MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

ÚSTAV CHEMIE

ANALÝZA KOSTERNÍCH

POZŮSTATKŮ POMOCÍ

LASEROVÉ ABLACE

Diplomová práce

Lenka Tenorová Vedoucí práce: Mgr. Michaela Vašinová Galiová, Ph.D. Brno 2013

2

Bibliografický záznam

Autor: Bc. Lenka Tenorová

Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita

Ústav chemie

Název práce: Analýza kosterních pozůstatků pomocí laserové ablace

Studijní program: Chemie

Studijní obor: Analytická chemie

Vedoucí práce: Mgr. Michaela Vašinová Galiová,Ph.D.

Akademický rok: 2012/2013

Počet stran: 112

Klí čová slova: Zub, LA-ICP-MS, diageneze, výživa, migrace, stopové

prvky, stabilní izotopy

3

Bibliographic Entry

Author Bc. Lenka Tenorová

Faculty of Science, Masaryk University

Department of chemistry

Title of Thesis: Analysis of skeletal remains using laser ablation

Degree programme: Chemistry

Field of Study: Analytical chemistry

Supervisor: Mgr. Michaela Vašinová Galiová, Ph.D.

Academic Year: 2012/2013

Number of Pages: 112

Keywords: Tooth, LA-ICP-MS, diagenesis, diet, migration, trace

elements, stable isotopes

4

Abstrakt

Studium migrace/mobility a výživy lidí a zvířat patří k jedné z nejdůležitější oblastí

studovaných v archeologii. Kosterní pozůstatky s hydroxyapatitovou matricí představují

výborný archiv těchto informací, které mohou být získány izotopovou analýzou přímo

pevného materiálu. Diplomová práce je zaměřena na analýzu kosterních pozůstatků pomocí

metody LA-ICP-MS. Byla provedena analýza osmi vzorků stálých lidských zubů

pocházejících z různých nalezišť. Cílem bylo studium distribuce prvků v různých částech zubů

(sklovina, dentin a cement) a stanovení obsahů Sr, Ba, Zn, P, a Ca a jejich poměrů. Za tímto

účelem byly připraveny 2D mapy rozložení stanovovaných prvků v analyzovaných vzorcích.

Kroky vedoucí k získaným výsledkům zahrnovaly analýzu vzorků ve formě výbrusu

i nábrusu. Z toho pohledu je diskutováno použití liniového skenu a také ablace jednotlivých

bodů. LA-ICP-MS analýza byla provedena tak, aby byly minimalizovány náklady spojené

s analýzou a bylo dosaženo dostatečného prostorového rozlišení.

Abstract

Study of migration/mobility and diet of humans and animals belongs to important areas in

archaeology. Skeletal remains with hydroxyapatite matrix represent excellent archive of this

information which can be revealed via isotope analysis of solid samples. This diploma thesis is

focused on study of tooth samples by LA-ICP-MS. Eight permanent human tooth samples

originating from various localities were analysed. The aim of this study was to obtain

elemental distributions in different parts of tooth (enamel, dentine and cementum) and

determine Sr, Ba, Zn, P and Ca contents and their ratios. For this purpose, 2 dimensional maps

were created. Laser sampling of studied materials embedded into the epoxy resin as well as

thin slices of tooth fixed on the glass was performed by line scan and ablation of individual

spots. The general objective of LA-ICP-MS analysis was to minimize costs and achieve

sufficient spatial resolution.

5

6

7

Poděkování

Z celého srdce bych ráda poděkovala mé vedoucí diplomové práce Mgr. Michaele

Vašinové Galiové, Ph.D. za její trpělivost, ochotu, vstřícnost, odborné rady při konzultaci

výsledků, pomoc při měření a zvláště za její věnovaný čas mé osobě. Dále bych chtěla

poděkovat RNDr. Miriam Nývltové Fišákové, Ph.D. za poskytnuté vzorky, odborné rady

a fotografie získané pod polarizačním mikroskopem, Mgr. Renatě Čopjakové, Ph.D. za

výsledky z analýz elektronovou mikrosondou a Mgr. Radkovi Škodovi, Ph.D. za informace

získané pomocí SEM. Svému odbornému konzultantovi Mgr. Ing. Lubomírovi Prokešovi

děkuji za ochotu a cenné rady při interpretaci výsledků. V neposlední řadě bych ráda

poděkovala Bc. Mgr. Simoně Huškové za pomoc při měření, Mgr. Tomášovi Vaculovičovi,

Ph.D. a paní Libuši Plchové.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím

informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 24. května 2013 ………………………………

Jméno Příjmení

8

Obsah

1 ÚVOD .............................................................................................................................. 10

2 TEORETICKÁ ČÁST...................................................................................................... 11

2.1 ZUBY....................................................................................................................... 12

2.1.1 Obecná charakteristika zubů ............................................................................ 12

2.1.2 Stavba zubu ...................................................................................................... 12

2.1.3 Vývoj zubů ....................................................................................................... 13

2.1.4 Chemické složení zubů..................................................................................... 15

2.1.5 Distribuce prvků v zubech................................................................................ 16

2.1.6 Faktory ovlivňující chemické složení zubů...................................................... 17

2.2 PRVKY VYUŽÍVANÉ V ARCHEOLOGII............................................................ 18

2.2.1 Stroncium a baryum ......................................................................................... 18

2.2.2 Zinek................................................................................................................. 20

2.2.3 Uhlík................................................................................................................. 20

2.2.4 Dusík ................................................................................................................ 21

2.2.5 Kyslík ............................................................................................................... 21

2.2.6 Olovo................................................................................................................ 22

2.2.7 Síra ................................................................................................................... 22

2.3 DIAGENEZE ........................................................................................................... 23

2.4 ANALÝZA ZUBŮ................................................................................................... 24

2.5 VYUŽITÍ LA-ICP-MS V ANALÝZE ZUBŮ ......................................................... 25

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST............................................................................................ 29

3.1 Popis zařízení ........................................................................................................... 30

3.1.1 Laserová ablace ve spojení s hmotností spektrometrií indukčně vázaného plazmatu .......................................................................................................................... 30

3.1.2 Elektronová mikrosonda .................................................................................. 31

9

3.2 Vzorky...................................................................................................................... 31

3.3 Experimentální podmínky ........................................................................................ 33

3.4 Vyhodnocení signálu................................................................................................ 34

3.5 Kvantifikace ............................................................................................................. 34

4 Literatura .......................................................................................................................... 36

10

1 ÚVOD

Archeologové se při určování složení potravy a sledování migrace často zaměřují na

stanovení obsahů některých prvků a poměrů stabilních izotopů v kalcifikovaných tkáních.

Z hlediska vyhodnocování druhu potravy jsou nejčastěji studovány obsahy prvků Ca, P, Sr,

Ba a Zn a jejich poměry.

Tyto prvky jsou během života daného jedince zabudovávány do tkání, jako jsou zuby a kosti

v závislosti na jejich množství v přijímané potravě. Zuby jsou častěji než kosti předmětem

zájmu vědců, protože různé části zubů odráží odlišné etapy života. Sklovina se začíná utvářet

v prenatálním stavu a je dokončena až několika let po narození. Její složení se v dalším

období nemění. Dentin se naopak remodeluje během celého života jedince a jeho analýza

odráží stravu posledních 10 let.

V poslední době patří v souvislosti s analýzou zubů mezi nejvíce používané metody laserová

ablace ve spojení s hmotnostní spektrometrií indukčně vázaného plazmatu, která je schopná

poskytovat přesné a správné výsledky izotopových poměrů a multiprvkové analýzy. Jako

analyzátor je často využíván kvadrupól, který je výhodný z hlediska pořizovacích nákladů, ale

na druhou stranu neposkytuje dostatečnou přesnost nutnou například pro určení poměru 87Sr/86Sr využívaného při určování migrace.

Tato práce se zabývá rozložením vybraných prvků ve fosilních lidských zubech a navazuje na

moji bakalářskou práci, ve které bylo zkoumáno využití kvadrupólové ICP-MS ve spojení

s laserovou ablací pro sledování distribuce vybraných prvků v zubech. Analýzy však byly

provedeny na velké ploše vzorku, což představovalo nemalé finanční náklady. Cílem této

navazující studie je tedy snížení nákladů potřebných na provedení analýzy při zachování

objemu získaných informací a optimalizace podmínek pro dosažení lepšího prostorového

rozlišení, které je nutné k odlišení různých částí zubu (sklovina a dentin). Dalším

předpokládaným výsledkem je zhodnocení možnosti využití vzorků připravených ve formě

tenkých plátků, tzv. výbrusů. Výbrusy mají lepší optické vlastnosti a lze je použít k určení

přítomnosti skloviny nebo stáří daného jedince základě počtu přírůstkových linií v cementu

pomocí polarizačního mikroskopu.

11

2 TEORETICKÁ ČÁST

12

2.1 ZUBY

2.1.1 Obecná charakteristika zubů

Jedná se o porcelánově bílé až nažloutlé tvrdé útvary v dutině ústní. Soubor všech zubů je

označován jako chrup, je heterodontní, což je dáno morfologickými rozdíly mezi zuby

zejména při vytváření korunky a kořene. Jsou rozeznávány čtyři typy zubů – řezáky, špičáky,

zuby třenové a stoličky. Každý zub se skládá z korunky, krčku a kořene.1

2.1.2 Stavba zubu

Zub je tvořen ze skloviny, dentinu a cementu, což jsou druhy tvrdých zubních tkání. Uvnitř

zubu se nachází měkká zubní dřeň (obr. č. 1).2

• Sklovina - v místě zubní korunky pokrývá dentin, často kryje i části zubního krčku,

kde je nejtenčí.1, 2

• Dentin - tvoří nejsilnější vrstvu zubu a jedná se tedy o jeho základní stavební část.

Vznik dentinu je spojen s činností odontoblastů na povrchu zubní dřeně.1 Dvě základní

složky dentinu jsou - jemné kolagenní fibrily a základní interfibrilární hmota.

V dentinu jsou dále přítomny dentinové tubuly, jimiž proudí tekutina.2

• Cement - v oblasti kořene pokrývá zub nejtlustší vrstva cementu, která se směrem

k zubnímu krčku ztenčuje.1

• Zubní dřeň - hlavní funkcí je tvorba a regenerace dentinu.2

13

Obr. 1: Stavba zubu - upraveno podle3

2.1.3 Vývoj zubů

Vývoj zubů je geneticky daný proces, který začíná už v prvních embryonálních týdnech

a končí až v dospělosti.4 Nejprve je fáze růstu, kdy se tvoří zárodky zubů a skloviny

a postupně se tvaruje korunka a kořen. Poté nastává mineralizace a nakonec dochází

k prořezání zubů.5

Sklovina je vyvíjena a kalcifikována kontrolovaně v podobě pravidelných prstencových

přírůstků. Jakmile se sklovina vytvoří, tak už není dále podrobována minerální resorpci.

Vysoce kalcifikované jsou také dentin a cement.6

Mineralizace dentinu probíhá za tvorby růstových linií periodicky v intervalech a není tedy

plynulá jako u skloviny. Při vývoji zubu vzniká primární dentin, který se tvoří do ukončení

vývoje kořene. Dále se po celý život tvoří sekundární dentin.7 S přibývajícím věkem se plní

dentinové kanálky solemi vápníku a dochází k přeměně na dentin sklerotický (transparentní).

Při výskytu zubního kazu se jeho tvorba urychluje. V reakci na výskyt například zubního

kazu, abraze a tepelného poškození vzniká terciární dentin. Ten nahrazuje ztracený dentin a je

více odolný proti demineralizaci.2

14

U savců se vyvíjí zuby mléčné a zuby stálé. Vývoj mléčných zubů probíhá po dobu 2 – 4 let,

zatímco stálé zuby se vyvíjí zhruba 10 let. U stálých zubů může docházet k dotvoření kořene

až za tři roky po prořezání zubů.5

Zuby mléčné (dočasné)

Mléčný chrup tvoří 20 zubů, které mají tenčí a méně mineralizovanou vrstvu tvrdých zubních

tkání. Jsou tedy náchylnější k abrazi.2 Zubní sklovina u mléčných zubů začíná kalcifikovat na

konci prvního trimestru těhotenství a vyvíjí se až do prvního roku po narození. Ve stejnou

dobu se začíná formovat také dentin, který podléhá kalcifikaci asi do dvou a půl let.6 V 90 %

mléčných zubů se vyskytuje charakteristická linie odpovídající době narození. Tato linie je

označována jako neonatální linie.8

Neonatální linie

Neonatální linie se nachází ve sklovině a odděluje od sebe její prenatálně a postnatálně

vytvořené části (obr. č. 2).9

Obr. č. 2: Umístění neonatální linie (znázorněna červeně) v zubu – upraveno podle9

Rozdíly v pozici neonatální linie v zubu jsou spojeny s délkou těhotenství a s druhem zubu.

V případě kratšího těhotenství je neonatální linie posunuta směrem ke špičce zubu a je blíže

rozhraní skloviny a dentinu. Jestliže dojde k prořezání zubu později než je obvyklé, bude

neonatální linie umístěna ve dříve vytvořené vrstvě skloviny.

zubní dřeň

neonatální linie

rozhraní skloviny s dentinem

dentin

sklovina

15

Šířka neonatální linie je ovlivněna porodem, v případě přirozeného porodu je její šířka asi

12 µm, ovšem jestli je proveden císařský řez, je neonatální linie užší. Širší neonatální linie

byla zjištěna také u kojenců, jejichž matky jsou diabetičky.8 Oproti sklovině má neonatální

linie jiný směr umístění krystalů a je méně mineralizovaná.10

Zuby stálé (trvalé)

Stálý chrup tvoří 32 zubů. Korunky stálých zubů se vytváří již v době, kdy je dokončováno

prořezávání zubů mléčných. Korunky jsou tedy nejdříve kalcifikovány. Poslední stoličky

(zuby moudrosti) začínají kalcifikovat až kolem 12 let, zatímco v pátém roce jsou již ostatní

korunky kalcifikovány.1 V prvních trvalých stoličkách se může někdy vyskytovat neonatální

linie, protože tyto zuby se začínají vytvářet na konci těhotenství.11

2.1.4 Chemické složení zubů

Sklovina, dentin a cement jsou tvořeny převážně hydroxyapatitovými (Ca5(PO4)3OH)

krystaly, jejichž tvorba je pod přímou metabolickou a fyziologickou kontrolou. Místa mezi

hydroxyapatitovými krystaly jsou vyplněna organickými složkami, jako jsou proteiny a

lipidy, a vodou.6 Obsah anorganických látek ve sklovině dosahuje až 98 %hm, v dentinu činí

přes 70 %hm a v cementu je ~ 70 %hm. Dentin a cement jsou však méně odolné než sklovina.1

Vápník a fosfor jsou v zubech obsaženy v rozsahu (34 – 39) %hm pro vápník a (16 – 18) %hm

pro fosfor. Ve sklovině jsou v hydroxyapatitové matrici začleňovány různé ionty na

kationická (Ca2+) a anionická (OH-, PO43-) centra.6 Může tedy docházet k tvorbě

nestechiometrických apatitových krystalů a to vlivem nedostatku vápníku, fosfátů a

hydroxylových iontů anebo díky přítomnosti uhličitanů a hydrogenuhličitanů. Dále se může

v důsledku substitučních reakcí tvořit fluoroapatit.7 V zubech bylo zjištěno dalších přibližně

40 prvků v obsahu od ≥ 1000 mg.kg-1 (např. Zn, Sr, Fe, Al, B, Ba, Pb) do ≤ 100 µg.kg-1 (např.

Ni, Li, Ag, As, Se, Nb, Hg).6 Zjištěné obsahy některých prvků v mléčných a stálých zubech

jsou uvedeny v tabulce číslo 1.

Složení fosilních zubů je ovlivňováno geologickým prostředím, přijímanou potravou a vodou

během života, věkem a dalšími faktory.12

16

Tab. č. 1: Zjištěné průměrné obsahy vybraných prvků v mléčných a stálých zubech13

mléčné zuby stálé zuby

Průměrný obsah (µg.g-1) průměrný obsah (µg.g-1)

Pb 17,2 ± 8,9 Pb 11,3 ± 5,9

Cd 0,17 ± 0,14 Cd 0,12 ± 0,08

Cu 12,6 ± 5,0 Cu 6,7 ± 4,4

Cr 8,0 ± 2,2 Cr 6,2 ± 1,1

Mn 2,0 ± 1,0 Mn 1,09 ± 0,68

Fe 45 ± 71 Fe 44 ± 61

Zn 137 ± 61 Zn 175 ± 61

K 420 ± 190 K 390 ± 150

Na 10,5 ± 1,9 Na 5,5 ± 1,0

2.1.5 Distribuce prvků v zubech

Rozložení stopových prvků (Sr, Zn, a Pb) v zubech je heterogenní ve všech částech zubu, což

odpovídá specifickým strukturním a vývojovým rysům zubu.14 Větší rozdíly v poměrech 25Mg, 57Fe, 66Zn, 68Zn, 88Sr, 138Ba a 208Pb ku 43Ca byly zjištěny mezi jednotlivými vývojovými

částmi zubu než mezi různými zuby od stejného jedince.15

Ve sklovině se směrem od povrchu ke spojení dentinu se sklovinou snižuje obsah fluoru, cínu,

železa, chloru, hořčíku, sodíku, vápníku a uhličitanů.7 Obsah zinku se snižuje směrem od

vnější po vnitřní stranu skloviny a zvyšuje se poté od okrajového ke kořenovému dentinu.16

Vyšší obsah stroncia byl zjištěn v dentinu a zvyšoval se směrem k pulpě.14 Navíc byly

zjištěny vyšší hodnoty poměrů izotopů 57Fe, 66Zn, 68Zn, 138Ba a 208Pb ku 43Ca v postnatální

sklovině oproti prenatální. Naopak v případě 25Mg byl tento poměr nižší v postnatální

sklovině. Hodnoty poměru 88Sr/43Ca byly v obou případech srovnatelné.15 Vysoké intenzity 66Zn a 208Pb byly zjištěny v zubní dřeni a podél neonatální linie. Zvýšené intenzity izotopů 66Zn, 208Pb, 25Mg, 57Fe, 88Sr, 65Cu jsou také v místech spojujících jednotlivé části zubu.6

V oblasti okolo neonatální linie se obsahy prvků jako C, Ca, P, N, O a S významně neliší.

Výrazně nižší hodnoty byly ovšem zjištěny pro hořčík a sodík.8 Jiná studie prokázala pokles

obsahu fluoridu v neonatální linii.17 Také byly pozorovány změny v poměru Sr/Ca

v prenatální a postnatální sklovině v závislosti na stravování dítěte a matky během

těhotenství. Zuby od dlouhodobě a výhradně kojených dětí vykazovaly vyšší hodnoty poměru

Sr/Ca v prenatální sklovině, zatímco zuby od dětí s kojeneckou výživou měly vyšší hodnoty

poměru Sr/Ca v části skloviny tvořené ihned po narození.18

17

2.1.6 Faktory ovlivňující chemické složení zubů

Jak již bylo zmíněno, chemické složení zubů není stálé, ale mění se v důsledku různých vlivů.

V této kapitole jsou popsány některé tyto vlivy a změny v rozložení a obsahu prvků v zubech,

které s nimi souvisí.

Věk

Bylo dokázáno, že obsah mnoha prvků v dentinu se zvyšuje s věkem až do 50 let života.

Obsah stroncia se může zvyšovat dokonce až do 70 let života. Předpokládá se, že je to kvůli

tomu, že dentin obsahuje velké množství kolagenových vláken, ve kterých jsou absorbovány

a kumulovány prvky s afinitou k těmto vláknům a jejich obsahy se tudíž zvyšují

s přibývajícím věkem.19

Olovo se může dostávat do dentinu adsorpcí z vodných roztoků a nahrazuje vápník

v hydroxyapatitové struktuře, což potvrzuje negativní korelace mezi vápníkem a olovem.20

Nicméně v závislosti na věku nebyly prokázány žádné změny v obsahu vápníku v zubech.

Dále bylo publikováno, že dochází ke zvyšování obsahu stroncia s obsahem fluoru v dentinu.

Obsah fluoru byl zjištěn vyšší v oblasti pulpy a na straně dentinu sousedící se sklovinou. Je

předpokládáno, že zvyšující se obsah stroncia v zubech je způsoben postupným vystavením

dentinu okolnímu prostředí.

Obsah železa a mědi byl zjištěn nižší v zubech žen, což může být spojeno se zapojením těchto

prvků v syntéze hemoglobinu a s menstruací.21

Druh zubu, přítomnost kazů a kořenů

Zuby s přítomností kazu mají vyšší obsah většiny kovových prvků než zuby bez kazu. Rozdíl

byl statisticky významný pro olovo, rtuť a zinek.22 Dále bylo prokázáno, že fluor chrání zuby

proti kazům a naopak olovo a kadmium jsou spojeny se vznikem zubního kazu

a s onemocněními zubů.14 Naopak obsah železa je významně vyšší ve zdravých zubech. Nižší

obsah železa ve sklovině může ukazovat na snížený přívod krve do zubu.20 Dále byly

analyzovány roztoky různých druhů zubů (špičáky, řezáky a stoličky) s kořeny a bez kořenů.

Bylo zjištěno, že zuby s kořeny mají vyšší obsah olova a zinku než zuby bez kořene. Rozdíly

v obsazích u různých druhů zubů byly zjištěny u olova, rtuti a zinku, což může být způsobeno

změnami v expozici daným kovům během vývoje zubu.22 Navíc zinečnaté ionty stejně jako

18

ionty některých dalších kovů (Mg2+, Fe2+,3+, Mn2+, Cu2+, K+, Na+) slouží jako kofaktory

mnoha enzymů.21

2.2 PRVKY VYUŽÍVANÉ V ARCHEOLOGII

Některé prvky přijímané v potravě jsou akumulovány v tkáních, jako jsou kosti, zuby, nehty

a vlasy. Ovšem jen některé tyto tkáně jsou vědci využívány jako spolehliví ukazatelé obsahů

přijímaných prvků. Jsou to především zuby a kosti (dlouhodobé) a vlasy a nehty

(krátkodobé).19

V archeologii je využívána řada prvků a poměry některých stabilních izotopů, které se

nachází v kostech a zubech. Analýza stabilních izotopů se zaměřuje převážně na závislost

izotopového složení kyslíku, uhlíku a dusíku na přijímané potravě a vodě spojené se závislostí

na klimatu (kyslík) nebo mechanismu fotosyntézy (uhlík). Při sledování migrace je využíváno

izotopového složení (Sr, Pb) tkání, které odráží složení daného geologického podloží. Využití

stopových prvků je v podstatě závislé na různé diskriminaci daného prvku vůči vápníku, což

umožňuje studování potravních řetězců a trofických úrovní.23 Určením obsahu některých

prvků nebo jejich poměrů (prvkových i izotopových) je tedy možné určit složení potravy, což

může vědcům poskytnout informace o chování daného jedince a o jeho postavení ve

společnosti.

2.2.1 Stroncium a baryum

Fakt, že množství stroncia a barya v organismu je úzce spojené s pozicí v potravním řetězci,

je základním předpokladem pro jejich využití jako stravovacích ukazatelů. Jelikož se tyto

prvky neúčastní žádného metabolického děje a nejsou pod homeostatickou kontrolou, nachází

se téměř v celém množství v minerální složce kostí a zubů. Stroncium a baryum se dostávají

do potravního řetězce z vody a rostlin, kterými jsou přijímány z okolní půdy společně

s vápníkem.24 Dochází k jevu zvanému biopurifikace, kdy daný organismus přednostně

vstřebává vápník oproti baryu a stronciu, které jsou přednostně odstraňovány ze zažívacího

traktu. Důsledkem biopurifikace je redukce poměrů Sr/Ca a Ba/Ca oproti těmto poměrům

v přijímané potravě. Hodnoty poměrů Sr/Ca a Ba/Ca se snižují se stoupající pozicí

v potravním řetězci.25, 26 Podle provedených výpočtů dochází v potravním řetězci ke snižování

19

poměru Sr/Ca o 70% a poměru Ba/Ca o 84 % s každou vyšší pozicí v potravním řetězci

(obr. č. 3).27 Pro půdy se zjištěné hodnoty log(Ba/Ca) pohybovaly kolem -1,5 a hodnoty

log(Sr/Ca) kolem -1,5, u rostlin byly kolem -2,5 respektive -2, u býložravců -3 respektive -

2,5, a u masožravců -4 respektive -3.28

Obr. č. 3: Teoretický potravní řetězec znázorňující pokles v hodnotách poměrů Sr/Ca a Ba/Ca,

upraveno podle27

Poměry Sr/Ca a Ba/Ca mohou být také ovlivněny, pokud jsou hlavním zdrojem potravy

rostliny, anebo různé části rostlin s vysokým obsahem vápníku. Kořeny a stonky rostlin mají

oproti listům zvýšený obsah Sr/Ca, a proto býložravci konzumující převážně listy mohou mít

nižší obsah Sr/Ca (fosilní vzorky: 0,47.10-3 ± 0,17.10-3, recentní: 1,12.10-3 ± 0,35.10-3)

v porovnání s býložravci, kteří se živí převážně stonky a kořeny (fosilní vzorky:

0,92.10-3 ± 0,28.10-3, recentní: 2,61.10-3 ± 1,06.10-3).29

Dále se poměr Ba/Sr využívá při určení, zda převládala u daného jedince potrava mořského

původu nebo suchozemského. Mořská voda a organismy, které se v ní nachází, mají extrémně

nízký poměr Ba/Sr, zatímco obsah barya a stroncia v suchozemském prostředí je přibližně

stejný (Ba/Sr = 1). Z toho vyplývá, že převládající mořská potrava se v kostech a zubech

projeví nižšími hodnotami Ba/Sr. Ovšem různé poměry masa v potravě mohou tento poměr

ovlivnit.30

Z poměru Sr/Ca lze také odvodit délku kojení dítěte. Mateřské mléko má nízkou hodnotu

poměru Sr/Ca oproti běžné stravě, u kojenců tedy můžeme očekávat nízké hodnoty Sr/Ca.

20

Zvýšení hodnoty Sr/Ca odráží zavedení pevné nebo náhradní stravy s vyššími hodnotami

Sr/Ca a lze tedy určit zhruba dobu odstavení dítěte od mateřského mléka.31

Dále mohou být využity poměry Sr/Ca a Ba/Ca v zubní sklovině k určení migrace/mobility.

Jejich množství v okolním prostředí se může značně měnit v závislosti na regionu, což platí

díky zvětrávání hornin hlavně u stroncia.32

Kromě zmíněných se využívá měření poměrů izotopů stroncia 87Sr/86Sr. Izotop stroncia 87Sr

vzniká rozpadem radioaktivního 87Rb. Poměr 87Sr/86Sr je daný geologickým stářím horniny

a obsahem 87Rb. Na rozdíl od jiných izotopů jsou v kostech a zubech zachovávány původní

hodnoty poměru 87Sr/86Sr.33 Pokud tedy známe poměr izotopů stroncia dané oblasti, můžeme

určit, zda došlo k migraci/mobilitě daného jedince. Nejvhodnějším materiálem pro zjišťování

migrace/mobility pomocí poměru izotopů stroncia se ukázala zubní sklovina, která je méně

náchylná k diagenezi a dalším změnám. Například sklovina prvních trvalých stoliček

uchovává původní poměr 87Sr/86Sr. Existuje-li tedy rozdíl v poměru 87Sr/86Sr zjištěném ve

sklovině a poměrem 87Sr/86Sr v kostech nebo dentinu, které vyjadřují poměr 87Sr/86Sr

v průběhu života, je možné uvažovat o migraci/mobilitě jedince.34 Využití poměru 87Sr/86Sr

při sledování migrace komplikuje znečištění antropogenními zásahy do prostředí a neznalost

izotopového poměru dané oblasti.35

2.2.2 Zinek

Dalším důležitým prvkem týkajícím se potravy je zinek. Vysoké obsahy zinku jsou zejména

v mase, a proto se obsahy zinku zvyšují v potravním řetězci v pořadí býložravci < všežravci

< masožravci. Analýzou kostí byly zjištěny následující obsahy: býložravci (90 – 150 µg/g),

všežravci (120 – 220 µg.g-1) a masožravci (175 – 250 µg.g-1). Je předpokládáno, že zinek je

méně náchylný k diagenezi a je tedy vhodný pro určení druhu potravy.32 Nicméně zinek je

esenciální prvek, jehož obsah v těle podléhá homeostatické regulaci. Proto se setkáváme

s rozdílnými výsledky při určování podílu masité potravy u fosilních vzorků.36 Vyšší obsah

zinku může také souviset se zánětem zubní a kostní tkáně.37

2.2.3 Uhlík

Využití poměru izotopů uhlíku 13C/12C (δ13C) poskytuje informaci jak o složení potravy, tak

o prostředí, ve kterém daný jedinec pobýval.29 Z poměru 13C/12C se dá určit, jedná-li se o C3

nebo C4 rostliny. Tyto typy rostlin se liší v poměru, ve kterém zabudovávají při fotosyntéze

21

izotopy uhlíku do struktury cukrů.35 Mezi C3 rostliny patří různé druhy obilí, ovocné stromy,

běžné trávy a luštěniny, zatímco C4 rostliny zahrnují hlavně tropické a subtropické traviny,

proso, kukuřici nebo třtinu. Hodnoty δ13C jsou tedy nižší u C3 rostlin, průměrná hodnota

kolem -26,5 ‰, zatímco pro C4 rostliny je průměrná hodnota okolo -12,5 ‰.29 Býložravci

s převládající konzumací C3 rostlin a jejich konzumenti vykazují hodnoty okolo -12 ‰ a nižší

a býložravci C4 rostlin a jejich konzumenti mají hodnoty blízké 0 ‰.38 Dále se dá podle

poměru izotopů uhlíku určit, zda u daného jedince převládala mořská nebo suchozemská

strava, a také zavedení pevné stravy kojencům.32 Hodnoty poměru izotopů uhlíku nezávisí

jenom na typu konzumovaných rostlin, ale i na nadmořské výšce, teplotě prostředí, nebo na

počtu srážek a vlhkosti.39

Izotopové složení může být získáno analýzou kostního kolagenu a analýzou zubní skloviny.

Izotopové složení kolagenu odráží primárně zdroje bílkovin v potravě. Na druhé straně

hodnoty získané z uhličitanové složky apatitu ukazují spíše na celkové složení potravy.40

2.2.4 Dusík

Postavení určitého druhu v potravním řetězci se dá určit z hodnot δ15N (15N/14N) zjištěných

z kostního kolagenu. Dochází k navýšení zhruba o 2 – 3 ‰ na každém stupni potravního

řetězce. Z toho vyplývá, že zatímco rostliny mají hodnotu δ15N kolem 3 ‰, býložravci, jenž

se jimi živí, mají už kolem 6 ‰ a masožravci dosahují hodnot v rozmezí 9 – 10 ‰.35 Vyšší

hodnoty δ15N v rozmezí 17 – 20 ‰ byly zjištěny u konzumentů především mořských plodů.

Dále se dá pomocí δ15N určit, kdy dítě přešlo z mateřského mléka na pevnou stravu, což se

projeví náhlým poklesem hodnot δ15N.32

2.2.5 Kyslík

Poměr izotopů kyslíku 18O/16O (δ18O) našel uplatnění jak při určování pozice v potravním

řetězci tak i při určení migrace/mobility daného jedince. Hodnota δ18O je funkcí celkového

množství kyslíku, který vstupuje a vystupuje z těla.38 Hlavními zdroji tělního kyslíku jsou

atmosférický kyslík, voda a kyslík vázaný v potravě. Jelikož jsou hodnoty δ18O

z atmosférického kyslíku téměř konstantní, izotopové složení zubní skloviny je ovlivňováno

hlavně přijímanou vodou a do menší míry i potravou. Izotopové složení dešťové vody je

22

ovlivňováno řadou faktorů, jako je zeměpisná šířka, nadmořská výška, průměrná roční teplota

a množství srážek.41 Hodnoty δ18O tedy odráží geografické rozdíly v klimatických

podmínkách a souvisí tudíž s paleoklimatem.35 Voda vázaná v kořenech a stoncích rostlin je

izotopovým složením podobná srážkové vodě, kdežto voda v listech je obohacená o H218O

kvůli vypařování lehčích molekul H216O. Z toho vyplývá, že býložravci, kteří získávají více

vody z listů, mají vyšší hodnoty δ18O, než ostatní býložravci a masožravci, kteří musí

pravidelně pít.29 Průměrné hodnoty δ18O publikovány pro býložravce (26,94 ‰ – 31,73 ‰),

člověka (15,19 ‰ – 18,64 ‰), vlka (8,01 ‰) a žraloka (21,83 ‰)42. Dále lze z hodnot δ18O

určit, zda došlo k migraci jedince, a pokles v přijímání mateřského mléka a tím doba, kdy byla

dítěti zavedena pevná strava.32

2.2.6 Olovo

Olovo má čtyři stabilní izotopy 204Pb, 206Pb, 207Pb a 208Pb. Zmíněné poslední tři jsou

radioaktivní. Izotopové složení se liší u různých geologických podloží v závislosti na jejich

stáří a na zdrojích olova. Využívány jsou poměry 206Pb/204Pb, 207Pb/204Pb, 208Pb/204Pb

a 208Pb/206Pb. Díky rozdílům v těchto poměrech zjištěných z biologických tkání je tedy možné

určit, zda se jedinec na dané místo přistěhoval, nebo zda na tomto místě žil po celý život.43

2.2.7 Síra

K určení zdroje potravy a migrace/mobility může být využito také poměru izotopů síry 32S/34S

(δ34S). Anaerobní bakterie redukující síranové ionty na sirovodík způsobuje velké rozdíly

v hodnotách (δ34S), které tak nabývají hodnot od -22 ‰ do +20 ‰ pro sladkovodní

organismy. Živočichové žijící v mořských ekosystémech mají hodnoty (δ34S) blízké +20 ‰,

zatímco výhradně suchozemští savci mají hodnoty (δ34S) nižší než +10‰.

Izotopové složení síry dané lokality je určeno geologickým podložím a jeho utvářením.

Hodnoty δ34S zdrojů potravy z různých regionů se mohou lišit a je tedy možné využít tohoto

poměru k určení migrace/mobility. Za tímto účelem jsou hodnoty δ34S měřeny v kostním

kolagenu a ve sklovině podobně jako v případě izotopů stroncia.33

23

2.3 DIAGENEZE

Chemické složení zubů se mění i po smrti daného jedince nebo po vypadnutí zubu. Tyto

změny způsobené vlivem okolního prostředí, které jsou patrné hlavně u velmi starých zubů,

bývají souhrnně označovány jako diageneze. Je tedy nutné, aby vědci přistupovali

k interpretaci výsledků opatrně, protože rozsah diageneze určitého prvku není možné zcela

určit.

Proces diageneze je tvořen několika mechanismy - rozpouštění, srážení, adsorpce

a rekrystalizace. Rozsah diageneze je závislý na okolních podmínkách, například na složení

podzemní vody a okolní půdy, na pH půdy, teplotě, tlaku a také na biologických

faktorech.44,45 Příjem stopových prvků fosiliemi je dále ovlivněn velikostí dané fosilie,

poškozením, rychlostí difúze a typem fosilie. Krystaly hydroxyapatitu v dentinu, cementu

a kostech jsou jemnozrnné. Mají tudíž díky větší porozitě a povrchu více míst pro adsorpci

stopových prvků a větší potenciál pro rekrystalizaci. Z toho důvodu je sklovina odolnější proti

změnám vlivem diageneze a je vhodným materiálem pro biologické a klimatologické studie.

Některé prvky, zejména Y, F, prvky vzácných zemin a U jsou ve větším množství přítomny

u hodně starých fosilií46. Zvýšené obsahy Fe, Mn, Si, Al a Ba ve fosilních zubech naznačují

tvorbu sekundárních minerálů.23 V hydroxyapatitu může během fosilizace docházet

k substituci různých skupin za jiné. Například se zvyšuje podíl uhličitanu, který nahrazuje jak

skupinu PO43-, tak i skupinu OH-. Naopak obsah vody se snižuje během fosilizace. Skupina

PO43- je dále nahrazována skupinou HPO4

2- a skupina OH- může být zastoupena skupinami F-,

Cl- a H2O.Vápník v hydroxyapatitové struktuře může být nahrazován Na, Mg, Zn, Sr, Ba,

prvky vzácných zemin, U a Pb. Tyto substituce vyvolávají změny ve vlastnostech

hydroxyapatitu, například větší obsah uhličitanu na pozici fosforečnanu zvyšuje rozpustnost

hydroxyapatitu a snižuje jeho krystalizaci, a zároveň vyvolávají i změny v jeho struktuře.

Například když je nahrazena skupina PO43- za uhličitanovou skupinu dochází ke zkrácení

jednoho parametru mřížky a zároveň i k prodloužení jiného. Naopak je tomu u substituce

uhličitanové skupiny za OH-.47 Hodnoty δ18O získané z fosilních zubů mohou zaznamenat

část interakce mezi vodou a daným biominerálem během diageneze, což může změnit

původní izotopové složení zubů. Naproti tomu hodnoty δ13C jsou mnohem více odolné proti

diagenezi, obzvláště ve sklovině je zachovávána původní hodnota, zatímco v dentinu je patrný

různý rozsah diageneze.48

K vyhodnocení vlivu diageneze na fosilní zuby by měly být analyzovány i okolní půdy za

účelem porovnání obsahů prvků například vzácných zemin.49 Může být využito i poměru

24

Ca/P (hlavní prvky v hydroxyapatitu). Zjištěné hodnoty poměru Ca/P v recentních kostech se

pohybují v rozmezí 1,8 – 2,19.24 Pro sklovinu se hodnoty poměru Ca/P pohybují v intervalu

1,91 – 2,17 a v dentinu nabývá tento poměr hodnot od 2,1 do 2,2.50 K odstranění

znečišťujících uhličitanů bývá používána kyselina octová.26 Diagenetické změny ve fosilních

vzorcích je možné určit pomocí různých metod jako je laserová ablace ve spojení

s hmotnostní spektrometrií indukčně vázaného plazmatu (LA-ICP-MS), nukleární magnetická

rezonance (NMR) a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR).51

2.4 ANALÝZA ZUBŮ

K analýze povrchů pevných látek je možné využít hned několika metod. V posledních letech

je však stále častěji využívána LA-ICP-MS, jejíž princip a instrumentace jsou uvedeny již

v mé bakalářské práci.52 Jedná se o relativně jednoduchou metodu s minimálním poškozením

vzorku. Ovšem v případě fosilních vzorků, kdy je zachována například nepatrná část skloviny,

se i v tomto případě může jednat o významné poškození a nevratnou ztrátu informací. Tato

metoda nevyžaduje složité rozpouštěcí procedury, které mohou vést ke kontaminaci vzorku,

ale i ke ztrátě cenných informací vyplývajících z distribuce prvků.14 Další výhody této metody

jsou vysoká citlivost, nízké detekční limity (jednotky mg.kg-1), možnost hloubkového

profilování a sledování specifického místa na povrchu vzorku.6 Mezi hlavní nedostatky

naopak patří poskytování semikvantitativních výsledků a nedostatek certifikovaných/

standardních referenčních materiálů. Pro svou schopnost poskytnout informace o distribuci

stopových prvků je metoda LA-ICP-MS využívána například v analýze zubů, kostí, korálů,

mušlí, rybích otolitů a dřeva.15

Pro určení prvkových a izotopových poměrů bývají využívány analyzátory s různou přesností.

Nejvyšší přesnosti lze dosáhnout s multikolektorem až 0,002 % (RSD), naopak nejnižší

přesnost má kvadrupólový analyzátor (0,1 % RSD). Multikolektoru se využívá zejména při

analýze poměrů 87Sr/86Sr, jejichž hodnoty se liší jen nepatrně a přesnost musí být tedy co

největší.

25

2.5 VYUŽITÍ LA-ICP-MS V ANALÝZE ZUBŮ

Studiem distribuce prvků v zubech se zabývá například Kang et al, který ve své práci zkoumal

distribuci stopových prvků (Cu, Fe, Mg, Sr, Pb a Zn) v mléčných zubech. Ablatovaná místa

(196 µm x 339 µm) zahrnovala prenatální a postnatální sklovinu, neonatální linii, rozhraní

dentinu se sklovinou, dentin a rozhraní dentinu s pulpou. K analýze povrchu vzorku byl

použit liniový sken s průměrem laserového paprsku 10 µm, vzdáleností mezi liniemi 10 µm

a rychlostí posunu vzorku 20 µm.s-1. Intenzity jednotlivých izotopů byly normalizovány

pomocí izotopu 43Ca a následně byly vytvořeny mapy znázorňující rozložení jednotlivých

prvků. Z výsledných map je patrné heterogenní rozložení prvků jak v jednotlivých částech

zubu tak i mezi nimi. Zvýšené intenzity zinku a olova byly zjištěny v oblasti pulpy

v porovnání s ostatními analyzovanými částmi zubu. Vyšší hodnoty těchto prvků byly

pozorovány i podél neonatální linie. Zvýšené intenzity vybraných izotopů byly nalezeny

v oblastech rozhraní jednotlivých částí zubu.6

V jiné studii byly publikovány 2D mapy rozložení některých izotopů (66Zn, 88Sr, 111Cd a 208Pb) v recentních mléčných dětských zubech a obsahy prvků vypočítané pomocí NIST SRM

1486 (kostní moučka). Analýza byla provedena pomocí liniového skenu s průměrem

laserového paprsku 30 µm, vzdáleností linií 30 µm a rychlostí posunu vzorku 30 µm.s-1.

Hustota zářivé energie dosahovala hodnoty 1 J.cm-2 a frekvence byla zvolena 20 Hz. Zjištěné

obsahy stroncia ve všech analyzovaných zubech byly vyšší než 120 µg.g-1 s podstatně vyššími

hodnotami především v dentinu blízko zubní dutiny. Maximální obsahy zinku se pohybovaly

od (250 ± 55) µg.g-1 do (750 ± 165) µg.g-1. Ve všech zubech byl obsah zinku nižší ve sklovině

oproti dentinu. Ve sklovině byl vyšší obsah zinku na vnější straně. Dále byla pozorována také

akumulace těžkých kovů olova a kadmia ve dvou zkoumaných vzorcích s vyššími hodnotami

na okraji rozhraní dentinu s pulpou, kam jsou zabudovávány vlivem expozice daným kovům

z okolního prostředí.14

Další skupina vědců ve své práci porovnávala intenzity 25Mg, 57Fe, 66Zn, 68Zn, 88Sr, 138Ba

a 208Pb jednotlivých zubů v postnatální a prenatální sklovině a mezi různými zuby.

V postnatální sklovině byly zjištěny vyšší hodnoty a větší rozdíly v intenzitách všech izotopů

kromě hořčíku, kdy se hodnoty snížily, a stroncia, kdy zůstaly konstantní. Naopak srovnání

podle typu zubu a umístění zubu v ústech daného jedince odhalilo nepodstatné rozdíly.15

Srovnání obsahů prvků (Zn, Sb, Hg, Pb, Cu, Cd, Ni, Co, Fe, Cr) v pre- a postnatální sklovině

mrožích zubů a mezi jednotlivými zuby bylo také publikováno. Jako standard byl využit

rozložený kousek zubu analyzovaný pomocí ICP-OES. Stejně jako u předchozích byly

26

zjištěny vyšší obsahy většiny prvků v postnatální sklovině a výskyt určitých prvků v daném

čase vývoje zubu.53

Distribuci manganu v recentních mléčných zubech se věnovali Arora et al. Ablace byla

provedena pomocí liniového skenu se vzdáleností linií 20 µm, průměrem laserového paprsku

20 µm, rychlostí posunu 20 µm.s-1, hustotou laserového záření 1 J.cm-2 a frekvencí 20 Hz.

Hodnota poměru 55Mn/43Ca na vnější straně skloviny se pohybovala od 0,57 do 4,74, zatímco

hlouběji ve sklovině byla v rozsahu 0,005 – 0,013. To můžeme být následkem vývoje

skloviny, kdy se vnější strana stává více mineralizovanou oproti vnitřní. Jiným možným

vysvětlením je výměna iontů manganu mezi vnější vrstvou skloviny a slinami, čímž dochází

k akumulaci většího množství manganu. Nejvyšší hodnoty manganu byly ovšem v dentinu

přiléhajícím k pulpě (2,27 – 6,95). Z map byly také patrné vysoké hodnoty poměru 55Mn/43Ca

v oblasti dentinu blízko špičky zubu. Jak bylo později zjištěno, hodnoty 55Mn/43Ca jsou vyšší

v prenatálně vytvořeném dentinu než v dentinu vytvořeném po narození. Pomocí NIST SRM

1486 byly zjištěny obsahy manganu v jednotlivých částech zubu. Ve vnitřní sklovině byl

obsah v rozsahu (0,1 – 0,2) µg.g-1 (kromě povrchu skloviny) a ve spojení dentinu s pulpou byl

rozsah (0,5 – 0,7) µg.g-1.54

V jiné studii byly zkoumány zuby krys, kterým byla aplikována injekce s octanem olovnatým

(c = 30 mg.kg-1). Záměrem bylo zjistit, zda výsledné fyziologické narušení může být určeno

využitím analýzy stopových prvků v zubech. Byl pozorován nárůst sledovaných prvků

v místě, kde byl zřejmý úbytek vápníku, který odpovídal době podání injekce. Trauma

způsobené aplikací injekce pravděpodobně způsobilo, že proces mineralizace byl narušen, což

vedlo k „soutěžení“ prvků o volná místa v hydroxyapatitové struktuře. Toto narušení

mineralizace je obdobné neonatální linii v lidských zubech. Také je pravděpodobné, že

hustota hydroxyapatitové matrice vlivem stresu způsobeného expozicí olovem klesá, což

vyúsťuje v jasný pokles obsahu vápníku. Bylo zjištěno, že expozice olovem vede k začlenění

olova do vyvíjející se skloviny zubu, což vede ke změnám v poměru Ca/Pb. Podobně analýza

recentních lidských zubů odhalila nerovnoměrnou distribuci prvků (Zn, Pb, Ca) v celém zubu.

To potvrzuje, že prvky jsou začleňovány do zubů i během jejich vývoje. Dále byly zjištěny

zvýšené obsahy zinku a olova na povrchu zubu, zatímco stroncium a vápník ukázaly

rovnoměrnou distribuci s malými změnami na povrchu skloviny.55

Vědci se věnovali také analýze olova a určení poměru Pb/Ca ve sklovině mléčných zubů, za

účelem zjištění expozice olovem během vývoje plodu. Jedná se o toxin ovlivňující

behaviorální vývoj, který snadno prochází přes placentu a hromadí se v kalcifikovaných

27

tkáních, jako jsou zuby. Průměrný obsah Pb/Ca ve zkoumaných sklovinách byl 0,47 mg.kg-1

(rozsah 0,10 – 1,2 mg.kg-1).56

Distribuci olova v archeologických a recentních zubech popisuje ve své práci Budd et al.

Práce byla zaměřena především na stálé obohacování olovem ve vnější vrstvě skloviny, která

se jeví nezasažená diagenezí. Určení distribuce olova v recentních a archeologických lidských

zubech odhalilo shodná schémata, kdy jsou hodnoty obsahu olova vysoké ve vrstvách

skloviny v bezprostřední blízkosti jejího povrchu. Zajímavostí je, že v tomto případě celková

expozice olovem se nejeví být významně odlišná od té u recentních vzorků.57

Vědci se zaměřili také na zjištění vlivu struktury dané tkáně a chemického složení okolní

půdy na příjem stopových prvků ve fosíliích. Ve fosilních zubech a kostech byly zjištěny

prvkové profily pro běžné bivalentní kationty (Sr, Zn, Ba), prvky vzácných zemin, Y, U a Th.

Byly vytvořeny 2D mapy pro zobrazení strukturních vlivů na příjem stopových prvků

a kvantitativní vyhodnocení relativní rychlosti difuze v různých směrech uvnitř strukturně

heterogenních fosílií. Bylo zjištěno, že příjem stopových prvků ve sklovině je 2 – 4 pomalejší

než v dentinu. Bylo také prokázáno, že různorodost ve struktuře tkání silně ovlivňuje příjem

stopových prvků ve fosíliích. Efektivní difuzní rychlost se zvyšuje v pořadí sklovina, dentin,

kost. Rozdělovací koeficienty (tkáň/půda) pro prvky vzácných zemin byly řádově vyšší

v kostech než v dentinu a sklovině, zatímco rozdělovací koeficienty pro uran byly podobné ve

všech tkáních.46

Řada vědců se zabývá výživou a migrací/mobilitou jednotlivých druhů. Například bylo

zkoumáno, zda se obsah zinku ve sklovině mléčných zubů současných dětí mění v závislosti

na rozdílech ve stravě matky, jako je příjem zinku, podíl konzumovaných živočišných

produktů a částí potravy, které ovlivňují příjem zinku. Zcela nečekaně bylo zjištěno, že

nejvyšší poměr Zn/Ca vykazovala sklovina dětí, jejichž matky během těhotenství

konzumovaly stravu chudou na zinek. Bylo to způsobeno pravděpodobně kvůli zvýšení

absorpce zinku během těhotenství. Získané výsledky v této studii naznačují, že zinek není

spolehlivým ukazatelem trofické úrovně, protože ani prenatální ani postnatální poměr Zn/Ca

ve sklovině neodrážel relativní příspěvek masa, živočišných produktů a přijímaného zinku

v potravě.36

Metoda LA-ICP-MS byla využita i ke zjištění odlišností v poměru Sr/Ca mezi částmi

skloviny mléčných zubů. Cílem práce bylo zjistit, zda distribuce Sr/Ca ve sklovině odráží

změny ve stupni mineralizace a zda tyto odchylky odpovídají časovým změnám v důležitých

stravovacích přechodech. Byly odhaleny změny v poměru Sr/Ca v závislosti na výživě

kojenců. Zuby dětí, které byly po dlouhou dobu výhradně kojeny, projevují zřejmý úbytek

28

v poměru Sr/Ca v postnatální sklovině. Naproti tomu zuby od dětí, které byly krmeny

převážně nebo výhradně kojeneckou výživou hned po pár dnech od porodu, vykazují vyšší

poměr Sr/Ca v postnatální sklovině. Brzké zavedení kojenecké výživy jako doplňku nebo

náhrady mateřského mléka je spojeno s nárůstem hodnot Sr/Ca v pásu skloviny, která se

v tomto čase začíná utvářet.18

V jiné publikaci se zaměřili v ědci na měření poměru 87Sr/86Sr v kostech a zubech

pocházejících z období 5. - 6. století našeho letopočtu, za účelem vyhodnocení migrace.

Pozornost byla zaměřena i na separaci stroncia od rubidia, z důvodu odstranění interferencí

během měření poměrů izotopů stroncia. Výsledky získané pomocí LA-ICP-MS poskytly

výsledky s RSD pro poměr izotopů kolem 0,1 – 0,2 % jak v dentinu, tak i ve sklovině. Jak již

ale bylo zmíněno, pro poměr 87Sr/86Sr je vyžadována směrodatná odchylka v řádu tisícin.

Získaný poměr izotopů stroncia u jednoho zkoumaného jedince byl homogenní v dentinu

i v kosti, zatímco ve sklovině se významně lišil, což naznačuje možnou migraci daného

jedince během raného dětství.34

29

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

30

3.1 Popis zařízení

3.1.1 Laserová ablace ve spojení s hmotností spektrometrií indukčně vázaného plazmatu

Všechny vzorky zubů byly analyzovány pomocí laserového ablačního systému UP 213 (New

Wave, USA) s pulzním Nd:YAG laserem, který emituje záření o vlnové délce 213 nm

s délkou pulzu 4,2 ns (Obr. č. 5). Mezi nastavitelné parametry tohoto laserového ablačního

systému patří frekvence (1 – 20 Hz), hustota zářivé energie (max. hodnota ~ 25 J.cm-2)

a průměr laserového paprsku (4 – 400 µm). Další součástí tohoto systému je komora

SuperCell (New Wave, USA) s objemem 33 cm3. Ablační systém obsahuje také zařízení,

které umožňuje posun vzorku v osách x a y. Dále je zařízení vybaveno CCD kamerou, jež

umožňuje monitorování povrchu vzorku. Pomocí tohoto systému je možné provést mapování

povrchu vzorku pomocí bodové analýzy (linie bodů) nebo liniového skenu. Před analýzou

může být po zadanou dobu měřen signál odpovídající pozadí. V tomto případě je měřen signál

všech izotopů bez dopadu laserového paprsku na vzorek. V případě linie bodů je nejprve

ablatován jeden bod a poté se vzorek posune o přesně definovanou vzdálenost k dalšímu

bodu. K jeho ablaci dojde po uplynutí zadané časové prodlevy nutné k odstranění materiálu

z ablačního systému po předchozí ablaci. Tento postup se opakuje, dokud nejsou ablatovány

všechny body zvoleného rastru. U liniového skenu naopak dochází k posunu vzorku přímo

během ablace. V závislosti na zvolené rychlosti posunu vzorku se mohou ablační krátery

překrývat. Po ablaci dochází k transportu ablatovaného materiálu polyuretanovou hadičkou

(firma Lergis, d = 4 mm, l = 1 m) do ICP. Nosným plynem je helium o průtoku 1 l.min-1. Jako

detekční systém je využíván ICP-MS spektrometr Agilent 7500ce (Agilent Technologies,

Santa Clara, CA, USA) s kvadrupólovým analyzátorem a elektronovým násobičem jako

detektorem (obr. č. 4). Za účelem minimalizace interferencí je hmotnostní spektrometr

vybaven kolizně – reakční celou. Pro analýzu kosterních pozůstatků byla použita cela

v kolizním módu (kolizní plyn He – průtok 2,5 ml.min-1). Parametry ICP-MS jsou uvedeny

v tabulce číslo 2.

31

Tab. č. 2: Parametry ICP-MS výkon generátoru 1500 W

vnější plazmový plyn (Ar) 15 l.min-1

střední plazmový plyn (Ar) 1 l.min-1 pomocný plyn (Ar) 0,6 l.min-1

nosný plyn (He) 1 l.min-1

Obr. č. 4: Laserový ablační systém UP 213 a ICP-MS Agilent 7500ce

3.1.2 Elektronová mikrosonda

Některé vzorky byly analyzovány také pomocí elektronové mikrosondy (EMPA) Cameca

SX–100 (Cameca, Francie) na společném pracovišti Ústavu geologických věd Masarykovy

Univerzity a České geologické služby. Analýzou pomocí elektronové mikrosondy je možné

získat informace o chemickém složení vzorků a také rozlišení jednotlivých fází vzorku.

Nevýhodou oproti LA-ICP-MS je, že kvůli vyšším detekčním limitům mohou být ve vzorcích

stanoveny pouze prvky matriční a minoritní.

Instrumentace elektronové mikrosondy zahrnuje zdroj elektronů, optický systém, soustava

spektrometrů (5 vlnově-disperzních a 1 energiově-disperzní) a detektory. Detekovány jsou

sekundární elektrony, zpětně odražené elektrony a elektrony procházející vzorkem.

3.2 Vzorky

32

K analýze byly využity vzorky stálých lidských zubů z archeologických nalezišť Podolí,

Blučina, Tuřany a Kyjovice. Všechny analyzované vzorky byly získány od RNDr. Miriam

Nývltové Fišákové, Ph.D. z Ústavu archeologie, Akademie věd ČR. Lokalita Podolí

(velatická kultura – 13. – 10. st. př.n.l.) se vyznačuje přítomností unikátního hromadného

hrobu, kde bylo pohřbíváno i několikrát po sobě. Do velatické kultury spadá i oblast Blučina,

která byla jednou z největších osad doby bronzové na území Moravy. Vedla zde i jedna

z dálkových pravěkých komunikací, což umožňovalo kontakt se vzdálenými regiony. Tato

oblast je zajímavá i z hlediska nálezů stop po kanibalismu. Jednalo se nejspíše o podivný

rituál spojený s pojídáním lidského a zvířecího masa, čemuž nasvědčují štípané a řezané

lidské a zvířecí kosti se stopami od ohně58. Tuřany spadají do únětické kultury (~ 2000

př.n.l.), kde převažují žárové pohřby. Jedná se navíc o jedno z největších pohřebišť na

Moravě. V případě Kyjovic jde o polykulturní naleziště, které bylo osídleno od neolitu až po

středověk (neolit – 6000 př.n.l, středověk 476 – 1592)59.

Pro účely analýzy byly vzorky fosilních zubů rozříznuty na dvě části. Jednu část tvořila

korunka zubu obsahující sklovinu a dentin a druhá část zahrnovala jak část korunky, tak

i kořen zubu, kde se kromě dentinu a cementu nacházela i část se sklovinou. Korunka vzorku

byla využita pro izotopovou analýzu poměru 87Sr/86Sr. Sklovina a dentin byly mechanicky

odděleny a před jejich rozkladem bylo sledováno množství diageneticky vázaného stroncia.

Tato analýza byla provedena mimo mou diplomovou práci a je součástí projektu ve spolupráci

s univerzitou v Gentu. Z druhé oddělené části vzorku zubu byly navíc odříznuty v místě řezu

se sklovinou tenké plátky materiálu s tloušťkou < 100 µm, které byly pro LA-ICP-MS

analýzu zachyceny na podložní sklo ve formě tzv. výbrusů. Před analýzou pomocí LA-ICP-

MS byla zbylá část kořene vzorku zalita do epoxidové pryskyřice ve formě tablety

s průměrem ~ 2 cm (nábrus). Seznam vzorků a informace o nich jsou uvedeny v tabulce číslo

3.

33

Tab. č. 3: Seznam analyzovaných vzorků

Vzorek číslo

Označení Naleziště Stáří Druh zubu

Věk Úprava vzorku

1 H822 Podolí Doba bronzová M dospělý nábrus

2 H815 Podolí Doba bronzová M dospělý nábrus 3 H595 Podolí Doba bronzová M dospělý nábrus

4 H825 Podolí Doba bronzová M dospělý výbrus

5 Tu816 Tuřany Doba bronzová M dospělý výbrus 6 Kyjovice Kyjovice Neolit M dospělý výbrus

7 Blu8 Blučina Doba bronzová M dítě výbrus 8 Blu2 Blučina Doba bronzová M dítě výbrus

3.3 Experimentální podmínky

Distribuce prvků v jednotlivých vzorcích zubů byla zjišťována pomocí linie bodů nebo

liniového skenu. V případě linie bodů jsou důležitými parametry z hlediska prostorového

rozlišení průměr laserového paprsku a vzdálenost jednotlivých kráterů. Tyto parametry byly

voleny dle velikosti a typu analyzované části (dentin, sklovina). V případě analýzy skloviny je

nutné vzhledem k její velikosti zvolit nižší průměry laserového paprsku, čímž však dochází

k ablaci menšího množství materiálu i kvůli její větší tvrdosti, a proto je potřeba zvolit vyšší

energie. Hustota zářivé energie se pohybovala při využití linie bodů v rozmezí 5 – 25 J.cm-2.

Pokud byl k analýze povrchu vzorku využit liniový sken, byly vybírány následující

parametry: průměr laserového paprsku, rychlost posunu vzorku a vzdálenost jednotlivých

linií. Menší průměry laserového paprsku byly opět zvoleny při analyzování skloviny, a proto

musely být opět nastaveny vyšší hodnoty energie. Hustota zářivé energie dosahovala hodnot 5

– 20 J.cm-2.

Frekvence byla během analýzy všech vzorků nastavena na hodnotu 10 Hz. Konkrétní hodnoty

jednotlivých parametrů a izotopy, jejichž intenzity byly během měření zaznamenávány, jsou

uvedeny v kapitolách věnovaných jednotlivým cílům diplomové práce. Vyhodnocovány byly

ve všech případech distribuce prvků Ca, P, Sr, Ba a Zn, které jsou důležité z hlediska

zhodnocení výživy případně migrace daného jedince. Po každém měření byl za stejných

podmínek změřen signál jednotlivých izotopů u NIST SRM 1486 (kostní moučka).

34

3.4 Vyhodnocení signálu

Výsledky analýzy jsou ve formě závislosti průběhu intenzity signálu jednotlivých izotopů na

čase. Získaná data byla zpracována v programu Microsoft Excel. Tato závislost pro linii bodů

obsahuje velké množství maxim odpovídajících jednotlivým ablatovaným bodům. Jednotlivá

maxima od sebe musí být oddělena a musí od nich být odečtena hodnota pozadí. V některých

místech je navíc patrný pouze signál odpovídající pozadí a v takovém případě musí být počet

chybějících maxim dopočítán, aby bylo možné správně vytvořit 2D mapy rozložení daných

prvků. Data získaná pomocí liniového skenu byla vyhodnocena v programu Laser Ablation

Tool. Jedná se o program, který po zadání pozadí, doby trvání signálu, rychlosti posunu

vzorku a vzdáleností jednotlivých linií vyexportuje matici s naměřenými hodnotami intenzit

pro daný izotop korigované na hodnotu pozadí. 2D mapy byly vytvořeny v programu Grams.

3.5 Kvantifikace

Obsahy prvků ve vzorcích zubů byly vypočítány pomocí NIST SRM 1486. Jde o kostní

moučku slisovanou do tablety o průměru asi 1 cm, jejíž matriční složkou je hydroxyapatit.

Hodnoty obsahů některých prvků v tabletě NIST SRM 1486 jsou uvedeny v tab. č. 4.

Tab. č. 4: Deklarované obsahy některých prvků v NIST SRM 1486

prvek Obsah (mg·kg-1)

Ba 189

Zn 147 Sr 264

Ca 265 800 P 123 000

Obsahy prvků ve vzorku jsou počítány na základě přímé úměry mezi intenzitou daného

izotopu a jeho obsahem.

ci – vypočítaný obsah daného prvku ve vzorku (mg.kg-1)

cNIST – udávaný obsah daného prvku v NIST SRM 1486 (mg.kg-1)

Ivzorek – intenzita izotopu daného prvku naměřená pomocí LA-ICP-MS ve vzorku

35

INIST – intenzita izotopu daného prvku naměřená pomocí LA-ICP-MS v NIST SRM 1486

Vypočítané obsahy jednotlivých prvků byly poté přepočítány na porovnávací prvek (Ca).

Obsah porovnávacího prvku se stanoví nezávislou metodou (elektronová mikrosonda) nebo

může být vypočítán ze stechiometrie hydroxyapatitu (39,8 %hm). Tento přepočet spočívá

v tom, že se určí, kolikrát je nutné navýšit zjištěný průměrný obsah vápníku ve vzorku na

hodnotu obsahu zjištěnou pomocí elektronové mikrosondy nebo ze stechiometrie

hydroxyapatitu.

cCa(EMPA) – průměrný obsah vápníku ve vzorku zjištěný pomocí elektronové mikrosondy nebo

výpočtem ze stechiometrie hydroxyapatite

cCa(LA-ICP-MS) – průměrný obsah vápníku ve vzorku po přepočtu na NIST SRM 1486 zjištěný

analýzou pomocí LA-ICP-MS

Pomocí hodnoty přepočítávacího faktoru je poté provedena korekce obsahů vybraných prvků

na porovnávací prvek (vápník).

ci(korekce na obsah Ca) – obsah daného prvku ve vzorku po přepočtu na porovnávací prvek – Ca

(mg.kg-1)

Z naměřených hodnot intenzit izotopů byly vypočítány z NIST SRM 1486 limity detekce pro

vybrané prvky za různých podmínek zvolených při analýze daného vzorku.

SDpozadí – směrodatná odchylka naměřených intenzit daného izotopu během záznamu pozadí

I – průměrná hodnota intenzity daného izotopu v NIST SRM 1486

c – obsah daného prvku v NIST SRM 1486 (mg.kg-1)

36

4 Literatura

1. Dokládal, M., Anatomie zubů a chrupu. vydavatelství Masarykovy univerzity: Brno,

1994; 1. vydání.

2. Šedý, J.; Foltán, R., Klinická anatomie zubů a čelistí. Triton: Praha, 2009.

3. http://www1.us.elsevierhealth.com/SIMON/Bird/modern/EIC/graphics/7627_04_24.jpg.

(10. 5. 2013)

4. Smith, T. M.; Tafforeau, P., New Visions of Dental Tissue Research: Tooth

Development, Chemistry, and Structure. Evolutionary Anthropology 2008, 17 (5), 213-226.

5. www.szsvzs.cz/zt/soubory/vyvojzubu.doc.(10. 11. 2012)

6. Kang, D.; Amarasiriwardena, D.; Goodman, A. H., Application of laser ablation-

inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) to investigate trace metal

spatial distributions in human tooth enamel and dentine growth layers and pulp. Analytical

and Bioanalytical Chemistry 2004, 378 (6), 1608-1615.

7.

http://www.lfp.cuni.cz/histologie/education/guides/hardtissues/atlas_zub_kost_lowres.pdf.

(20. 11. 2012)

8. Sabel, N.; Johansson, C.; Kuhnisch, J.; Robertson, A.; Steiniger, F.; Noren, J. G.;

Klingberg, G.; Nietzsche, S., Neonatal lines in the enamel of primary teeth - A morphological

and scanning electron microscopic investigation. Archives of Oral Biology 2008, 53 (10), 954-

963.

9. Arora, M.; Kennedy, B. J.; Elhlou, S.; Pearson, N. J.; Walker, D. M.; Bayl, P.; Chan,

S. W. Y., Spatial distribution of lead in human primary teeth as a biomarker of pre- and

neonatal lead exposure. Science of the Total Environment 2006, 371 (1-3), 55-62.

10. Mahoney, P., Human Deciduous Mandibular Molar Incremental Enamel

Development. American Journal of Physical Anthropology 2011, 144 (2), 204-214.

11. Antoine, D.; Hillson, S.; Dean, M. C., The developmental clock of dental enamel: a

test for the periodicity of prism cross-striations in modern humans and an evaluation of the

most likely sources of error in histological studies of this kind. Journal of Anatomy 2009, 214

(1), 45-55.

12. Brown, C. J.; Chenery, S. R. N.; Smith, B.; Mason, C.; Tomkins, A.; Roberts, G. J.;

Sserunjogi, L.; Tiberindwa, J. V., Environmental influences on the trace element content of

37

teeth - implications for disease and nutritional status. Archives of Oral Biology 2004, 49 (9),

705-717.

13. Fischer, A.; Wiechula, D.; Postek-Stefanska, L.; Kwapulinski, J., Concentrations of

Metals in Maxilla and Mandible Deciduous and Permanent Human Teeth. Biological Trace

Element Research 2009, 132 (1-3), 19-26.

14. Hare, D.; Austin, C.; Doble, P.; Arora, M., Elemental bio-imaging of trace elements in

teeth using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Dentistry

2011, 39 (5), 397-403.

15. Dolphin, A. E.; Goodman, A. H.; Amarasiriwardena, D. D., Variation in elemental

intensities among teeth and between pre- and postnatal regions of enamel. American Journal

of Physical Anthropology 2005, 128 (4), 878-888.

16. Frank, R. M.; Sargentinimaier, M. L.; Turlot, J. C.; Leroy, M. J. F., Zinc and strontium

analyses by energy dispersive X-Ray fluorescence in human permanent teeth. Archives of

Oral Biology 1989, 34 (8), 593-597.

17. Toyama, Y.; Nakagaki, H.; Kato, S.; Huang, S.; Mizutani, Y.; Kojima, S.; Toyama,

A.; Ohno, N.; Tsuchiya, T.; Kirkham, J.; Robinson, C., Fluoride concentrations at and near

the neonatal line in human deciduous tooth enamel obtained from a naturally fluoridated and a

non-fluoridated area. Archives of Oral Biology 2001, 46 (2), 147-153.

18. Humphrey, L. T.; Dean, M. C.; Jeffries, T. E.; Penn, M., Unlocking evidence of early

diet from tooth enamel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States

of America 2008, 105 (19), 6834-6839.

19. Kumagai, A.; Fujita, Y.; Endo, S.; Itai, K., Concentrations of trace element in human

dentin by sex and age. Forensic Science International 2012, 219 (1-3), 29-32.

20. Lane, D. W.; Duffy, C. A., The analysis of trace elements in human teeth collected

from the Oxfordshire area in the UK. Nuclear Instruments & Methods in Physics Research

Section B-Beam Interactions with Materials and Atoms 1996, 118 (1-4), 392-395.

21. Lane, D. W.; Peach, D. F., Some observations on the trace element concentrations in

human dental enamel. Biological Trace Element Research 1997, 60 (1-2), 1-11.

22. Tvinnereim, H. M.; Eide, R.; Riise, T., Heavy metals in human primary teeth: some

factors influencing the metal concentrations. Science of the Total Environment 2000, 255 (1-

3), 21-27.

23. Kohn, M. J.; Schoeninger, M. J.; Barker, W. W., Altered states: Effects of diagenesis

on fossil tooth chemistry. Geochimica Et Cosmochimica Acta 1999, 63 (18), 2737-2747.

38

24. Szostek, K.; Glab, H.; Pudlo, A., The use of strontium and barium analyses for the

reconstruction of the diet of the early medieval coastal population of Gdansk (Poland): A

preliminary study. Homo-Journal of Comparative Human Biology 2009, 60 (4), 359-372.

25. Burton, J. H.; Price, T. D.; Middleton, W. D., Correlation of bone Ba Ca and Sr Ca

due to biological purification of calcium. Journal of Archaeological Science 1999, 26 (6),

609-616.

26. Sponheimer, M.; de Ruiter, D.; Lee-Thorp, J.; Spath, A., Sr/Ca and early hommin diets

revisited: new data from modern and fossil tooth enamel. Journal of Human Evolution 2005,

48 (2), 147-156.

27. Peek, S.; Clementz, M. T., Sr/Ca and Ba/Ca variations in environmental and biological

sources: A survey of marine and terrestrial systems. Geochimica Et Cosmochimica Acta 2012,

95, 36-52.

28. Balter, V., Allometric constraints on Sr/Ca and Ba/Ca partitioning in terrestrial

mammalian trophic chains. Oecologia 2004, 139 (1), 83-88.

29. Lee-Thorp, J. A.; Sponheimer, M.; Van der Merwe, N. H., What do stable isotopes tell

us about hominid dietary and ecological niches in the Pliocene? International Journal of

Osteoarchaeology 2003, 13 (1-2), 104-113.

30. Burton, J. H.; Price, T. D., The ratio of barium to strontium as a paleodietary indicator

of consumption of marine resources. Journal of Archaeological Science 1990, 17 (5), 547-

557.

31. Mays, S., Bone strontium: calcium ratios and duration of breastfeeding in a Mediaeval

skeletal population. Journal of Archaeological Science 2003, 30 (6), 731-741.

32. Smrčka V., Trace elements in the bone tissue. The Karolinum press: Praha, 2005.

33. Oelze, V. M.; Koch, J. K.; Kupke, K.; Nehlich, O.; Zauner, S.; Wahl, J.; Weise, S. M.;

Rieckhoff, S.; Richards, M. P., Multi-isotopic analysis reveals individual mobility and diet at

the early iron age monumental tumulus of magdalenenberg, germany. American Journal of

Physical Anthropology 2012, 148 (3), 406-421.

34. Prohaska, T.; Latkoczy, C.; Schultheis, G.; Teschler-Nicola, M.; Stingeder, G.,

Investigation of Sr isotope ratios in prehistoric human bones and teeth using laser ablation

ICP-MS and ICP-MS after Rb/Sr separation. Journal of Analytical Atomic Spectrometry

2002, 17 (8), 887-891.

35. L. Kovaříková, J. Brůžek: Stabilní izotopy a bioarcheologie – výživa a sledování

migrací v populacích minulosti, Živa (2008) 42 - 45

39

36. Dolphin, A. E.; Goodman, A. H., Maternal Diets, Nutritional Status, and Zinc in

Contemporary Mexican Infants' Teeth: Implications for Reconstructing Paleodiets. American

Journal of Physical Anthropology 2009, 140 (3), 399-409.

37. Brudevold, F.; Steadman, L. T.; Spinelli, M. A.; Amdur, B. H.; Gron, P., A study of

zinc in human teeth. Archives of Oral Biology 1963, 8 (2), 135-144.

38. Diaz, A. L.; O'Connell, T. C.; Maher, L. A.; Stock, J. T., Subsistence and mobility

strategies in the Epipalaeolithic: a stable isotope analysis of human and faunal remains at

'Uyun al-Hammam, northern Jordan. Journal of Archaeological Science 2012, 39 (7), 1984-

1992.

39. van der Merwe, N. J.; Thackeray, J. F.; Lee-Thorp, J. A.; Luyt, J., The carbon isotope

ecology and diet of Australopithecus africanus at Sterkfontein, South Africa. Journal of

Human Evolution 2003, 44 (5), 581-597.

40. Harrison, R. G.; Katzenberg, M. A., Paleodiet studies using stable carbon isotopes

from bone apatite and collagen: examples from Southern Ontario and San Nicolas Island,

California. Journal of Anthropological Archaeology 2003, 22 (3), 227-244.

41. Sponheimer, M.; Lee-Thorp, J. A., Oxygen isotopes in enamel carbonate and their

ecological significance. Journal of Archaeological Science 1999, 26 (6), 723-728.

42. Kohn, M. J.; Schoeninger, M. J.; Valley, J. W., Herbivore tooth oxygen isotope

compositions: Effects of diet and physiology. Geochimica Et Cosmochimica Acta 1996, 60

(20), 3889-3896.

43. Turner, B. L.; Zuckerman, M. K.; Garofalo, E. M.; Wilson, A.; Kamenov, G. D.; Hunt,

D. R.; Amgalantugs, T.; Frohlich, B., Diet and death in times of war: isotopic and osteological

analysis of mummified human remains from southern Mongolia. Journal of Archaeological

Science 2012, 39 (10), 3125-3140.

44. Dauphin, Y.; Massard, P.; Quantin, C., In vitro diagenesis of teeth of Sus scrofa

(Mammalia, Suidae): Micro- and nanostructural alterations and experimental dissolution.

Palaeogeography Palaeoclimatology Palaeoecology 2008, 266 (3-4), 134-141.

45. Carvalho, M. L.; Marques, A. F., Diagenesis evaluation in Middle Ages human bones

using EDXRF. X-Ray Spectrometry 2008, 37 (1), 32-36.

46. Hinz, E. A.; Kohn, M. J., The effect of tissue structure and soil chemistry on trace

element uptake in fossils. Geochimica Et Cosmochimica Acta 2010, 74 (11), 3213-3231.

47. Michel, V.; Ildefonse, P.; Morin, G., Chemical and structural changes in Cervus

Elaphus tooth enamels during fossilization (Lazaret Cave) - A combined PR and XRD

rietveld analysis. Applied Geochemistry 1995, 10 (2), 145-159.

40

48. Wang, Y.; Cerling, T. E., A model of fossil tooth and bone diagenesis - implications

for paleodiet reconstruction from stable isotopes. Palaeogeography Palaeoclimatology

Palaeoecology 1994, 107 (3-4), 281-289.

49. Wen, X. Y.; Wang, C. S.; Huang, C. M.; Bai, S.; Zhang, Q., A novel method to assess

the effect of diagenesis on fossil teeth: Rare earth element signatures. Journal of Rare Earths

2011, 29 (7), 710-715.

50. De Muynck, D.; Vanhaecke, F., Development of a method based on inductively

coupled plasma-dynamic reaction cell-mass spectrometry for the simultaneous determination

of phosphorus, calcium and strontium in bone and dental tissue. Spectrochimica Acta Part B-

Atomic Spectroscopy 2009, 64 (5), 408-415.

51. King, C. L.; Tayles, N.; Gordon, K. C., Re-examining the chemical evaluation of

diagenesis in human bone apatite. Journal of Archaeological Science 2011, 38 (9), 2222-

2230.

52. Tenorová, L., Studium distribuce prvků ve vzorcích zubů pomocí LA-ICP-MS. In

Bakalářská práce, Brno, 2011.

53. Lochner, F.; Appleton, J.; Keenan, F.; Cooke, M., Multi-element profiling of human

deciduous teeth by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytica

Chimica Acta 1999, 401 (1-2), 299-306.

54. Arora, M.; Hare, D.; Austin, C.; Smith, D. R.; Doble, P., Spatial distribution of

manganese in enamel and coronal dentine of human primary teeth. Science of the Total

Environment 2011, 409 (7), 1315-1319.

55. Lee, K. M.; Appleton, J.; Cooke, M.; Keenan, F.; Sawicka-Kapusta, K., Use of laser

ablation inductively coupled plasma mass spectrometry to provide element versus time

profiles in teeth. Analytica Chimica Acta 1999, 395 (1-2), 179-185.

56. Uryu, T.; Yoshinaga, J.; Yanagisawa, Y.; Endo, M.; Takahashi, J., Analysis of lead in

tooth enamel by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical

Sciences 2003, 19 (10), 1413-1416.

57. Budd, P.; Montgomery, J.; Cox, A.; Krause, P.; Barreiro, B.; Thomas, R. G., The

distribution of lead within ancient and modern human teeth: Implications for long-term and

historical exposure monitoring. Science of the Total Environment 1998, 220 (2-3), 121-136.

58. Dočkalová, M., Antropofagie a pohřební ritus doby bronzové. Čs. společnost

antropologická při ČSAV a Moravské muzeum - Ústav Anthropos Brno: Brno, 1988; p 251.

59. Přichystal, A.; Valová, P., Provenience metabazitů kamenné broušené industrie z

neolitického sídliště u Těšetic-Kyjovic, okr. Znojmo. Krystalinikum: Brno, 2010; pp 156-161.

41

60. Galiova, M.; Kaiser, J.; Fortes, F. J.; Novotny, K.; Malina, R.; Prokes, L.; Hrdlicka,

A.; Vaculovic, T.; Fisakova, M. N.; Svoboda, J.; Kanicky, V.; Laserna, J. J., Multielemental

analysis of prehistoric animal teeth by laser-induced breakdown spectroscopy and laser

ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. Applied Optics 2010, 49 (13), C191-

C199.

61. Vašinová Galiová, M.; Nývltová Fišáková, M.; Kynický, J.; Prokeš, L.; Neff, H.;

Mason, A. Z.; Gadas, P.; Kanický, V., Elemental mapping in fossil tooth root section of Ursus

arctos by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS).

Talanta, 2013, 105, 235-243.