52

coklat). Umumnya kandungan flavonoid belum terbentuk maksimal ketika masih

muda dan akan berkurang ketika sudah matang. Pada saat pemilihan dilakukan

seleksi, buah yang akan digunakan pada kulit buahnya tidak terdapat bekas ulat,

tidak berjamur, ataupun busuk. Karena dapat terjadi perubahan

(konversi/biodegradasi/biotransformasi) senyawa atau zat aktif sehingga

mempengaruhi mutu simplisia maupun ekstrak yang dibuat, dan dapat menjadi

kontaminan (cemaran). Karena mutu ekstrak dipengaruhi bahan baku yang

digunakan (Anonim, 2000).

C. Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Ketapang

Simplisia yang digunakan dalam proses penyarian adalah simplisia kering

yang berupa serbuk. Karena lebih tahan lama dalam penyimpanannya dan tidak

mudah rusak.

Buah ketapang memiliki bagian-bagian. Dari luar ke dalam bagian-bagian

buah ketapang sebagai berikut. Bagian eksokarpium berupa kulit buah yang

berwarna hijau. Bagian mesokarpium berupa serat-serat yang tersusun menjadi

serabut yang tebal, berwarna kuning gading. Bagian endokarpium berupa lapisan

keras (seperti batok kelapa) yang melindungi biji yang terdapat di dalamnya,

berwarna coklat. Terakhir adalah biji yang berwarna putih. Semua bagian dari

buah ketapang digunakan dalam penelitian ini.

Buah ketapang yang diperoleh dicuci dengan air mengalir untuk

menghilangkan pengotor yang menempel pada kulit buah. Setelah bersih, air yang

masih menempel pada buah ketapang dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

Untuk memudahkan dalam pengeringan, buah ketapang yang sudah kering,


53

dihancurkan menggunakan alat penghancur (palu). Pengeringan untuk buah

ketapang yang telah hancur dilakukan di dalam oven dengan suhu maksimal 55oC.

Bahan simplisia dapat dikeringkan pada suhu 30oC sampai 90oC, tetapi suhu yang

terbaik tidak melebihi 60oC (Anonim, 1985). Proses pengeringan dihentikan

ditandai dengan mudah dipatahkannya buah ketapang.

Penyerbukan buah ketapang yang telah kering menggunakan blender.

Tujuan dari penyerbukan adalah untuk memperluas permukaan simplisia yang

bersentuhan dengan cairan penyari dan untuk mempermudah cairan penyari

menembus simplisia (Anonim, 1985). Luas permukaan yang besar akan

mengoptimalkan pembasahan serbuk simplisia oleh cairan penyari sehingga hasil

penyarian juga optimal. Simplisia lunak lebih mudah ditembus oleh cairan

penyari, sedangkan simplisia keras perlu dilakukan penyerbukan untuk

mempermudah cairan penyari menembus simplisia.

Serbuk yang didapat kemudian diayak dengan pengayak berukuran mesh

8/24. Derajat halus yang dinyatakan dengan 2 nomor (8/24) mempunyai

pengertian semua serbuk dapat melalui ayakan dengan nomor terendah (8) dan

tidak lebih dari 40% melewati ayakan nomor tertinggi (24). Penggunaan nomor

mesh yang berbeda ini tidak memberikan pengaruh yang berarti pada hasil

penyarian karena meskipun serbuk lebih halus namun serbuk masih dapat

tersaring dan tidak masuk ke dalam perkolat saat proses penyaringan. Serbuk yang

dipakai dalam penyarian adalah serbuk yang dapat melalui ayakan dengan nomor

mesh 8 dan serbuk yang tidak lebih dari 40%nya melewati ayakan dengan nomor

mesh 24.


54

Makin halus serbuk simplisia, proses ekstraksi makin efektif, namun

semakin halus serbuk, makin rumit dalam tahap filtrasi (penyaringan), karena

butir-butir halus tersebut membentuk suspensi yang sulit dipisahkan dari hasil

penyarian (Anonim, 1986); Anonim, 2000). Dalam Anonim (1986) menyebutkan,

simplisia yang terlalu halus akan memberikan kesulitan pada proses penyarian.

Pada proses perkolasi, bila serbuk terlalu halus cairan penyari tidak dapat turun,

karena ruang antar sel berkurang, dimana ruang antar sel merupakan jalan yang

mudah ditembus oleh cairan penyari. Hal ini meyebabkan pemilihan ayakan

dengan nomor mesh 8/24.

Penyarian dilakukan dengan metode perkolasi. Penyarian bertujuan untuk

mendapatkan senyawa aktif yang diinginkan. Metode perkolasi memiliki

keuntungan yaitu karena menggunakan pelarut yang selalu baru maka terjadi

peningkatan derajat perbedaan konsentrasi sehingga lebih efektif untuk menyari

senyawa aktif karena memungkinkan zat yang larut dalam pelarut tersari hampir

seluruhnya. Proses penyariannya tidak menggunakan panas sehingga senyawa

yang tidak tahan panas, tidak akan rusak. Penyari yang digunakan adalah etanol

70% dengan pertimbangan kombinasi etanol-air mempunyai sifat polar yang

diharapkan mampu menyari senyawa polar maupun yang semi polar. Campuran

etanol-air digunakan untuk meningkatkan penyarian (Anonim, 1986). Pelarut

etanol dapat dengan efisien berpenetrasi ke dalam membran sehingga mendorong

terekstraksinya sejumlah besar komponen endoseluler (Silva et.al, 1998).

Senyawa polifenol (misal flavonoid) merupakan senyawa yang cenderung bersifat

polar karena banyak mengandung gugus hidroksi sehingga diharapkan senyawa


55

flavonoid dalam buah ketapang dapat tersari ke dalam etanol 70%. Selain itu

etanol bersifat universal, selektif, aman dan lebih ekonomis.

Etanol bersifat universal karena dapat melarutkan sebagian besar

kandungan kimia (senyawa organik) dalam simplisia. Selektif artinya etanol

bersifat polar sehingga dapat menyari senyawa yang bersifat polar yaitu flavonoid

sehingga penyarian dapat optimal. Aman karena dibandingkan pelarut yang lain

etanol lebih aman bagi kesehatan dan lingkungan serta tidak beracun. Bersifat

ekonomis karena etanol lebih murah harganya.

Serbuk simplisia yang akan diperkolasi tidak langsung dimasukkan ke

dalam bejana perkolasi (perkolator), tetapi dibasahi atau direndam dulu dengan

cairan penyari dalam bejana tertutup selama 24 jam (Anonim, 1986). Bila serbuk

simplisia tersebut langsung dialiri dengan cairan penyari maka cairan penyari

tidak dapat menembus sel dengan sempurna. Jika serbuk simplisia telah tebasahi

dengan sempurna maka aliran cairan penyari tidak akan mengalami hambatan

sehingga aliran cairan penyari akan merata dan dapat menembus sel dengan

sempurna. Pembasahan juga bertujuan untuk memberikan kesempatan sebesar-

besarnya kepada cairan penyari memasuki seluruh pori-pori simplisia sehingga

memudahkan penyarian selanjutnya.

Selama proses perkolasi, perkolator ditutup rapat yang bertujuan untuk

mencegah masuknya kontaminan dari luar dan untuk mencegah penguapan dari

cairan penyari. Perkolator juga diletakkan pada tempat yang terlindung dari

cahaya matahari. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kerusakan


56

senyawa-senyawa akibat terpapar cahaya matahari atau untuk mencegah

terjadinya reaksi beberapa senyawa dengan bantuan cahaya matahari.

Penetesan pada keran diatur dengan kecepatan tetesan 20-30 tetes per

menit (1mL per menit) (Anonim, 1986). Jika terlalu cepat, penyarian tidak

sempurna dan jika terlalu lambat akan membuang waktu dan kemungkinan

penguapan cairan penyari lebih besar. Proses penyarian dilakukan sampai perkolat

yang menetes warnanya sama dengan cairan penyari (jernih). Hal ini

menunjukkan bahwa sudah tidak ada lagi senyawa aktif dalam serbuk simplisia

yang dapat dilarutkan oleh cairan penyari.

Perkolat yang didapatkan sebelum dipekatkan disaring dulu dengan kertas

saring. Tujuan adalah untuk menghilangkan pengotor yang didapat dari

lingkungan ataupun serbuk yang lolos dari perkolator. Pemekatan menggunakan

rotavapor sampai hampir semua etanol menguap. Kelebihan dari rotavapor adalah

dengan penguapan pada tekanan rendah suhu yang digunakan juga rendah

(<50oC) sehingga senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan tidak rusak.

Setelah proses penguapan dianggap cukup, perkolat yang didapatkan dikentalkan

di atas penangas air dengan suhu maksimal 50oC sampai didapat ekstrak kental,

yang selanjutnya disebut ekstrak etanol. Pemekatan dengan rotavapor bertujuan

untuk meningkatkan jumlah senyawa terlarut dalam pelarut, didapat ekstrak pekat,

sedangkan penangas air digunakan untuk mengentalkan ekstrak, karena

diinginkan ekstrak kental untuk digunakan dalam penelitian. Ketika dipanaskan

dengan penangas air semua pelarut dihilangkan. Berat ekstrak etanol 27,07 g


57

dengan rendemen sebesar 18,05%. Ekstrak disimpan dalam eksikator untuk

melindungi dari uap air udara.

D. Hasil Pembuatan Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang

Pembuatan fraksi etil asetat menggunakan proses ekstraksi dengan

menggunakan dua pelarut yang tidak saling campur. Ekstrak kental etanol yang

didapat dilarutkan terlebih dahulu dengan 100 mL air hangat, dan kemudian

disebut sebagai fraksi air. Tujuan dari proses separasi adalah menghilangkan

(memisahkan) senyawa yang tidak dikehendaki semaksimal mungkin tanpa

berpengaruh pada senyawa kandungan yang dikehendaki, sehingga diperoleh

ekstrak yang lebih murni (Anonim, 2000). Proses separasi dilakukan dengan

menggojok fraksi air dalam corong pisah menggunakan pelarut etil asetat. Etil

asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan

untuk digunakan dalam proses pemurnian (Robinson, 1995).

Pada saat pemisahan fraksi etil asetat berada di atas sedangkan fraksi air

berada di bawah. Hal ini disebabkan karena berat jenis air (0,997) lebih besar dari

etil asetat (0,898). Fraksi air diekstraksi dengan etil asetat sebanyak 100 mL,

ekstraksi diulang 9 kali. Etil asetat yang ditambahkan sebanding dengan air yang

ditambahkan ketika pertama akan mempartisi, sebanyak 100 mL. Ekstraksi

dilakukan berulang dengan jumlah pelarut yang sedikit dimaksudkan untuk

mengefektifkan separasi artinya senyawa yang diinginkan akan didapat dalam

jumlah yang lebih banyak. Sembilan kali ekstraksi merupakan hasil optimasi.

Pada saat menggojog, kekuatan yang diberikan tidak terlalu keras (hanya

penggojogan lemah saja) untuk menghindari terjadinya emulsi, karena proses


58

pemisahan akan berlangsung lebih lama ketika terbentuk emulsi. Selanjutnya,

fraksi air dibuang dan fraksi etil asetat dikentalkan (diuapkan di atas penangas air)

sampai didapat ekstrak kental etil asetat, yang selanjutnya disebut fraksi etil

asetat. Berat fraksi etil asetat 4,28 g, dengan rendemen 2,85%.

E. Hasil Uji Kualitaif Flavonoid dengan metode KLT

Gambar 9 . Struktur rutin

Pada penelitian ini dilakukan uji kualitatif terhadap fraksi etil asetat untuk

mengetahui apakah di dalam buah ketapang mengandung flavonoid. Sebagai

pembanding digunakan rutin yang merupakan senyawa golongan flavonoid. Rutin

merupakan glikosida flavonol yang pada umumnya terdapat dalam tanaman, dan

terdiri atas kuersetin (aglikon) dan disakarida rutinosa. Metode yang digunakan

adalah metode KLT, dengan selulosa sebagai fase diam dan n-butanol-asam

asetat-air (BAA) 4:1:5 v/v sebagai fase gerak. Fase diam tidak menggunakan

silika gel GF 254 karena dapat membentuk ikatan dengan flavonoid. Hal ini

menyebabkan flavonoid tidak dapat terelusi dengan baik. Ikatan yang terjadi

adalah ikatan dengan Ca (kalsium) yang terdapat pada gipsum (perekat) pada

silika gel GF 254. Fase geraknya BAA karena disarankan untuk pemeriksaan awal

keberadaan flavonoid. Penjenuhan menggunakan kertas saring. Tujuan dari


59

penjenuhan chamber adalah untuk mempercepat elusi sehingga waktu yang

digunakan lebih singkat.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

hRf

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

hRf

1 2 1 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

hRf

A B C

Gambar 10 Foto kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air (4:1:5)v/v, deteksi: uap amonia, pengembangan: 10cm. Keterangan:A: cahaya tampak, B: UV 365, C: UV 254

1: rutin, 2: fraksi etil asetat

Deteksi bercak menggunakan uap amonia. Warna kedua bercak tidak

nampak ketika dilihat pada cahaya tampak baik sebelum maupun setelah diuapi

amonia. Warna kedua bercak nampak ketika dilihat pada UV 365 dan UV 254

setelah diuapi amonia. Kedua bercak memberikan warna kuning tua ketika

diamati baik pada UV 365 dan UV 254. hRf rutin: 63 dan hRf fraksi etil asetat:

64. Hal tersebut diatas menunjukkan dalam fraksi etil asetat terdapat flavonoid,

dapat dilihat dari warna bercak yang sama dan hRf yang berdekatan.


60

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

hRf

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

hRf

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

hRf

Gambar 11 Foto kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air (4:1:5) v/v, deteksi: pereaksi semprot besi (III) klorida, pengembangan: 10 cm. Keterangan: A: cahaya tampak, B: UV 365, C: UV 254


Penyemprotan dengan besi (III) klorida memberikan kromatogram dengan

empat bercak, tiga bercak berasal dari fraksi etil asetat dan yang satu adalah rutin

yang digunakan sebagai pembanding. Rutin dengan warna coklat kekuningan

memberikan hRf: 68. Untuk fraksi etil asetat ketiga bercak memberikan warna

yang berbeda-beda. Bercak a berwarna ungu dengan hRfa: 69, untuk bercak b dan

c berwarna biru tua dengan hRfb: 85 dan hRfc: 95. Hal tersebut diatas

menunjukkan dalam fraksi etil asetat terdapat flavonoid, dapat dilihat dari hRf

yang berdekatan antara bercak a dan rutin. Bercak b dan c diperkirakan masuk

dalam golongan flavonol (kuersetin atau erictodiol).

Kesimpulan dalam analisis kualitatif ini adalah dalam buah ketapang

terdapat flavonoid yang tersari dalam fraksi etil asetat.


61

F. Optimasi Metode

1. Penentuan waktu operasi

Penentuan waktu operasi (operating time) bertujuan untuk mendapatkan

waktu pengukuran absorbansi dengan nilai stabil. Waktu operasi ditentukan pada

saat terbentuknya warna yang stabil, ditandai dengan nilai absorbansi yang stabil

dari senyawa yang diukur. Penentuan waktu operasi dilakukan dengan mengukur

absorbansi larutan kontrol dengan tujuan mendapatkan waktu operasi senyawa

kromogen MDA-TBA tanpa adanya gangguan senyawa lain. Pengukuran

absorbansi setelah larutan kontrol diinkubasi pada suhu 80oC kemudian

didinginkan 5 menit dibawah air mengalir. Waktu pengukuran absorbansi kontrol

adalah 30 menit. Hasil pengukuran absorbansi menunjukkan pada menit ke 0

sampai menit ke 30 memberikan nilai absorbansi yang stabil, yaitu 0,981.

Kestabilan nilai absorbansi menunjukkan bahwa jumlah kromogen MDA-

TBA relatif stabil. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA dipercepat dengan

adanya panas. Pada penelitian ini, panas yang diterima larutan berasal dari

pemanasan dengan waterbath pada suhu 80oC. Setelah 30 menit melalui tahap

pemanasan, larutan didinginkan selama 5 menit sehingga suhu larutan sama

dengan suhu lingkungan . Ketiadaan panas ini memperlambat reaksi pembentukan

kromogen MDA-TBA.


62

Gambar 12. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA

Pada metode deoksiribosa, proses degradasi deoksiribosa menjadi MDA

terjadi pada saat larutan campuran diinkubasi pada suhu 37oC. Selanjutnya

penambahan TCA menyebabkan larutan dalam suasana asam (pH rendah). MDA

kemudian akan bereaksi dengan TBA membentuk kromogen MDA-TBA. Selain

memberikan suasana asam TCA menghambat proses oksidasi vitamin C sehingga

proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+ terhambat pula. Terhambatnya reaksi ini

mengakibatkan terhambatnya pembentukan radikal hidroksil sehingga terjadi

penurunan kecepatan degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil. Reaksi yang

terjadi sebagai berikut.


63

Fe3+ EDTA + Asam Askorbat Fe2+ EDTA + Asam Dehidro Askorbat

Fe2+ EDTA + H2O2 Fe3+ EDTA + -OH + .OH

Radikal hidroksil yang terjadi akan menyerang deoksiribosa dengan cara

abstraksi (pemisahan) hidrogen dan membentuk suatu radikal deoksiribosa

kemudian dengan adanya oksigen akan secara cepat diubah menjadi radikal gula

peroksil. Selanjutnya radikal gula peroksil akan mengalami serangkaian reaksi

yang meliputi disproposionasi, penataan ulang, eliminasi air dan pemecahan

ikatan C-C menjadi malondialdehid (MDA) dan produk yang lain (Purwantoko,

2007).

Selain memberikan suasana asam, penambahan TCA berfungsi sebagai

katalis pembentukan kromogen MDA-TBA. Adanya H+ mengakibatkan

pengubahan salah satu gugus keton pada TBA menjadi lebih reaktif sehingga

TBA dapat bereaksi dengan MDA.

N

N

O

OS

H

H HN

N

O

OS

H

H H

H H+ H

Gambar 13. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA


64

OH2C OH

HHO

OHH

OH

OOHH2C

HO

HOH

H2O

OOHH2C

HO

HOH

H

OOH2C

HO

HOH

H

H

OHOH2C

O

OH

H

H

OHOH2C

OH

H2O

H

- H2O

OHOH2C

OH

oksidasiH O

O H

HOOH

O

H O

O H

H OHH O

O H

malondialdehid

OH

deoksiribosa

Gambar 14. Reaksi pembentukan MDA


65

N

N

O

O

H

HH

HS

N

N

O

O

H

H H

HS

HO

H O

N

N

O

O

H

H H

SOH

HO

TBATBAMDA

+HN

N

O

H

H

S

H

OH

S

N

N

O

H

H

HH

H

O O S

N

N

O

H

H

S

N

N

O

H

HH

OH

H H

OH

O O

+H

+HN

N

O

O

H

H

S

HH

S

N

N

O

H

H

H

O

N

N

O

H

H

SH

S

N

N

O

O

H

H

O

+HN

N

OH

H

H

S

N

N

OH

H

H

S

H

OH HO

N

N

OH

S

N

N

OH

HS OH HO

+ + H

- H2O

- H2O

+

+ H

+ H

MDA-TBAwarna merah muda

Gambar 15. Mekanisme reaksi pembentukan MDA-TBA (Purwantoko, 2006)


66

Senyawa MDA yang dihasilkan dari reaksi degradasi deoksiribosa

merupakan senyawa yang tidak berwarna. Reaksi pengkoplingan MDA dengan

TBA membentuk kromogen yang berwarna merah muda. Warna ini terbentuk

karena ada perpanjangan gugus kromofor dan penambahan gugus auksokrom.

N

N

N

N S

OH

HOOH

OH

HS

gugus kromoforgugus auksokrom

Gambar 16. Struktur kromogen MDA-TBA

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Menurut Kunchandy dan Rao (1998), panjang gelombang serapan

maksimum teoritis kromogen MDA-TBA adalah 532 nm. Penentuan panjang

gelombang serapan maksimum dalam penelitian ini dilakukan untuk verifikasi

terhadap panjang gelombang serapan maksimum teoritis karena terdapat beberapa

kondisi percobaan yang berbeda antara penelitian ini dengan penelitian yang

pernah dilakukan. Perbedaan itu antara lain perbedaan waktu, iklim dan perbedaan

individu yang melakukan.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan

kontrol, yaitu larutan tanpa penambahan sampel dengan tujuan mendapatkan

panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA yang berwarna merah

muda tanpa gangguan senyawa lain yang ada dalam sampel. Dari hasil scanning


67

yang dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm didapatkan panjang

gelombang maksimum untuk kromogen MDA-TBA dalam penelitian ini adalah

532,2 nm. Panjang gelombang yang didapat mendekati panjang gelombang

teoritis yaitu 532nm. Selisih panjang gelombang teoritis dengan hasil penelitian

adalah 0,2 nm, selisih nilai ini masih memenuhi selisih yang diperbolehkan dalam

Farmakope Indonesia Edisi IV, yaitu kurang dari 2 nm. Karena hal diatas, panjang

gelombang yang diperoleh dapat digunakan dalam penelitian.

Gambar 17. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi

kromogen MDA-TBA

Panjang gelombang serapan maksimum merupakan faktor penting di

dalam analisis kimia dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Tujuan


68

menentukan panjang gelombang maksimum dalam penelitian ini adalah untuk

mencari panjang gelombang saat kromogen MDA-TBA dapat memberikan

serapan yang optimum. Panjang gelombang yang didapat akan digunakan untuk

mengukur serapan kompleks yang dianalisis.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dapat digunakan untuk

identifikasi molekul yang bersifat karakteristik. Panjang gelombang maksimum

tidak tergantung pada struktur molekul suatu senyawa tetapi bergantung pada

gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UV-Vis sehingga jika ada dua

senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama, belum tentu kedua senyawa tersebut

sama. Hal inilah yang menyebabkan panjang gelombang maksimum digunakan

sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif. Dalam analisis kuantitatif,

pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum

karena perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling

besar, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum. Selain itu

kurva serapan disekitar panjang gelombang serapan maksimum tersebut relatif

lebih datar sehingga jika dilakukan pengukuran ulang atau replikasi, kemungkinan

kesalahan yang terjadi makin kecil (Mulja dan Suharman, 1995).

G. Hasil Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil

dengan Metode Deoksiribosa

Metode deoksiribosa yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan

prosedur kerja maupun konsentrasi mengarah pada penelitian Purwantoko (2006).

Berdasarkan penelitian Purwantoko (2006), metode deoksiribosa memilki akurasi,


69

presisi dan linearitas yang baik sehingga dapat digunakan untuk menguji aktivitas

penangkapan radikal hidroksil.

Berdasarkan tabel IV, absorbansi larutan kontrol lebih tinggi daripada

larutan sampel karena pada larutan kontrol tidak terdapat senyawa penangkap

radikal hidroksil sehingga deoksiribosa langsung didegradasi oleh radikal

hidroksil. Pada larutan sampel, dimungkinkan terdapat senyawa penangkap

radikal hidroksil yang mengakibatkan penurunan jumlah degradasi deoksiribosa.

Terbukti dengan adanya penurunan absorbansi kromogen MDA-TBA dari larutan

sampel pada berbagai konsentrasi.

Tabel IV. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat buah ketapang dengan berbagai konsentrasi

Replikasi Konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang (mg/mL)

0 0,033 0,067 0,100 0,133 0,167 I 1,070 0,448 0,436 0,426 0,405 0,387 II 1,072 0,515 0,448 0,413 0,365 0,330 III 1,071 0,582 0,559 0,509 0,455 0,438 IV 1,070 0,545 0,510 0,461 0,431 0,405 V 1,073 0,577 0,535 0,516 0,478 0,451 VI 1,071 0,582 0,552 0,526 0,486 0,457

Rata-rata 1,071 0,542 0,507 0,475 0,437 0,411 SD 0,001 0,048 0,053 0,049 0,046 0,048


70

0.0

0.4

0.8

0 0.05 0.1 0.15 0.2

konsentrasi (mg/ml)

abso

rban

si

1.2

Gambar 18. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang

dengan absorbansi kromogen MDA-TBA

Semakin besar konsentrasi fraksi etil asetat yang ditambahkan maka terjadi

penurunan absorbansi. Penurunan absorbansi ini disebabkan peristiwa

penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang. Peristiwa ini

mengakibatkan penurunan jumlah radikal hidroksil yang akan mendegradasi

deoksiribosa akibatnya terjadi penurunan MDA. Adanya penurunan jumlah MDA

mengakibatkan penurunan jumlah kromogen MDA-TBA yang ditunjukkan

dengan penurunan absorbansi larutan dengan sampel pada berbagai konsentrasi

dibandingkan dengan larutan kontrol.

Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat

dinyatakan dalam persen scavenging. Nilai persen scavenging dihitung dari selisih

antara purata absorbansi sampel (fraksi etil asetat) pada konsentrasi tertentu,

dibagi purata absorbansi blangko dikalikan 100%.


71

Tabel V. Persen scavenging fraksi etil asetat buah ketapang

Konsentrasi Fraksi Etil

Asetat (mg/mL)

% Scavenging Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang

Persamaan Regresi Linear

0,033 46,51 Y= 96,711 X + 43,289 A = 43,289 B = 96,711 r = 0,9985

0,067 49,66 0,100 52,83 0,133 56,61 0,167 59,19

0

20

40

60

80

0 0.05 0.1 0.15 0.2

konsentrasi (mg/ml)

% s

cave

ngin

g

Gambar 19. Kurva hubungan kenaikan konsentrasi fraksi etil asetat dengan % scavenging

Persamaan regresi linear yang didapat adalah Y= 96,711X + 43,289

dengan r = 0,9985 lebih besar dari r tabel (db = 4; P’ = 0,05), sebesar 0,811

(Muth, 1999), sehingga persamaan di atas dapat digunakan untuk menghitung

nilai ES50 dari fraksi etil asetat buah ketapang. Nilai ES50 berbanding terbalik

dengan kemampuan senyawa untuk menangkap radikal hidroksil. Semakin kecil

nilai ES50 maka sampel tersebut mempunyai nilai keefektifan sebagai penangkap

radikal hidroksil (sebagai antioksidan) yang lebih baik. Nilai ES50 fraksi etil asetat

buah ketapang 0,06939 mg/mL = 69,39 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa

dengan konsentrasi 69,39 µg/mL fraksi etil asetat buah ketapang dapat

menangkap 50% radikal hidroksil yang terdapat dalam larutan.


72

Jika dibandingkan dengan ES50 fraksi etil asetat teh hijau sebesar 0,22

mg/ml (Dewi, 2007) dan ES50 fraksi etil asetat teh hitam sebesar 0,22 mg/ml

(Leny, 2007), fraksi etil asetat buah ketapang mempunyai nilai keefektifan

sebagai penangkap radikal hidroksil (sebagai antioksidan) yang lebih baik. Hal ini

dikarenakan nilai ES50 fraksi etil asetat buah ketapang, yaitu sebesar 69,39 µg/mL

lebih kecil dibandingkan ES50 fraksi etil asetat teh hijau dan teh hitam.

Flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat buah ketapang dapat

mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan. Karena flavonoid yang

terkandung dalam fraksi etil asetat dalam bentuk aglikon dan yang terikat gula.

Mekanisme penangkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dalam fraksi etil asetat

disebabkan karena terdapat gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya.

Gugus ini berperan besar dalam mendonorkan atom hidrogennya ketika diserang

oleh radikal hidroksil, flavonoid-flavonoid tersebut akan membentuk radikal

bebas baru yang lebih stabil yaitu radikal fenoksil (FIO•) dan molekul air yang

stabil.

FIOH + •OH FIO• + H2O

Radikal fenoksil tersebut akan mengalami efek resonansi pada cincin

aromatiknya, hal inilah yang menyebabkan radikal fenoksil lebih stabil daripada

radikal hidroksil. Radikal fenoksil juga akan melakukan terminasi yaitu

penggabungan dengan radikal bebas lain. Reaksi terminasi ini dapat terjadi antara

radikal fenoksil dengan radikal hidroksil maupun dengan radikal fenoksil lainnya.

FIO• + •OH FIO-OH

FIO• + FIO• FIO-FIO


73

Fase propagasi dari radikal hidroksil dapat dihambat karena flavonoid

memiliki kemampuan menangkap radikal hidroksil. Hal inilah yang menyebabkan

berkurangnya radikal hidroksil yang menyerang deoksiribosa ketika penambahan

fraksi etil asetat buah ketapang ke dalam campuran pereaksi fenton dan

deoksiribosa. Setiap konsentrasi fraksi etil asetat meningkat, absorban yang

terbaca menjadi menurun. Hal ini menunjukkan semakin meningkat konsentrasi

berarti semakin banyak flavonoid yang terkandung di dalamnya, sehingga radikal

hidroksil yang akan menyerang deoksiribosa akan semakin berkurang.

Menyebabkan deoksiribosa yang didegradasi berkurang, sehingga kromogen

MDA-TBA yang terbentuk juga semakin sedikit dan menyebabkan ansorbansinya

berkurang.

O

O

OHO

O H

OOH

OHO

O

O

OHO

O

O

OHO

+ H2O

G ambar 20. Mekanisme penegkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dan efek resonansi yangterjadi pada flavonoid


74

O

OHO

O

O

HOO

O

O O

H. Penentuan Kadar Senyawa Flavonoid Total

Tujuan dari penentuan kadar flavonoid total adalah untuk melihat korelasi

antara aktivitas antioksidan dengan kadar flavonoidnya. Dasar penetapan

flavonoid menggunakan spektrofotometri visibel adalah terbentuknya kompleks

antara flavonoid dengan logam Al menghasilkan warna kuning yang bila

direaksikan dengan basa kuat (NaOH) memberikan warna merah muda. Intensitas

warna yang terbentuk dapat diukur pada panjang gelombang 510 nm.

AlCl3 dapat membentuk kompleks yang stabil dengan atom C nomor 3

dan atom C nomor 5 pada flavonoid. Namun pada golongan yang mengandung

sistem ortohidroksi pada cincin A dan B, akan membentuk kompleks yang tidak

stabil dan akan terdekomposisi dengan penambahan asam.

Aglikon flavonoid yang sifatnya kurang polar jika dibandingkan dengan

gula akan lebih banyak tersari ke dalam fraksi etil asetat. Gula dari flavonoid akan

lebih tersari ke dalam air, dimana air lebih polar jika dibandingkan dengan etil

asetat. Keberadaan gugus gula pada glikosida flavonoid menyebabkan rintangan

sterik sehingga menghambat reaksi penangkapan radikal yang digambarkan

Gambar 21. Reaksi kopling radikal fenoksil

O

OHO

O

OH

+

O


75

dengan ES50 yang tinggi. Hal ini menyebabkan glikosida flavonoid kurang efektif

sebagai antioksidan dibanding bentuk aglikonnya. Selain itu, aktivitas antioksidan

flavonoid disebabkan karena adanya gugus hidroksi pada struktur molekulnya.

Flavonoid dengan gugus hidroksi bebas mempunyai aktivitas sebagai penangkap

radikal dan adanya gugus hidroksi lebih dari satu terutama pada cincin B akan

meningkatkan aktivitas antioksidannya.

Reaksi yang terjadi antara flavonoid dengan logam Al dalam suasana basa

adalah sebagai berikut.

OHO

O

OH

OH

OH

OH

OHO

O

O

O

O

O

Al Cl

AlCl3netral

Kuersetin

Kompleks kuersetin - AlCl3(Kuning)

OO

O

O

O

O

O

Al Cl

NaOH

Merah muda

AlCl

AlCl

Al

Cl ClCl

AlClCl Cl

Gambar 22. Reaksi yang terjadi dalam penetapan kadar flavonoid

Natrium nitrit (NaNO2) digunakan sebagai buffer yang bertujuan untuk

mempertahankan pH larutan karena jika pH larutan sangat asam, kompleks AlCl3


76

dengan kuersetin terbentuk tidak optimum. Penambahan basa (NaOH)

dimaksudkan untuk meningkatkan intensitas warna kompleks yang terbentuk.

Tabel VI. Kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan dengan AlCl3 dalam suasana basa

Kadar Kuersetin

(mg/100 ml) Absorbansi Persamaan regresi linear

0,1632 0,188 Y= 0,821 X + 0,073 r = 0,995 X = kadar kuersetin (mg/mL) Y = absorbansi

0,2448 0,284 0,3264 0,353 0,4080 0,417 0,4896 0,484 0,6120 0,548 0,7344 0,685

Gambar 23. Kurva kadar kuersetin dan absorbansinya setelah direaksikan dengan AlCl3 dalam suasana basa

Persamaan regresi linear yang diperoleh adalah Y= 0,821 X + 0,073 ditulis

sebagai kurva baku kuersetin disajikan pada gambar 16. Dari tabel V diperoleh

nilai koefisien korelasi, r = 0,995; lebih besar dari r tabel (db = 6; P’ = 0,05),

sebesar 0,707 (Muth, 1999), sehingga persamaan di atas dapat digunakan untuk

menghitung kadar flavonoid total dari fraksi etil asetat buah ketapang. Kadar

flavonoid dalam fraksi etil asetat disajikan dalam tabel berikut.


77

Mula-mula, menimbang fraksi etil asetat sebanyak 25 mg kemudian

ditambahkan metanol dalam labu ukur sampai 100 mL, sehingga konsentrasi awal

0,025 g/100 mL. Diambil 250 µL larutan fraksi, ditambahkan metanol daalm labu

ukur 10 mL sampai tanda, sehingga konsentrasinya menjadi 0,00625 g/100 mL =

6,25 mg/100 mL. Larutan kedua yang digunakan dalam penentuan kadar

flavonoid total, yang selanjutnya dinamakan sampel. Diambil 250 μL sampel dan

dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan

pada pembuatan kurva baku. Selanjutnya didapatkan absorbansi sampel.

Contoh perhitungan penentuan kadar flavonoid total fraksi etil asetat

replikasi pertama dengan absorbansi 0,246. dari persamaan regresi linear dari

kurva baku kuersetin Y= 0,821 X + 0,073 didapat X = 0,2107 mg/100 ml

%100x

asetatetilfraksikadarflavonoidkadartotalflavonoidKadar =

%100

100/25,6100/2107,0 x

mlmgmlmgtotalflavonoidKadar =

= 3,376 % b/b

Tabel VII. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat dihitung sebagai % b/b ekivalen kuersetin

Sampel Faktor pengenceran Absorbansi X

(mg/100ml)Kadar

(% b/b) X ± SD

Fraksi etil asetat 0,25%

40x

0,246 0,2107 3,376

3,302 ± 0,0806 0,243 0,2071 3,313

0,238 0,2010 3,216

Dengan kadar flavonoid sebesar 3,302 ± 0,0806 sudah dapat memberikan

aktivitas antioksidan sebesar 69,39 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa flavonoid


78

yang berada dalam fraksi etil asetat dapat memberikan kontribusi sebagai

antioksidan.

Untuk mengetahui kepastian dari flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil

asetat buah ketapang dapat diketahui dengan menggunakan pendekatan

perhitungan serapan jenis (A1%,1cm). Dengan perhitungan serapan jenis, dapat

diketahui serapan jenis untuk flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat

berbeda atau tidak dengan serapan jenis untuk kuersetin. Serapan jenis

(A1%,1cm) adalah serapan dari larutan 1 % zat terlarut dalam sel dengan

ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada panjang gelombang tertentu dalam suatu

pelarut merupakan sifat dari zat terlarut (Anonim, 1995). Data serapan jenis yang

diperoleh diuji dengan uji Kolmogorov-Smirnov untuk melihat kenormalan

distribusi data. Hasil analisis menunjukkan bahwa data terdistribusi normal

dengan nilai p > 0,05 yaitu sebesar 0,052, maka analisis dapat dilanjutkan dengan

uji Anava satu arah dengan taraf kepercayaan 95 %. Uji ini dilakukan untuk

mengetahui apakah ada perbedaan antar kelompok. Uji Anava satu arah memiliki

p < 0,05 yang menunjukkan adanya perbedaan antar kelompok. Karena nilai p =

0,180, maka flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat buah ketapang tidak

berbeda dengan kuersetin.


79

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

1. Kesimpulan

1. Fraksi etil asetat buah ketapang memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang

dapat diketahui dari nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil yang

dinyatakan sebagai ES50 adalah 69,39µg/mL.

2. Kadar flavonoid total fraksi etil asetat buah ketapang sebesar 3,302 %b/b

ekivalen kuersetin.

2. Saran

1. Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat buah ketapang

dengan metode yang lain seperti metode penangkapan radikal DPPH.

2. Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi lebih lanjut untuk mengetahui senyawa

flavonoid yang terkandung di dalam fraksi etil asetat buah ketapang.

3. Perlu dilakukan identifikasi jenis flavonoid (dengan melihat struktur) yang

terkandung dalam fraksi etil asetat dengan spektrofotometri massa dan NMR.

79


80

DAFTAR PUSTAKA Amarowicz, R., Naczk, M., dan Fereiodon, Shahidi., 2000, Antioxidant Activity

of Crude Tannins of Canola and Repessed Hulls, JAOCS, 77, 957-961 Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,

Jakarta Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid V, 482-485, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, 9-12,

Departemen Kesehatan RI, Rektorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Direktorat Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta Anonim, 2006a, Sea Almond Tree,

http://www.naturia.per.sg/buloh/plants/sea_almond.htm. Diakses pada 13 Oktober 2006

Anonim, 2006b, Terminalia Catappa,

http://en.wikipedia.org/wiki/Terminalia_catappa, Diakses pada 13 Oktober 2006

Backer, C.A., and Brink, R.C. Bakhuizen van den., 1965, Flora of Java

(Spermatophytes Only), volume I, Published Der The Auspices of The Ruksherbakiu, Wolters Noordhoff, NVP, Groningen De Netherlands

Bast, Aalt., 1991, Oksidant and Antioksidant : State of Art, The American Journal

of Medicine, Preceeding of A Symposium Oxicant and Antioxidant : Patophysiologic Detyerminants and Therapeutics Agents, pp.25,30

Buhler, Dr. Donald R., and Miranda, Dr. Cristobal, Antioxidant Activities of

Flavonoids, The Linus Pauling Institute, Oregon State University, [email protected], diakses 30 Juni 2007

Bors, Wolf., Michel, Christa., and Stettmainer, Kurt., The Virtual Free Radical

School Flavonoids and Their Free Radical Reactions, Inst. Strahlenbiol., GSF Research Center, Neuherberg, Germany, diakses 15 April 2005

Caillet, S., Salmieri, S., dan Lacroix, M., 2006, Evaluation of Free Radical-

Scavenging Properties of Commercial Grape Phenol Extracts by A Fast Colorimetric Method, J.Food Chem., 95, 1-6



http://en.wikipedia.org/wiki/Terminalia_catappa

mailto:[email protected]

81

Chyau, Charng-Cherng., Tsai, Shu-Yao., Ko, Pei-Tzu., 2002, Mau, Jeng-Leun., Abstract: Antioxidant Properties of Solvent Extracts from Terminalia catappa leaves, J. Food chemistry, 78(4), 483-488

Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1991, Comparison of The

Antioxidative of Some Acid Phenols : Structure Activity Relathionship, Biosci. Biotech. Biochem., 5 (2), 324-325

Davidek, 1997, in Macek, K., 1972, Pharmaceutical Ahallications Of Thin Layer

Chromatography, 569, 608-611, Elseiver Publishing Company, Amsterdam, London, New York

Dewi, Aprilliana Sari., 2006, Uji Antioksidan Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Air

Ekstrak Etanol Teh Hijau Melalui Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, 119-220,

diterjemahkan oleh Pujaatmaka, A.H., edisi ke 3, Penerbit Erlangga Jakarta

Fouad, T., 2005, Antioxidant, Nature and Chemistry,

http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant, diakses tanggal 25 juni 2005

Gilman, Edward F., and Watson, Dennis G., Terminalia catappa - Tropical

Almond, Fact Sheet ST-626, Environmental Horticulture department, Florida Cooperative Department, diakses tanggal 13 Oktober 2006

Giorgio, P., 2000, Flavonoid as Antioxidant, Journal National Product, 63: 1035-

1042 Grittter, R., Bobbit, J.M., dan Schwarting, A., 1991, Pengantar Kromatografi, 7-

25, diterjemahkan oleh Padwaninata, K., Penerbit ITB, Bandung Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., and Auroma, O.I., 1987, The Deoxyribose

Method : A Simple ‘Test-Tube’ Assay for Deteminations of Rate Constants for Reaction of Hydroxyl Radical, Anal. Biochem, 165, 215-219, Academic Press, London

Halliwell, B, 1991, Reactive Oxigent Spesies In Living System : Source

Biochemistry and Role in Human Disease, The American Journal of Medicine, Preceeding of A Symposium Oxicant and Antioxidant : Patophysiologic Detyerminants and Therapeutics Agents, pp.3, 12, 20


http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant

82

Halliwel, B. dan Auroma O.I., 1993, DNA and Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd ed, 1-231, 353-425, Oxford University Press Inc., New York

Halliwell, B., and Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and

Medicine, Third Edition, 368-369, Oxford University Press, New York Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan,

Ed. 2, 47-109, diterjemahkan oleh Padwaninata, K., Penerbit ITB, Bandung

Hertiani, T., 2000, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Antioksidan dari

Daun Plantago major L., Tesis, Program Pasca Sarjana UGM, Yogyakarta

Kahkonen, M.P., Hopia, A.I., Vuorela, H.J., Rauha, J.P., Pihlaja, K., Kujala, T.S.,

dan Heinomen, M., 1999, Antioxidant Activity of Extract Containing Phenolic Compounds, J. Agric. Food Chem., 47, 3954-3962

Kikuzaki, H., Hasimoto, M., Hirose, K., Akiyama, K., dan Taniguchi, H., 2002,

Antioxidant Properties of Ferulic Acid and Its Related Compounds, J Agric. Food Chem., 50, 2161-2168

Kumalaningsih, Sri., 2007, Antioksidan Alami, Penangkal Radikal Bebas, 2-22,

Trubus Agrisarana, Surabaya Kunchandy, Elizabeth., and Rao, M.N.A., Oxygen Radical Svavenging Activity

of Curcumin, International Journal of Pharmaceutics, 58(1990), 237-240

Lin, Chun-Ching., Hsu, Yu-Fang., Lin, Ta-Chen., Hsu, Hsue-Yin., 2001, Abstract:

Antioxidant and Hepatoprotective Effects of Punicalagin and Punicalin on Acetaminophen-Induced Liver Damage in Rats, Phytoterapy Research, 15 (3), 206-212

Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic

Identification of Flavonoid, 1-343, Springe-Verlag, New York Madhujith, T., and Fereiodon, Shahidi., 2005, Antioxidant of Pea Beans

(Phaseolus vulgaris L.), J.Food Sci., 70(1), S85-S90 Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, 1-103, diterjemahkan

oleh Padwanita, K., Penerbit ITB, Bandung


83

Mulja, M., dan Suharman., 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya

Nagappa, A.N., Thakurdesai, P.A.,Venkat Rao, N., Singh, Jiwan., 2006,

Antidiabetic Activity of Terminalia Catappa Fruits, J. of Ethnopharmacology, 88, 45-50

Nusarini, Ni Made Rahayu., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat

Ekstrak Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Percival, Dr. Mark., 1998, Antioxidant, Advanced Nutrition Publication, Inc. Pokorni, J., Yanishilieva, N., and Gordon, M., 2001, Antioxidant in Food,

Practical Ahallications, 1-123, Wood Publishing Limited, Cambridge England

Purwantoko, Ardhyan., 2006, Validasi Metode Deoksiribosa sebagai Uji

Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Vitamin C secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Robert, K.M, 1990, Harper’s Biochemistry, 20th edition, Pretice Hall International

Inc, USA, pp 138,139,228 Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 191-213,

diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung Sastrohamidjojo, 2001, Spektroskopi, Edisi Kedua, 39-42, Liberty, Yogyakarta Setyawati, Leny., 2006, Uji Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Fraksi Etil

Asetat dan Fraksi Air Ekstrak Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Silva, Lee, and Kinghorn, 1998, Special Problems with The Extraction of Plants,

in Cannel, R.J.P. (Ed), Natural Product Isolation, 343-351, Humana Press Inc., New Jersey

Silverstein R.M. dab Bassler, 1991, Spectrometric Identification of Organic

Compounds, John Willey And Sons, Inc., New York Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental

Analysis, 5th Ed, 11-14, 314-344, Harcourt Brace College, Philadelphia Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Mikroskopi (terjemahan), 3-17, 241-252,

Penerbit ITB, Bandung


84

Supardjan, A. M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Uraiannya dalam

Sediaan Tetrasiklin secara KLT Densitometri, Laporan Penelitiani, Lembaga Penelitian, Penerbit Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Syahbana, D dan Bahalwan, R.R., 2002, Seri Referensi Herbal: Pesona

Tradisional dan Ilmiah Buah Mengkudu (Morinda citifolia L.), 5-20, Salemba Medika, Jakarta

Thompson, Lex A.J., Evans, Barry., Terminalia Cattappa (tropical almond),

www.traditionaltree.org, diakses tanggal 13 April 2006 Wardani, T., 2003, Pengaruh Penambahan EM-4 (Effective Microorganism-4)

terhadap Kadar Kurkumin pada Maserasi Rimpang Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yoyakarta

Wiyatsih, Esti., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Kloroform Ekstrak

Metanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta


http://www.traditionaltree.org/

85

Lampiran 1. Tabel nilai koefisien korelasi (r)

Nilai kepercayaan (r) pada beberapa taraf kepercayaan disajikan pada tabel

berikut (Muth, 1999).

Taraf Kepercayaan Derajat bebas 0,1 0,5 0,01 0,001 1 0,988 0,997 0,999 1,000 2 0,900 0,950 0,990 0,999 3 0,805 0,878 0,959 0,991 4 0,730 0,811 0,917 0,974 5 0,669 0,755 0,875 0,951 6 0,622 0,707 0,834 0,925 7 0,582 0,666 0,798 0,898 8 0,549 0,632 0,765 0,872 9 0,521 0,602 0,735 0,847

10 0,497 0,576 0,708 0,823 Lampiran 2. Perhitungan rendemen

Bobot serbuk = 150 g

Bobot ekstrak etanol = 27,07 g

%100Re xserbukbobot

kentalekstrakbobotndemen =

%100150

07,27 xgg

=

= 18,05%.

Bobot fraksi etil asetat = 4,28 g

%100Re xserbukbobot

kentalfraksibobotndemen =

%100150

28,4 xgg

=

= 2,85%.


86

Lampiran 3. Gambar kromatogram uji kualitatif flavonoid

Pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air

(4:1:5) v/v, pengembangan: 10 cm.

Deteklsi: A: uap amonia, B: besi (III) klorida


1 2

hRf

A

hRf

a b c

1 2

B

Lampiran 4. Contoh perhitungan % scavenging fraksi etil asetat buah ketapang

Rumus yang menyatakan besar penangkapan radikal hidroksil :

%100%tan

tantan xAbsorbansi

AbsorbansiAbsorbansiScavenging

kontrollaru

sampellarukontrollaru −=

% Scavenging

%51,46%1001,071

0,542-1,071 mg/ml 0,033 iKonsentras == x

%66,49%1001,071


%83,52%1001,071



87

%61,56%1001,071


%19,59%1001,071


Lampiran 5. Perhitungan nilai ES50 fraksi etil asetat

Persamaan regresi linear dari % scavenging

Y = 96,711 X + 43,289

Y = aktivitas antioksidan

X = konsentrasi fraksi etil asetat

ES50 adalah nilai X pada saat Y = 50

711,96289,43−

=YX

711,96289,4350 −

=X

X = 0,06939 mg/mL

= 69,39 µg/mL

Lampiran 6. Contoh perhitungan kadar flavonoid fraksi etil asetat

Data penimbangan sampel fraksi etil asetat replikasi 1

Neraca Bobot Fraksi (g) Analytical balance

Wadah 27,6264 Wadah + zat 27,6514

Semi micro balance Wadah 27,63255 Wadah + zat 27,65759

Zat 0,02494


88

Mula-mula 25 mg ad 100 ml 0,025 g/100 mL

Diambil 250 µL ad 10 mL 0,00625 g/100 mL = 6,25 mg/100 mL

Konsentrasi fraksi etil asetat 6,25 mg%

Absorbansi = 0,246

Persamaan regresi linear dari kurva baku kuersetin

Y= 0,821 X + 0,073

Y = absorbansi larutan

X = kadar flavonoid ekivalen dalam mg%

821,0073,0−

=YX

821,0073,0246,0 −

=X

X = 0,2107 mg %

%100xasetatetilfraksikadar

flavonoidkadartotalflavonoidKadar =

%100%25,6

%2107,0 xmg

mgtotalflavonoidKadar =

= 3,376 %

Lampiran 7. Perhitungan A (1%, 1 cm)

Serapan jenis (A 1%, 1 cm) adalah serapan dari larutan 1 % zat terlarut dalam sel

dengan ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada panjang gelombang tertentu dalam

suatu pelarut merupakan sifat dari zat terlarut. Jika a adalah daya serap.


89

cbAa.

=

A 1% = a x BM

A = absorbansi

a = serapan jenis

b = tebal kuvet = 1 cm

c = konsentrasi (mg %)

Untuk Kuersertin 1

BM = 338,27

c = 0,2448 mg %

A = 0,248

cbAa.

=

%2448,01248,0

mgcma

×=

a = 1,01307cm-1 mg %-1

A (1%, 1 cm) = a x BM

= 1,01307 x 338,27

= 342,691

Untuk Kuersertin 2

BM = 338,27

c = 0,4080 mg %


90

A = 0,417

cbAa.

=

%4080,01417,0

mgcma

×=

a = 1,02206 cm-1 mg %-1

A (1%, 1 cm) = a x BM

= 1,02206 x 338,27

= 345,732

Untuk Kuersertin 4

BM = 338,27

c = 0,2448 mg %

A = 0,284

cbAa.

=

%2448,01284,0

mgcma

×=

a = 1,16013 cm-1 mg %-1

A (1%, 1 cm) = a x BM

= 1,16013 x 338,27

= 392,437

Untuk flavonoid fraksi etil asetat replikasi 1

BM = 338,27

c = 0,2107 mg %


91

A = 0,246

cbAa.

=

%2107,01246,0

mgcm a

×=

a = 1,16754 cm-1 mg %-1

A (1%, 1 cm) = a x BM

= 1,16754 x 338,27

= 566,738


BM = 338,27

c = 0,2071 mg %

A = 0,243

cbAa.

=

%2071,01243,0

mgcma

×=

a = 1,17335 cm-1 mg %-1

A (1%, 1 cm) = a x BM

= 1,17335 x 338,27

= 396,909


BM = 338,27

c = 0,2010 mg %


92

A = 0,238

cbAa.

=

%2010,01238,0

mgcma

×=

a = 1,18408 cm-1 mg %-1

A (1%, 1 cm) = a x BM

= 1,18408 x 338,27

= 400,539

Jenis flavonoid A c a A (1%, 1 cm)

Kuersetin 1 0,248 0,2448 1,01307 342,691

Kuersetin 2 0,284 0,2448 1,16013 392,437

345,732 Kuersetin 4 0,417 0,4080 1,02206

Fraksi replikasi 1 0,246 0,2107 1,16754 566,738



NPar Tests One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

6407.507782.17024

.367

.367-.215.899.394

NMeanStd. Deviation

Normal Parametersa,b

AbsolutePositiveNegative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov ZAsymp. Sig. (2-tailed)

SRPN

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.


93

Oneway

Descriptives

SRPN

3 360.2867 27.8844916 16.09912 291.017750 429.555584 342.6910 392.43703 454.7287 97.0199067 56.01447 213.717858 695.739476 396.9090 566.73806 407.5077 82.1702518 33.54586 321.275276 493.740057 342.6910 566.7380

1.00002.0000Total

N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound

95% Confidence Interval forMean

Minimum Maximum

Test of Homogeneity of Variances

SRPN

7.477 1 4 .052

LeveneStatistic df1 df2 Sig.

ANOVA

SRPN

13378.937 1 13378.937 2.626 .18020380.814 4 5095.20433759.751 5

Between GroupsWithin GroupsTotal

Sum ofSquares df Mean Square F Sig.


94

Lampiran 8. Foto-foto

Gambar 25. Buah ketapang

Gambar 24. Pohon ketapang

Gambar 26. Daun ketapang Gambar 27. Bunga ketapang


95

Gambar 29. Fraksi etil asetat buah ketapang

Gambar 28. Ekstrak kental buah ketapang

Gambar 30. Perkolator


96

Lampiran 9. Surat determinasi


97

Lampiran 10. Sertifikat analisis deoksiribosa

2-Deoxy-D-ribose, cell culture tested

Product Name

Product Number D5899

Product Brand Sigma

CAS Number 533-67-5

Molecular Formula C5H10O4

Molecular Weight 134.13

Storage Temp 2-8°C

TEST SPECIFICATION LOT 084K0971 RESULTS

APPEARANCE WHITE TO OFF-WHITE POWDER OFF-WHITE POWDER

CLEAR TO SLIGHTLY HAZY COLORLESS TO LIGHT YELLOW SOLUTION AT 100MG/ML IN WATER

CLEAR FAINT YELLOW SOLUBILITY

-54 TO -58 DEG (C = 1 IN WATER AT 20DEGC)

SPECIFIC ROTATION -57 DEG

PURITY BY GAS CHROMATOGRAPHY

NLT 99% 99%

CELL CULTURE TEST PASS PASS

QC RELEASE DATE AUGUST 2004


98

Lampiran 11. Sertifikat analisis rutin

Rutin hydrate, ≥95% (HPLC), powder

Product Name

Product Number R5143

Product Brand Sigma

CAS Number 207671-50-9

Molecular Formula C27H30O16 · xH2O

Molecular Weight 610.52 (anhydrous basis)


APPEARANCE YELLOW-GREEN POWDER CONFORMS

CLEAR TO SLIGHTLY HAZY YELLOW TO BROWN SOLUTION AT 50MG/ML IN PYRIDINE

SOLUBILITY CLEAR BRIGHT YELLOW

LOSS ON DRYING 5.5 TO 9.0% 6.6%

EMM = 21.8 TO 22.8 AT LAMBDA MAX 256 TO 258NM IN METHANOL

EMM = 22.5 AT LAMBDA MAX 257NM

UV-VIS SPECTRUM *

PURITY BY HPLC MINIMUM 95% 97%

* DRY BASIS

QC RELEASE DATE JULY 2003


99

Lampiran 12. Sertifikat analisis kuersetin

Quercetin dihydrate, ≥98% (HPLC), powder

Product Name

Product Number Q0125

Product Brand Sigma

CAS Number 6151-25-3

Molecular Formula C15H10O7 · 2H2O

Molecular Weight 338.27


YELLOW TO YELLOW WITH A GREEN TO BROWN CAST POWDER

APPEARANCE YELLOW POWDER

DARK RED SOLUTION AT 200 MG PLUS 4 ML OF 1 M SODIUM HYDROXIDE

SOLUBILITY CONFORMS

PURITY BY HPLC NOT LESS THAN 98% 99%

QC RELEASE DATE JANUARY 2005

PRODUCT CROSS REFERENCE INFORMATION

REPLACEMENT FOR ALDRICH #171964


100

Lampiran 12. Asam urat sebagai antioksidan

Sebagai chain breaking antioxidant, akan bereaksi dengan radikal peroksil ROO•,

dan merupakan donor elektron.


Biografi Penulis

Penulis skripsi berjudul Uji Aktivitas Antioksidan dan

Penentuan Kandungan Senyawa Flavonoid Total Fraksi Etil

Asetat Buah Ketapang (Terminalia cattapa L.) bernama

lengkap Yovita Dwi Arini. Dilahirkan pada tanggal 2 Februari

1985, di Tanjung Selor, Kabupaten Bulungan, Kalimantan

Timur. Penulis merupakan anak kedua dari enam bersaudara

pasangan MC. Putut Supriyanto H.S dan Herce Olga

Rondonuwu.

Riwayat pendidikan penulis dimulai tahun 1989 - 1991 di TK Katolik Santa Maria,

Rembang. Tahun 1991-1997 di SDK Santa Maria Rembang. Pada Tahun 1997-2000

melanjutkan di SLTPN 2 Rembang. Tahun 2000-2003 merantau ke kota Surakarta dan

menempuh pendidikan di SMU Regina Pacis ”Ursulin” Solo. Tahun 2003 penulis

melanjutkan pendidikan S1 di Fakultas Farmasi Univevrsitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Selama menjalani masa perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai kegiatan antara lain :

PSF Veronica sebagai penyanyi alto; Apotek Music ’04 sebagai sie. Publikasi dan

Dokumentasi; Panitia Pelepasan Wisuda bulan November ’04 sebagai sie. Penerima

Tamu; Panitia Bakti Sosial 5 Fakultas di Paingan; Panitia Ziarah 6 Fakultas tahun 2004

(Koordinator sie. konsumsi) dan 2005 (Bendahara); Herba Garden Team, pernah

menjabat menjadi ketua pada tahun 2005; Pharmacy Performance ’05 sebagai

Koordinator sie. Keamanan; TITRASI ’05 sebagai bendahara. Menjabat pengurus BEMF

2004-2005 sebagai bendahara 2 dan pada periode 2005-2006 menjabat sebagai bendahara

1. Pernah juga menjadi Panitia Misa Raya Mahasiswa se Jogja tahun 2004 sebagai sie.

Dekorasi. Menjadi Asisten praktikum Botani Dasar, praktikum Farmakologi dan

praktikum Analisis Sediaan Obat Tradisional selama menjalani masa perkuliahan.

101


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk fileflavonoid total fraksi etil asetat buah...

Documents