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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 9 , p p . 1 1 0 0 - 1 1 0 4 , F e b r u a r y 1 9 9 2B i o c h e m i s t r y

E n z y m a t i c c a t a l y s i s a n d d y n a m i c s i n l o w - w a t e r e n v i r o n m e n t sRHETT A F F L E C K * , ZU-FENG X U t , V A L E R I E S U Z A W A * , KATHLEEN F O C H T t , DOUGLAS S . CLARK*1,AN D JONATHAN S . D O R D I C K t t* D e p a r t m e n t o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , B e r k e l e y , C A 9 4 7 2 0 ; a n d t D e p a r t m e n t o f C h e m i c a l a n d B i o ch e m i c a l E n g i n e e r i n g a n d C e n t e rf o r B i o c a t a l y s i s a n d B i o p r o c e s s i n g , U n i v e r s i t y o f I o w a , I o w a C i t y , I A 5 2 2 4 2C o m m u n i c a t e d b y T . K e n t K i r k , O c t o b e r 2 8 , 1 9 9 1 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w J u l y 2 8 , 1 9 9 1 )ABSTRACT E n z y m e s s u s p e n d e d i n o r g a n i c s o l v e n t s r e p -r e s e n t a v e r s a t i l e s y s t e m f o r s t u d y i n g t h e i n v o l v e m e n t o f w a t e ri n e n z y m e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . A d d i t i o n o f l e s s t h a n 1 %( v o l / v o l ) w a t e r t o t e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g 1 M 1 - p r o p a n o ll e a d s t o a s u b s t a n t i a l i n c r e a s e i n t h e t r a n s s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t yo f s u b t i l i s i n C a r l s b e r g ( f r o m B a c i l u s l i c h e n i f o r m i s ) t h a t c o r -r e l a t e s w i t h a s h a r p i n c r e a s e i n t h e a c t i v e - s i t e p o l a r i t y a n d a90% d e c r e a s e i n t h e r o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e ( i . e . , i n c r e a s ei n m o b i l i t y ) o f a n i t r o x i d e s p i n l a b e l w i t h i n t h e a c t i v e s i t e .W a t e r i n e x c e s s o f 1 % h a s l i t t l e a d d i t i o n a l e f f e c t o n a c t i v e - s i t ep o l a r i t y a n d c o i n c i d e s w i t h a f u r t h e r i n c r e a s e i n s p i n - l a b e lm o b i l i t y , y e t t h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y d e c r e a s e s d r a m a t -i c a l l y . T h u s , t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y i n c r e a s e s a n d t h e nd e c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n g e n z y m e h y d r a t i o n a n d f l e x i b i l i t y( w h i c h a r e p r e s u m a b l y c o u p l e d t h r o u g h d i e l e c t r i c s c r e e n i n g ) ,s u g g e s t i n g t h a t t h e c o n f o r m a t i o n o f p a r t i a i l y h y d r a t e d s u b t i l i -s i n i s d i f l e r e n t f r o m t h a t o f t h e n e a r l y d r y e n z y m e - 4 . e . ,e n z y m e c o n t a i n i n g l e s s t h a n 9 % ( w t / w t ) w a t e r .T h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f e n z y m e s d e p e n d l a r g e l yo n t h e d i r e c t o r i n d i r e c t r o l e o f w a t e r i n v a r i o u s n o n c o v a l e n ti n t e r a c t i o n s i n c l u d i n g s o l v a t i o n o f i o n i c g r o u p s a n d d i p o l e s ,h y d r o g e n b o n d i n g , a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s ( 1 , 2 ) . M o s ts t u d i e s a i m e d a t e l u c i d a t i n g t h e r o l e o f w a t e r i n e n z y m es t r u c t u r e a n d f u n c t i o n h a v e u t i l i z e d h y d r a t e d p r o t e i n p o w -d e r s o r f i l m s ( 3 - 1 0 ) . F o r e x a m p l e , s t u d i e s o f l y s o z y m ep o w d e r s e q u i l i b r a t e d w i t h w a t e r i n a i r h a v e s h o w n t h a tc a t a l y s i s o c c u r s a t a h y d r a t i o n l e v e l ( c a . 0 . 2 g o f w a t e r p e r go f e n z y m e ) w e l l b e l o w m o n o l a y e r w a t e r c o v e r a g e ( 1 0 ) . NMRa n a l y s i s o f t h e h y d r a t i o n p r o c e s s i n d i c a t e s t h a t t h e o n s e t o fc a t a l y t i c a c t i v i t y i s a d i r e c t c o n s e q u e n c e o f a n i n c r e a s e i nl y s o z y m e ' s c o n f o r m a t i o n a l f l e x i b i l i t y ( 3 , 1 1 ) . I t h a s b e e ns u g g e s t e d t h a t t h i s i n c r e a s e d f l e x i b i l i t y may b e d u e , i n p a r t ,t o t h e r e d u c e d i n t e r a c t i o n o f c h a r g e d a n d / o r p o l a r a m i n o a c i dr e s i d u e s w i t h i n t h e e n z y m e m o l e c u l e c a u s e d b y w a t e r ' sa b i l i t y t o e f f e c t d i e l e c t r i c s c r e e n i n g ( 1 2 ) . T h u s , w a t e r may a c tb o t h a s a p l a s t i c i z e r t o i n c r e a s e t h e s t r u c t u r a l f l e x i b i l i t y o f a ne n z y m e m o l e c u l e ( 3 ) a n d a s a s o l v e n t t o d i e l e c t r i c a l l y s c r e e nu n f a v o r a b l e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c h a r g e d a n d / o r p o l a r r e s -i d u e s w i t h i n t h e p r o t e i n m o l e c u l e ( 3 , 1 2 ) . H o w e v e r , t h e u s eo f e n z y m e p o w d e r s c o m p l i c a t e s t h e m e a s u r e m e n t o f e n z y m ea c t i v i t y , p a r t i c u l a r l y a t l o w c a t a l y t i c a c t i v i t i e s . H e n c e , t h em o l e c u l a r b a s i s f o r t h e i n d u c t i o n o f e n z y m e f u n c t i o n b yw a t e r r e m a i n s u n c l e a r .An a l t e r n a t i v e t o h y d r a t e d p o w d e r s i s t o u s e e n z y m e s i np a r t i a l l y h y d r a t e d o r g a n i c s o l v e n t s . E n z y m e s a r e w e l l k n o w nt o f u n c t i o n i n n o n a q u e o u s m e d i a ( 1 3 - 1 5 ) . A s i n h y d r a t e dp o w d e r s , e n z y m e f u n c t i o n i n n o n a q u e o u s m e d i a i s s t r o n g l yd e p e n d e n t u p o n t h e w a t e r c o n t e n t o f t h e e n z y m e ( 1 6 , 1 7 ) .H o w e v e r , t h e r o l e o f w a t e r i n m o l e c u l a r e v e n t s a t t h ee n z y m i c a c t i v e s i t e l e a d i n g t o c a t a l y s i s i n l o w - w a t e r e n v i -r o n m e n t s i s n o t w e l l u n d e r s t o o d . I n t h i s w o r k , we h a v e

p r o b e d t h e a c t i v e s i t e s t r u c t u r e a n d d y n a m i c s o f s u b t i l i s i n i nn o n a q u e o u s m e d i a a n d h a v e c o r r e l a t e d o b s e r v e d s t r u c t u r a l /c h e m i c a l c h a n g e s i n t h e e n v i r o n m e n t o f a n a c t i v e - s i t e s p i nl a b e l w i t h b o t h e n z y m e h y d r a t i o n a n d c a t a l y t i c f u n c t i o n .S u b t i l i s i n C a r l s b e r g w a s c h o s e n f o r t h e s e s t u d i e s f o r s e v e r a lr e a s o n s : ( i ) t h e e n z y m e i s c o f a c t o r - i n d e p e n d e n t a n d , h e n c e ,c o f a c t o r - e n z y m e i n t e r a c t i o n s n e e d n o t b e c o n s i d e r e d ; ( i i ) t h et h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e e n z y m e i s k n o w n t o 1 . 8 A( 1 8 ) ; a n d ( i i i ) s u b t i l i s i n i s a c t i v e i n a w i d e v a r i e t y o f o r g a n i cs o l v e n t s a n d i s c a t a l y t i c a l l y a c t i v e e v e n w i t h v e r y l i t t l eb o u n d - w a t e r [ c a . 9 % o ( w t / w t ) ] ( 1 6 ) .MATERIALS A N D M E T H O D S

M a t e r i a l s . S u b t i l i s i n C a r l s b e r g ( f r o m B a c i l l u s l i c h e n i -f o r m i s ) w a s o b t a i n e d f r o m S i g m a . T h e e n z y m e w a s a c t i v a t e dp r i o r t o u s e i n o r g a n i c m e d i a b y l y o p h i l i z a t i o n f r o m a q u e o u s2 0 mM p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 8 ) . I n t h i s m a n n e r , t h ei o n o g e n i c g r o u p s o f t h e e n z y m e a r e r e t a i n e d i n t h e i r c a t a l y t -i c a l l y c o r r e c t f o r m i n n o n a q u e o u s m e d i a ( 1 3 - 1 5 ) . S u b t i l i s i nB P N ' ( f r o m B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s ) w a s s u p p l i e d b yJ a m e s W e l l s , G e n e n t e c h . T h e s p i n l a b e l , 4 - ( e t h o x y f l u o r o -p h o s p h i n y l o x y ) - T E M P O (TEMPO = 2 , 2 , 6 , 6 - t e t r a m e t h y l - 1 -p i p e r i d i n y l o x y , f r e e r a d i c a l ) , w a s o b t a i n e d f r o m A l d r i c h . A l lo t h e r c h e m i c a l s a n d s o l v e n t s u s e d i n t h i s w o r k w e r e o f t h eh i g h e s t g r a d e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . A l l s o l v e n t s w e r et w i c e d i s t i l l e d a n d s t o r e d o v e r m o l e c u l a r s i e v e s ( 3 A , L i n d e )a t l e a s t 2 4 h r p r i o r t o u s e .K i n e t i c S t u d i e s . T h e c a t a l y t i c e f f i c i e n c i e s o f s u b t i l i s i nC a r l s b e r g w e r e d e t e r m i n e d i n t e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n gd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f w a t e r . T h e r e a c t i o n s t u d i e d w a st h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o n o f N - a c e t y l - L - p h e n y l a l a n i n e 2 - c h l o r o -e t h y l e s t e r ( N A P C E ) w i t h 1 - p r o p a n o l . I n a t y p i c a l e x p e r i -m e n t , 2 mg o f s u b t i l i s i n p o w d e r w a s a d d e d t o 2 m l o ft e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g 1 0 - 5 0 mM N A P C E a n d 1 M1 - p r o p a n o l . T h e e n z y m e s u s p e n s i o n w a s m i x e d v i g o r o u s l y i na V o r t e x f o r 1 0 s e c , a n d w a t e r w a s t h e n a d d e d ( r a n g i n g f r o mn o a d d e d w a t e r t o a t o t a l o f 1 4 0 1 . o f w a t e r ) , a n d t h es u s p e n s i o n w a s m i x e d f o r 1 0 s e c a n d s o n i c a t e d f o r a na d d i t i o n a l 3 0 s e c . No e v i d e n c e o f e n z y m e i n t e r a c t i n g w i t h t h eg l a s s v i a l w a s o b t a i n e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s s h a ke n a t2 5 0 r p m a t 3 0 0 C . I n i t i a l r a t e m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e do v e r a 4 - t o 8 - h r p e r i o d , d u r i n g w h i c h t i m e n o l o s s i n e n z y m ea c t i v i t y o c c u r r e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e a n a l y z e d b yg a s c h r o m a t o g r a p h y ( G C ) a n d h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o -m a t o g r a p h y ( H P L C ) . T h e f o r m e r m e t h o d m e a s u r e d t h e f o r -m a t i o n o f t h e N - a c e t y l - L - p h e n y l a l a n i n e p r o p y l e s t e r( N A P P E ) t r a n s e s t e r i f i c a t i o n p r o d u c t b y u s i n g a n H P - 1 ,5 3 0 - , u m f u s e d s i l i c a c a p i l l a r y c o l u m n ( H e w l e t t - P a c k a r d ) o f2 5 - m l e n g t h a n d 0 . 3 3 - , u m i n s i d e d i a m e t e r w i t h a N 2 c a r r i e r g a sf l o w r a t e o f 0 . 5 m l / m i n , 2 5 0 C i n j e c t i o n a n d d e t e c t i o n t e m -A b b r e v i a t i o n s : TEMPO, 2 , 2 , 6 , 6 - t e t r a m e t h y l - 1 - p i p e r i d i n y l o x y f r e er a d i c a l ; NAPCE, N - a c e t y l - L - p h e n y l a l a n i n e 2 - c h l o r o e t h y l e s t e r ;NAPPE, N - a c e t y l - L - p h e n y l a l a n i n e p r o p y l e s t e r ; S T - E S R , s a t u r a -t i o n - t r a n s f e r e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e .t T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

1 1 0 0

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 9 ( 1 9 9 2 ) 1 1 0 1p e r a t u r e s , a n d a n i n i t i a l c o l u m n t e m p e r a t u r e o f 1 8 0 0 C f o r 1m i n , w h i c h t h e r e a f t e r i n c r e a s e d t o 2 5 0 ' C a t a r a t e o f 3 5 0 C /m i n . H y d r o l y s i s o f N A P C E i n s o l u t i o n s w i t h a d d e d w a t e rw a s m e a s u r e d b y H P L C b y u s i n g a A B o n d a p a k C 1 8 r e v e r s e -p h a s e c o l u m n w i t h a 24% a c e t o n i t r i l e s o l u t i o n i n 1 0 mMammonium p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 2 . 3 ) a s e l u a n t a t a f l o w r a t eo f 1 . 5 m l / m i n . D e t e c t i o n o f t h e N A P P E p r o d u c t w a s p e r -f o r m e d a t 2 8 0 nm w i t h a p h o t o d i o d e a r r a y d e t e c t o r ( m o d e l9 9 0 , W a t e r s ) . T h e k i n e t i c p a r a m e t e r V m a . , / K m w a s d e t e r -m i n e d b y n o n l i n e a r M i c h a e l i s - M e n t e n f i t t i n g o f t h e r a t e d a t aw i t h a n o n l i n e a r r e g r e s s i o n a l g o r i t h m ( 1 9 ) .T h e k i n e t i c d a t a w e r e c o n v e r t e d i n t o i n t r i n s i c c a t a l y t i ce f f i c i e n c i e s ( k c a t / K m ) b y n o r m a l i z i n g V m j / K m b y t h e c o n -c e n t r a t i o n o f a c t i v e e n z y m e u s e d . T h i s w a s d o n e v i a a c t i v e -s i t e t i t r a t i o n u s i n g t h e a c t i v e - s i t e r e v e r s i b l e i n h i b i t o r N - t r a n s -c i n n a m o y l i m i d a z o l e a s d e s c r i b e d b y Z a k s a n d K l i b a n o v ( 1 6 ) .I n a q u e o u s b u f f e r , a l l e n z y m i c a c t i v e s i t e s w e r e a c c e s s i b l e t ot h e s o l v e n t , a n d 63% o f t h e e n z y m e w a s a c t i v e . I n d r yt e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g 1 M 1 - p r o p a n o l , r o u g h l y 1 5 4%o f t h e s u b t i l i s i n ' s a c t i v e s i t e s w e r e a c c e s s i b l e t o t h e o r g a n i cs o l v e n t w i t h i n 4 8 h r , a t w h i c h p o i n t e q u i l i b r i u m w a s r e a c h e d .T h i s f r a c t i o n d i d n o t c h a n g e s i g n i f i c a n t l y u p o n a d d i t i o n o fw a t e r u p t o 2 0 j k l / m l . A b o v e t h i s w a t e r c o n c e n t r a t i o n , t h ef r a c t i o n o f a c t i v e s i t e s e x p o s e d t o t h e s o l v e n t i n c r e a s e dd r a m a t i c a l l y ; w h e n a d d e d w a t e r r e a c h e d 7 0 p u / m l , a l l p o s s i b l ea c t i v e s i t e s w e r e a c c e s s i b l e t o t h e s o l v e n t .D e t e r m i n a t i o n o f E n z y m e - B o u n d W a t e r . T h e e n z y m e -b o u n d w a t e r w a s m e a s u r e d a s f o l l o w s ( 1 6 ) : 1 m g o f s u b t i l i s i np e r m l w a s s u s p e n d e d i n t e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g a s p e -c i f i c c o n c e n t r a t i o n o f w a t e r . T h e s u s p e n s i o n w a s s h a k e n a t2 5 0 r p m a t 3 0 ' C f o r 1 0 m i n , a f t e r w h i c h t h e m i x t u r e w a sc e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s d e c a n t e d . T h e w a t e rc o n t e n t o f t h e s u p e r n a t a n t was t h e n d e t e r m i n e d b y K a r lF i s c h e r c o u l o m e t r i c t i t r a t i o n . T h e r e m a i n i n g s o l i d m a t e r i a lw i t h e n t r a i n e d s o l v e n t ( t h e w a t e r c o n t e n t o f t h e e n t r a i n e ds o l u t i o n w a s a s s u m e d t o b e e q u i v a l e n t t o t h e d e c a n t e ds u p e r n a t a n t ) w a s t h e n w e i g h e d . T h e s o l v e n t v o l u m e w a s

3 0 -

0 " OE 2 0 -ca )c0a )0

4 0W a t e r a d d e d , , l / m lF I G . 1 . W a t e r a d s o r p t i o n i s o t h e r m f o r s u b t i l i s i n C a r l s b e r g i nt e t r a h y d r o f u r a n . T h e c o n d i t i o n s were s u b t i l i s i n a t 1 m g / m l s us -p e n d e d i n t e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g 1 M 1 - p r o p a n o l w i t h d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o f a d d e d w a t e r . T h e d a t a p o i n t s s h o w n r e p r e s e n tt r i p l i c a t e measurements w i t h s t a n d a r d d e v i a t i o n s o f l e s s t h a n 5% o ft h e m e a s u r e d v a l u e s . S h a k i n g f o r 6 0 m i n h a d no e f f e c t on t h ee q u i l i b r i u m o f w a t e r b i n d i n g o n t o t h e enzyme.

c a l c u l a t e d f r o m t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m e a s u r e d w e i g h t o ft h e t o t a l s a m p l e a n d t h e w e i g h t o f t h e e n z y m e i n i t i a l l y a d d e d .T h e w a t e r c o n t e n t o f t h e e n t i r e m i x t u r e w a s t h e n d e t e r m i n e d b yK a r l F i s c h e r t i t r a t i o n . T h e a m o u n t o f w a t e r b o u n d t o t h es u b t i l i s i n w a s t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m e a s u r e d w a t e r a n dt h e w a t e r c a l c u l a t e d t o b e i n t h e e n t r a i n e d s o l v e n t .E l e c t r o n S p i n R e s o n a n c e ( E S R ) S t u d i e s . S u b t i l i s i n w a ss p i n - l a b e l e d w i t h 4 - ( e t h o x y f l u o r o p h o s p h i n y l o x y 3 - T E M P O a sd e s c r i b e d b y M o r r i s e t t a n d B r o o m f i e l d ( 2 0 ) . T h e s p i n - l a b e l e de n z y m e w a s s u s p e n d e d i n o r g a n i c s o l v e n t s o l u t i o n s c o n t a i n -i n g t h e w a t e r c o n c e n t r a t i o n s i n d i c a t e d a n d t r a n s f e r r e d v i a as y r i n g e t o g l a s s c a p i l l a r y t u b e s f o r E SR m e a s u r e m e n t s .C o n v e n t i o n a l s p e c t r a w e r e r e c o r d e d a t r o o m t e m p e r a t u r e o na B r u k e r ER200D-SRC E SR s p e c t r o m e t e r w i t h a m i c r o w a v ep o w e r o f 1 2 . 6 m W, a m o d u l a t i o n a m p l i t u d e o f 1 . 0 G ( 1 G =0 . 1 m T ) , a n d a s c a n r a n g e o f 1 5 0 G . _ - T o o b t a i n s a t u r a t i o nt r a n s f e r ESR ( S T - E S R ) s p e c t r a , o u t - o f - p h a s e s e c o n d h a r -m o n i c a b s o r p t i o n s p e c t r a w e r e p h a s e d u s i n g t h e " s e l f - n u l l "m e t h o d ( 2 1 ) . T h e m o d u l a t i o n f r e q u e n c y w a s 5 0 k H z , t h em o d u l a t i o n a m p l i t u d e w a s 5 G , a n d t h e m i c r o w a v e p o w e rw a s 3 5 0 m W.F o r a c t i v e - s i t e p o l a r i t y c a l c u l a t i o n s , t h e A o v a l u e s w e r ed e t e r m i n e d f r o m c o m p u t e r s i m u l a t i o n s o f E SR s p e c t r a r e -c o r d e d a t 1 2 0 K . R i g i d - l i m i t c o m p u t e r s i m u l a t i o n s u s i n gs t a n d a r d f i r s t - o r d e r t r a n s i t i o n e n e r g i e s ( 2 2 ) w e r e p e r f o r m e dw i t h a p r o g r a m o b t a i n e d f r o m J . H . F r e e d a n d c o - w o r k e r s( D e p t . o f C h e m i s t r y , C o r n e l l U n i v . ) . B e s t - f i t s i m u l a t i o n sw e r e o b t a i n e d b y a l l o w i n g c o m p o n e n t s o f t h e A a n d g t e n s o r st o v a r y i n o r d e r t o m a x i m i z e t h e a g r e e m e n t b e t w e e n e x p e r -i m e n t a l a n d c a l c u l a t e d s p e c t r a . F o r t h e s i m u l a t i o n s , t h e x a x i sw a s t a k e n a s b e i ng a l o ng t h e N - O b o n d , t h e z a x i s a l o n g t h e

0 . 8 -

' 0 . 6 -4 0 . 40

0.2

0 . 00 8 00 4 0W a t e r a d d e d , , u l / m l

F I G . 2 . C a t a l y t i c e f f i c i e n c i e s o f s u b t i l i s i n C a r l s b e r g i n t e t r a h y -d r o f u r a n w i t h d i f f e r e n t w a t e r c o n t e n t s . The r a t e o f NAPPE f o r m a t i o nf r o m N A P C E was d e t e r m i n e d b y GC. H y d r o l y s i s was n o t o b s e r v e d( a s d e t e r m i n e d b y t h e l a c k o f appearance o f N - a c e t y l - L -p h e n y l a l a n i n e o n r e v e r s e - p h a s e H P L C) b e l o w 3 0 1 d o f a d d e d w a t e rper m l o f s o l v e n t . W h i l e t h e c a t a l y t i c e f f i c i e n c i e s o f s u b t i l i s i n are c a .3 o r d e r s o f m a g n i t u d e b e l o w v a l u e s i n aq u eou s s o l u t i o n s , c a t a l y s i s i na n o r g a n i c medium i s a r e s u l t o f a c t i v e - s i t e c h e m i s t r y a s shown i n twoc o n t r o l e x p e r i m e n t s : ( i ) s u b t i l i s i n p r e i n a c t i v a t e d w i t h p h e n y l -m e t h a n e s u l f o n y l f l u o r i d e was n e a r l y c o m p l e t e l y i n a c t i v e i n t e t r a h y -d r o f u r a n ( a t l e a s t 4 o r d e r s o f m a g n i t u d e l e s s a c t i v e t h a n t h e p H -a d j u s t e d e n z y m e - t h e s e n s i t i v i t y l i m i t f o r d e t e c t i o n o f t h e e s t e rp r o d u c t b y G C ) ; a n d ( i i ) t h e a c t i v i t y o f a n a c t i v e - s i t e mutant S221A[ w h e r e b y a l a n i n e r e p l a c e s s e r i n e a t t h e a c t i v e s i t e ( p o s i t i o n 2 2 1 ) o ft h e s u b t i l i s i n ] f o r t h e r e l a t e d e n z y m e f r o m B . a m y l o l i q u e f a c i e n s( s u b t i l i s i n B P N ' ) i s a l s o a t l e a s t 4 o r d e r s o f m a g n i t u d e l e s s a c t i v e t h a nt h e p H - a d j u s t e d enzyme.

*

B i o c h e m i s t r y : A f f l e c k e t A

7/29/2019 PNAS-1992-Affleck-1100-4

3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 )2 p i r o r b i t a l o f t h e n i t r o g e n , a n d t h e y a x i s p e r p e n d i c u l a r t ot h e o t h e r t w o .

R ESUL TS A N D DISCUSSIONI n t h e a b s e n c e o f a d d e d w a t e r i n t e t r a h y d r o f u r a n [ < 0 . 0 1 %( v o l / v o l ) w a t e r ] c o n t a i n i n g 1 M 1 - p r o p a n o l , t h e e n z y m ec o n t a i n s a b o u t 9 % 6 ( w t / w t ) w a t e r . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ,s u b t i l i s i n e x h i b i t s l o w b u t m e a s u r a b l e t r a n s e s t e r i f i c a t i o na c t i v i t y w i t h N A P C E a n d 1 - p r o p a n o l ( k c a t / K m = 0 . 1 5M - 1 l s ' 1 ) . An i n c r e a s e i n t h e w a t e r c o n t e n t o f t h e t e t r a h y -d r o f u r a n c a u s e s a n i n c r e a s e i n t h e l e v e l o f e n z y m e h y d r a t i o n ,u p t o c a . 3 5 % ( w t / w t ; t h e c a l c u l a t e d m o n o l a y e r c o v e r a g eb a s e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t s u b t i l i s i n i s a s p h e r i c a l p r o t e i no f Mr 2 7 , 5 0 0 ) i n t e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g 7 0 , A l o f w a t e r p e rm l . T h e e n z y m i c h y d r a t i o n l e v e l f o l l o w s a L a n g m u i r - t y p ea d s o r p t i o n i s o t h e r m ( F i g . 1 ) . T h e l e v e l o f e n z y m e h y d r a t i o nh a s a s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f s u b t i l i s i n i nt e t r a h y d r o f u r a n ( F i g . 2 ) . T h e a d d i t i o n o f 2 , l o f w a t e r p e r m lo f t e t r a h y d r o f u r a n d o u b l e s t h e c a t a l y t i c e f f i c i e n c y o f t r a n s -e s t e r i f i c a t i o n , w h i l e a d d i t i o n o f 5 p l o f w a t e r p e r m l i n c r e a s e st h e c a t a l y t i c e f f i c i e n c y m o r e t h a n 6 - f o l d . T h i s i n c r e a s e i nc a t a l y t i c e f f i c i e n c y i s n o t d u e t o a n i n c r e a s e i n t h e f r a c t i o n o fe n z y m e a c t i v e s i t e s e x p o s e d t o t h e o r g a n i c s o l v e n t , a s t h i sf r a c t i o n d o e s n o t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e u p o n a d d i t i o n o f w a t e ru p t o 2 0 d u l / m l . H o w e v e r , f u r t h e r a d d i t i o n o f w a t e r c a u s e s ad r a m a t i c i n a c t i v a t i o n o f s u b t i l i s i n t o w a r d t h e e s t e r s u b s t r a t e .S p e c i f i c a l l y , a l o s s i n c a t a l y t i c e f f i c i e n c y b y a f a c t o r o f 7r e s u l t s f r o m a n i n c r e a s e i n w a t e r f r o m 5 p l t o 2 0 A l p e r m l o ft e t r a h y d r o f u r a n . T h i s d r o p i n a c t i v i t y i s n o t d u e t o c o m p e t i n gh y d r o l y s i s i n t h e p r e s e n c e o f h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f w a t e r ,a s h y d r o l y s i s r e m a i ns s u p p r e s s e d b e l o w a w a t e r c o n t e n t o f 3 0, l p e r m l o f t e t r a h y d r o f u r a n .T o i n v e s t i g a t e w h e t h e r t h e i n i t i a l i n c r e a s e i n c a t a l y t i ce f f i c i e n c y a t l o w w a t e r c o n t e n t i n t e t r a h y d r o f u r a n may b e d u et o a n i n c r e a s e i n t h e f l e x i b i l i t y o f t h e e n z y m e , t h e m o b i l i t y o fa n i t r o x i d e s p i n l a b e l b o u n d t o S e r - 2 2 1 ( t h e a c t i v e - s i t en u c l e o p h i l e ) w a s e x a m i n e d o v e r a w i d e r a n g e o f w a t e rc o n c e n t r a t i o n s . S h o w n i n F i g . 3 a r e c o n v e n t i o n a l a n d s a t u -r a t i o n t r a n s f e r E SR s p e c t r a o f s u b t i l i s i n s p i n - l a b e l e d a t i t sa c t i v e - s i t e s e r i n e w i t h a f l u o r o p h o s p h o n a t e s p i n l a b e l . T h es p e c t r u m i n t e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g 7 0 A l I o f a d d e d w a t e rp e r m l i s s i m i l a r t o t h a t o f s u b t i l i s i n d i s s o l v e d i n a q u e o u sb u f f e r a n d i s c h a r a c t e r i s t i c o f i n t e r m e d i a t e s p i n - l a b e l m o b i l -i t y . S p e c t r a l s i m u l a t i o n s ( 2 3 ) i n d i c a t e t h a t t h e a v e r a g e r o t a -t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e o f t h e s p i n l a b e l i n t h i s c a s e i s a b o u t3 n s e c . H o w e v e r , a s t h e c o n c e n t r a t i o n o f a d d e d w a t e rd e c r e a s e s , t h e s p e c t r u m b r o a d e n s , r e f l e c t i n g a l o n g e r r o t a -t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e a n d r e d u c e d m o b i l i t y o f t h e s p i n l a b e l .I n t h e r a n g e o f 0 - 5 p l o f a d d e d w a t e r p e r m l o f t e t r a h y -d r o f u r a n , t h e c o n v e n t i o n a l s p e c t r u m i s n e a r l y i d e n t i c a l t ot h a t o f t h e r i g i d , d r y e n z y m e ( f r e e e n z y m e p o w d e r ) . T h u s , t h es p e c t r a i n t h i s r a n g e o f a d d e d w a t e r r e p r e s e n t t h e r i g i d l i m i to f c o n v e n t i o n a l E SR a n d a r e n o t v e r y s e n s i t i v e i n s h a p e t om o t i o n s s l o w e r t h a n a b o u t 1 0 0 n s e c . I n c o n t r a s t , S T - E S R ,w h i c h i s s e n s i t i v e t o m u c h s l o w e r m o t i o n s t h a n c o n v e n t i o n a lE SR ( 2 1 ) ; s h o w e d a s u b s t a n t i a l i n c r e a s e i n s p i n - l a b e l m o b i l i t yw i t h a d d e d w a t e r f r o m 0 t o 2 0 A l / m l . H e n c e , t h e i n c r e a s e dc a t a l y t i c e f f i c i e n c y o f s u b t i l i s i n i n t h e p r e s e n c e o f 5 p l o fw a t e r p e r m l o f t e t r a h y d r o f u r a n i s a c c o m p a n i e d b y a n i n -c r e a s e i n t h e m o t i o n o f t h e s p i n l a b e l a n d , p r e s u m a b l y , b yg r e a t e r f l e x i b i l i t y o f t h e e n z y m e ' s a c t i v e s i t e . M o r e o v e r , t h ed e c r e a s e i n c a t a l y t i c a c t i v i t y o f s u b t i l i s i n w h e n t h e w a t e rc o n t e n t i s a b o v e 5 p A / m l c o i n c i d e s w i t h a f u r t h e r i n c r e a s e i nt h e s p i n - l a b e l ' s m o t i o n .I n a d d i t i o n t o t h e n e a r b y d y n a m i c s , t h e p o l a r i t y o f t h e s p i nl a b e l ' s e n v i r o n m e n t c a n b e d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g one o ft h e f o u r s p l i t t i n g c o n s t a n t s , A 0 , A = , A y y , o r A Z Z , f o r t h e N-Og r o u p o f t h e s p i n l a b e l . A x , A y y , a n d A z z c o m p r i s e t h ed i a g o n a l A m a t r i x o f t h e H a m i l t o n i a n w r i t t e n i n t h e n i t r o x i d e

W a t e ra d d e d( P I / m l )W a t e ra d d e d( M I / m l )0

2

5

2 0

3 5

lOG

W a t e r o ne n z y m e( w t % )9

9

8

1 9

2 6

3 3

lOGF I G . 3 . S a t u r a t i o n t r a n s f e r ( L e f t ) a n d c o n v e n t i o n a l ( R i g h t ) E SRs p e c t r a o f s u b t i l i s i n s p i n - l a b e l e d a t S e r - 2 2 1 w i t h 4 - ( e t h o x y f l u o r o -p h o s p h i n y l o x y ) - T E M P O . T h e s p i n l a b e l i n g s t o i c h i o m e t r y , d e t e r -m i n e d b y t w i c e i n t e g r a t i n g t h e ESR s p e c t r u m , w a s a b o u t 0 . 8 s p i n -

l a b e l m o l e c u l e s p e r e n z y m e . I n s e p a r a t e e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d w i t hf r e e s p i n l a b e l , t h e s p e c t r a l l i n e s h a p e s were i n d e p e n d e n t o f t h e w a t e rc o n c e n t r a t i o n . T h u s , t h e d i f f e r e n c e s i l l u s t r a t e d a b o v e are s p e c i f i c t oe n z y m e - b o u n d s p i n l a b e l . R o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e s were e s t i -m a t e d f r o m t h e S T - E S R s p e c t r a b y c o m p a r i n g t h e c e n t r a l r e g i o n o fe a c h s p e c t r u m t o t h e c a l i b r a t i o n curve p r e p a r e d b y T h o m a s e t a l . ( 2 1 )f o r s p i n - l a b e l e d h e m o g l o b i n . T h e c a l i b r a t i o n curve was s h i f t e d t oo b t a i n a g r e e m e n t b e t w e e n t h e r o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e s d e t e r -m i n e d f r o m t h e S T - E S R s p e c t r u m a n d a s i m u l a t i o n o f t h e conven-t i o n a l s p e c t r u m f o r a d d e d w a t e r a t 2 0 , u l / m l o f s o l v e n t . T h e e s t i m a t e dr o t a t i o n a l c o r r e l a t i o n t i m e s a r e 1 5 0 0 nsec a t 0 a d d e d w a t e r ( b a s e d onS T - E S R ) , 7 5 0 nsec a t 2 A . l / m l ( b a s e d on S T - E S R ) , 1 4 0 nsec a t 5 , u I / m l( b a s e d on S T - E S R ) , c a . 1 7 nsec a t 2 0 j l / m l ( b a s e d on s p e c t r a ls i m u l a t i o n s ) , a n d c a . 3 nsec a t 7 0 l d / m l ( b a s e d on s p e c t r a l s i m u l a -t i o n s ) . T h e c o n v e n t i o n a l s p e c t r a a t w a t e r c o n c e n t r a t i o n s more t h a n5 j u I / m l o f s o l v e n t c o n t a i n two c o m p o n e n t s , w h i c h r e d u c e s t h ea c c u r a c y o f t h e s i m u l a t i o n s .c o o r d i n a t e s y s t e m ; A O i s t h e a v e r a g e o f t h e t h r e e . F o r a s p i nl a b e l u n d e r g o i n g a n i s o t r o p i c r e o r i e n t a t i o n , none o f t h e s ep a r a m e t e r s ca n b e m e a s u r e d d i r e c t l y a t room t e m p e r a t u r eb e c a u s e o f p a r t i a l m o t i o n a l a v e r a g i n g o f t h e e l e c t r o n - n u c l e a rd i p o l a r i n t e r a c t i o n . H o w e v e r , t h e y ca n b e d e t e r m i n e d f r o mc o m p u t e r s i m u l a t i o n s o f e x p e r i m e n t a l E SR s p e c t r a r e c o r d e da t v e r y l o w t e m p e r a t u r e - i . e . , i n t h e a b s e n c e o f s p i n - l a b e lm o t i o n . V a r i a t i o n s i n t h e l o c a l p o l a r i t y u n d e r d i f f e r e n t con-d i t i o n s can t h e n b e r e l a t e d t o r e l a t i v e c h a n g e s i n t h e s p l i t t i n gc o n s t a n t s . A l t h o u g h t h e e n v i r o n m e n t o f t h e s p i n l a b e l a t l o wt e m p e r a t u r e s may d i f f e r s o m e w h a t f r o m t h a t a t room t e m -p e r a t u r e , d i f f e r e n c e s i n t h e a c t i v e - s i t e p o l a r i t y o f s a m p l e sm e a s u r e d a t l o w t e m p e r a t u r e s s h o u l d s t i l l r e f l e c t d i f f e r e n c e sb e t w e e n t h e s a m e s a m p l e s a t room t e m p e r a t u r e .

1 1 0 2 B i o c h e m i s t r y : A f f l e c k e t a l .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 9 ( 1 9 9 2 ) 1 1 0 3A15.75

1 5 . 7 01 5 . 6 51 5 . 6 0

CaU ) 1 5 . 5 5CD 1 5 . 5 0

1 5 . 4 51 5 . 4 01 5 . 3 51 5 . 3 01 5 . 2 5 015.80

1 5 . 7 51 5 . 7 0

U)= 1 5 . 6 5c o1 5 . 6 0

1 5 . 5 0 40 1 0 20 30 40 50 6 0 70 80

W a t e r a d d e d , u l / m lF I G . 4 . ( A ) P o l a r i t y o f s u b t i l i s i n ' s a c t i v e s i t e a s i n d i c a t e d b y t h eh y p e r f i n e s p l i t t i n g c o n s t a n t A O o f t h e a c t i v e - s i t e b o u n d s p i n l a b e l . F o r

a g i v e n s p e c t r u m , t h e b e s t - f i t s i m u l a t i o n wa s i n d e p e n d e n t o f t h es t a r t i n g v a l u e s . T r i p l i c a t e e x p e r i m e n t s p r o d u c e d a c o m p a r a b l ec h a n g e o f A O v a l u e s over t h e range o f w a t e r a d d e d w i t h a s t a n d a r dd e vi a t i o n o f t h e i n i t i a l A O v a l u e ( a t 0 A I / m l ) o f l e s s t h a n 1 % . ( B ) A Ov a l u e s o f t h e f r e e s p i n l a b e l i n t e t r a h y d r o f u r a n a s a f u n c t i o n o f a d d e dw a t e r .

Shown i n F i g . 4A are A O v a l u e s o f t h e f l u o r o p h o s p h o n a t es p i n l a b e l l i n k e d t o t h e a c t i v e - s i t e s e i n e o f s u b t i l i s i n . T h e s ev a l u e s were d e t e r m i n e d f r o m s p e c t r a r e c o r d e d a t 1 2 0 K i nt e t r a h y d r o f u r a n c o n t a i n i n g a d d e d w a t e r f r o m 0 t o 7 0 t . l / m l .T h e r e f o r e , t h e A O v a l u e s r e f l e c t t h e r e l a t i v e p o l a r i t y o f t h ea c t i v e - s i t e e n v i r o n m e n t u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . A l a r g e r A Ocorresponds t o a h i g h e r p o l a r i t y , a n d t h e i n c r e a s e f r o m a b o u t1 5 . 3 t o 1 5 . 7 G i s s i g n i f i c a n t . F o r e x a m p l e , F i g . 4B s h o w s t h ec h a n g e o f A O as w a t e r i s a d d e d t o t e t r a h y d r o f u r a n c o nt a i ni n gt h e f r e e s p i n l a b e l . D u r i n g A O m e a s u r e m e n t s o f t h e f r e e s p i nl a b e l i n v a r i o u s s o l v e n t s , A O i n c r e a s e d b y 0 . 3 G when t h es o l v e n t was c h a n g e d f r o m b e n z e n e t o d i m e t h y l s u l f o x i d e ( ac h a n g e i n d i e l e c t r i c c o n s t a n t f r o m 2 . 3 t o 4 7 ) . T h u s , F i g . 4i l l u s t r a t e s t h a t t h e l o c a l p o l a r i t y i n c r e a s e s s h a r p l y as w a t e r i sa d d e d u p t o 5 A l / m l o f s o l v e n t , p o s s i b l y b e c a u s e o f w a t e rm o l e c u l e s b i n d i n g i n or near t h e a c t i v e s i t e . As m o r e w a t e ri s a d d e d t o t h e s o l v e n t , a more g r a d u a l i n c r e a s e i n A O i so b s e r v e d u p t o 2 0 d u l o f a d d e d w a t e r per m l o f s o l v e n t , a n da b o v e t h i s w a t e r c o n t e n t , l i t t l e i n c r e a s e i n a c t i v e - s i t e p o l a r i t yi s e v i d e n t . I n t e r e s t i n g l y , t h e i n i t i a l i n c r e a s e i n p o l a r i t y c o i n -c i d e s w i t h t h e i n c r e a s e i n t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y ( F i g . 2 ) .T o g e t h e r , t h e a c t i v i t y r e s u l t s a n d t h e E S R d a t a s u g g e s t t h ef o l l o w i n g sequence o f e v e n t s , w h i c h i s s i m i l a r t o t h e s t e p w i s eprocess o f p r o t e i n h y d r a t i o n o r i g i n a l l y p r o p o s e d b y R u p l e y e ta l . ( 1 0 ) . I n i t i a l l y , i n t h e a b s e n c e o f a d d e d w a t e r , t h e l y -o p h i l i z e d p r o t e i n i s very r i g i d a n d h a s r e l a t i v e l y l o w c a t a l y t i ca c t i v i t y . The a d s o r b e d w a t e r [ c a . 9o ( w t / w t ) ] i s s t r o n g l yb o u n d t o i o n i z a b l e groups on t h e p r o t e i n . As w a t e r i s a d d e dt o t h e o r g a n i c s o l v e n t , t h e a c t i v e - s i t e p o l a r i t y i n c r e a s e sb e c a u s e o f f u r t h e r h y d r a t i o n o f p o l a r a n d c h a r g e d groups i nt h e a c t i v e s i t e . D u r i n g t h i s p r o c e s s , t h e a c t i v e - s i t e f l e x i b i l i t yi n c r e a s e s , as d o e s t h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y . The i n -c r e a s e d f l e x i b i l i t y w i t h i n c r e a s i n g w a t e r c o n t e n t i s c o n s i s t e n tw i t h B o n e ' s h y p o t h e s i s ( 3 , 1 2 ) t h a t p r o t e i n - b o u n d w a t e r

m o l e c u l e s screen e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n p o l a ra n d c h a r g e d r e s i d u e s o f t h e p r o t e i n a n d h e n c e i n d u c e g r e a t e rf r e e d o m o f m o t i o n . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t a s i m i l a r" l o o s e n i n g u p " o f i n i t i a l l y d r y l y s o z y m e , i n d u c e d b y p a r t i a lh y d r a t i o n , w a s necessary f o r t h e en z y m e t o become c a t a l y t -i c a l l y a c t i v e ( 4 , 1 0 ) .The s u b s e q u e n t l e v e l i n g o f f o f p o l a r i t y a t a b o u t 1 5%( w t / w t ) b o u n d w a t e r ( f o u n d b y i n s p e c t i o n o f F i g s . 1 a n d 4 )p r e s u m a b l y c o r r e s p o n d s t o t h e f o r m a t i o n a n d g r o w t h o fw a t e r c l u s t e r s ( s m a l l p a t c h e s o f c o n d e n s a t e ) w i t h i n t h e a c t i v es i t e . A t t h i s p o i n t t h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y h a s b e g u n t od e c l i n e . A t w a t e r c o n c e n t r a t i o n s a b o v e 15% w t / w t a n d u p t om o n o l a y e r coverage [ e s t i m a t e d t o b e c a . 3 5% ( w t / w t ) ] , w a t e rb i n d s t o l e s s s t r o n g l y i n t e r a c t i n g s i t e s o n t h e p r o t e i n ( e . g . ,n o n p o l a r a t o m s n o t a d j a c e n t t o t h e e a r l i e s t f o r m i n g c l u s t e r s ) .T h i s a d d i t i o n a l h y d r a t i o n i s a c c o m p a n i e d b y a f u r t h e r i n -crease i n enzyme f l e x i b i l i t y a n d , a p p a r e n t l y , b y a m i n o rc o n f o r m a t i o n a l c h a n g e t h a t causes t h e d e c r e a s e i n t r a n s e s -t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y . T h u s , ou r r e s u l t s s u g g e s t t h a t l y o p h i l i z e ds u b t i l i s i n d o e s n o t h a v e t h e same c o n f o r m a t i o n a s t h e p a r -t i a l l y h y d r a t e d enzyme, a n d t h a t t h e i n i t i a l i n c r e a s e i n t r a n s -e s t e r i f i c a t i o n a c t i v i t y r e s u l t i n g f r o m i n c r e a s e d f l e x i b i l i t y i so f f s e t b y a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a t h i g h e r ( a l b e i t submono-l a y e r ) h y d r a t i o n l e v e l s . I n t h i s r e s p e c t , s u b t i l i s i n a p p e a r s t ob e h a v e d i f f e r e n t l y f r o m l y s o z y m e , w h i c h h a s b e e n r e p o r t e dt o m a i n t a i n i t s c o n f o r m a t i o n d u r i n g h y d r a t i o n ( 5 ) . H o w e v e r ,e v i d e n c e t h a t lysozyme d o e s e x p e r i e n c e a c o n f o r m a t i o n a lc h a n g e upon h y d r a t i o n h a s b e e n p r e s e n t e d b y Baker e t a l . ( 8 ) .I n su m m ary , enzymes s u s p e n d e d i n o r g a n i c s o l v e n t s r e p -r e s e n t a v e r s a t i l e s y s t e m f o r s t u d y i n g w a t e r - p r o t e i n i n t e r a c -t i o n s a n d t h e i n v o l v e m e n t o f w a t e r i n enzyme s t r u c t u r e andf u n c t i o n . I n p a r t i c u l a r , ou r r e s u l t s i n d i c a t e a c o r r e l a t i o nb e t w e e n p r o t e i n f l e x i b i l i t y a n d c a t a l y t i c a c t i v i t y ; h o w e v e r ,l o s s o f c e r t a i n a c t i v i t y ca n occur as t h e enzyme becomesi n c r e a s i n g l y f l e x i b l e i n a nonaqueous e n v i r o n m e n t . I n t h ecase o f s u b t i l i s i n , i t a p p e a r s t h a t t h e c o n f o r m a t i o n o f t h el y o p h i l i z e d enzyme c h a n g e s upon h y d r a t i o n , a n d t h a t t h ec o n f o r m a t i o n a l c h a n g e a c c o m p a n i e s t h e c o n d e n s a t i o n o fw a t e r over t h e p r o t e i n .

We t h a n k J . P . Klinman a n d R . J . L i n h a r d t f o r h e l p f u l comments.T h i s work was s u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l S c i e n c e Foundation( P r e s i d e n t i a l Y o u n g I n v e s t i g a t o r Awards t o D . S . C . a n d J . S . D . ) ,Genencor I n t e r n a t i o n a l , Me a d C o r p o r a t i o n , Merck and C o . , and O l i nC o r p . R . A . was s u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h T r a i n i n gG r a n t G M O 8 3 5 2 . V . S . was s u p p o r t e d b y a Merck f e l l o w s h i p .1 . T a n f o r d , C . ( 1 % 1 ) P h y s i c a l C h e m i s t r y o f Macromolecules( W i l e y , N e w Y o r k ) .2 . S c h u l t z , G . E . & S c h i r m e r , R . H . ( 1 9 7 9 ) P r i n c i p l e s o f P r o t e i nS t r u c t u r e ( S p r i n g e r , New Y o r k ) .3 . B o n e , S . & P e t h i g , R . ( 1 9 8 2 ) J . M o l . B i o l . 1 5 7 , 5 7 1 - 5 7 5 .4 . F i n n e y , J . L . & P o o l e , P . L . ( 1 9 8 4 ) C om men ts Mol. C e l l .B i o p h y s . 2 , 1 2 9 - 1 5 1 .5 . R u p l e y , J . A . , G r a t t o n , E . & C a r e r i , G. ( 1 9 8 3 ) Trends Biochem.S c i . 8 , 1 8 - 2 2 .6 . C a r e r i , G . , G r a t t o n , E . , Y a n g , P . - H . & R u p l e y , J . A. ( 1 9 8 0 )N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 4 , 5 7 2 - 5 7 3 .7 . C a r e r i , G . , G i a n s a n t i , A . & R u p l e y , J . A. ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t I .A c a d . S c i . U S A 8 3 , 6 8 1 0 - 6 8 1 4 .8 . B a k e r , L . J . , H a n s e n , A . M. F . , R a o , P . B . & B r y a n , W. P .( 1 9 8 3 ) B i o p o l y m e r s 2 2 , 1 6 3 7 - 1 6 4 0 .9 . S c h i n k e l , J . E . , D o w n e r , N. W. & R u p l e y , J . A. ( 1 9 8 5 ) B i o -c h e m i s t r y 2 4 , 3 5 2 - 3 6 6 .1 0 . R u p l e y , J . A . , Y a n g , P . - H . & T o l l i n , G . ( 1 9 8 0 ) ACS S y m p . S e r .1 2 7 , 1 1 1 - 1 3 2 .1 1 . C a r e r i , G . , G i a n s a n t i , A . & G r a t t o n , E . ( 1 9 7 9 ) B i o p o l y m e r s 1 8 ,1 1 8 7 - 1 2 0 3 .

1 2 . B o n e , 5 . ( 1 9 8 7 ) B i o c h i m . B i o p h y s . Acta 9 1 6 , 1 2 8 - 1 3 4 .1 3 . D o r d i c k , J . S . ( 1 9 8 9 ) E n z y m e M i c r o b i o l . T e c h n o l . 1 1 , 194-211.1 4 . Z a k s , A. & R u s s e l l , A. J . ( 1 9 8 8 ) J . B i o t e c h n o l . 8 , 259-270.1 5 . K l i b a n o v , A . M. ( 1 9 9 0 ) Acc. C h em. Res. 2 3 , 114-120.

- ' ' I - , "IK

B i o c h e m i s t r y : A f f l e c k e t A

f

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5/5

1 1 0 4 B i o c h e m i s t r y : A f f l e c k e t a l .1 6 . Z a k s , A . & K l i b a n o v , A . M . ( 1 9 8 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 3 1 9 4 -3 2 0 1 .1 7 . R y u , K . & D o r d i c k , J . S . ( 1 9 8 9 ) J . Am . C h e m . S o c . 1 1 1 ,8 0 2 6 - 8 0 2 7 .1 8 . B o t t , R . , U l t s c h , M . , K o s s i a k o f f , A . , G r a y c a r , T . , K a t z , B . &P o w e r , S . ( 1 9 8 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 7 8 9 5 - 7 9 0 6 .1 9 . H i m m e l b r a u , D . M . ( 1 9 7 0 ) P r o c e s s A n a l y s i s b y S t a t i s t i c a lM e t h o d s ( W i l e y , N ew Y o r k ) .

P r o c . N a t d . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 )2 0 . M o r r i s e t t , J . D . & B r o o m f i e l d , C . A . ( 1 9 7 2 ) J . B i o l . C h e m . 2 4 7 ,7 2 2 4 - 7 2 3 1 .2 1 . T h o m a s , D . D . , D a l t o n , L . R . & H y d e , J . S . ( 1 9 7 6 ) J . C h e m .P h y s . 6 5 , 3 0 0 6 - 3 0 2 4 .2 2 . A t h e r t o n , N . M . ( 1 9 7 3 ) E l e c t r o n S p i n R e s o n a n c e ( W i l e y , N ewY o r k ) .2 3 . F r e e d , J . H . ( 1 9 7 6 ) i n S p i n L a b e l i n g : T h e o r y a n d A p p l i c a t i o n s ,e d . B e r l i n e r , L . J . ( A c a d e m i c , N ew Y o r k ) , p p . 5 3 - 1 3 2 .