Bộ Giáo Dục Và Đào TạoTrường Đại Học Mở TPHCM

Môn học: Nhập môn công nghệ sinh học

Đề Tài

Giảng viên: TS. Võ Minh Trí Danh sách thành viên:

Nguyễn Thị Thanh Trúc 0953010809Nguyễn Thị Thanh Thảo 0953010647Hoàng Bội Yến 0953010921

1

Mục Lục

☻ Một số khái niệm quan trọng..........................3

* Vector.....................................................................3

* Plasmid...................................................................3

☻ Ti plasmid.........................................................4

* Agrobacteria tumefaciens.......................................4

* Ti Plasmid ( Plasmid Ti).........................................4

Khái niệm...................................................................4

Đặc điểm ....................................................................4

Đặc điểm cấu trúc của Ti-plasmid cải tiến.................7

Hiện tượng “ bệnh ung thư thực vật”.........................7

Ứng dụng....................................................................8

☻ Tham Khảo.......................................................9

2

I. Một số khái niệm quan trọng1. VECTOR

Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài ( gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và không gây biến đổi bộ gen của tế bào chủ.

a) Đặc Điểm Có trình tự ori (origin). Có trình tự nhận biết của RE. Có trình tự điều hòa (promotor). Có các gen đánh dấu(marker gen ). Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp và không gây biến động cho tế bào

chủ. Ngoài ra còn cần một số yếu tố và trình tự cần thiết khác.

b) Ứng dụng Tạo dòng và khuếch đại. Nghiên cứu về sự biểu hiện của một

trình tự DNA. Chuyển gen.  Sản xuất RNA. Sản xuất protein.

c) Các loại vector thường dùng Plasmid. Cosmid. Phage. Nhiễm sắc thể nhân tạo. Ti plasmid. Vector ở nhiễm sắc thể nhân chuẩn.

2. PLASMID Plasmids (thường) là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc

thể. Chúng thường hiện diện trong vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh vật có nhân

thật (eukaryote) micrometre ở Saccharomyces cerevisiae). Kích thước khoảng từ 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp),có thể là hiện diện một bản sao,

đối với plasmid lớn, cho tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào. Plasmid thường chứa các gene hay nhóm gene (gene-cassettes) mang lại một ưu thế chọn

lọc nào đó cho tế bào vi khuẩn chứa nó, ví dụ như khả năng giúp vi khuẩn kháng kháng sinh. Mỗi plasmid chứa ít nhất một trình tự DNA có vai trò là vị trí bắt đầu sao chép , mang lại cho plasmid khả năng tự sao chép độc lập với DNA nhiễm sắc thể.

*** Phân loại:Phân nhóm các plasmid dựa vào khả năng

truyền sang vi khuẩn khác của chúng Plasmid tiếp hợp (conjugative) chứa

các tra-genes, giúp thực hiện một quá trình phức tạp gọi là tiếp hợp (conjugation), chuyển một plasmid sang vi khuẩn khác.

Plasmid không tiếp hợp là những plasmid không có khả năng tự thực hiện tiếp hợp, vì thế chúng chỉ có thể được chuyển sang một vi khuẩn khác khi có sự trợ giúp (ngẫu nhiên) của plasmid tiếp hợp.

Nhóm plasmid trung gian gọi là nhóm di chuyển được(mobilisable). Chúng chỉ mang các gene cần thiết cho việc di chuyển. Những plasmid này có thể chuyển với tần suất cao khi có mặt một plasmid tiếp hợp

Phân loại plasmid dựa vào chức năng Plasmid giới tính (Fertility-(F)

plasmid), mang các tra gene, có khả năng tiếp hợp

Plasmid mang độc tính, làm cho sinh vật trở thành sinh vật gây bệnhCol-plasmid, chứa gene mã hóa cho sự tổng hợp colchicine, một protein có thể giết chết các vi khuẩn khác.

Plasmid phân hủy, giúp phân hủy các chất lạ như toluene hay salicylic acid

Plasmid mang tính kháng (Resistance-(R) plasmid), mang các gene có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hay các chất độc. Được biết dưới thuật ngữ R-factor trước khi phát hiện ra bản chất của nó là plasmid.

II. Ti plasmid

3

1. Agrobacteria tumefaciensĐể có thể hiểu rõ hơn về Ti plasmid và cơ chế của nó gây ra căn “bệnh ung thư thực vật”

chúng ta cần nghiên cứu về sự hiện diện của loài vi khuẩn Agrobacteria tumefaciens cùng với cơ chế chuyển gen của nó.

Khái niệm A.tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống trong đất, trong lĩnh vực biến

nạp gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển các gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các đặc tính mong muốn.

Đặc diểm cấu trúc của Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm

nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium gồm các loài chính sau: tumefaciens gây bệnh u sùi thân rhisogenes gây bệnh tóc rễ rubi gây u ở các loại dâu đất, mâm sôi. radiobacter sản sinh kháng sinh đặc trưng (agrocin 84) ngăn cản tác hại của các loài Agrobacterium kể trên.

2. Ti Plasmid ( Plasmid Ti)Dước đây là hình ảnh về hiện tượng hình thành khối u ( còn gọi là “ bệnh ung thư thực vật) ở một số loài thực vật mà nguyên nhân chính là do tác động của Ti plasmid có trong vi khuẩn Agrobacteria tumefaciens. Ti plasmid có những đặc điểm, cơ chế gì mà gây ra hiện tượng như thế ?

Khi xem xét các vi khuẩn A. tumefaciens, chúng cũng giống các loại vi khuẩn thông thường khác là đều chứa các plasmid (một dạng DNA vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể vi khuẩn, có khả năng nhân bản độc lập). Chắc chắn plasmid này đã chuyển vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u cho cây, do vậy người ta gọi chúng là Ti-plasmid (Tumor inducing plasmid/ plasmid gây u bướu). Ti-plasmid đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid nhập vào gen của cây.

a. Khái niệm Ti-plasmid là một plasmid lớn với kích thước khoảng 200kb, là một phần của các thiết bị

di truyền Agrobacterium tumefaciens vàAgrobacterium rhizogenes sử dụng để transduce vật liệu di truyền của nó cho cây trồng. 

b. Đặc điểm Các plasmid Ti bị mất khi Agrobacterium được trồng trên 28 ° C Ti plasmid có 196 gen mã hóa cho 195 protein. Không có một cấu trúc RNA. Plasmid có

206.479 nucleotid dài, gồm GC 56% và 81% vật liệu được mã hóa gen. Không có pseudogenes.

Trên Ti-plasmid có đoạn T-DNA (tumor DNA) được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border).

Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau. T-DNA là một đoạn có kích thước 25kb chứa các gen tổng hợp opine và đoạn này sẽ được

chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào cây chủ và gây ra bệnh u.

4

Gen trong khu vực được phân thành các operons vir ABCDEFG, trong đó mã cho các enzym chịu trách nhiệm trung gian dẫn truyền của DNA-T với các tế bào thực vật.

Vir mã số cho một thụ thể có phản ứng với sự hiện diện của hợp chất phenolic như acetosyringone, mà rò rỉ trong mô thực vật bị hư hỏng.

Vir B mã hóa protein mà tạo ra một lỗ giống như cấu trúc tiêm mao. Vir C liên kết các chuỗi xoắn. Vir D1 và vir D2 sản xuất endonucleases lặp lại biên giới nhắm mục tiêu trực tiếp của các

phân đoạn DNA-T, bắt đầu với biên bên phải. Vir G kích hoạt vir-gen biểu hiện sau khi liên hết với một chuỗi sự đồng thuận, một khi nó

đã được phosphoryl hóa bởi Vira.

5

Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng vir (vir region) chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp (conjugative transfer) và tiêu hóa opine (opine catabolism).

Quá trình chuyển nạp gen của vi khuẩn như sau: khi cây bị thương tiết ra chất độc vết thương thường là các chất có bản chất phenol: acetosyringone (AS)(hình) và hydroxyacetosyringone (OH-AS). Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng vết thương đồng thời chúng cũng hoạt hóa các gen ở vùng vir của plasmid hoạt động.

Vi khuẩn đất A.tumefaciens

Ti plasmid map

6

c. Đặc điểm cấu trúc của Ti-plasmid cải tiến Hệ thống vector đồng liên hợp

Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmid: Ti-plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium. Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa plasmid trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) nên vector này ít được sử dụng.

Hệ thống vector kép Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. Một plasmid tách dòng từ E.coli trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmid này được gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu.

d. Hiện tượng “ bệnh ung thư thực vật” Từ lâu người ta đã phát hiện hiện tượng hình thành các u ở thân khi cây bị nhiễm vi sinh vật đất A. tumefaciens qua các vết thương. Phân tích các u cho thấy trong u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octoine gọi chung là opine. Các chất này không tồn tại ở các cây bình thường khác.

Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí tổn thương trên cây hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó.

7

Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành các chất độc có bản chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl acetosyringon). Chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật. Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành khối u. Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và vùng gen ipt kích thích cho sự hình thành xytokinin. Tỷ lệ auxin/xytokinin kích thích sự hình thành callus tạo lên các khối u.

e. Ứng dụng Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ thuật chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien vẫn được ứng dụng rộng dãi là nhờ những ưu điểm sau.

• Không đòi hỏi dụng cụ đặc biệt.• Số lượng bản copy thấp và ổn định ở thế hệ con cháu.• Dễ thao tác invitro, dễ làm.• Đây là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp.

Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens1.Thiết kế vector mang gen 2. Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli.3. Chuyển vector mang gen biến nạp từ E.coli sang A.tumefaciens.4. Lây nhiễm A.tumefaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô thực vật để tiến hành quá

trình chuyển gen sang mô, tế bào đích.5. Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công.6. Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây biến nạp hoàn chỉnh.

Sau đó, từ những cây chuyển gen thu được, cần đánh giá sự ổn định di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu được con cái mang gen mong muốn. Đồng thời đánh giá tác động của môi trường đối với cây chuyển gen để đưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường.

8

III. Tham Khảo

9

http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=838http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=1925586http://www.nhasinhhoctre.com/forum/viewtopic.php?f=47&t=210http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio40.swf::The%20Ti%20Plasmidhttp://en.wikipedia.org/wiki/Ti_plasmidhttp://tailieu.vn/xem-tai-lieu/mot-so-cac-vector-ti-plasmid-lien-hop.143642.htmlhttp://www.newton.dep.anl.gov/askasci/bio99/bio99765.htmhttp://www.molecular-plant-biotechnology.info/agrobacterium-tumefaciens/Ti-plasmid-as-gene-vector.htmhttp://4e.plantphys.net/article.php?ch=t&id=216http://bioweb.wku.edu/courses/biol350/CloningVectEuk9/Review.htmlhttp://www.sccs.swarthmore.edu/users/00/aphilli1/genetics/Ti.htmlhttp://ucce.ucdavis.edu/files/repositoryfiles/ca3608p15-72271.pdf