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Virginie HUTEAU et Olivier CORITON
UMR 1349 IGEPP INRA – LE [email protected]
Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale (Axe Bio -imagerie)
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� Offre actuelle,
� Contour de la PF,
� Projets développés
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Cytogénétique Moléculaire ?
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Qu’est ce que la Cytogénétique Moléculaire ?
L’outil principal est l’Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur préparation chromosomique permet une :
« Analyse fine de la structure des chromosomes »
«Biologie moléculaire » et «Cytogénétique traditionnelle»
née de la rencontre
FISH
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Les outils de cytogénétique moléculaire permettent de développer des projets scientifiques d’études des génomes pour : :
5 Mb
1 kb
FISH
• Caractérisation cytogénétique du matériel végétal impliquant des hybrides interspécifiques ou des espèces polyploïdes : identification respectivement des introgressions ou chromosomes parentaux,
• Evolution structurale des génomes chez des espèces polyploïdes,
• Caractérisation des translocations chromosomiques par liaison entre la cartographie génétique et physique,
• Cartographie physique fine sur chromosomes en permettant la caractérisation fine de l’ordre du kb
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Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes
� Chromosomes en Mitose
� Chromosomes en Méiose
Accès aux chromosomes de plantes ?
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Préparation des lames
� Chromosomes en Mitose :
A partir de pointesde racines
Sélection des lames au DAPI
Le DAPI ou 4',6'-diamidino-2-phénylindole est une molécule fluorescente capable de se lier fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN
Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes
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4X38 chrs
3X33 chrs
2X24 chrs
4X, 28 chrs
6X, 42 chrs 8X56 chrs
2X38 chrs
2X44 chrs
2X18 chrs
# Niveau de Polyploïdie
Taille de 2-10 µm
Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes Multi-espèces
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Préparation des lames
� Chromosomes en Méiose :
Anthères
Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes
Anthère (Tomate)
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Hybridation In Situ en Fluorescence ( FISH)sur chromosomes
Leptotène Zygotène Pachytène Diplotène Diacinèse Métaphase I Anaphase I Anaphase I
Métaphase II Anaphase II Télophase II Tétrade
• Stade pachytène (les chromosomes sontappariés sur toutes leurs longueurs)
Résolution x 15
• Stade métaphase I
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Quelles sont les prestations proposées
par la Plate -Forme?
1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides
2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)
3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)
4- Caryotype : Comptage chromosomique
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Quelles sont les prestations proposées
par la Plate -Forme?
1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides
2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)
3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)
4- Caryotype : Comptage chromosomique
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Prestations proposées par la plate-forme
1- L’hybridation génomique in situ (GISH) :
Polyploïdeset
Hybrides interspécifiques ?
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A-genome
B-genomeD-genome
?
(2n=6X=42, AABBDD genome)
0,5 MYA
10000 YA
Ae. speltoides
T. urartu
Exemple 1 :
Technique GISH chez un polyploïdeLe blé tendre, Hexaploide (6X)
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chromosomes « cible »
A-probe-biotine
B-genome
D-probe-digoxgénine
Mix sondes ADN Génomiqueparentaux
Anti-dig-Fluorescéine
Avidin- Texas red
Détection Anti-corps Fluo
Hybridation
Exemple 1 :
Technique GISH chez un polyploïde
A-genome
B-genomeD-genome
?
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Filtre DAPI Filtre Fluorescein Filtre Texas Red
Exemple 1 :
Technique GISH chez un polyploïde
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Translocation4A/7B
Translocation4A/7B
Exemple 1 :
Technique GISH chez un polyploïde
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Technique GISH-like : Le COLZA, Allotétraploide
B. rapaAA, 2n=20
B. oleraceaCC, 2n=18
B. napusAACC, 2n=38
2000 YA
Exemple 2 :
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B. rapaAA, 2n=20
B. napusAACC, 2n=38
Sonde ADN répétée spécifique du génome C
B. oleraceaCC, 2n=18
Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide
Exemple 2 :
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Quelles sont les prestations proposées
par la Plate -Forme?
1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides
2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'A DN répétées (FISH)
3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)
4- Caryotype : Comptage chromosomique
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Prestations proposées par la plate-forme
6Sv5Sv5U1U
Télomérique CentromériqueADN ribosomique
(45 S rDNA + 5S rDNA)Seq rep spécifique
de génome
Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées ( FISH)
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Quelles sont les prestations proposées
par la Plate -Forme?
1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides
2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)
3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC- FISH)
4- Caryotype : Comptage chromosomique
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Prestations proposées par la plate-forme
Remaniements structuraux : localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et e n méiose
(BAC- FISH)
ADN Génomique
Fragmentation par sonication ~ 150 kb
Caractérisation de délétion, translocation
Banque BAC
Banque BAC inserts ~ 100-150 kb
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Quelles sont les prestations proposées
par la Plate -Forme?
1- L’hybridation génomique in situ (GISH) permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures polyploides ou hybrides
2- Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)
3- Localisation physique de clones BAC génétiquement ancrés sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC- FISH)
4- Caryotype
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Prestations proposées par la plate-forme
Caryotype : Comptage chromosomique
Iris Spartine Rose
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Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale
• Equipement / Personnel• Conditions d’accès• Cout des prestations• Formations• Démarche Qualité
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Plate-Forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale
INRA - UMR 1349 « Institut de Génétique, Environnement et Protection des
Plantes » (IGEPP) - 35653 LE RHEU
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1- Équipements
• Laboratoire de Cytogénétique Moléculaire
• Microscopie
• Système d'imagerie
� Caméra refroidie (Photometrics Cool SNAP HQ)
� Logiciel d'acquisition (METAVUE et ZEN)
� Deux microscopes à Epifluorescence Zeiss
2- Personnel Permanent
2000
2015
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La plate-forme étant ouverte à 50% de sa capacité vers les équipes de recherche extérieures
Site web - Un appel d’offre accompagné d’une plaquette de présentation
3- Accès
Pour la prise en charge des prestations en fonction des demandes,nous avons deux niveaux d’engagement :
� soit nous répondons à une prestation complète,
� soit nous accueillons du personnel des unités demandeuses.
http://www6.rennes.inra.fr/igepp/L-IGEPP/Plateformes/Cytogenetique-moleculaire
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• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétée (FISH)= 40 Euros/lame
• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux = 45 Euros/lame
• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'ADN peignées (BAC Fiber-FISH) = 40 Euros/lame
• Localisation physique de clones BAC sur les chromosomes (BAC-FISH)sur chromosomes en mitose et en méiose (stade pachytène)
= 40 Euros/lame
4- Cout des prestations
� Forfait Semaine 500 € HT
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La plate-forme a également une mission de formation et d'information auprès des chercheurs, techniciens et stagiaires pour un transfert de technologie.
� Sur Bananier - Afin de caractériser des translocations, le BAC-FISH a été mis au point sur la plate-forme de cytogénétique de Montpellier
-> optimiser les techniques de marquage des clones BAC et de détection
� Sur Caféier diploïde ( C. canephora ), nous avons pu mettre au point et former du personnel à la technique du BAC-FISH
5- Formations
Exemples :
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6- Qualité
La PF est adossée à la démarche qualité mise en place par l’unité sous l’animation de deux groupes de travail « AQR » et « Métrologie » en lien avec un animateur qualité suivant le référentiel INRA (ISO 9001).
Les principales actions « qualités » mises en œuvre sur la PF ont été :
(1) Mise en place des cahiers de laboratoires,
(2) Rédaction des Modes Opératoires,
(3) Document unique OPPI (Outil de Pilotage de la Prévention à l’INRA),
(4) Métrologie : Contrôle des températures (Frigo, Congélateur, Etuve) (OCEASOFT)Contrôle des balancesContrôle annuel des micropipettes METTLER TOLEDO
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Apport de la Cytogénétique Moléculaire aux programmes de séquençage des génomes
chez les Plantes (1) :Identification de réarrangements structuraux
Equipe - Biodiversité et Polyploïdie
Décrire et structurer la diversité génétique, l’exploitervia la recombinaison homologue et homéologue
Plate forme de cytogénétiqueMoléculaire
50%
Mathieu Rousseau, Anne-Marie Chèvre
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(AACC, 2n=4X=38)
Espèces diploïdes
Espèces Tétrapolyploïdes
Stratégies :
Synthétiques
[1] COLZA : Quels sont les mécanismes de spéciation ?
� Suivi des modifications structurales qui interviennent dans les génomes lors du choc génomique d’espèces allopolyploïdes
4X4X
1+1=2 ?
2000 ans
Science. 2014 Aug 22;345(6199):950-3.
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Quelles sont les différences entre un colza synthéti que et un colza naturel ?
B. Rapa (Navet)AA, 2n=2X=20
B. Oleracea (choux)CC, 2n=2X=18
AACC, 2n=4X=38
B. Napus (colza)
S0
1- Modifications structurales : Le GISH-like a montré d’des irrégularités méiotiques avec des appariementsentre les chromosomes (homologues et homeologues) desgénomes A et C permettant la formation de translocations.
x
AA
CC
AA
CCAA
CC
AA
CCAA
CC
AACC
CC
CC
AA AA
ACAC
AA
Faible stabilité méiotique (6-50% des cellules avec
univalents ou multivalents)
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Quelles sont les différences entre un colza synthéti que et un colza naturel ?
- Puces Illumina (SNP)
- NGS DNA Seq
BAC 43F18 (A9/C8) : 4 signaux
• Translocation A/C (hétérozygote) : non visible avec
les puces SNP
18 chrs C-genome
Caractérisation des réarrangements par BAC- FISH
Données :
Identification de réarrangements structuraux importants chez les colzas synthétiques : jusqu’à 4% du génome remanié en 3 générations
Identification de réarrangements structuraux importants chez les colzas synthétiques : jusqu’à 4% du génome remanié en 3 générations
Pour la caractérisation des réarrangements chromosomiques par BAC-FISH chez le Colza : 15 BAC permettent d’identifier les 38 chrs
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Quelles sont les différences entre un colza synthéti que et un colza naturel ?
Publications :
G3 (Bethesda). 2017 Feb 9;7(2):705-717.
Collaboration : INRA MOULONIJPB-VERSAILLES URGV-EVRY, BRNO-CZECH REPUBLIC
Ann Bot. 2017 Jan;119(1):13-26.
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Apport de la Cytogénétique Moléculaire aux programmes de séquençage des génomes
chez les Plantes (2) :Identification de réarrangements structuraux
EquipePlate forme de cytogénétique
Moléculaire
50%
Guillaume Martin , Franc-Christophe Baurens, Paco Derouault, Gaëtan Droc, Mathieu Rouard, Angélique D’Hont
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Objectif est de mieux comprendre la structure et l’ organisation de génomes complexes en particulier polyploïdes, le ba nanier.
Identification de réarrangements structuraux par BAC-FISH : Chromosomes transloqués
(chr01-chr04)?
Nature. 2012 Aug 9;488(7410):213-7
BMC Genomics. 2016 Mar 16;17:243
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Quelques exemples de projets développés en collaboration
avec des équipes extérieures
Cytogénétique Moléculaire chez les plantes?
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La plate-forme est ouverte à 50% de sa capacité pour des projets extérieurs :
INRA- EvryMUSEUM- ParisINRA- Versailles
INRA, CNRSUniv- Rennes INRA- Colmar
INRA- Angers
INRA- Bordeaux
INRA- Clermont-Fd
INRACIRADIRD Montpellier
INRA- Toulouse
INRA- Lusignan
A. Mason, M. Nelson University of Queensland Brisbane – AUSTRALIA
G. King, C. Ryder– Univ Warwick - UK
A. Kovarik, Academy of Sciences, Brno – CZECH REPUBLIC
R. Freuda-Agyeman, H. Rahman - University of AlbertaCANADA
PFMCV
R. Snowdon , A. Stein University Giessen, - ALLEMAGNE
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PROJETS : Structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes ?
Projets : Etude des mécanismes de stabilisation d’un polyploide,
Brachypodium à partir de synthétiques
UR Génomique Végétale (URGV) - EVRY (B. CHALHOUB et Vinh Ha DINH THI PHD student )
PLoS One. 2016 Dec 9;11(12):e0167171
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Projet 1: Evaluation de l’implication des rétrotransposons dans la variation de la taille des génomes chez des espèces de lupins écologiquement divergentes
UMR CNRS 6553 Ecobio « Evolution des Genomes et Spec iation – RENNES
(Malika AINOUCHE)
Projet 2 : Detect the different copies in the ribosomal RNA gene family in the hexaploid grass Spartina maritima from next-generation sequencing (Roche-454) reads
PROJETS : Dynamique des génomes chez des espèces polyploïdes- Eléments Transposables
G3 (Bethesda). 2015 Nov 3;6(1):29-40
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• Les remaniements chromosomiques observés chez les Téléostéens notothénioïdes impliquent-ils une mobilisation des DIRS et des Gypsy, deux types de rétrotransposons, lors de stress environnementaux ?
PROJETS : Evolution structurale des génomes chez de s espèces polyploïdes- Eléments Transposables
« Painting probe »
Microdissection de chromosomes
UMR 7138, IBPS, UPMC/CNRS Laboratoire « Evolution d es génomes Eucaryotes» et service de Cytogénomique Paris (D. HIGUET, C. OZOUF)
Thèse en cours J. AUVINET
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PROJETS : Cartographie physique fine de locus sur chromosomes
Projet : Localisation par BAC-FISH des gènes codants pour les cytochromes P450 chez le Panais
UMR1121 INRA- NANCY (Sandro ROSELLI, Fréderic BOURGAUD, Alain HEH N)
Plant J. 2017 Mar;89(6):1119-1132
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Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire
Végétale ( )
http://www.biogenouest.org/contenu/plates-formes/bio-imagerie/cytogenetique
http://www6.rennes.inra.fr/igepp/L-IGEPP/Plateformes/Cytogenetique-moleculaire