secuencias de ADN que se distribuyen de forma ms o menos aleatoria a lo largo del

genoma y presentan como caracterstica singular el hecho de ser polimrficas. Esto ltimo

es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias la caracterstica primordial

del anlisis gentico, la variabilidad.

Por lo general, los polimorfismos se encuentran en regiones no codificantes del

genoma lo cual garantiza que no se alterar el producto de ningn gen. Sin embargo,

pueden existir secuencias polimrficas en regiones codificantes (polimorfismos exnicos)

que no afectan al producto gnico (en su mayora son polimorfismos donde vara un solo

nucletido) o que afectan al producto generando un fenotipo alterado.

Un locus corresponde a un lugar en el genoma y las variantes de un locus es lo que

se conoce como alelos. Por ejemplo, todos los genes pertenecientes a autosomas presentan

2 alelos, uno materno y otro paterno. Tambin se pueden distinguir distintos alelos para los

loci implicados en enfermedades, alelos normales y mutados como el alelo F508 de la

BT0003 POLIMORFISMOS DE ADN: SU APLICACIN ENEL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENETICAS deVernica Ferreiro (Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,

UBA)Introduccin

El genoma humano no es ms que unmanual de instrucciones para construir y hacerfuncionar un ser humano, en su interior seocultan miles de genes y millones de otrassecuencias que constituyen un tesoro de secretosfilosficos...

Matt Ridley. Genoma

En el mbito de la biologa molecular, pocos trminos son ms difciles

de definir y generan tantas controversias como el de polimorfismos. En una

aproximacin a su definicin podemos decir que los polimorfismos son

secuencias de ADN que, normalmente

2 Introduccin

fibrosis qustica (Kapoor et al., 2006). Sin embargo, este tipo de alelos son,

afortunadamente, muy poco frecuentes y no seran tiles en los estudios de segregacin.

Por el contrario las secuencias polimrficas utilizadas en estudios indirectos presentan por

definicin varios alelos con una frecuencia significativamente alta en la poblacin (en

general superior al 1%).

Tipos de Polimorfismos

Como ya se ha dicho, la caracterstica primordial de las secuencias polimrficas es

su variabilidad, veamos ahora en qu consiste dicha variabilidad. Bsicamente existen dos

tipos de polimorfismos, los que derivan de la sustitucin de un nucletido por otro y los que

derivan de la insercin o delecin de secuencias de ADN. En estos ltimos distinguimos

dos subtipos: las inserciones o deleciones de fragmentos de ADN, como las secuencias Alu

(Terreros et al., 2005) y las repeticiones de secuencias de dos o ms nucletidos.

1) Polimorfismo de nucletido nico SNP (single nucleotide polymorphism): representa

una variacin en un nico nucletido. Si este cambio de nucletido afecta el sitio de

restriccin de una enzima estamos en presencia de los llamados polimorfismos de

restriccin RFLPs (restriction fragment length polymorphisms) (polimorfismos de

longitud de los fragmentos de restriccin). Cuando el cambio de un nucletido altera la

diana para una determinada enzima de restriccin podemos detectar el polimorfismo en

funcin de la variacin que ste genera en el patrn de restriccin. En este caso el nmero

de variantes allicas es siempre dos (C: corta / NC: no corta) y los genotipos tres

(homocigota C/C, heterocigota C/NC y homocigota NC/NC) (Figura 1.a). Es por ello que

su utilizacin en el diagnstico indirecto es limitada.

3 Introduccin

2) Polimorfismos de repeticin VNTRs (variable number of tandem repeats)

(repeticiones en tandem de nmero variable). Existen dos tipos de polimorfismos de

repeticin de uso en diagnstico gentico, los minisatlites y los microsatlites.

- Los minisatlites son secuencias de ADN de unas pocas decenas de nucletidos repetidas

en tandem. El nmero de dichas repeticiones puede variar de cromosoma a cromosoma. La

singularidad ms especial de este tipo de polimorfismos radica en que para cada locus

pueden observarse muchas variantes allicas, sin embargo presentan el inconveniente de

que no estn distribuidos por todo el genoma y por lo tanto slo pueden ser utilizados en el

diagnstico de un nmero muy reducido de enfermedades. Los minisatlites han encontrado

su mxima aplicacin en la determinacin de la paternidad y en los protocolos de

identificacin gentica en el marco judicial, aunque en la actualidad los microsatlites y los

SNPs han cobrado tambin gran importancia en estos mbitos.

- Los microsatlites STRs (short tandem repeats) (repeticiones cortas en tandem) son

por excelencia los polimorfismos utilizados en el diagnstico gentico. Corresponden a la

repeticin en tandem de secuencias de entre 2 y 5 nucletidos. Presentan dos caractersticas

que los hacen ideales para su uso. En primer lugar, estn distribuidos de forma casi

homognea por todo el genoma y en segundo lugar, presentan un nmero elevado de

variantes allicas con frecuencias similares entre s, de forma que la probabilidad de que un

individuo sea heterocigota es muy elevada (presentan una alta heterocigosidad). Los

polimorfismos ptimos para la realizacin de estudios de segregacin sern los que se

localicen dentro del gen de inters (intragnicos), lo que sugiere que habr desequilibrio

de ligamiento (estarn ligados) entre la secuencia polimrfica y la enfermedad. Su

deteccin se realiza normalmente mediante la tcnica de reaccin en cadena de la

polimerasa (PCR) (Figura 1.b).

4 Introduccin

Figura 1: Polimorfismos empleados en el diagnstico de enfermedaes hereditarias.

Se muestran los dos tipos de polimorfismos principalmente utilizados en el diagnstico de patologas

hereditarias. a) RFLP: la flecha roja indica el corte con una enzima de restriccin. Las variantes allicasposibles para el polimorfismo son corta y no corta. b) VNTR: los rectngulos verdes indican la cantidadde repeticiones en cada alelo (5 repeticiones en un alelo y 8 en el otro). Puede presentar muchas variantesallicas.

Supongamos que queremos saber si el locus a, que est implicado en una

enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b, que es una secuencia polimrfica de ADN.

Lo primero que necesitaremos ser identificar las variantes del polimorfismo en cada uno

de los miembros de una familia y estudiar su segregacin juntamente con la de la

enfermedad. La aplicacin de diversos mtodos estadsticos nos permitir establecer la

existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia que los

separa, para luego ser utilizados como herramienta diagnstica principalmente en estudios

indirectos.

El diagnstico indirecto

El diagnstico indirecto es independiente del conocimiento previo de la naturaleza

molecular de la mutacin responsable de la patologa a diagnosticar y para llevarlo a cabo

slo es preciso conocer la localizacin cromosmica del locus implicado. Dicha estrategia

NO CORTACORTA

PPoolliimmoorrffiissmmoo ddeerreeppeettiicciinn

PPoolliimmoorrffiissmmoo ddeerreessttrriicccciinn

PPCCRR

a)

b)

5 Introduccin

consiste en estudiar, en la familia del propsito, la segregacin conjunta de la enfermedad y

secuencias polimrficas fsicamente prximas (ligadas) al locus de la misma.

El ADN es una molcula lineal en la que las secuencias de nucletidos se hallan

contiguas y distribuidas a lo largo de la doble hlice en un mundo de una dimensin. Existe

por lo tanto, una relacin fsica de proximidad entre secuencias de ADN. Dicha relacin de

continuidad puede alterarse en el proceso de la divisin meitica que se produce durante la

formacin de las clulas germinales. En la profase de la primera divisin meitica, los

cromosomas homlogos (uno proveniente de la lnea paterna y el otro de la lnea materna)

intercambian material por el proceso de recombinacin o crossing over (Froenicke et al.,

2002). El resultado final es tal que los cromosomas de la clula germinal madura

(espermatozoide u vulo) presentan nuevas combinaciones de las secuencias existentes en

la clula original. Dada la relacin fsica existente entre secuencias adyacentes en un mismo

cromosoma, la frecuencia con que dos de estas secuencias se transmiten (segregan)

independientemente de una generacin a la siguiente es directamente proporcional a la

distancia que las separa. Es decir, cuanto menor es la distancia que separa a dos secuencias

de ADN, menos probable es la recombinacin entre ellas y por lo tanto segregarn

independientemente con una menor frecuencia. Cuando se da esta situacin decimos que

ambas secuencias estn ligadas.

En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en funcin

de la frecuencia con que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centiMorgan (cM)

(Lodish et al., 2002). Si dos loci recombinan en el 1% de las meiosis, decimos que los

separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de recombinacin entre dos loci puede variar

desde 0 (ntimamente ligados) hasta 50% (independientes) (Lodish et al., 2002). No

siempre existe una relacin lineal entre distancia gentica (frecuencia de recombinacin

6 Introduccin

medida en cM) y distancia fsica (nmero de nucletidos que las separan, medida en pares

de bases), sino que pueden existir mecanismos moleculares, en general dependientes de la

secuencia, que facilitan la recombinacin de determinados loci, como se describir ms

adelante en el Captulo I de esta Tesis.

El ligamiento entre secuencias de ADN se establece mediante el estudio de la

segregacin de los alelos de dichas secuencias en genealogas y la realizacin posterior de

clculos de distancias genticas. Es por ello que es distinto hablar de estudios de ligamiento

y de segregacin. En estos ltimos no se calculan distancias genticas ni fsicas, sino que se

infiere informacin acerca de una patologa en una determinada familia por medio del

estudio de secuencias polimrficas que se describieron previamente como ligadas a la

aparicin de la misma. Es por ello que tambin se los denomina marcadores genticos.

Aplicacin de los polimorfismos en el diagnstico de patologas genticas

1) Diagnstico indirecto de enfermedades hereditarias:

El ejemplo ms sencillo de aplicacin de los polimorfismos en el diagnstico

indirecto lo constituye el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X.

La familia de la Figura 2.a presenta un varn afectado (flecha) de una enfermedad

hereditaria recesiva ligada al cromosoma X, como por ejemplo la Distrofia Muscular de

Duchenne que se describir en el Captulo I de esta Tesis. De acuerdo con el patrn de

herencia, su padre presentar el alelo normal del gen implicado en la enfermedad, mientras

que su madre, que tiene un hermano afectado fallecido, ser obligatoriamente portadora del

gen alterado. El varn afectado habr heredado de su madre el cromosoma con el alelo

mutado responsable de la enfermedad y dada su condicin de hemicigota para el X,

7 Introduccin

manifestar el fenotipo correspondiente a la misma. Sin embargo no podemos predecir, ms

all del modelo mendeliano (Bayes, 1763), el genotipo de la hermana ni el del feto que se

est desarrollando.

Supongamos que existe un locus polimrfico, del tipo microsatlite, ntimamente

ligado al locus de la enfermedad (frecuencia de recombinacin igual a 0). Si determinamos

los alelos de dicho polimorfismo para cada uno de los miembros de la familia podremos

inferir el alelo del locus de la enfermedad que porta cada individuo.

Figura 2: Genealoga de una familia en la que se hereda una enfermedad recesiva ligada al

cromosoma X.

Se muestra un ejemplo de estudio indirecto. a. Genealoga de la familia estudiada. b. Resultados de laamplificacin por PCR de un STR que mapea dentro del gen de inters. Flecha roja: fragmento de 2repeticiones, Flecha negra: 4 repeticiones y Flecha azul: 6 repeticiones.

a.

II.1 I.2 II.2 I.1 II.3

II.3

I.1 I.2

II.2II.1

b.

8 Introduccin

En la Figura 2.b se presenta, de forma simplificada, el resultado obtenido al

caracterizar mediante PCR el locus polimrfico. Podemos ver que el varn afectado ha

heredado de su madre el alelo de 2 repeticiones, por lo que podemos inferir que dicho alelo

est ligado a la mutacin responsable de la enfermedad. Segn ello, la hermana habr

heredado de su padre el alelo de 4 repeticiones del polimorfismo junto con el alelo normal

del gen y de su madre el alelo de 6 repeticiones que tambin en este caso segregar junto al

alelo normal. Siguiendo un razonamiento similar podemos inferir que el feto analizado

corresponde a una nia, ya que presenta dos alelos del polimorfismo y por lo tanto dos

cromosomas X, y que dicha nia es portadora de la enfermedad por haber heredado de su

madre el alelo de 2 repeticiones del polimorfismo que, como se ha indicado anteriormente,

est ligado al alelo mutado causante de la enfermedad.

En el ejemplo anterior se ha utilizado para el anlisis un locus altamente

polimrfico, los cromosomas parentales presentan alelos distintos y por lo tanto los

podemos diferenciar sin ambigedad alguna, e ntimamente ligado, es decir no existe

recombinacin entre ambos loci y por lo tanto el alelo del polimorfismo que en la madre se

encuentra ligado al alelo de la enfermedad segregar junto a ste en la descendencia. Estas

dos caractersticas son fundamentales en el momento de elegir un determinado

polimorfismo en el desarrollo de una estrategia de diagnstico indirecto.

Si el marcador utilizado no presenta una gran cantidad de variantes allicas entonces

pueden darse situaciones de ambigedad cuando uno o ambos padres sean homocigotas

para un determinado alelo del marcador. En este caso diremos que el marcador es "no

informativo" para dicha familia y por lo tanto deberemos utilizar otro polimorfismo para el

diagnstico. Por otra parte, si el marcador o polimorfismo no esta ntimamente ligado, es

decir existe la probabilidad de que ocurra una recombinacin entre el locus de la

9 Introduccin

enfermedad y el locus polimrfico, el diagnstico deber tener en cuenta dicha

probabilidad, como se ver en los Captulos sucesivos.

En la Figura 3 se presenta la genealoga correspondiente a una familia en la que se

estudia una enfermedad con una herencia autosmica dominante, como por ejemplo la

Neurofibromatosis Tipo 1 (NF1) que se describir en el Captulo II de esta Tesis. Por lo

tanto, la madre afectada tiene una probabilidad del 50% de transmitir la mutacin causante

de la patologa a sus descendientes. La utilizacin de un locus polimrfico ligado a la

mutacin en cuestin nos permitir establecer un diagnstico para el hijo. Se observa que la

madre presenta los alelos 6 y 2 y el padre los alelos 4 y 7 del polimorfismo. La hija afectada

es portadora de los alelos 2 y 7, el primero procedente de la madre y el segundo del padre.

Podemos considerar que el alelo 2 en la madre est ligado al alelo mutado del locus de la

enfermedad ya que es el compartido por ambas afectadas. Por lo tanto, como el hijo

presenta el alelo 2 materno del polimorfismo podemos inferir que tambin ha heredado el

alelo mutado del locus de la enfermedad.

Figura 3: Genealoga de una familia en la que se hereda una enfermedad autosmica

dominante.

6 24 7

7 2 4 2

?

10

Introduccin

Se muestra el resultado del estudio de segregacin de alelos para la familia analizada. El alelo 2 del

polimorfismo es el ligado a la mutacin responsable de la enfermedad ya que es compartido por ambas

afectadas.

Sin embargo, si la distancia que separa a ambos loci es tal que permite la

recombinacin entre ellos, es posible que el hijo haya heredado de su madre el alelo 2 del

polimorfismo y no la mutacin causante de la enfermedad debido a la recombinacin de

ambos loci en la meiosis de las clulas germinales de la madre. La frecuencia con la que se

presentar este segundo caso ser la frecuencia de recombinacin entre los loci implicados.

As, si la distancia que los separa es de 5 cM, es decir su frecuencia de recombinacin es

del 5%, el diagnstico que daremos en el caso presentado en la Figura 3 ser de un 95% de

probabilidad de que el hijo resulte afectado y de un 5% de que el hijo haya heredado el

alelo normal.

Para obtener una mayor fiabilidad en el diagnstico se utilizan varios loci

polimrficos localizados dentro del gen implicado en el fenotipo alterado. Con ello se

consiguen disminuir las ambigedades generadas por la recombinacin.

2) Diagnstico directo de enfermedades genticas:

Algunas patologas suelen ser producidas por grandes deleciones que pueden

abarcar desde un exn hasta uno o ms genes completos. De esta manera, la delecin

abarcar no slo a las secuencias codificantes de un gen, sino que tambin involucrar a los

intrones del mismo, donde mapea la gran mayora de los polimorfismos utilizados en

gentica molecular diagnstica. Por lo tanto, el hallazgo de deleciones heterocigotas,

imposible mediante PCR de exones (Giliberto et al., 2003), puede realizarse por medio del

anlisis de polimorfismos. Esto es as ya que, si bien la delecin de polimorfismos

11

Introduccin

intrnicos pertenecientes al gen relacionado con la enfermedad no constituye la causa de la

patologa, al mapear stos dentro de dicha delecin resultan de utilidad para ponerla en

evidencia. Este tipo de estudios directos son los utilizados para el diagnstico de

pacientes con el sndrome de microdelecin de NF1 o de portadoras de distrofia muscular

de Duchenne y para el rastreo de las deleciones que dan origen a los sndromes de Prader-

Willi y Angelman (PWS/AS), como se demostrar en los sucesivos Captulos de esta Tesis.

Luego de la amplificacin por PCR de los polimorfismos correspondientes y de la

asignacin de los alelos para cada miembro del ncleo familiar (madre, padre, hijo

afectado), la delecin se pondr de manifiesto por la ausencia de un alelo (materno o

paterno) en el genotipo del afectado (Figura 4).

Figura 4: Rastreo de deleciones mediante el anlisis de secuencias polimrficas.

Se muestra el resultado del estudio de segregacin de alelos para la familia analizada. Se observa una delecin

en la afectada evidenciada por la falta del alelo materno.

Bajo el mismo concepto los polimorfismos se pueden utilizar tambin para poner en

evidencia los mecanismos de inactivacin de supresores tumorales en los cnceres

hereditarios, mediante la evidencia de prdida de heterocigosidad (LOH) en los tumores,

6 24 7

7 - 4 2

12

Introduccin

como se ver en el Captulo II. As como tambin se podrn evidenciar disomas

uniparentales (DUP), discriminando entre homo y hetero DUP, en los pacientes con

PWS/AS, como se ver en el Captulo III de esta Tesis.

Las secuencias polimrficas generalmente no se ven relacionadas con el

desencadenamiento de fenotipos patolgicos. Sin embargo, existen algunas excepciones

tales como las alteraciones producidas por la inestabilidad de microsatlites (Robertson,

2005). Entre ellas, la expansin de repeticiones de trinucletidos es la base molecular de

numerosas enfermedades genticas hereditarias. Se trata de una mutacin dinmica del

ADN en la cual una determinada secuencia repetitiva se expande dando origen a un

fenotipo alterado. Los alelos expandidos asociados a enfermedades son inestables tanto en

la lnea somtica como en la germinal, con una clara tendencia hacia las expansiones

(Robertson, 2005). La tasa de expansiones est directamente relacionada con el tamao del

alelo expandido y con la edad del individuo.

Entre las patologas producidas por expansin de trinucletidos ms estudiadas se

encuentra el Sndrome de X frgil (SXF) (Martin y Bell, 1943), la causa ms frecuente de

retardo mental hereditario. El SXF se produce por una expansin del trinucletido (CGG)n

que mapea en el exn 1 no codificante (se transcribe pero no se traduce) del gen FMR-1

(Xq27.3) (Verkerk, 1991). Como consecuencia de la expansin se produce una

hipermetilacin en la isla CpG de la zona promotora del gen, lo que inhibe su transcripcin

y, por lo tanto, produce la falta de la protena FMRP (Kremer et al., 1991). La expansin es

progresiva y el proceso puede abarcar varias generaciones, observndose tres posibles

estados cromosmicos: normal, premutacin y mutacin completa (Figura 5) (Sherman et

al., 1985). El alelo normal suele presentar entre 5 y 50 repeticiones del triplete (CGG)n en

el locus en cuestin. En el alelo premutado las repeticiones oscilan entre las 50 y 200,

13

Introduccin

permitiendo al gen ser an funcional y sintetizar la protena. En este caso se habla de

mujeres portadoras y de hombres transmisores normales. Por ltimo, en la mutacin

completa los tripletes exceden las 200 repeticiones, pudiendo llegar a varios miles, lo que

inactiva al gen FMR-1 (Sherman et al., 1985).

Figura 5: Mecanismo Molecular de inactivacin del gen FMR-1 en el SXF.

Nuestro grupo de trabajo realiz la puesta a punto e implementacin de un

diagnstico directo de la mutacin dinmica causante de la patologa mediante las tcnicas

de PCR y Southern blot. Durante el perodo en el que hemos desarrollado la tarea

diagnstica se analizaron 240 individuos no relacionados, hallndose premutaciones, y

RNA m = 0 = silenciamiento del gen

CpG

sitio hipometilado

(CGG)n

gen FMR-1

n =5 a 50regin inestable

Normal

ARN m 4,8 Kb

meiosis por vamaterna

CH3 CH3CH3

CH3

CH3

CH3 CH3CH3

CH3

mutacincompleta

(CGG)n

n >200

sitio hipermetilado

Premutacin(CGG)n

n = 50-200ARN m 4,8 Kb

(estado intermedio)

sitio hipometilado

Zona promotora

Zona promotora

Zona promotora

14

Introduccin

mutaciones completas en 14 de los individuos analizados (6%). Tambin se estudiaron 17

casos familiares encontrndose alteraciones en 8 de las familias analizadas (47%). La

diferencia en los porcentajes de deteccin puede deberse al criterio de diagnstico de los

diferentes especialistas y a que debido a la gran variabilidad fenotpica de la patologa se

recomienda la prueba diagnstica a toda persona con retraso mental de origen desconocido.

Los protocolos utilizados en el diagnstico y los resultados obtenidos fueron presentados y

discutidos en la Tesis doctoral de la Dra Florencia Giliberto, directora adjunta del presente

trabajo de Tesis. En ella se realiza una comparacin entre los mtodos utilizados,

demostrndose como la tcnica de Southern blot resulta ms informativa que la de PCR en

el diagnstico de SXF, y se discute la gran importancia del diagnstico precoz en los

individuos nacidos con el sndrome, con el objeto de ofrecer un correcto asesoramiento

gentico a las familias.

No todo polimorfismo en regiones codificantes trae aparejado un fenotipo alterado.

Existen polimorfismos exnicos, generalmente SNPs, que no producen alteracin alguna

del producto del gen en el que mapean. Un ejemplo de ello lo constituye el polimorfismo de

restriccin APA I del gen IGF2. Este tipo de polimorfismos resultan tiles para la

determinacin de prdida de imprinting (LOI) de genes imprinteados. El imprinting

genmico (o impronta gentica) implica una expresin monoallica parental especfica. Se

conocen numerosos genes que sufren el fenmeno de imprinting genmico, entre los cuales

figuran algunos que codifican para factores de crecimiento como el gen IGF2, inactivo en

el cromosoma heredado de la madre en la mayora de los tejidos normales. La LOI de estos

genes produce una sobreexpresin de los factores de crecimiento con la consecuente

aparicin de tumores.

15

Introduccin

El gen IGF2 (11p15) codifica para una protena mitognica para muchos tipos

celulares (Morton et al., 1986; Brissenden et al., 1984). La expresin monoallica de IGF2

se conserva en casi todos los tejidos adultos normales, mientras que la expresin biallica

de IGF2, producida por LOI o duplicacin del alelo activo, fue descripta en numerosas

patologas, entre ellas el Sndrome de Beckwith-Widemann (BWS) (Constancia et al.,

2000) y el Tumor de Wilms (Rainieri et al., 1993). En un estudio piloto para investigar la

utilidad de la LOI como un marcador de riesgo de cncer colorectal, se evaluaron pacientes

en una clnica colonoscpica y se concluy que la LOI podra ser un marcador predictivo

valioso para individuos en riesgo de cncer colorectal (Cui et al., 2003).

El cncer de mama es genticamente heterogneo y durante el progreso de la

enfermedad una variedad de alteraciones genticas tienden a acumularse. Para evaluar si

existe LOI en el locus IGF2 se han realizado numerosos trabajos a lo largo de los aos pero

los resultados obtenidos por los distintos grupos son muy controversiales (McCann et al.,

1996; Yballe et al., 1996; Wu et al., 1997). Es por ello que nuestro grupo desarroll una

estrategia para detectar la LOI de IGF2 en pacientes con cncer de mama, mediante el

estudio del RFLP APA I perteneciente a la zona codificante del gen IGF2 (Figura 6).

Figura 6: Estrategia de rastreo de LOI en el gen IGF2 en pacientes con cncer de mama.

ARN ADN

Tejido Normal

NCC

ARN ADN

Tejido Tumoral

NCC

LOI !

16

Introduccin

Se observa claramente la expresin monoallica del gen IGF2 en el tejido normal extrado de la zonaadyacente al tumor, debido a la falta del alelo corta (C) luego de la RT-PCR / RFLP. Luego se observa una

expresin biallica del gen en el tejido tumoral. Estos resultados demuestran la ocurrencia de LOI en el tumor.(C): corta. (NC): no corta. LOI: prdida de imprinting.

Si bien se ha observado LOI en unos pocos tumores analizados utilizando la

estrategia descripta en la Figura 6, an debemos estudiar un nmero mayor de pacientes

para obtener resultados concluyentes.

El consejo gentico

Es importante que las familias que padecen cualquier enfermedad hereditaria,

reciban consejo gentico. Segn la publicacin de la Sociedad Americana de Gentica

(Fraser, 1974) el consejo gentico es: Un proceso de comunicacin para tratar los

problemas humanos asociados al padecimiento y al riesgo de padecer una enfermedad

hereditaria en la familia. Un profesional o grupo de profesionales deben ayudar al individuo

y a la familia a:

1. Comprender los actos mdicos, incluyendo el diagnstico, el pronstico de la

enfermedad y los tratamientos disponibles.

2. Entender cmo la herencia determina la enfermedad y el riesgo de recurrencia de cada

familiar.

3. Comprender las opciones disponibles para afrontar el riesgo de recurrencia (el riesgo de

transmitir la enfermedad).

4. Elegir la actuacin que parece ms apropiada para ellos teniendo en cuenta el riesgo y los

intereses de la familia, y actuar de acuerdo a la decisin.

17

Introduccin

5. Conseguir la mejor aceptacin posible de la enfermedad y/o del riesgo de recurrencia por

parte de la familia afectada.

El consejo gentico es un proceso de comunicacin entre los especialistas, los

pacientes y sus familiares, que abarca mltiples facetas, no es slo el estudio molecular y el

informe del estudio molecular. El consejo gentico debe informar de los aspectos clnicos y

genticos de la enfermedad, orientar a las personas para que decidan aquello que ms les

conviene y ofrecerles ayuda psicolgica para aceptar su enfermedad, si la necesitan.

Para impartir un consejo gentico se debe contar con un rbol genealgico de la

familia, con la informacin relativa a la enfermedad y con un diagnstico cierto de la

misma en algn integrante de la familia. Luego se ha de establecer el riesgo relativo de

cada individuo de padecerla o transmitirla y, una vez conocidos todos estos datos, se podr

informar al paciente y a su familia sobre la enfermedad en s, su pronstico, su posible

tratamiento y el riesgo de recurrencia de la misma en las sucesivas generaciones. Es por

ello que el consejo gentico constituye la ltima etapa del diagnstico molecular y debe ser

realizado por profesionales entrenados para tal fin, (constituyendo el grupo ptimo: un

especialista en la patologa en cuestin, un mdico genetista, el mdico de cabecera de la

familia y un psiclogo), con el objeto de brindar una adecuada informacin a las familias

que lo soliciten.

En resumen, los polimorfismos de ADN juegan un papel fundamental en el

diagnstico de patologas genticas, lo que constituye uno de los eslabones imprescindibles

para el establecimiento de un buen consejo gentico en las familias que las padecen, como

se demostrar a continuacin...

18

Introduccin

Objetivos Generales

Existen aproximadamente 100.000 repeticiones del dinucletido (CA)n dispersas

ms o menos uniformemente en el genoma humano. Estos loci, adems de hipervariables,

se heredan en forma mendeliana, de manera que, en cada autosoma, los hijos heredan una

copia de su padre habitualmente distinta a la que heredan de su madre para cada STR en

particular. Estas caractersticas son las responsables de la eleccin de estas secuencias para

la puesta a punto de las estrategias diagnsticas que se plantean en esta Tesis.

El objetivo central del trabajo es aportar y reunir informacin que enriquezca el

conocimiento bsico de la aplicacin de los polimorfismos en gentica molecular

diagnstica, utilizando como modelos a la Distrofia Muscular de Duchenne / Becker

(DMD/DMB), la Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) y los sndromes de Prader-Willi y

Angelman (PWS/AS), con el objeto de establecer un centro de diagnstico molecular en el

que todos los individuos puedan acceder a un diagnstico de alta complejidad y reciban el

asesoramiento gentico adecuado.

En particular, se utiliz un sistema de diagnstico basado en la segregacin de alelos

polimrficos, con el objeto de:

- En una primera parte, resolver casos diagnsticos habituales y complejos de DMD/DMB.

19

Introduccin

- En una segunda parte, implementar un diagnstico molecular indirecto y establecer la

estrategia para rastrear las microdeleciones de NF1.

- En una tercera parte, analizar la utilidad de los microsatlites en la deteccin de

deleciones y disomas uniparentales en los pacientes con PWS y AS.